DNA recombinante in a nutshell

DNA recombinante in a nutshell
Biologia Molecular Aplicada
A tecnologia do DNA recombinante
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
Teoria bem fundamentada
• Por volta do início da década de
70, os fundamentos básicos da
teoria já haviam sido propostos
solidamente por Crick, Watson e
C&A
• Assim, os cientistas passaram a se
perguntar: será que o material
genético e o processo de
expressão podem ser
manipulados?
• Ciência X (Bio)Tecnologia
A descoberta da DNA ligase
• 1960: recombinação de
DNA ocorre em células
– Reparo de danos ocorridos
por luz UV
• 1967, Martin Gellert
– Extratos de E. coli produziam
fagos lambda circulares
– Purificação da DNA ligase!
• Circularização de genomas
Paul Berg
•
Reuniu o fago SV40 ao bacteriófago lambda
– Queria cortar o SV40 e inserir pedaços do fago lambda nele
•
Usou enzimas de restrição para cortar os fagos e incubou-os
juntos, utilizando DNA ligase
– Criou uma técnica, segundo ele mesmo, para ligar covalentemente
moléculas de DNA
•
Como o bacteriófago era de E. coli e esta bactéria habita nossos
corpos, ele teve medo de gerar um novo e letal vírus
•
Posteriormente sugeriu moratória aos estudos em biologia
molecular
Nobel, 1980: “por seus estudos fundamentais em bioquímica
de ácidos nucléicos, particularmente com relação ao DNA
recombinante”
•
Paul Berg, 1926-
Fago λ
SV40
Endonucleases de restrição
•
1968, Paul Arber sugere a existência de
enzimas existentes em bactérias que atuassem
como proteção à infecção por fagos
– Essas enzimas cortariam o DNA do fago em sítios
específicas
– Endonuclease R
•
1968
– Meselson & Yuan: EcoRI
•
1970
– Smith & Kelly: nova endonuclease descoberta
em H. influenzae -- HindIII
– Confirmação da hipótese de Arber, enzima corta
DNA exógeno mas não DNA celular
– Descoberta do sítio específico de corte pela
enzima (AAGCTT)
Mapa de restrição
• 1971 - Kathleen Danna and Daniel
Nathans
– Verificado o fato de que a enzima
corta em sítios específicos
EcoRI
EcoRI
EcoRI
EcoRI
HindIII
EcoRI
• Fragmentos tinham tamanho
constante e, logo, podiam ser
facilmente separados em uma
eletroforese!
EcoRI
• Ensaio de digestão: Usam a
endonuclease R (EcoRI) para
cortar o DNA do fago SV40
De novo, Berg
Extremidades
cegas
• 1972, Berg’s lab
– Janet Mertz and Ronald Davis
descobrem que a endonuclease R1
produzia quebras espaçadas entre as
duas fitas, gerando extremidades
coesivas idênticas e complementares
• Extremidades unidas e encubadas com
DNA ligase poderiam gerar moléculas
de DNA híbridas!
Extremidades
coesivas
Ensaio de digestão
• Adicione DNA + tampão +
endonuclease de restrição
• Deixe digerindo num banho a
determinada temperatura por
determinado tempo
• 1 unidade de enzima de restrição
digere 1 μg DNA em 1h00
• Caixa de truques do biólogo
molecular contém: DNA ligase +
enzimas de restrição + ...
