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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE – UNESC
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
GISELLI SCAINI
INVESTIGAÇÃO DOS MECANISMOS DE TOXICIDADE DOS
COMPOSTOS ACUMULADOS NA DEFICIÊNCIA DA DESIDROGENASE
DE ACILAS DE CADEIA MÉDIA (MCAD) EM CÉREBRO, FÍGADO E
MÚSCULO DE RATOS DURANTE O SEU DESENVOLVIMENTO NA
PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE HIPERAMONEMIA.
CRICIÚMA, DEZEMBRO DE 2010
Livros Grátis
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GISELLI SCAINI
INVESTIGAÇÃO DOS MECANISMOS DE TOXICIDADE DOS
COMPOSTOS ACUMULADOS NA DEFICIÊNCIA DA DESIDROGENASE
DE ACILAS DE CADEIA MÉDIA (MCAD) EM CÉREBRO, FÍGADO E
MÚSCULO DE RATOS DURANTE O SEU DESENVOLVIMENTO
NAPRESENÇA OU AUSÊNCIA DE HIPERAMONEMIA.
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências da Saúde obtenção do
título de Mestre em Ciências da Saúde
Orientador: Prof. Dr. Emílio Luiz Streck
Co-orientadora: Profa. Dra. Patrícia F. Schuck
CRICIÚMA, DEZEMBRO DE 2010
Dedico este trabalho aos meus familiares, em
especial aos meus pais, Elcio e Adioni, que estão
presentes em todos os momentos da minha vida e
por serem sempre os maiores incentivadores de
todas as minhas escolhas.
AGRADECIMENTOS
Considerando esta dissertação como resultado de uma caminhada que não começou
na UNESC, agradecer pode não ser tarefa fácil, nem justa. Para não correr o risco da
injustiça, agradeço de antemão a todos que de alguma forma passaram pela minha vida e
contribuíram para a construção de quem sou hoje. E agradeço, particularmente, a algumas
pessoas pela contribuição direta na construção deste trabalho:
A Deus, que sempre olha por mim e que me concedeu tantas maravilhas. Por seu amor
incondicional, sua misericórdia, sua luz e, principalmente, por ter me dado força, coragem e
incentivo para que, nos momentos de fraqueza, eu me levantasse e continuasse a minha
jornada. Obrigada, Senhor!
Aos meus pais, Adione Cardoso Scaini e Elcio Scaini, pelas noites mal dormidas, pelas
angústias e preocupações, por todo amor, carinho e felicidade que me concederam. Obrigada
pela vida e por terem feito de mim o que sou hoje. Por terem me dado a melhor educação e
incentivo ao aperfeiçoamento constante. Por serem exemplos a ser seguidos e por serem tudo
aquilo que um dia eu quero ser para o meu filho. Muito obrigada. Amo vocês!
Aos meus irmãos, Junior e Giovanna, presenças alegres e incentivos constantes, pelo
carinho e força que me dão, por estarmos sempre juntos nos momentos mais importantes, por
"contar" com vocês! Agradeço também a minha cunhada e ao meu futuro sobrinho que com
certeza vai ser lindo e já é muito amado. Tenho certeza de que a minha alegria os faz alegres
também.
Agradecimento muito especial, ao meu orientador, Prof. Dr. Emilio Luiz Streck,
obrigada primeiramente pela confiança depositada, pelo exemplo de profissionalismo e
comprometimento com o conhecimento científico, pelos ensinamentos, amizade, e,
principalmente, por nunca ter medido esforços para que esse trabalho acontecesse. O seu
apoio incondicional foi fundamental para que tudo desse certo. A você serei eternamente
grata. Minha eterna gratidão pela valiosa orientação que tornou real a concretização de um
sonho.
A Profa. Dra. Patrícia Fernanda Schuck, pela paciência, pelos ensinamentos no
âmbito profissional e pessoal, pelo incentivo, pela amizade e pela experiência profissional que
contribuíram para o meu crescimento. Agradeço imensamente o carinho em todos os
momentos.
Aos professores que compõem a banca examinadora dessa dissertação: Agradeço as
valiosas contribuições dadas durante a defesa do projeto, sua disponibilidade e abertura à
troca de conhecimentos.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, agradeço
pelo muito que aprendi nestes dois anos, pelas dúvidas e incertezas que por vocês foram
esclarecidas.
À Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC), em especial ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências da Saúde, pela formação e pela possibilidade de realizar esse
trabalho de pesquisa. Agradeço também a CAPES, pelo auxílio financeiro.
A todos os meus amigos pela amizade, carinho, companheirismo, cumplicidade e,
principalmente paciência e tolerância por todos os “nãos” recebidos a muitos dos seus
convites feitos a mim nesses dois últimos anos. São tantos os amigos que se encaixam nessas
palavras, que eu precisaria de muitas páginas para nomear a todos. Deixo aqui, meu muito
obrigada e minha eterna gratidão pelo simples fato de existirem.
As minhas companheiras de laboratório, em especial a Gabi, a Bela e a Gislaine, pelo
incentivo, força, amizade, carinho que partilhamos durante nosso caminhar... Muito
Obrigada!
Agradecimento muito especial as “minhas” aprimorandas, Nati, Joana (mesmo que
longe) e Meline, pela amizade, pela confiança que depositaram em mim, pelas coincidências e
reencontros em nossas vidas e também pelo auxílio na etapa final desse trabalho. Muito
obrigada!
À toda a família do Laboratório de Fisiopatologia Experimental pela grande amizade,
convivência e troca de experiência. Obrigada por tudo.
“Qualquer caminho que você decida tomar,
sempre existe alguém para te dizer que você está
errado. Existem sempre dificuldades surgindo
que te tentam a acreditar que as críticas estão
corretas. Mapear um caminho de ação e segui-lo
até o fim requer coragem”
Ralph Waldo Emerson
RESUMO
A deficiência da desidrogenase de acil-CoA de cadeia média (MCADD) é o mais
frequente defeito da oxidação de ácidos graxos, caracterizado bioquimicamente pelo acúmulo
tecidual predominante dos ácidos graxos de cadeia média, ácido octanóico (AO) e ácido
decanóico (AD). Os pacientes afetados apresentam hipoglicemia hipoacetótica, rabdomiólise,
hepatomegalia, hiperamonemia, letargia e convulsões, podendo rapidamente evoluir para o
coma e morte. Atualmente, os mecanismos fisiopatológicos dos danos teciduais apresentados
pelos pacientes afetados por esse distúrbio ainda não estão esclarecidos. Assim, no presente
trabalho, investigamos o efeito in vitro dos ácidos octanóico (AO) e decanóico (AD) na
ausência ou presença de acetato de amônia (AA) sobre parâmetros do metabolismo energético
e de estresse oxidativo em córtex cerebral, fígado e músculo esquelético de ratos jovens.
Verificamos que o AO e AD diminuiu a atividade do complexo I-III, II, III e IV no
fígado, e também inibiu a atividade do complexo IV no músculo esquelético. Além disso, o
AD causou uma diminuição da atividade do complexo II-III no músculo esquelético.
Verificamos também que o AO e AD aumentaram os níveis de TBA-RS e o conteúdo de
carbonilas em ambos os tecidos. Finalmente, AD, mas não AO, diminuiu significativamente os
níveis de GSH no músculo esquelético de ratos. Além disso, observamos que o AA inibiu a
atividade do complexos II-III no fígado, e a atividade do complexo IV no músculo esquelético,
cérebro e fígado. Por outro lado, houve um aumento na atividade do complexo II no fígado.
Quanto à associação entre AA e os ácidos graxos, observamos uma inibição do complexo I-III
e II no cérebro, e do complexo II no músculo esquelético quando o AD e o AA estiveram
presentes simultaneamente no meio de incubação, sugerindo uma ação sinérgica entre AA e
AD. Além disso, as evidências de efeitos aditivos entre AA e os ácidos graxos foram
observadas, uma vez que o AA potencializou os efeitos inibitórios do AO e AD sobre a
atividade do complexo IV em diferentes estruturas. Observou-se também que o AO, AD e AA,
sozinhos ou associados, inibiram a atividade da citrato sintase no cérebro, mas somente a
combinação do AD com AA inibiu a atividade da citrato sintase no fígado. Já a atividade da
succinato desidrogenase no córtex cerebral foi reduzida pelo AD isolado ou associado com
AA.
