Biotecnologia

Biotecnologia
Paulo Marques
Processos biológicos → difícil de definir o começo → funcionam de
forma muito integrada.
CÉLULAS: Unidade fundamental da vida – Menor parte de um ser vivo
capaz de desenvolver, de forma autônoma, as funções básicas que
caracterizam a vida: Reprodução e Crescimento.
Organismos vivos → unicelulares e pluricelulares
↓
células assumem diferentes
formas e
se especializam em várias
funções
↓
diferenciação celular
CÉLULAS – local de muitas reações químicas e
suas funções dependem das substâncias
químicas que produzem.
CÉLULAS ENTRE AS ESPÉCIES – com muitas
diferenças, mas também com muitas
similaridades → TODOS OS ORGANISMOS
DESCENDEM DE UM ANCESTRAL COMUM!
↓
PROCARIONTES
EUCARIONTES
CONSTITUIÇÃO QUÍMICA DAS CÉLULAS:
orgânicos
↓
Carboidratos, lipídios
inorgânicos
e
↓
água, sais min.
proteínas e ác. Nucléicos
PROTEÍNAS E ÁC. NUCLÉICOS – IMPORTANTES PARA A BIOL.
MOLECULAR
ÁCIDOS NUCLÉICOS – DNA E RNA → controlam de forma integrada a síntese
de proteínas
O código do DNA – moléculas de DNA e proteínas são lineares
↓
linear segundo a seqüência de nucleotídeos
↓
cada 3 letras = 1 aminoácido
SÍNTESE DE PROTEÍNAS – DNA →RNAm → Proteína
↓
Quando ocorre um erro - MUTAÇÃO
1. HISTÓRICO
O advento da Biologia Molecular
•1940 - Bases da Biologia Molecular:
estudo da estrutura e função das moléculas
biológicas.
•1944 – Avery, MacLeod e McCarty – ácido
desoxirribonucléico (DNA) continha a
informação genética.
•1952 – Hershey e Chase - DNA tem a capacidade de
controlar as células : experiência com bacteriófagos.
•1950 – Chargaff – distribuição dos nucleotídeos
(identificados pelas bases nitrogenadas) possuia um padrão:
quantidade de timina era igual a de adenina e guanina igual
a de citosina.
•1953 – utilizando os dados sobre a molécula de DNA
obtidos através de cristalografia de raios X por Rosalind
Franklin, James Watson e Francis Crick propuseram o
modelo dupla hélice do DNA: duas cadeias de nucleotídeos
enroladas em espiral e ligadas entre sí pelas bases - como
o material genético se duplica e produção do RNA , síntese
protéica e controle da atividade celular).
•1956 – processos de autoduplicação
do DNA
•1960 – decifração do código
genético dos aminoácidos
•1961 – processo de transcrição do
RNA.
•1962 – processo de tradução do
RNA para sintetizar proteínas.
Estrutura do DNA
Estrutura de Dupla
Hélice
(Watson e Crick 1953)
Capacidade de
Replicação
A Molécula de DNA
Tipos de DNA
Há pelo menos três modelos de DNA :
Modelos A, B e Z
O DNA B é de longe o mais frequente, mas o DNA Z
tamém é encontrado na célula. Admite-se que o DNA
Z é "silencioso", isto é, não pode ser transcrito. A
transição B-Z seria, assim, um recurso para silenciar
grandes blocos de genes. A forma Z é também a
única que é imunogênica, isto é, quando um paciente
tem anticorpos contra DNA, é contra esta forma que
eles são produzidos.
DNA: A, B e Z. Nesta figura está bem visível a fenda maior entre a volta verde de
cima e a vermelha de baixo e a menor, entre a vermelha de baixo e a verde da base,
no modelo B. Também fica claro que os dois modelos A e B são hélices destrógiras,
enquanto o Z é levógiro. DNA Z não tem duas fendas nítidas, mas uma escancarada
e outra muito discreta.
CLASSES DE DNA
O DNA das células eucariontes apresenta três frações
caracterizadas pelo grau de repetição:
•DNA Singular ou de Cópia Única
Constitui a maior parte do DNA no genoma. As
sequências que codificam proteínas (isto é, a
porção codificadora dos genes) compreendem
apenas uma pequena proporção do DNA de cópia
única. A maior parte do DNA de cópia única
encontra-se em extensões curtas, entremeadas
com diversas famílias de DNA repetitivo .
Proporção do genoma: 75% .
•DNA Repetitivo Disperso
Consiste em sequências relacionadas que se
espalham por todo o genoma, em vez de
ficarem localizadas.
Os elementos repetidos dispersos mais
exatamente estudados pertencem à família
Alu e à família L1.
•DNA Satélite
Envolve sequências repetidas (em
tandem) agrupadas em um ou em
alguns locais, intercaladas com
sequências de cópia única ao longo do
cromossomo.
As famílias de DNA satélite variam
quanto à localização no genoma,
comprimento total da série em tandem,
comprimento das unidades repetidas
que constituem a série.
TRANSPOSONS
Transposons - moléculas que “copiam e colam”
Transposons são pedaços de DNA que podem
copiar e inserirem-se em regiões não-homólogas
de outros DNAs na mesma célula.
Transposons = Transposição
DNA: Processos de
replicação, Transcrição e
Tradução
Controle da expressão
gênica
Jacob e Monod criaram um modelo no qual o sítio
promotor, associado a um outro sítio chamado
operador, controlava a expressão de todos os genes
imediatamente “abaixo”, isto é, 3’, do promotor. A este
conjunto chamaram operon. Como os genes que
estudavam eram os responsáveis pela síntese das
proteínas que degradavam lactose, chamaram a este
arranjo de genes operon lac.
TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE
À partir do conhecimento da molécula de DNA, os cientistas agora querem
administrar essa fábrica de proteínas!!
DNA – molécula relativamente simples e muito regular; varia só nas 4 bases
(com caract. químicas muito semelhantes) e são macromoléculas com as
mesmas propriedades químicas.
↓
pelo comportamento químico é impossível separar uma molécula de DNA
↓
TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE
↓
O DNA é extraído da célula com o gene de interesse – cortado em fragmentos
menores de modo controlado - cada fragmento é ligado em uma outra
molécula de DNA – célula hospedeira
↓