Vetores de clonagem
• ~1970: Trabalho com plasmídeos
• Peças de DNA circulares e não cromossomais
encontradas em bactérias
– E às vezes trocadas por elas
• 1970
Descobriu um método segundo
o qual uma E. coli adquiriria um
plasmídeo conhecido como pSC101
• pSC101: contém um gene que
confere resistência ao antibiótico tetraciclina
Stahen Cohen, 1936-
Plasmídeo encontra
Endonucleases
• Cohen junta-se a Boyer, especialista em enzimas de
restrição
– P1 confere resistência a tetraciclina
– P2 confere resistência a kanamicina
EcoRI
Herbert Boyer, 1936
EcoRI
• Trabalharam com dois plasmídeos,
P1
P2
• Experimento
• Este talvez tenha sido obtiveram o primeiro
organismo recombinante feito propositalmente por
um ser humano
T
Digestão +
ligação
EcoRI
K
K
P1/2
T
EcoRI
– Corte os dois plasmídeos com enzimas de restrição
– Incube-os com DNA ligase
– Teste a presença de bactérias duplamente
resistentes no meio
Cohen & Boyer
• 1973
– Inseriram genes de Xenopus laevis em E. coli e
verificaram que os genes estavam ativos nas
bactérias depois de várias gerações
– Como as bactérias reproduziam-se rapidamente,
poderiam ser utilizadas para produzir genes de
grandes mamíferos em larga-escala
– Constroem um organismo capaz de combinar e
replicar a informação genética de diferentes
espécies!
O que, então, era possível fazer?
• Era possível pegar o DNA de
qualquer espécie, picotá-lo e
inseri-lo em uma bactéria que o
amplificaria milhões de vezes
• A era da engenharia e da
manipulação genética tem
início...
• Mas o que se pode fazer? Até
onde podemos chegar?
– Verdade seja dita: ninguém sabe
ao certo...
Engenharia genética
• Pode-se aumentar a expressão de
um gene bacteriano
• Pode-se fazer bactérias produzir
genes de qualquer espécie
– Expressão em levedura, células
de mamíferos
• Produzir vírus transgênicos,
produzir vírus contendo toxinas
• Terapia gênica, knockout gênico
• Que medo!?
Discussões éticas
• 1974
– Paul Berg (juntou SV40 com fago lambda e
se arrependeu) alerta para o perigo da
biotecnologia e sugere uma moratória
• 1975
– Conferência Asilomar
– Moratória de 16 meses ao DNA recombinante
– Bomba atômica da biologia?
• Watson acha que a natureza já fez muitos
mais experimentos, por muito mais tempo
e muitos mais jeitos do que podemos
imaginar e nada de muito significativo
aconteceu...
– Se fosse causar algum dano, a natureza
per se já teria causado...
Joshua Lederberg
• 1958, Nobel com Beadle e Tatum (um gene, uma enzima)
• 1960
Enquanto as discussões giravam sobre clonagem humana, sugeriu que
a biotecnologia se desenvolveria através da microbiologia
Lederberg defendia a terapia gênica e a engenharia de fenótipos
• 1974, Asilomar
Defendia a tecnologia para diagnose de doenças, medicina
terapêutica, produção de proteínas humanas em larga escala,
processos de fermentação, produção maciça de antibióticos
• 1978, Genentech
Produção da primeira insulina humana
O DNA recombinante hoje
• Há centenas de vetores de clonagem comerciais, cada um
com vantagens específicas (encontrar promotores, descobrir
interações entre genes, expressar proteína em larga escala,
etc)
• DNAs das mais variadas espécies são clonados a todo instante
em laboratórios de biologia molecular em todo o mundo
• Parece que nada de muito anormal aconteceu... Ainda...
– Será que Watson está certo?
Plantas transgênicas
•
Genes de resistência a patógenos
–
–
•
Resistência a inseticidas (Roundup)
Aumento da produtividade, desequilíbrio
ecológico
Aumento nutricional
–
–
Adição de determinado aminoácido torna
alimentos mais nutritivos
Banana vacina
•
Rotulação!
•
Prejuízo ecológico da monocultura
–
–
•
A maior parte do prejuízo ecológico vem
da simples monocultura
A engenharia genética adiciona um nível
de prejuízo ecológico ligeiramente maior
É preciso diferenciar a tecnologia de
transgênicos de seu abuso pela indústria
do capital
–
Produção de insulina, hormônio de
crescimento, etc.
Clonagem de genes
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
Pra quê clonar genes?
