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Universidade Federal de Santa Maria
Centro de Ciências da Saúde
Biofísica Molecular
Microscopia Eletrônica de Transmissão
Professor:
Paulo César Piquini.
Acadêmicos:
Tanise Dalmolin
Sabrina Homrich
Vanessa Torbitz
Verônica Dias
Santa Maria/RS, Junho de 2009.
Introdução
O conhecimento detalhado da microestrutura dos materiais permite o entendimento e, em
muitos casos, até a previsão das propriedades e do comportamento dos mesmos. Esse
conhecimento sempre dependeu da disponibilidade e do aperfeiçoamento de técnicas
experimentais. Em 1897 J. J. Thomson anunciou a existência de partículas carregadas
negativamente que mais tarde foram denominadas “elétrons”. Em 1924, de Broglie propõe
que um elétron em movimento tem propriedades semelhantes a ondas, e Bush, em 1926
prova que é possível focar um feixe de elétrons com uma lente magnética cilíndrica,
lançando os fundamentos da óptica eletrônica. Em 1935, Knoll demonstra a viabilidade do
microscópio eletrônico de varredura (MEV) e três anos mais tarde um instrumento protótipo
foi construído por Von Ardene. Logo, em 1939, Siemens produz o primeiro microscópio
eletrônico de transmissão (MET).
Microscópio Eletrônico de Transmissão
O microscópio eletrônico de transmissão é em princípio similar, a um microscópio de luz,
apesar de usar um feixe de elétrons em vez de feixe de luz, e uma bobina magnética para
focar esse feixe em vez de lentes de vidro. O tecido observado, depois de quimicamente
fixado, colocado em plástico e cortado em várias secções finas que foram revestidas com sais
de urânio e chumbo, é colocado sob o vácuo do microscópio. Geralmente é obtido um
contraste pelo uso de corantes baseados em metais elétron-densos que absorvem ou espalham
elétrons, removendo-os do feixe à medida que passam através do espécime. O MET possui
um poder de aumento útil de até um milhão de vezes e uma resolução, com espécimes
biológicas, de cerca de 2 nm.
Princípios da Microscopia Eletrônica
Poder resolvente (ou poder de resolução)
Ao empregar um microscópio em um estudo, tem-se como objetivo visualizar mais detalhes
do que podemos com a vista desarmada. A ampliação que as lentes nos proporcionam é
apenas um meio para chegar a esse objetivo, e não terá valor se a imagem produzida no fim
não contiver mais detalhes do que podemos ver – ou resolver – sem o auxílio do microscópio.
A limitação básica não é uma questão de aumento, mas de poder resolvente, ou seja, a
capacidade de distinguir, distinta e separadamente, dois pontos adjacentes. O poder
resolvente de um microscópio é função do comprimento de onda da luz utilizada e da
abertura numérica, que é uma característica do sistema de lentes.
Comprimento de onda
Um objeto torna-se visível ao microscópio como resultado de sua interação com as ondas de
luz usadas para iluminá-lo. Essa interação ocasiona um desvio das ondas quando estas
passam pelo objeto. Objetos muito pequenos não ocasionarão quaisquer desvios detectáveis
nas ondas e, portanto, permanecerão invisíveis (ou não resolvidos). Quanto menor o
comprimento de onda da luz, menor será o objeto que poderá ocasionar desvios das ondas e,
portanto, melhor será o poder resolvente do microscópio. Isto significa que a natureza da luz
limita a quantidade de detalhes que pode ser resolvida em um microscópio.
Abertura numérica
O ângulo formado pelo eixo óptico e os raios mais externos ainda cobertos pela objetiva é a
medida da abertura numérica. O valor da abertura numérica está diretamente relacionado
com o índice de refração do meio por onda a radiação é projetada. Assim, o máximo de
abertura numérica para a objetiva a seco é menos do que 1, e as objetivas de imersão têm uma
abertura numérica ligeiramente maior, na faixa de 1,2 a 1,4. O comprimento de onda da luz
utilizada nos microscópios de luz é, também, limitado; a luz visível varia entre 400 e 700 nm.
O limite de resolução, isto é, o menor objeto que pode ser distintamente visualizado, é obtido
com o menor comprimento de onda da luz visível e com objetiva de maior abertura numérica.
Portanto, o melhor poder resolvente conseguido com o microscópio de luz é de 0,2 mm – a
abertura numérica não pode ser aumentada, e mesmo usando luz visível de comprimento de
onda mínimo (cerca de 0,45 mm), o poder resolvente não melhora significativamente.