O presente estudo fornece evidências de que os AO e AD, os principais metabólitos
acumulados na MCADD, alteram a bioenergética mitocondrial e causam estresse oxidativo em
tecidos periféricos de ratos jovens. Esse estudo também demonstrou um efeito
sinérgico/aditivo entre o AO, DA e a amônia, prejudicando a bioenergética mitocondrial no
cérebro, fígado e músculo esquelético de ratos.
Palavras-chave: ácido octanóico; ácido decanóico; amônia; mitocôndrias; deficiência de
MCAD.
ABSTRACT
Medium-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency (MCADD) is the most frequent
fatty acid oxidation disorder, leading to the accumulation of octanoic (AO), and decanoic
(AD) acids. Affected patients present hypoketotic hypoglycemia, rhabdomyolysis,
hepatomegaly, hyperammonemia, seizures and lethargy, which may quickly progress to coma
and death. At present the pathophysiological mechanisms underlying tissues damage in
affected patients are poorly known. Therefore, in the present study we investigated the in vitro
effects of OA and DA in the absence or presence ammonium acetate (AA) on energy
metabolism and oxidative stress parameters in rat cerebral cortex, liver and skeletal muscle. It
was first verified that OA and DA decreased complex I-III, II-III and IV activities in liver, and
also inhibit complex IV activity in skeletal muscle. In addition, DA decreased complex II-III
activity in skeletal muscle. We also verified that OA and DA increased TBA-RS levels and
carbonyl content in both tissues. Finally, DA, but not OA, significantly decreased GSH levels
in rat skeletal muscle.
Moreover, we verified that AA inhibited complex II-III in liver, complex IV activity in
the brain, liver and skeletal muscle. On the other hand, AA increased complex II activity in
liver. Regarding the associations between AA and the fatty acids, we observed that inhibitions
of complex I-III and II in the brain and complex II in skeletal muscle were detected only when
DA plus AA were simultaneously present in the incubation medium, suggesting a synergistic
action between AA and DA. In addition, evidences for additive effects between AA and the
fatty acids were observed, since AA enhanced the effects of OA and DA on complex IV in the
different structures. observed that OA, DA and AA, per se or associated, inhibited sitrate
synthase activity in the brain, but only the combination of DA plus AA inhibited the same
enzyme activity in liver. On the other hand, citrate synthase activity was not affected by these
compounds in skeletal muscle. Succinate dehydrogenase activity was decreased by DA, but
AA failed to enhance this inhibition.
The present study provides evidence that OA and DA, the major metabolites
accumulating in MCADD, disturb mitochondrial bioenergetics and elicit oxidative stress in rat
peripheral tissues. This study also demonstrated evidence for a synergistic/additive effect
between OA, DA and ammonia impairing bioenergetics parameters in brain, liver and skeletal
muscle of rats.
Keywords: octanoic acid; decanoic acid; ammonia; mitochondria; MCAD deficiency
Lista de Figuras
Figura 1. Bloqueio de uma rota metabólica ...........................................................
15
Figura 2. Efeitos dos ésteres de CoA sobre a síntese da uréia ..............................
22
Figura 3. Destinos da glicose .................................................................................
28
Figura 4. Ciclo de Krebs ........................................................................................
29
Figura 5. Cadeia respiratória mitocondrial ............................................................
31
Lista de Abreviaturas
AD – Ácido decanóico
AcD – Ácido cis-4-decenóico
AO – Ácido octanóico
Acetil-CoA – acetil coenzima A
ATP – adenosina trifosfato
CK – creatina quinase
CO2 – gás carbônico
CoQ – coenzima Q
EIM – erros inatos do metabolismo
ERO – espécies reativas de oxigênio
ERN – espécies reativas de nitrogênio
FAD+ – flavina adenina dinucleotídeo (forma oxidada)
FADH2 – flavina adenina dinucleotídeo (forma reduzida)
GABA – ácido γ-aminobutírico
GTP – guanosina trifosfato
GSH – glutationa reduzida
H+ – próton
H2O – água
H2O2 – peróxido de hidrogênio
LCHAD – desidrogenases de 3-hidroxi-acil-CoA de cadeia longa
LDL – lipoproteína de baixa densidade (low density lipoprotein)
MCAD – desidrogenase de acil-CoA de cadeia média
NAD+ – nicotinamida adenina dinucleotídeo (forma oxidada)
NADH – nicotinamida adenina dinucleotídeo (forma reduzida)
NADPH – nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (forma reduzida)
NMDA – N-metil-D-aspartato
NO• – óxido nítrico
NOS – óxido nítrico sintase
O2 – oxigênio
O2•- – ânion superóxido
OCl- - ânion hipoclorito
1
O2 – oxigênio “singlet”
OH• – radical hidroxila
ONOO- – peroxinitrito
SDH – succinato desidrogenase
SOD – superóxido dismutase
Pi – fosfato inorgânico
PKC – proteína quinase C
SCAD – desidrogenases de acil-CoA de cadeia curta
SCHAD – desidrogenases de 3-hidroxi-acil-CoA de cadeia curta
SDH – succinato desidrogenase
SNC – Sistema nervoso central
VLCAD – desidrogenases de acil-CoA de cadeia muito longa
SUMÁRIO
I. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 14
1. Erros Inatos do Metabolismo ....................................................................................... 14
1.1. Histórico ....................................................................................................................... 14
1.2. Defeitos da Oxidação de Ácidos Graxos ..................................................................... 15
1.3. Deficiência da Desidrogenase de Acil-CoA de cadeia média (MCAD) ...................... 16
1.3.1. Metabólitos Acumulados nos pacientes com deficiência de MCAD ........................ 18
1.3.2. Aspectos Moleculares da deficiência de MCAD ....................................................... 18
1.3.3. Fisiopatologia da deficiência de MCAD .................................................................. 19
2. Hiperamonemia ............................................................................................................. 21
2.1. Hiperamonemia na deficiência de MCAD ................................................................... 22
2.2. Toxicidade da Amônia ................................................................................................. 23
3. Metabolismo Energético ............................................................................................... 27
3.1. Histórico ....................................................................................................................... 27
3.2. Destino da Glicose e Ciclo de Krebs ............................................................................ 27
3.3. Cadeia Respiratória e Fosforilação Oxidativa ............................................................. 30
3.4. Creatina Quinase .......................................................................................................... 32
4. Radicais Livres .............................................................................................................. 34
4.2. Defesa Antioxidante ..................................................................................................... 35
4.3. Estresse Oxidativo ....................................................................................................... 36
II. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 39
Objetivo Geral ..................................................................................................................... 39
Objetivos Específicos .......................................................................................................... 39
III. RESULTADOS ............................................................................................................... 40
IV. DISCUSSÃO .................................................................................................................... 83
V. REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 90
PARTE I - INTRODUÇÃO
1. Erros Inatos do Metabolismo
1.1. Histórico
Em 1908, Sir Archibald E. Garrod usou o termo erros inatos do metabolismo (EIM)
para designar doenças como a alcaptonúria, em que os indivíduos afetados excretam grandes
quantidades de ácido homogentísico na urina. Garrod observou uma maior frequência desta
doença em indivíduos de uma mesma família e maior incidência de consanguinidade entre os
pais dos pacientes. Baseando-se nas leis de Mendel e no fato de que os pais dos indivíduos
afetados não apresentavam a doença, Garrod propôs um modelo de herança autossômica
recessiva para este distúrbio. Através da observação de que o ácido homogentísico presente
em excesso na urina dos pacientes era um metabólito normal da degradação protéica, ele
relacionou este acúmulo a um bloqueio na rota de catabolismo da tirosina. Com o surgimento
de novos distúrbios relacionados a alterações genéticas e que envolviam o acúmulo de outras
substâncias nos líquidos biológicos dos pacientes, postulou-se que estas doenças resultavam
da síntese qualitativa ou quantitativamente anormal de uma proteína, enzimática ou não,
pertencente ao metabolismo (Scriver et al., 2001). Presumiu-se, então, que em consequência
deste bloqueio metabólico pode ocorrer o acúmulo de precursores da reação catalisada pela
enzima envolvida, com a formação de rotas metabólicas alternativas e a deficiência de
produtos essenciais ao organismo (Bickel, 1987).
14
Figura 1. Bloqueio de uma rota metabólica (Adaptado de Scriver et al., 2001).
