Genética Molecular em Medicina Transfusional
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Genética Molecular em Análises Clinicas TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS Prof.Doutor José Cabeda Genética Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos PCR Real Time PCR NASBA/TMA PCR OPTIMIZAÇÃO DO PCR [MgCl2] Th [dNTP] [primers] [DNA] [inibidores] Variações RT-PCR Multiplex PCR Nested PCR Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos PCR Real Time PCR NASBA/TMA Principio de funcionamento do Real-Time PCR 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda Genética Detecção dos produtos de PCR Montar uma reacção Químicas Utilizáveis 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda Genética SYBR-Green I 3’ 5’ Excitation SG SG SG 3’ 5’ SG SG SYBR-Green I Excitation Emission 5’ 3’ SG SG SG SG SG 3’ 5’ Detcção com SybGreen Sybr-Green Detection Intercalates to dsDNA Inhibits DNA amplification so concentration is critical Detects specific and nonspecific targets Low starting background with large increase in signal Can run a melt curve to look at product specificity Detecção com sondas Quimicas utilizáveis: sondas taqman Sequence specific probes: Dual labeled probes 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ Excitation Excitation 3’ R Q Q 5’ Quimicas utilizáveis: molecular beacons Molecular Beacons I FAM DabCyl 10mer 25mer Molecular Beacons II Excitation Emission R Q Molecular Beacons II Excitation Emission R Q Molecular Beacons III Can be used to quantitation and mutation detection Need beacons for the normal and mutation sequence Design is difficult due to nature of folding structure Expensive when compared to FRET Quimicas utilizáveis: sondas FRET TM Hyb-Probes Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: Quencher Transfer Excitation 2001/2002 Emission Prof.Doutor José Cabeda Genética Quenched FRET analysis 5’ 3’ Two labeled probes, FAM at the 5’ and BH1 on the 3’ When the probes hybridize the FAM energy is quenched by the BH1 After the product is amplified run a melt curve to determine genotype Different melt points are seen for normal and mutation Quimicas utilizáveis: sondas Eclipse F Q MGB F Q Aplicações Quantificação 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda Genética End Point versus Real-Time Quantificação Aplicações Detecção de Mutações / SNP 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda Genética Detecção de mutações Aplicações Multiplex Detection 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda Genética Detecção simultânea de vários produtos Os equipamentos 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda Genética Light Cycler Smartcycler Rotorgene The samples spin continually during a run at 500 rpm The samples are heated and cooled in a low mass air oven Tubes are illuminated as they pass the detector On data acquisition energy is averaged over 20 revolutions to give the fluorescence of each sample Four Channels • • • • Ch1: ex 470nm, det 510nm Ch2: ex 530nm, det 550nm Ch3: ex 585nm, det 610nm Ch4: ex 625nm, det 660nm O Futuro próximo Detecção com sondas Detcção com SybGreen Quantificação Detecção de mutações Detecção simultânea de dois produtos Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos PCR Real Time PCR NASBA/TMA NASBA/ NUCLISENS Amplification: schematic diagram Primer 1 Legend: • sense RNA • antisense RNA • sense DNA • antisense DNA Reverse Transcriptase RNase H Primer 2 Reverse Transcriptase T7 RNA polymerase Primer 2 Reverse Transcriptase Reverse Transcriptase RNase H Primer 1 Técnicas de amplificação de Sinal bDNA (Quantiplex) bDNA (I) bDNA (II) bDNA (III) bDNA (IV) bDNA (V)