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Amplificar milhares de vezes apenas este gene
Realizar um estudo individual da função de genes
Identificar mutações que modifiquem a função deles
Entender a ação enzimática da proteína produzida
Verificar com quais outros genes ele interage
Produzir a proteína em larga-escala
Montar genomas completos
Produzir organismos transgênicos de interesse
Etc etc etc etc
Clonagem de fragmentos de DNA
•
Enzimas
–
–
–
–
•
Vetores
–
–
–
–
–
•
enzimas de restrição
DNA polimerases
DNA ligase/Topoisomerases
Fosfatases
Plasmídios
Fagos
Cosmídeos
BACS/YACS
Vírus, bacteriófagos
Hospedeiros
–
–
–
–
Escherichia coli
Levedura
Células animais
Células vegetais
Vetor plasmidial
• Origem de replicação
• Gene repórter
• Sítio múltiplo de clonagem
Ligação do DNA exógeno ao plasmídeo
• Produção da molécula
de DNA recombinante
• Plasmídeo + DNA
cortado do organismo
de interesse
• Ligação das
extremidades coesivas
DNA Ligase
• Realiza a ligação fosfodiéster
• E agora, quem dirá de qual organismo é esta molécula?
Ensaio de digestão e subclonagem
Clivagem do inserto clonado
no vetor com enzima de restrição
1
+ EcoRI
2
PM
Kb
2,0
1,0
0,5
Clonagem de fragmentos de DNA
INSERTO: Fragmento de DNA
Ligação enzimática: Ligase de DNA
VETOR ou veículo de clonagem:
-plasmídeo
-bacteriófago
-cosmídeo
-cromossomo artificial de bactéria (BAC)
-cromossomo artificial de levedura (YAC)
Amplificação do clone em bactérias
inserto
fragmento de DNA
ligado ao vetor
construção
introduzir nas células:
transformação e seleção
Objetivo:
Obter muitas
Cópias do gene
pretendido
bactéria
transformada
Transformação
• Inserção do
plasmídeo
em bactérias
• Replicação bacteriana
• Produção em massa
da proteína
recombinante!
Métodos de
transformação bacteriana
A transformação natural descrita por Griffiths, em
1928, e por Avery e colaboradores, em 1944, é um
evento raro.
Permeabilização com CaCl2
-- Choque térmico
Eletroporação
-- Choque elétrico
Gene gun
-- Bombardeamento
• Plasmídeos pequenos são mais facilmente
incorporados pela célula bacteriana
competente.
• DNA linear é pobremente incorporado, talvez
pelo fato de sofrer degradação pelas
enxonucleases presentes no espaço
periplasmático.
Seleção de clones
• Bactérias são colocadas em meio nutritivo
com antibiótico para que cresçam e
amplifiquem nosso DNA do inserto
• Gene repórter
– Reporta se a
transformação
aconteceu
– Bactérias nãotransformadas
não sobrevivem
– Gene de resistência
a algum antibiótico
Será que
entrei?
Seleção de recombinantes
Durante a clonagem de fragmentos, a DNA ligase pode fechar o plasmídeo sem
que nenhum inserto tenha sido clonado. Para evitar a análise de um vetor
fechado é preciso um novo teste de gene repórter.
Keywords
• Conceitos-chave para a tecnologia do DNA
recombinante:
– Vetor
• Sítio múltiplo de clonagem
• Genes repórteres
– Inserto
– Endonucleases de restrição sítio-específicas
– Digestão, ligação, clonagem
http://www.youtube.com/watch?v=acK
WdNj936o&feature=related
Material Suplementar
• Várias técnicas de biomol podem ser escolhidas aqui para a
realização do trabalho de fim de curso:
http://www.genomenewsnetwork.org/resources/timeline/
• http://www.nature.com/milestones/miledna/timeline.html
• http://en.wikipedia.org/wiki/History_of_biotechnology
• http://www.nature.com/scitable/topicpage/RecombinantDNA-Technology-and-Transgenic-Animals-34513
• http://www.nature.com/scitable/topicpage/RestrictionEnzymes-545