Até o momento foram descritos mais de 500 EIM, a maioria deles envolvendo
processos de síntese, degradação, transporte e armazenamento de moléculas no organismo
(Scriver et al., 2001). Embora individualmente raras essas doenças em seu conjunto afetam
aproximadamente 1 a cada 500/2.000 recém nascidos vivos (Baric et al., 2001).
1.2. Defeitos de Oxidação de Ácidos Graxos
A beta-oxidação mitocondrial de ácidos graxos é uma fonte de energia muito
importante para a síntese de ATP, principalmente em períodos de jejum, já que este processo
gera acetil-coenzima A (acetil-CoA) e energia na forma de ATP. A rota de oxidação dos
ácidos graxos é complexa e inclui muitos passos: captação celular de ácidos graxos, ativação
desses mesmos ácidos graxos a ésteres acil-CoA, trans-esterificação a acilcarnitinas,
translocação através da membrana mitocondrial, re-esterificação a acil-CoA, e a espiral da
beta-oxidação intramitocondrial, que fornece elétrons para flavoproteínas transferidoras de
elétrons e acetil-CoA. Cada etapa da espiral de oxidação é catalisada por enzimas específicas
para o comprimento da cadeia carbônica do ácido graxo (Smith et al., 2005).
Na década de setenta foram descritos os primeiros erros inatos do metabolismo
atribuídos a defeitos na oxidação dos ácidos graxos em pacientes com astenia ou rabdomiólise
15
induzida por exercício. Pouco tempo depois foi descrita a deficiência sistêmica de carnitina e,
em 1982, a deficiência da desidrogenase de acil-CoA de cadeia média (MCADD) foi
diagnosticada em pacientes que apresentavam descompensação metabólica com sintomas
neurológicos durante o jejum (Kolvraa et al., 1982). Atualmente, já estão descritas pelo menos
23 diferentes entidades clínicas dentro deste grupo de doenças, incluindo defeitos no
transporte de carnitina na membrana plasmática, nas enzimas carnitina palmitoiltransferase I e
II, carnitina/acilcarnitina translocase, nas desidrogenases de acil-CoA de cadeia muito longa
(VLCAD), média (MCAD) e curta (SCAD), na 2,4-dienoil-CoA redutase e nas
desidrogenases de 3-hidroxi-acil-CoA de cadeia longa (LCHAD) e curta (SCHAD), bem
como na proteína trifuncional mitocondrial (Roe & Ding, 2001).
Acredita-se que a prevalência dessas doenças seja subestimada, visto que seu
diagnóstico depende da detecção dos metabólitos acumulados por métodos sofisticados e
equipamentos de alto custo que poucos laboratórios possuem (Walker, 1994). Além disso,
devido à semelhança do quadro clínico, uma parte considerável dos pacientes afetados por
defeitos de oxidação de ácidos graxos é diagnosticada erroneamente como síndrome de morte
súbita da infância, infecção bacteriana aguda (sepse), síndrome de Reye, fígado gorduroso da
gravidez ou síndrome de vômito cíclico (Rinaldo et al., 1998).
Dentre os defeitos de beta-oxidação, a MCADD é o mais frequente destes distúrbios,
com uma prevalência similar à da fenilcetonúria, o mais frequente erro inato do metabolismo.
1.3. Deficiência de Desidrogenase de Acil-CoA de Cadeia Média (MCAD)
A MCADD é um defeito hereditário metabólico de herança autossômica recessiva
cujos primeiros sinais clínico-laboratoriais geralmente aparecem entre os primeiros dias de
vida até os seis anos de idade (Wilcken et al., 2007), podendo, no entanto, ocorrer na fase
16
adulta (Ruitenbeek et al., 1995). Os pacientes afetados pela MCADD geralmente são
assintomáticos e os sintomas são precipitados por períodos de jejum ou de outras formas de
estresse metabólico, usualmente associadas a infecções virais ou bacterianas ou mesmo à
vacinação (Derks et al., 2006). Pacientes afetados pela MCADD apresentam uma
sintomatologia muito variada, incluindo episódios de vômitos, letargia, apnéia e coma,
podendo levar à morte súbita (Grosse et al., 2006). Podem também apresentar atraso no
desenvolvimento psicomotor, rabdomiólise, paralisia cerebral, retardo no crescimento,
problemas comportamentais e déficit de atenção (Roe & Ding, 2001). Durante as crises mais
graves o coma, muitas vezes acompanhado de convulsões, e a hiperamonemia com disfunção
hepática são frequentes (Ruitenbeek et al., 1995).
Os principais achados neuropatológicos dos pacientes com MCADD são microcefalia,
edema cerebral e anomalias no lobo frontal (Egidio et al., 1989; Maegawa et al., 2008). Em
muitos casos ocorre acúmulo microvesicular de lipídeos no fígado, similar ao acúmulo
observado em pacientes com síndrome de Reye (Roe & Ding, 2001). Também pode ocorrer
rabdomiólise, acúmulo microvesicular de lipídeos entre as miofibrilas e de glicogênio
detectados por biópsia muscular (Ruitenbeek et al., 1995).
Se não diagnosticados precocemente, 20 a 25% dos pacientes afetados pela MCADD
morrem durante o primeiro episódio de crise metabólica (Grosse et al., 2006), enquanto o
risco de sofrer uma crise fatal estende-se por toda a vida (Roe & Ding, 2001).
17
1.3.1. Metabólitos Acumulados nos Pacientes com Deficiência de MCAD
O defeito no catabolismo de ácidos graxos de cadeia média ocasiona o acúmulo destes
ácidos graxos e seus derivados que, principalmente durante os períodos de crise, encontram-se
muito aumentados no sangue e em outros tecidos, bem como na urina dos pacientes. Os
principais metabólitos acumulados são os ácidos graxos de cadeia média octanoato, decanoato
e cis-4-decenoato. Outro achado comum na doença é a elevação da concentração urinária de
hexanoilglicina, fenilpropionilglicina e suberilglicina (Costa et al., 2000).
1.3.2. Aspectos Moleculares da Deficiência de MCAD
A MCADD é uma doença autossômica recessiva, cuja mutação mais comum é uma
mutação ponto que resulta na substituição de lisina por ácido glutâmico no aminoácido 329 do
precursor da MCAD (K329E). Isso ocorre devido à adição de um nucleotídeo adenina (na
posição 985) no lugar de guanina no gene da MCAD (c.985A>G), mutação responsável por
aproximadamente 80-90% dos alelos mutantes em caucasianos. Deve-se considerar também
que o desenvolvimento dos sintomas deve ser influenciado pelo grau de estresse metabólico e
a combinação de fatores, tais como infecção e jejum (Matsubara et al., 1992). Por outro lado,
mais recentemente tem-se tentado correlacionar o tipo de mutação envolvida na doença com o
acúmulo de metabólitos nos pacientes, sendo que aparentemente a presença da mutação
c.985A>G parece estar correlacionada a maiores níveis de acúmulo neonatal de
octanoilcarnitina no plasma bem como de acilglicinas na urina. Além disso, as mutações
c.985A>G e c.583G>A parecem resultar em maior severidade, enquanto que a mutação
c.199T>C está associada a sintomas menos severos da doença (Waddell et al., 2006).
18
1.3.3. Fisiopatologia na Deficiência de MCAD
A síntese diminuída de corpos cetônicos durante o jejum é uma característica da
MCADD, fazendo com que aumente a importância da glicose sanguínea como fonte de
energia celular, ocasionando hipoglicemia nos pacientes. Outra consequência da nãoutilização dos ácidos graxos de cadeia média na síntese de corpos cetônicos é o acúmulo de
acil-CoA de ácido graxo de cadeia média dentro das mitocôndrias. Eleva-se então a razão
acil-CoA:CoA, causando a inibição das enzimas piruvato desidrogenase e α-cetoglutarato
desidrogenase, que utilizam coenzima A como substrato. Assim, ocorre diminuição da
conversão do piruvato a acetil-CoA e diminuição na velocidade do ciclo de Krebs, visto que a
síntese do citrato e a conversão do α-cetoglutarato a sucinil-CoA também estão diminuídas.