A única maneira de melhorar o poder resolvente consiste em se reduzir o comprimento de
onda da radiação. Para isso, se fez necessário desenvolver equipamentos que empreguem
outra forma de radiação, e é aqui que o desenvolvimento do microscópio eletrônico começa.
Componentes do microscópio eletrônico
Propriedades ondulatórias dos elétrons
Em condições apropriadas, os elétrons apresentam propriedades ondulatórias, que, assim
como a luz visível, encontram-se associados a um comprimento de onda, cujo valor é de,
aproximadamente, 0,005 nm. Desta forma tem-se uma melhoria correspondente no poder
resolvente. A comparação deste valor com o comprimento de onda da luz visível (0,5
500 nm) mostra que um feixe eletrônico é cerca de 100.000 vezes menor. Considerando
apenas este fator, teríamos um aumento correspondente no poder resolvente.
Canhão eletrônico
Canhão eletrônico é a fonte de iluminação do microscópio eletrônico e consiste de um
pequeno fragmento de fio em forma de V. Uma alta voltagem é aplicada nesse filamento,
fazendo com que uma corrente flua através dele e o incandesça, emitindo elétrons. A
propriedade de emitir elétrons por aquecimento é comum a todos os metais e chama-se
emissão termoiônica. O comprimento de onda dos elétrons está diretamente relacionado a
voltagem aplicada sobre o filamento. Quanto maior for a voltagem menor será o
comprimento de onda dos elétrons, favorecendo o poder resolvente.
Lentes eletrônicas
Um campo magnético radialmente simétrico – como aquele formado por um enrolamento de
fio elétrico através do qual passa uma corrente – atuará como uma lente que pode ser usada
para focalizar um feixe eletrônico. Na prática, a lente eletrônica consiste basicamente de uma
bobina, formada por milhares de voltas de fio, através da qual passa uma corrente.
Princípio do Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET)
O MET possui sistemas de iluminação e vácuo que produz feixes de elétrons de alta energia
(energia cinética), que ao incidir sobre uma amostra de tecido ultrafina (na espessura de
nanômetro), fornece imagens planas, imensamente ampliadas, possuindo a capacidade de
aumento útil de até um milhão de vezes e assim permitindo a visualização de moléculas
orgânicas, como o DNA, RNA, algumas proteínas, etc.
O sistema de vácuo remove o ar e outras moléculas de gás da coluna do microscópio,
evitando assim que ocorra erosão do filamento e propiciando a formação de uma imagem
com excelente qualidade e contraste. A imagem é projetada em um anteparo fluorescente,
que poderá ser redirecionada para uma chapa fotográfica para registro, ou ainda a imagem
pode ser captada por um sistema computadorizado de captação de imagens e armazenada em
CD-Rom para futura análise.
Grande parte dos átomos das estruturas celulares tem baixo número atômico e muito pouco
contribui para a formação da imagem. O emprego de substâncias que contêm átomos
pesados, como ósmio, chumbo e urânio permitem obter um contraste entre as estruturas
celulares, contribuindo para uma melhor imagem, na prática, o intervalo de aumentos do
MET varia de 1.000 a cerca de 200.000 vezes. Então, por fim, a imagem é também uma
resultante da absorção diferenciada de elétrons por diversas regiões da amostra, seja por
variação de espessura, seja por interação com átomos de maior ou menor número atômico.
A construção do MET é robusta, a fim de garantir estabilidade mecânica e evitar
perturbações por vibrações do meio. As bobinas das lentes, através das quais passam
correntes, tenderiam a aquecer-se e, portanto são usualmente resfriadas por água que circula
a sua volta. Isso é conseguido com uma unidade de refrigeração de água interligada ao MET.
As lentes eletrônicas, assim como as lentes de vidro, apresentam defeitos. Esses defeitos
interferem no poder resolvente do microscópio eletrônico. A solução adotada para minimizar
esse problema reside em se trabalhar apenas com a porção central da lente, e isso se consegue
construindo nela uma abertura de pequeno diâmetro. Outro fator que impede que se atinja o
poder resolvente teórico é a estabilidade mecânica do MET. Devido ao fato de se atingir um
poder resolvente na ordem de nanômetros, qualquer oscilação em escala semelhante irá
interferir no resultado final. Portanto, o poder resolvente obtido na prática depende
essencialmente da qualidade do projeto e construção do ME, da natureza do espécime, e
ainda do cuidado e experiência do operador. Os melhores resultados obtidos para amostras
biológicas situa-se na faixa de 1 nm. Comparando-se com o poder resolvente do microscópio
de luz, temos uma melhoria de cerca de 200 vezes.