célula com a molécula híbrida, passa a copiá-la, duplicando-a em cada divisão
celular – com grande quantidade da molécula é possível localizar o gene.
Isolar o gene – multiplicá-lo e obter grande quantidade da proteína
↓
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO (endonucleases)
2. Introdução à Engenharia Genética
Utilizando
as
enzimas
de
restrição
bacterianas, tornou-se possível cortar dois DNAs
diferentes e, pela ação de enzimas ligases, unir os
segmentos
resultantes
e
formar
um
DNA
recombinante - Tecnologia do DNA Recombinante –
início da Engenharia Genética.
Assim, os cientistas têm desenvolvido técnicas
que possibilitam transferir os genes de um tipo celular
para outro (por exemplo, de plantas e animais para as
bactérias).
Aplicações comerciais: o futuro da
engenharia genética é considerado muito amplo,
sendo que já resolveu alguns dos maiores problemas
de pesquisa. Por exemplo, genes que codificam a
produção de compostos importantes, com produção
reduzida em seu tecido normal, podem ser
retirados de células animais ou vegetais e inseridos
na célula bacteriana- esta sintetiza em
quantidades ilimitadas os produtos codificados pelos
genes. Muitos exemplos de sua aplicação são
observados na medicina.
Outra aplicação importante é a
transformação de plantas, animais e microrganismos
para a obtenção de Transgênicos (OGM).
3. Importância dos Microrganismos e das Enzimas na
Engenharia Genética
As células animais e vegetais usualmente não podem
ser cultivadas para produção de compostos específicos –
estas perdem a habilidade de síntese quando são isoladas e
cultivadas em laboratório. Também , o cultivo de células de
tecido em laboratório é dispendioso e requer meios
complexos altamente enriquecidos.
Uso de microrganismos – medicina: altamente
empregado, pois evita muitos dos problemas associados com
a obtenção de compostos importantes (insulina, interferom,
hormônios, etc.). As bactérias que carregam os genes para
os mais diversos compostos, podem ser cultivadas
indefinidamente.
Por meio da introdução de genes estranhos em
microrganismos, é possível desenvolver cepas que oferecem novas
soluções para problemas diversos, como poluição, escassez de
alimento e energia , controle de doenças e até mesmo terapia
gênica.
ENZIMAS: fundamental para a tecnologia do DNA
recombinante.
•Endonucleases de restrição: apresentam papel fundamental,
clivando o DNA em seqüências específicas, gerando um
conjunto de fragmentos menores.
•DNA ligase: os fragmentos separados para serem clonados
podem ser unidos a um vetor de clonagem apropriado usando
a DNA ligase.
Assim, o vetor recombinante é introduzido numa célula
hospedeira que o “clona”, a medida que a célula realiza muitas
gerações de divisões celulares.
Vetores de Clonagem
Plasmídios – bacteriófagos – cosmídios - E. coli.
Plasmídios : moléculas de DNA circulares que se
replicam
separadamente
do
cromossomo
hospedeiro.
-Plasmídios bacterianos naturais – 5.000
a 400.000 pares de bases.
-Plasmídios introduzidos nas células por
técnicas de transformação
Utilizados para clonar segmentos de DNA até
15.000 pares de bases.
Construção de uma Bactéria pela Engenharia
Genética
•Obtenção do gene do organismo doador ou, em
alguns casos, pode ser sintetizados em
laboratório pôr nucleotídeos artificiais.
•DNA plasmidial (ou outro vetor de clonagem) é
isolado para servir como carreador de
determinado gene.
•O DNA doador e o plasmidial são tratados
com a mesma enzima, uma endonuclease de
restrição, que cliva o DNA, formando fitas
simples
com
terminais
complementares
(“terminais coesivos”). Esses são capazes de
ligar-se a outros fragmentos de DNA que
apresentam o mesmo terminal complementar
das fitas simples.
•O terminal coesivo de um fragmento de
DNA doador liga-se com o terminal coesivo
do DNA plamidial através da DNA ligase
→ plasmídio com o fragmento do DNA
doador.
•O plasmídio é adicionado a uma suspensão
de bactérias receptoras 
transformação.
•As bactérias geneticamente construídas
são propagadas em grande quantidade e o
produto (proteína) codificado pelo gene
transferido é extraído da cultura e
purificado. Ou outro caminho é colocar
esta bactéria transformada com outro
tecido e fazer a transferência do gene.
Isolamento e amplificação
de plasmídios
Bacteriófago λ : clonagem de segmentos de
DNA maiores. Bacteriófago λ – 48.502 pares
de bases.
Clonagem do DNA no Bacteriófago λ é baseado
em duas carcaterísticas-chave do genoma do
genoma do λ: a) um terço do genoma não é
essencial e pode ser substituído pelo DNA
estranho b) o DNA será empacotado em
partículas do fago infecciosas, apenas se
possuírem entre 40.000 e 50.000 pares de
bases de comprimento.
Utilizados para clonar fragmentos de DNA até
23.000 pares de bases.
Cosmídios : plasmídios recombinantes com características
úteis tanto dos plasmídios quanto do bacteriófago λ.
Cosmídios – são moléculas de DNA circulares pequenas
(5.000 a 7.000 pares de bases), que contém:
a) uma origem plasmidial de replicação;
b) um ou mais marcadores de seleção;
c) um certo número de sítios únicos de restrição onde o
DNA estranho pode ser inserido e;
d) um sítio cos (seqüência de DNA do bacteriófago λ).
Utilizados para clonar fragmentos de DNA até 45.000
pares de bases.
Vetores de clonagem
PORQUE CONSTRUIR UMA MOLÉCULA DE DNA
RECOMBINANTE?
ESTUDO DA ESTRUTURA DOS GENES
DIAGNÓSTICO CLÍNICO
TERAPIA GÊNICA
MELHORAMENTO ANIMAL E VEGETAL
OBTENÇÃO DE GRANDES QUANTIDADES
DE PROTEÍNAS RARAS.
CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECAS DE
GENES
Isolamento de um gene
específico
Como exemplo – gene humano