Além disso, a sucinil-CoA ligase é inibida pelo ácido octanóico e também por intermediários
de acil-CoA. Com a baixa produção de acetil-CoA, há diminuição da síntese de citrato, o
citrato por sua vez é precursor de malato, substância necessária para a produção de glicose,
via gliconeogênese, e precursor de malonil-CoA, o principal regulador inibitório da carnitina
palmitoil transferase I, enzima responsável pela entrada de ácidos graxos de cadeia longa na
mitocôndria. Portanto, a diminuição dos níveis de citrato ocasionada pelo acúmulo do
octanoato e outros ácidos graxos na MCADD provoca também uma diminuição da
gliconeogênese e um aumento da entrada de ácidos graxos de cadeia longa na mitocôndria, o
que deve ser um agravante para a hipoglicemia e deve provocar o acúmulo de derivados de
acil-CoA graxos nos pacientes (Roe & Ding, 2001). Além disso, com a pouca disponibilidade
de substratos energéticos, há uma exacerbação de processos catabólicos, dentre os quais
podemos salientar a proteólise. Com a grande degradação de proteínas e utilização de
aminoácidos como substratos energéticos, há uma maior liberação de amônia, produto
resultante da degradação de aminoácidos (Smith et al., 2005), que apresenta alta toxicidade
19
para os tecidos em geral, em especial para o sistema nervoso central (SNC) (Felipo &
Butterworth, 2002).
Por outro lado, acredita-se que o quadro de letargia, que pode evoluir a coma e morte,
seja devido, particularmente, ao acúmulo de ácidos graxos de cadeia média e seus derivados
(Gregersen et al., 2008). Até o presente momento, poucos estudos foram realizados sobre os
efeitos tóxicos dos ácidos graxos de cadeia média acumulados na MCADD. Foi demonstrado
que o octanoato causa um aumento do consumo de oxigênio (O2) e produção de monóxido de
carbono (CO2), sem causar um correspondente aumento na produção de ATP em fígado de
ratos (Berry et al., 1983; Scholz et al., 1984). Além deste, outros efeitos têm sido atribuídos
ao octanoato, quando testado in vitro, como inibição do controle do volume de astrócitos e da
Na+,K+-ATPase em cultura de células gliais (Olson et al., 1989), que poderiam estar
relacionados ao edema cerebral observado na deficiência de MCAD e também na síndrome de
Reye, ambas caracterizadas por acúmulo de octanoato nos tecidos dos pacientes afetados. Foi
também demonstrado que o octanoato e o decanoato são inibidores do transporte de ácidos
orgânicos através do plexo coróide em coelhos. Os autores do trabalho sugeriram que tal
efeito poderia impedir a depuração do octanoato e compostos relacionados, contribuindo para
o acúmulo desses compostos no cérebro e no líquido cerebroespinhal e para a encefalopatia
das doenças em que essas substâncias se acumulam (Kim et al., 1983).
Mais recentemente, foi demonstrado que os ácidos octanóico (AO), decanóico (AD) e
cis-4decenóico (AcD) inibem in vitro importantes parâmetros do metabolismo energético em
cérebro de ratos jovens, incluindo as atividades de complexos da cadeia respiratória, da
creatina quinase e Na+,K+-ATPase, bem como a
produção de
14
CO2 a partir de [U-
14
C]glicose, [1-14C]acetato e [U-14C] citrato (de Assis et al., 2003; 2006; Reis de Assis et al.,
2004). Também foi demonstrado recentemente que esses mesmos compostos induzem
estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens (Schuck et al., 2007; 2009a).
20
Enfatize-se que, apesar de se ter investido muito no estudo dos defeitos da oxidação de
ácidos graxos com evidentes progressos no diagnóstico da maioria delas, poucas informações
estão disponíveis na literatura internacional sobre a etiopatogenia do dano neurológico nos
pacientes afetados por essas doenças (Lund et al., 2003). Assim, a expectativa é de que
estudos bioquímicos, como o presentemente proposto, sejam levados a efeito para clarificar a
associação do defeito genético e dos sintomas dos pacientes nos distúrbios propostos com a
finalidade precípua de contribuir mais decisivamente para o tratamento dos portadores dessas
doenças.
Neste contexto, apesar dos sintomas dos pacientes afetados pela MCADD piorarem
subitamente durante ou após crises metabólicas em que há exacerbação dos processos
catabólicos, levando uma parte deles a degeneração aguda ou crônica de estruturas cerebrais
durante esses episódios, praticamente nada tem-se investigado sobre a etiopatogenia da
disfunção neurológica e dano cerebral que acomete os indivíduos afetados pela MCADD
nestas situações de estresse metabólico. É possível que o acúmulo maior dos produtos tóxicos
nesses distúrbios durante as crises de descompensação metabólica possa ter um papel
importante na fisiopatologia dos danos apresentados pelos pacientes, embora não se possa
afastar a possibilidade de que um déficit de energia primário causado por hipoglicemia ou
pela impossibilidade de degradar ácidos graxos seja responsável por parte desse dano.
2. Hiperamonemia
A amônia é uma substância proveniente do metabolismo dos compostos nitrogenados,
sendo produto e/ou precursor de importantes compostos (Lehninger et al., 2007). Este
metabólito possui um papel importante na manutenção da homeostase do nitrogênio nos
21
organismos vivos, mas quando em altas concentrações se torna extremamente tóxico,
principalmente para o SNC (Cooper & Plum, 1987).
2.1. Hiperamonemia na deficiência da MCAD
A MCADD é clinicamente caracterizada por alterações no SNC, fígado e músculo
esquelético e cardíaco, ocorrendo principalmente após situações de estresse metabólico
associado a catabolismo exacerbado. Desta forma, a hiperamonemia é um dos achados
clínicos encontrados em pacientes com a MCADD (Ruitenbeek et al., 1995). Segundo Fenton
& Rosenberg (1995), ésteres de CoA inibem diretamente a enzima carbamil fosfato sintetase
I, enzima responsável pelo primeiro passo do ciclo da uréia. Um bloqueio na síntese da uréia
resulta num acúmulo de amônia, justificando a hiperamonemia apresentada por estes
pacientes. Além disso, com a grande degradação de proteínas e utilização de aminoácidos
como substratos energéticos, há uma maior liberação de amônia, produto resultante da
degradação de aminoácidos (Smith et al., 2005).
Figura 2: Efeitos dos ésteres de CoA sobre a síntese da uréia (Adaptado de Fenton & Rosenberg, 1995) .
22
A hiperamonemia é causa primária da neurotoxicidade em uma gama de doenças,
principalmente aquelas associadas à insuficiência hepática (Stewart & Walser, 1980; Smeltzer
& Bare, 1996), levando a dificuldades motoras, alterações comportamentais, convulsões,
coma e morte. Além disso, os pacientes que possuem níveis séricos elevados de amônia
podem apresentar diarréia, vômitos e acidose metabólica (Smeltzer & Bare, 1996).
Os mecanismos de neurotoxicidade da amônia ainda não estão bem esclarecidos.
Entretanto, existem evidências de que os distúrbios provocados pela amônia no SNC sejam
decorrentes da combinação de alterações bioquímicas, morfológicas, energéticas e físicoquímicas, tais como alterações no pH celular e consequente modificações na estrutura celular,
principalmente em astrócitos (Dolinska et al., 1996; Drewes & Leino, 1985; Noremberg et al.,
1991), alterações no metabolismo de alguns neurotransmissores (Felipo et al., 1994; Zhou et
al., 1999), produção de radicais livres (Kosenko et al., 1999) e possível depleção de alguns
intermediários do ciclo de Krebs e depleção de ATP (Cooper & Plum, 1987; Lai & Cooper,
1991; Felipo et al., 1994).
2.2. Toxicidade da Amônia
Os efeitos tóxicos provocados pela amônia parecem estar relacionados àqueles
envolvidos na neurotoxicidade glutamatérgica, uma vez que concentrações elevadas de
amônia induziram um aumento nos níveis extracelulares de glutamato por inibir a sua
captação (Felipo et al., 1994; Zhou & Noremberg, 1999), o acúmulo extracelular deste
neurotransmissor ativa receptores gtlutamatérgicos do tipo NMDA, levando à abertura dos
canais de íons a ele associados, permitindo o influxo neuronal de íons Ca+2 e Na+ (Lai &
Cooper, 1991; McDonald & Schoepp, 1993). Kosenko & colaboradores (2000) demonstraram
que a administração de amônia em ratos induziu uma importante alteração na homeostase de
23
cálcio nas células do SNC, levando a um rápido aumento no conteúdo de cálcio
intramitocondrial, seguido por uma redução na capacidade e na taxa de captação desse íon,
além de aumentar o efluxo espontâneo deste íon da mitocôndria para o citosol. O aumento
intracelular de cálcio permite a ativação de algumas enzimas dependentes deste íon e de
outros mecanismos que desencadeiam injúria neuronal (Brorson et al., 1995; Pavlakovic et al.,
1995).