Processamento Básico do Material para Visualização através do Microscópio
Eletrônico de Transmissão
1
Fixar o material por perfusão e/ou imersão;
2
O fragmento geralmente é embebido em tetróxido de ósmio, depois passa por
processos de lavagens, desidratado em concentrações crescentes de álcool e
imerso em resina, onde permanece até a polimerização;
3
O excesso de resina polimerizada é retirado para expor o material de estudo e
permitir o seu fatiamento no ultramicrótomo (aparelho capaz de fatiar o material
em espessuras na ordem de nanômetro ou micrometro);
4
As fatias ultrafinas são colocadas em telas de cobre ou níquel (as telas de
cobre são mais baratas e utilizadas quando não há necessidade da realização de
imuno-histoquímicas posteriormente, caso haja pretensão de realizar a
imuno-histoquímicas devem ser utilizadas telas de níquel que não oxidam.) e são
contracoradas geralmente com uranila e chumbo;
5
Após a obtenção de fotografias, caso não haja um sistema de captação de
imagens para CD-Rom, segue-se com a revelação do negativo, revelação e
ampliação das fotografias.
6
Análise dos dados.
A formação de imagens em Microscópio Eletrônico de Transmissão
Em microscopia eletrônica de transmissão a imagem observada é a projeção de uma
determinada espessura do material, havendo uma diferença com relação ao observado numa
superfície. A figura abaixo apresenta a projeção de uma lâmina fina conforme observada no
microscópio de transmissão. Como pode ser observado, ocorre uma projeção das linhas,
áreas e volumes de interesse, podendo ocorrer superposição.
O contraste nas imagens formadas em MET tem diversas origens, tais como diferença de
espessura, diferença de densidade ou de coeficiente de absorção de elétrons (contraste de
massa), difração e campos elásticos de tensão.
Algumas aplicações típicas do Microscópio Eletrônico de Transmissão
Sua principal aplicabilidade é em análises morfológicas, caracterização de precipitados e
determinação de parâmetros de rede.
A primeira aplicação da microscopia eletrônica de transmissão no estudo dos materiais foi a
observação de defeitos cristalinos não observáveis por microscopia óptica ou por
microscopia eletrônica de varredura, tais como discordâncias e defeitos de empilhamento.
Passados mais de 50 anos desde a primeira observação de discordâncias por MET, este tipo
de estudo continua atual e muito utilizado. A figura abaixo apresenta as distribuições de
discordâncias em cobre puro policristalino deformado até 10% de alongamento em ensaio de
tração realizado em duas temperaturas: a) a temperatura ambiente (25ºC) e b) 500ºC. No
cobre deformado na temperatura ambiente as discordâncias formam emaranhados arranjados
em uma substrutura celular, com muitas discordâncias nas paredes de célula e com densidade
de discordâncias mais baixa no interior das células.
No cobre deformado a quente (500ºC) o arranjo de discordâncias levou à formação de
subcontornos que subdividiram os grãos (cristais) em subgrãos. Enquanto a diferença de
orientação entre grãos vizinhos é da ordem de dezenas de graus, a diferença de orientação
entre subgrãos é em geral menor que 5º. A comparação entre as duas micrografias dessa
figura, permite afirmar que a densidade de discordâncias da amostra deformada a quente é
mais baixa. Determinando-se a espessura local da amostra e utlizando-se relações de
estereologia quantitativa é possível determinar a densidade de discordâncias (em cm/cm3 ou
m/ m3).
Cobre policristalino deformado até 10% de alongamento em ensaio de tração, em duas temperaturas
diferentes: a) 25ºC e b) 500ºC.
Bibliografia
Galleti , Silvia. INTRODUÇÃO A MICROSCOPIA ELETRÔNICA. Biológico, São Paulo,
v.65, n.1/2, p.33-35, jan./dez., 2003
http://www.neurofisiologia.unifesp.br/eletronica.htm
http://www.youtube.com/watch?v=mYwki_1NkIE
http://www.angelfire.com/crazy3/qfl2308/1_multipart_xF8FF_3_MET_PMI-2201.pdf