Quanto maior o número de fragmentos ou
clones produzidos, mais difícil será encontrar o
clone com o gene de interesse.
BANCOS GENÔMICOS DE ORGANISMOS
COMPLEXOS (P. EX. HOMEM), DEVEM SER
CONSTRUÍDOS COM FRAGMENTOS DE DNA
NÃO MUITO PEQUENOS.
BANCO CROMOSSÔMICO - Banco genômico
para cada cromossomo.
CROMOSSOMOS - são isolados por
fluorescência.
Seqüenciamento de DNA: Identificação da
Seqüência de Nucleotídeos que compõem a
molécula de DNA
Molécula de DNA
DNA- Polímero, cujas
unidades são os
nucleotídeos. Cada
nucleotídeo consiste de
um açúcar, uma base
nitrogenada e um grupo
fosfato
Informação Genética
6. Problemas Envolvidos na Clonagem do Gene
•Endonucleases de restrição – podem cortar e destruir
os genes a serem clonados. Também mais que um gene
pode
estar
envolvido
na
expressão
de
uma
característica.
•Inserção incorreta do gene doador no plasmídio vetor
– resultando na falha da bactéria em expressar o
gene.
•A proteína sintetizada pode estar dentro da célula
como agregados grandes e insolúveis – ocorrem
dificuldades no isolamento da proteína.
•Pode ocorrer síntese em excesso do produto do gene –
às vezes pode ser letal para a bactéria.
DNA recombinante