Kosenko & colaboradores (1995) demonstraram que administração de compostos que
previnem a toxicidade glutamatérgica do tipo NMDA, como os inibidores da enzima óxido
sintetase, atenuaram a toxicidade e as alterações nos metabólitos cerebrais provocadas pela
amônia. A nitroarginina, um inibidor da óxido nítrico sintetase (NOS), preveniu parcialmente
a morte dos animais, a depleção de ATP, o aumento no conteúdo da glicose, o aumento de
lactato e piruvato e o decréscimo no conteúdo de glicogênio. No entanto não preveniu o
aumento dos níveis de glutamina e a diminuição de glutamato. Estes dados sugerem o
envolvimento da produção de óxido nítrico via ativação de receptores NMDA nos efeitos
tóxicos causados pela amônia. Entretanto, estudos demonstram que o mecanismo de
toxicidade da amônia não está exclusivamente ligado aos efeitos mediados pelo receptor
NMDA, mas que a ativação deste receptor é um passo essencial no processo que levará a
depleção de ATP e morte (Marcaida et al., 1992; Kosenko et al., 1994; Felipo et al., 1994).
Um dos achados mais importantes nos estados de hiperamonemia é a depleção de
ATP. Recentemente foi proposto que a depleção de ATP é decorrente da ativação da enzima
Na+,K+-ATPase, induzida pela amônia (Felipo et al., 1994; Ratnakumari et al., 1995).
Kosenko & colaboradores (1994) demonstraram que a amônia induziu uma ativação da
enzima Na+,K+-ATPase, e que o MK-801 preveniu completamente este aumento, indicando
que este evento estava relacionado com ativação de receptores NMDA, e que poderia estar
envolvido na depleção de ATP. Foi proposto que a amônia pudesse ter influência sobre a
24
fosforilação desta ATPase pela proteína quinase C (PKC) ou sobre a desfosforilação desta
enzima por uma fosfotase (Felipo et al., 1993).
Além disso, a depleção de ATP pela amônia também foi associada a incorporação dos
grupos amônio ao α-cetoglutarato, glutamato e glutamina, em uma sequência de reações que
culminaram no consumo de ATP pela glutamina sintetase. Além do consumo de ATP pela
glutamina sintetase, o seqüestro do α-cetoglutarato provavelmente resultaria em uma
interferência no funcionamento do ciclo de Krebs, já que este é um intermediário desse ciclo,
prejudicando assim a formação do ATP (Hertz & Kala, 2007).
Além das teorias já citadas para a depleção de ATP, alguns trabalhos demonstraram
que a amônia influência diretamente o funcionamento do ciclo de Krebs, uma vez que este
composto inibe algumas enzimas importantes deste ciclo, como a α-cetoglutarato
desidrogenase e a isocitrato desidrogenase (Lai & Cooper, 1986; Siegel et al., 1994). Outra
hipótese sugeriu que a amônia pudesse causar uma inibição da lançadeira de elétrons malatoaspartato, uma vez que a diminuição no nível de glutamato total pode comprometer o
funcionamento desta lançadeira pela diminuição do fluxo de elétrons, e consequente causar
uma interferência no metabolismo energético (Fitzpatrick et al., 1983). Segundo Siegel &
colaboradores (1994) ratos com hiperamonemia apresentam as relações de lactato/piruvato e
NADH/NAD+ citoplasmáticas aumentadas, indicando assim que pode existir um
comprometimento no funcionamento da lançadeira de elétrons, através de uma diminuição na
translocação do glutamato-aspartato e pelo decréscimo nas atividades das aspartato
aminotransferases, principalmente a mitocondrial.
Por outro lado, estudos demonstraram que a amônia também interfere no metabolismo
da glicose. Muntz & Hurwitz (1951) verificaram que a amônia estimula a glicólise em
extratos cerebrais. A partir destes resultados os autores sugeriram que a amônia desinibia ou
ativava a fosfofrutoquinase, uma das enzimas marca-passo da via glicolítica in vivo e in vitro.
25
Uma desinibição ou ativação dessa enzima pode estimular a utilização de glicose, fato esse
observado em animais que apresentaram hiperamonemia aguda (Hawkins et al., 1973; James
et al., 1974). Outra evidência que indica a interferência da amônia sobre a glicólise é o
aumento nos níveis de lactato cerebral e a relação lactato/piruvato de animais
hiperamonêmicos (Duffy et al., 1972; Lai et al., 1986).
Além dos mecanismos já descritos para a toxicidade da amônia, acredita-se que este
composto cause prejuízo na função mitocondrial através da produção de radicais livres.
Alguns estudos demonstraram que a amônia provocou uma diminuição na atividade das
enzimas antioxidantes e um aumento na produção de radicais superóxido no cérebro
(Kosenko et al., 1997).
Embora as causas das disfunções neurológicas provocadas pela amônia não sejam
totalmente conhecidas, acredita-se que parte das alterações ocorridas nas células do SNC seja
decorrente, além das alterações já citadas, do acúmulo de água, já que altos níveis de amônia
induzem um grande acúmulo mitocondrial de glutamina no cérebro (Dolinska et al., 1996),
um metabólito que promove retenção de água, causando assim um edema celular que aparece
principalmente nos astrócitos, embora algumas alterações possam ocorrer nos neurônios
(Drewes & Leino, 1985; Noremberg et al., 1991).
Drewes & Leino (1985) demonstraram que a exposição aguda a amônia e ao ácido
octanóico causou dano nos corpos celulares dos neurônios em preparações de cérebro de cães.
Neste estudo foi verificado que as mitocôndrias dos neurônios se apresentam alteradas e,
apesar do edema, as mitocôndrias dos astrócitos pareciam normais. A partir destas
observações, os autores concluíram que além dos astrócitos, os neurônios também podem
sofrer alterações nas síndromes hiperamonêmicas.
26
3. Metabolismo Energético
3.1. Histórico
Hans Krebs propôs, em 1937, uma série de reações do metabolismo intermediário dos
carboidratos. Atualmente, o ciclo proposto por Krebs leva o seu nome. Há aproximadamente
meio século, Kennedy e Lehninger descobriram que as mitocôndrias contêm as enzimas do
ciclo de Krebs e as enzimas de oxidação dos ácidos graxos, além dos complexos respiratórios.
Alguns anos depois, Palade e Sjonstrand, através de microscopia eletrônica, mostraram que a
mitocôndria apresenta duas membranas, uma externa e uma interna, muito dobrada. Em 1961,
Peter Mitchell propôs a teoria quimiosmótica, sugerindo que o transporte de elétrons e a
síntese de ATP estão acoplados a um gradiente de prótons na membrana mitocondrial interna.
Mitchell sugeriu que bombas de prótons criariam este gradiente de prótons, que seria a força
motriz para a síntese de ATP (Berg et al., 2008).
3.2 Destinos da glicose e Ciclo de Krebs
Os seres vivos precisam de energia para realizar várias funções, como, por exemplo, o
transporte ativo de íons e moléculas, neurotransmissão, síntese de macromoléculas e outras
biomoléculas a partir de precursores simples e para a contração muscular. A energia
necessária para realizar essas funções é obtida com a oxidação de substâncias pela respiração
celular. O ATP é o principal combustível da célula na maioria dos processos que precisam de
energia, sendo a energia liberada pela hidrólise de ATP, que impulsiona uma série de reações
(Lehninger et al., 2007)
27
A glicose é a principal fonte de energia utilizada pela maioria das células e ocupa uma
posição central no metabolismo. Ela é transportada para dentro das células por proteínas
transportadoras especificas, e ao entrar na célula, a glicose pode ser metabolizada em
diferentes rotas metabólicas. No entanto, a principal via de degradação da glicose é a
glicólise. Esta via é composta por uma sequência de 10 reações enzimáticas, cuja função no
metabolismo energético é fornecer parte da energia utilizada pelos organismos; este processo
ocorre no citoplasma e tem como produto final o piruvato (Lehninger et al., 2007; Berg et al.,
2008). Uma molécula de glicose gera duas moléculas de piruvato e de ATP. Além disso, a
glicose pode participar do ciclo das pentoses, que tem como objetivo formar NADPH, um
doador de elétrons de fundamental importância para as biossíntesses redutoras, e ribose-5fosfato, precursor da biossíntese de nucleotídios. Quando a célula está com elevados níveis de
ATP, a glicose pode ser armazenada na forma de glicogênio, que pode ser liberado e utilizado
rapidamente se a célula necessitar de energia (Clark et al., 1993; Lehninger et al., 2007; Berg
et al., 2008).
Figura 3. Destinos da glicose (Nelson & Cox, 2000).
Em organismos superiores, o piruvato, formado na glicólise a partir de glicose, pode
seguir duas rotas metabólicas distintas. No metabolismo anaeróbico, o piruvato apresenta dois
28
caminhos. Primeiro, e mais comum, o piruvato é reduzido a lactato pela lactato desidrogenase,
formando ATP e consumindo NADH. Segundo, nos organismos capazes de fazer fermentação
alcoólica, o piruvato perde dióxido de carbono produzindo acetoaldeído, que então será
reduzido a etanol. No metabolismo aeróbico, o piruvato é transportado para dentro da
mitocôndria e sofre ação do complexo enzimático da piruvato desidrogenase formando acetilCoA, que seguirá para o ciclo Krebs (Lehninger et al., 2007; Berg et al., 2008).
O ciclo de Krebs ocorre na matriz mitocondrial, onde uma molécula de acetil-CoA é
completamente oxidada a CO2, através de uma série de reações composta por oito passos,
onde cada um é catalisado por enzimas diferentes (Lehninger et al., 2007; Berg et al., 2008).
O ciclo de Krebs começa e termina com oxaloacetato e consiste de uma sequência de reações
onde, em cada volta do ciclo, são formadas três moléculas de NADH, uma de FADH2, duas
de CO2 e uma de GTP. O NADH e FADH2 produzidos no ciclo de Krebs são carreadores de
elétrons que serão posteriormente utilizados na cadeia transportadora de elétrons para a
produção de ATP na fosforilação oxidativa (Marks et al., 1996; Lehninger et al., 2007; Berg
et al., 2008).
Figura 4. Ciclo de Krebs (Nelson & Cox, 2000).
29
Altos níveis de ATP inibem o ciclo de Krebs por mecanismos complementares em
vários locais do ciclo. Um dos pontos de controle é a conversão de piruvato a acetil-CoA pela
enzima piruvato desidrogenase, inibida por ATP, acetil-CoA e NADH (Smith et al., 2005;
Lehninger et al., 2007; Berg et al., 2008).
3.3. Cadeia respiratória e fosforilação oxidativa
A cadeia respiratória e a fosforilação oxidativa, assim como o ciclo de Krebs, ocorrem
nas mitocôndrias. A cadeia respiratória é formada por uma série de complexos protéicos, onde
ocorre a transferência de elétrons doados por NADH e FADH2. O fluxo de elétrons do NADH
e FADH2 até O2 se da através de complexos enzimáticos ancorados na membrana
mitocondrial interna, essa transferência de elétrons é impulsionada por um crescente potencial
redox entre as coemzimas NADH e FADH2, os complexos enzimáticos e oxigênio, o aceptor
final da cadeia respiratória (Lehninger et al., 2007; Berg et al., 2008).
A cadeia respiratória é composta de quatro complexos (I, II, III e IV). O complexo I,
conhecido como NADH desidrogenase ou NADH: ubiquinona oxidorredutase, transfere
elétrons do NADH para a ubiquinona, formando ubiquinol. Essa reação faz com que dois
prótons sejam bombeados para o espaço intermembrana. O complexo II, também denominado
de succinato: ubiquinona oxirredutase, é formado pela enzima succinato desidrogenase (SDH)
e três subunidades hidrofóbicas. Esse complexo participa do ciclo de Krebs e transfere
elétrons do succinato para a ubiquinona e também forma ubiquinol. O complexo III, ou
citocromo c oxirredutase, transfere elétrons do ubiquinol para o citocromo c, reação que serve
para o bombeamento de mais quatro prótons para o espaço intermembrana. O complexo IV,
mais conhecido como citocromo c oxidase, transfere elétrons do citocromo c reduzido para o
30
oxigênio, reduzindo-o a H2O. Nessa etapa os últimos dois prótons são bombeados (Wallace,
1999; Murray, 2002; Voet et al., 2008).
O gradiente eletroquímico formado pelo bombeamento de prótons durante a cadeia
respiratória mitocondrial é utilizado como força-motriz para o complexo V, ou ATP sintase,
formar ATP (fosforilação oxidativa). Dessa forma, a oxidação de substratos energéticos está
acoplada ao processo de fosforilação do ADP, ou seja, quando o potencial de membrana é
dissipado pelo fluxo de prótons a favor do gradiente eletroquímico, a energia liberada é
utilizada pela ATP sintase, que atua como uma bomba de prótons ATP-dependente
(Lehninger et al., 2007).
Figura 5. Cadeia respiratória mitocondrial (Nelson & Cox, 2000).
Além da regeneração do ATP, a mitocôndria é a principal fonte de espécies reativas de
oxigênio e de defesas antioxidantes nas células (Cadenas & Davies, 2000), gerando ânions
31
superóxido no espaço intermembrana pelo vazamento de elétrons que se combinam com
oxigênio molecular no complexo III em um processo que é dependente do potencial de
membrana, e na matriz, através do complexo I (Han et al., 2001). Além disso, a mitocôndria
participa ativamente da homeostase de cálcio (Nicholls & Akerman, 1982). Neste contexto,
alterações na função mitocondrial levam a uma rápida queda na produção de energia e morte
celular (Ankarcrona et al., 1995). Além disso, a diminuição do metabolismo energético pode
levar a apoptose através da liberação de citocromo c (Liu et al., 1996; Heales et al., 1999).
A redução de produção de energia no cérebro pode comprometer a síntese se
neurotransmissores (acetilcolina, glutamato, aspartato e GABA) e lipídios nesse tecido e
pode, por isso, levar ao dano neuronal (Di Donato, 2000). Acredita-se que a diminuição no
metabolismo energético pode estar envolvido na fisiopatologia de diversas doenças
neurodegenerativas, incluindo doença de Alzheimer, Parkinson, Huntington, isquemia
cerebral e esclerose amiotrófica lateral (Brennan et al., 1985; Beal et al., 1992; Heales et al.,
1999; Blass, 2001), e também de vários erros inatos do metabolismo (Schuck et al., 2002;
Reis de Assis et al., 2004; Latini et al., 2005; Ferreira et al., 2007; Viegas et al., 2008).
3.4 Creatina quinase
Outra forma de produção de ATP é a partir da enzima creatina quinase (CK). Esta
enzima foi descoberta em extratos de músculos por Karl Lohman, em 1934 (Wallimann et al.,
1992). A CK é uma enzima que possui um papel central no metabolismo energético,
principalmente para tecidos com alta demanda energética, como cérebro, músculo cardíaco e
esquelético, onde funciona como um efetivo sistema de tampão para os níveis celulares de
ATP, sendo assim é uma enzima crucial para a homeostase energética (Pilla et al., 2003). A
reação da CK catalisa a transferência metabolicamente reversível do grupamento N-fosforil da
32
fosfocreatina para o ADP, regenerando o ATP (Wyss & Kaddurah-daouk, 2000; Pilla et al.,
2003; Berg et al., 2008).
Esta enzima possui cinco isoenzimas, três citoplasmáticas e duas mitocôndrias. As
isoenzimas citoplasmáticas são compostas por dois tipos de subunidades, a M de “muscle” e a
B de “brain”; os nomes são em função dos lugares de onde foram primeiramente isoladas.
Essas isoenzimas são conhecidas como CK-MM, encontrada no músculo esquelético, CK-BB,
encontrada no cérebro e CK-MB, encontrada no músculo cardíaco (Eppemberg et al., 1967;
Wallimann et al., 1992).