Uso de enzimas bacterianas
conhecidas como enzimas de
restrição;
As enzimas de restrição são
altamente específicas;
Corta o DNA apenas nos locais onde
existem certas seqüências de bases
nitrogenadas.
Enzimas de restrição



Importância:
Foi empregada no Projeto Genoma
Humano;
É empregado em laboratórios de
Genética molecular
P.G.H.



Objetivos:
Mapeamento genético;
Determinar a seqüência de bases de
todos os genes de nossa espécie.
Curiosidade: O número total de genes
apresentado pelo projeto foi de 30 a
31 mil
P.G.H.



Perspectivas:
Cura de doenças por substituição de
genes anormais;
Questão da Bioética (uso para o bem
comum e não por interesses
individuais).
Eletroforese


É uma técnica que separa moléculas
DNA, RNA e proteínas de acordo com
seu tamanho e carga elétrica;
Velocidade de migração através de
um suporte de material gelatinoso
(gel de agarose), submetido a um
campo elétrico.


DNA tem carga geral
negativa;
Migração inversamente
proporcional ao tamanho
Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR)


É uma técnica para amplificar
pedaços de DNA por meio de uma
reação em cadeia utilizando enzimas
Muitos técnicas de manipulação de
DNA requerem muita amostra de
DNA e que este esteja puro
PCR






Algumas aplicações:
Diagnóstico de doenças genéticas;
Detecção de infecções;
Monitoração de terapia contra o
câncer;
Sequenciamento de DNA;
Fingerprinting forense.
Nanotecnologia


É a utilização de partículas que são
medidos na ordem de nanômetros
em várias ciências;
Richard Feynman.
Nanobiotecnologia



Aplicação na Biologia;
Perspectivas:
superfícies nanofabricadas com
padrões estruturais poderiam fazer
crescer artificialmente ilhas
pancreáticas e reverter os efeitos da
diabetes;
Nanobiotecnologia



nanodispositivos poderiam funcionar
como kits de reparo de neurônios
para pessoas com mal de Parkinson
ou doença de Alzheimer;
destruir vírus ou células cancerosas;
descoberta acelerada de drogas, com
menor custo