A CK consiste de dois domínios, um pequeno domínio de natureza α-helicoidal e um
amplo domínio contendo uma lâmina β antiparalela produzida por oito intermitências
franqueadas por sete α-hélices, o seu local ativo está localizado entre os dois domínios e é
coberto por resíduos que são conservados dentro da família CK. Além disso, as isoenzimas da
CK possuem no seu local ativo um grupo sulfidril que é altamente reativo, desta forma este
grupo pode ser uma maneira tanto para inibir a ativação da CK como proteger contra o dano
irreversível durante períodos de estresse oxidativo, entretanto as isoenzimas da CK foram
identificadas como alvos primários da modificação e inativação irreversível pelas espécies
reativas de oxigênio (Wyss & Kaddurah-daouk, 2000).
O sistema creatina quinase/creatina /fosfocreatina mostra diferentes funções integradas
em células cerebrais, isto é, tamponamento de energia, capacidade metabólica, transferência
de energia e controle metabólico. Desta forma este sistema é reconhecido como um regulador
metabólico importante entre a saúde e a doença (Pilla et al., 2003). A CK parece estar
envolvida em certas condições patológicas relacionadas com déficit de energia cerebral, foi
postulado que o prejuízo na função da CK possa ter um papel crítico no processo
neurodegenerativo que leva à perda neuronal. Além disso, a baixa atividade desta enzima está
33
associada a doenças neurodegenerativas, como por exemplo, isquemia cerebral, transtorno
bipolar, doença de Alzheimer e outros estados patológicos (Tomimoto et al., 1993).
4. Radicais Livres
Os radicais livres são definidos como qualquer espécie química capaz de existir de
forma independente e que contenha um ou mais elétrons desemparelhados. Por isso, são muito
reativos e atacam moléculas, como lipídios, proteínas e DNA. Dentre os radicais livres,
podem-se destacar dois grupos: as espécies reativas de oxigênio (ERO) e as de nitrogênio
(ERN). As ERO mais importantes são o ânion superóxido (O2•-), radical hidroxila (OH•),
peróxido de hidrogênio (H2O2), ânion hipoclorito (OCl-) e o oxigênio “singlet” (1O2). O óxido
nítrico (NO•) e o peroxinitrito (ONOO-) constituem as principais ERN (Halliwell &
Gutteridge, 1999).
Em condições fisiológicas do metabolismo celular aeróbico, o oxigênio molecular
sofre redução tetravalente, com aceitação de quatro elétrons resultando na formação de água.
Cabe a citocromo oxidase mitocondrial a função de acrescentar quatro elétrons em cada
molécula de oxigênio para gerar duas moléculas de água (Bergendri et al., 1999). Porém,
devido a uma forte configuração eletrônica, o oxigênio tem uma forte tendência a receber um
elétron de cada vez, formando compostos intermediários altamente reativos, como o radical
ânion superóxido e o radical hidroxil (Babior, 1997; Güinçin et al., 2004). O radical ânion
superóxido é formado pela redução do oxigênio molecular por apenas um elétron mediante
aporte de energia (Bowles & Crapo, 2002). Apesar do radical ânion superóxido não poder
atacar diretamente o DNA, lipídeos e proteínas (Halliwell & Gutteredge, 1999); ele é
altamente reativo, devendo ser removido rapidamente dos tecidos pela reação da dismutação
realizada pela enzima superóxido dismutase, em que dois ânions superóxido reagem entre si;
34
sendo um oxidado a oxigênio e outro reduzido a peróxido de hidrogênio (Bowles & Crapo,
2002; Forman & Torres, 2002).
As ERO ocorrem tanto em processos fisiológicos quanto em processos patológicos do
organismo. Fisiologicamente, essas espécies reativas apresentam diversas funções (Bergendi
et al., 1999). Assim, um aumento da liberação local de radicais livres pode ser benéfico, como
é o caso da liberação de radicais livres pelos neutrófilos, que podem atuar na defesa do
hospedeiro contra uma infecção (Delanty & Dichter, 1998; Halliwell & Gutteridge, 2007).
Participam ainda de processos de sinalização celular e também estão envolvidos na síntese e
regulação de algumas proteínas (Halliwell & Gutteridge, 2007).
Por outro lado, quando formadas em excesso, essas espécies altamente reativas têm o
potencial de oxidar moléculas (Maxwell, 1995). Com relação aos efeitos prejudiciais das
reações oxidantes ao organismo, os radicais livres podem promover lipoperoxidação, causar a
oxidação de lipoproteínas de baixa densidade (LDL), reagir com proteínas, levando à sua
inativação e consequente alteração de sua função, e reagir com o DNA e RNA, levando a
mutações somáticas e a distúrbios de transcrição (Delanty & Dichter, 1998), dentre outros
efeitos.
4.1. Defesas antioxidantes
Os antioxidantes podem ser definidos como substâncias que, em baixas concentrações
em relação ao substrato oxidável, retardam ou previnem a oxidação desse substrato. Desse
modo, os antioxidantes atuam como protetores da oxidação de biomoléculas por radicais
livres e impedem a propagação da reação em cadeia provocada pelos mesmos (Halliwell &
Gutteridge, 1999; Fang et al., 2002).
35
As principais defesas enzimáticas antioxidantes são a superóxido dismutase (SOD),
catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPX). Além disso, antioxidantes não-enzimáticos,
como a glutationa reduzida (GSH), tocoferol (vitamina E) e ácido ascórbico (vitamina C),
entre outros, auxiliam no combate às ERO. Os antioxidantes estão amplamente distribuídos
nos organismos vivos e constituem um sistema de defesa muito importante em condições
aeróbicas (Halliwell & Gutteridge, 1999; Fang et al., 2002).
4.2. Estresse oxidativo
Os radicais livres são formados normalmente no metabolismo celular. As defesas
antioxidantes, enzimáticas e não-enzimáticas, atuam contra a toxicidade dessas espécies e são
responsáveis pela manutenção da homeostase entre a produção e a eliminação de radicais
livres. No entanto, em determinadas condições patológicas pode haver um desequilíbrio entre
a produção de oxidantes e as defesas antioxidantes, favorecendo a ocorrência do estresse
oxidativo. Assim, o termo “estresse oxidativo” é usado para se referir à situação na qual a
geração de espécies reativas ultrapassa a capacidade das defesas antioxidantes disponíveis,
que pode resultar tanto de uma diminuição das defesas antioxidantes quanto de uma produção
aumentada de oxidantes, bem como da liberação de metais de transição ou a combinação de
quaisquer desses fatores (Bondy & Le Bel, 1993; Cadenas & Davies, 2000; Halliwell, 2006).
O estresse oxidativo pode promover adaptação, dano ou morte celular, onde a
adaptação ocorre quando as células podem tolerar um estresse oxidativo moderado, que
geralmente resulta em um aumento da síntese de sistemas de defesa antioxidante a fim de
restaurar o balanço oxidante/antioxidante. Apesar disso, nem sempre o estresse oxidativo
precisa envolver um aumento das defesas antioxidantes. No dano celular, o estresse oxidativo
pode danificar alvos moleculares (DNA, proteínas, carboidratos e lipídios) (Halliwell &
36
Gutteridge, 2007). A resposta à injúria pode ser reversível: a célula entra em um estado de
homeostase alterado temporário ou prolongado, que não leva à morte celular. Já a morte
celular pode ocorrer tanto por necrose quanto por apoptose. Na morte celular por necrose, a
célula incha e se rompe, liberando seu conteúdo para o meio extracelular. Pode haver a
liberação de antioxidantes, como a catalase e a glutationa reduzida, e também de próoxidantes, como os íons cobre e ferro e proteínas do grupo heme, agentes esses que podem
afetar as células adjacentes, podendo até mesmo induzi-las a um estresse oxidativo. Já na
apoptose, o mecanismo de morte celular programada é ativado e não há a liberação do
conteúdo celular (Halliwell & Gutteridge, 2007).
Todos os tecidos humanos são suscetíveis ao dano oxidativo. No entanto, o cérebro
parece ser especialmente sensível a este tipo de lesão. Uma razão importante para isso seria o
alto consumo de oxigênio apresentado por este tecido. Além disso, as membranas neuronais
apresentam grande quantidade de lipídios poliinsaturados, altamente suscetíveis a
lipoperoxidação. Ainda, a autooxidação de muitos neurotransmissores, como dopamina e
noradrenalina, gera espécies reativas, sendo que esta autooxidação pode ser acelerada pela
presença de ferro, amplamente distribuído no cérebro. Por fim, o tecido cerebral apresenta um
baixo nível de defesas antioxidantes (Halliwell & Gutteridge, 2007).
Existem evidências crescentes sugerindo que as espécies reativas desempenham um
papel importante na patogênese de muitas doenças, como diabetes, neoplasias, aterosclerose,
doenças inflamatórias e doenças neurodegenerativas, em particular a doença de Alzheimer, a
doença de Parkinson e a esclerose lateral amiotrófica (Reznick & Packer, 1993; Przedborski
et al., 1996; Bem–Menachem et al., 2000), sem, entretanto, obter até o momento uma explicação
completamente satisfatória para explicar o dano cerebral dessas doenças. No entanto, acredita-se
que possíveis mecanismos envolvam deficiência no metabolismo energético, estresse oxidativo e
37
neurotoxicidade mediada por receptores glutamatérgicos do tipo NMDA (excitotoxicidade), ou,
possivelmente, um somatório desses fatores (Rose & Henneberry, 1994).
Tem também sido recentemente demonstrado que o estresse oxidativo atua em vários
erros inatos do metabolismo (Colomé et al., 2000, Wajner et al., 2004). A produção excessiva
de radicais livres e a redução das defesas antioxidantes ocorrem em algumas acidemias
orgânicas, como nas acidemias glutárica (Kolker et al., 2001; Latini et al., 2005; 2007),
propiônica e metilmalônica (Fontella et al., 2000), bem como em aminoacidopatias como na
homocistinúria (Streck et al., 2003; Stefanello et al., 2005), tirosinemia tipo I (Bird et al.,
1995) e fenilcetonúria (Artuch et al., 2001; Hagens et al., 2002; Artuch et al., 2004; Sirtori et
al., 2005; Sitta et al., 2006) e também na doença peroxissomal adrenoleucodistrofia ligada ao
X (Vargas et al., 2004; Deon et al., 2006), sugerindo que o estresse oxidativo possa estar
envolvido no dano neurológico observado nessas doenças. Embora o mecanismo responsável
pelo estresse oxidativo nos erros inatos do metabolismo não seja totalmente compreendido, é
possível que o acúmulo de metabólitos tóxicos induza a formação excessiva de radicais livres.
38
PARTE II - OBJETIVOS
Objetivo Geral
Investigar os efeitos in vitro dos principais metabólitos que se acumulam na deficiência
de MCAD (ácidos octanóico e decanóico) na ausência ou presença de hiperamonemia
induzida pelo acetato de amônio (AA) sobre parâmetros de estresse oxidativo e de
metabolismo energético em córtex cerebral, fígado e músculo de ratos jovens.
Objetivos Específicos
Investigar o efeito in vitro dos ácidos octanóico e decanóico e do acetato de amônio
sobre parâmetros de estresse oxidativo e de metabolismo energético, através da determinação
dos seguintes parâmetros em córtex cerebral, fígado e músculo de ratos:
a) Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS);
b) Carbonilação de proteínas;
c) Atividade da creatina quinase;
d) Atividade da succinato desidrogenase;
e) Atividade da citrato sintase;
f) Atividade dos complexos I, II, III e IV da cadeia respiratória;
39
PARTE III – RESULTADOS
Artigo 1
Toxicity of octanoate and decanoate in rat peripheral tissues: evidence of
bioenergetic dysfunction and oxidative stress induction in liver and skeletal
muscle
Giselli Scaini, Kellen R. Simon, Anelise M. Tonin, Estela N. B. Busanello, Alana P. Moura,
Gustavo C. Ferreira, Moacir Wajner, Emilio L. Streck, Patrícia F. Schuck
Artigo submetido no periódico Archives of Biochemistry and Biophysics
40
Artigo 2
Ammonia potentiates toxicity of octanoate and decanoate in rat tissues
Giselli Scaini, Natália Rochi, Bethânia M. Borges, Bruna W. Freitas, Isabela C. Jeremias,
Gustavo C. Ferreira, Emilio L. Streck, Patrícia F. Schuck
Artigo submetido no periódico Cellular Physiology and Biocehmistry
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82
PARTE IV – DISCUSSÃO
A deficiência da MCAD é um EIM, sendo o mais frequente defeito da oxidação de
ácidos graxos, com uma prevalência estimada entre 1:6.500 e 1:17.000 recém-nascidos vivos,
dependendo da origem étnica da população. É caracterizado bioquimicamente por acúmulo
tecidual de ácidos graxos de cadeia média, principalmente os ácidos octanóico (AO),
decanóico (AD) e cis-4-decenóico (AcD), e seus derivados (Scriver et al., 2001); é causada
pela deficiência de atividade da desidrogenase de acil-CoA de cadeia média, uma enzima
envolvida na β-oxidação de ácidos graxos de cadeia média.
A apresentação clínica em pacientes com a MCADD tende a aparecer em resposta a
crises de estresse metabólico e normalmente inclui episódios de hipoglicemia hipoacetótica,
rabdomiólise, hepatomegalia e encefalopatia aguda, que pode rapidamente evoluir para o
coma e morte (Roe & Ding, 2001). Há um número considerável de estudos in vitro mostrando
que os efeitos tóxicos dos ácidos graxos poderiam estar envolvidos na fisiopatologia do dano
tecidual nos pacientes com MCADD, estando a maioria deles relacionados com um prejuízo
em etapas distintas do metabolismo energético (Parker et al., 1983; Davis et al., 1987; De
Assis et al., 2003; Reis de Assis et al., 2004; Schuck et al., 2009b). Neste contexto, especulase que o dano cerebral encontrado nos pacientes está associado aos efeitos dos AO e AD
relatados em estudos utilizando preparações de cérebro de ratos, que englobam rompimento
da via glicolítica e do funcionamento do ciclo de Krebs, inibição dos complexos da cadeia
respiratória e da creatina quinase, desacoplamento da fosforilação oxidativa e indução de
estresse oxidativo (Reis de Assis et al., 2004; Schuck et al., 2009a,b). Deve-se ainda enfatizar
que várias manifestações clínicas desta doença ocorrem sem a presença de hipoglicemia (Roe
& Ding, 2001) e que as com as concentrações dos ácidos graxos de cadeia média aumentam
drasticamente no plasma de pacientes durante as crises (Rinaldo et al., 2001); é concebível
83
que esses metabólitos podem estar associados com a toxicidade periférica na MCADD. De
fato, estudos anteriores mostraram que o AO aumenta o consumo de oxigênio e diminui a
concentração citosólica de ATP e taxa glicolítica em fígado de ratos perfundidos (Scholz et
al., 1984; Sobool et al., 1984). Desta forma, o presente estudo estendeu as investigações,
inicialmente estudando o efeito dos AO e AD, os principais metabólitos acumulados
MCADD, sobre importantes parâmetros do metabolismo energético em fígado e músculo
esquelético de ratos jovens. Foi verificado que a pré-incubação de homogeneizados de fígado
com AO e AD diminuiu as atividades dos complexos I-III, II-III e IV. Além disso, a préincubação de homogeneizados de músculo esquelético com AO e AD causou uma diminuição
da atividade do complexo IV, enquanto que altas concentrações de AD, mas não AO, inibiram
a atividade do complexo II-III. Estudos anteriores mostraram que o AO não afeta as
atividades dos complexos da cadeia respiratória in vitro (de Assis et al., 2003), e que o AD na
concentração de 3,0 mM inibe as atividades dos complexos II-III e IV em homogeneizados de
córtex cerebral (Reis de Assis et al., 2004). Em conjunto, estes dados indicam que a cadeia
respiratória nas células hepáticas apresenta uma maior vulnerabilidade para os AO e AD,
quando comparados ao córtex cerebral e músculo esquelético. A inibição da cadeia
respiratória causada pelos AO e AD pode ser parcialmente atribuída a diferenças entre os
tecidos, como isoformas das subunidades da cadeia respiratória codificadas pelo núcleo
(Rustin et al., 1994; Clay & Ragan, 1988; Merle & Kadenbach, 1980), ou, alternativamente,
pela regulação do fluxo de elétrons da cadeia respiratória mitocondrial específica para cada
órgão (Taylor et al., 1993). De fato, resultados semelhantes já foram relatados para o ácido
metilmalônico (Pettenuzzo et al., 2006). Observamos também que os AO e AD não alteraram
a atividade da creatina quinase em homogeneizados de músculo esquelético e fígado, estando
esses resultados em concordância com os resultados obtidos em homogeneizados cerebrais
(Reis de Assis et al., 2004).
84
O próximo passo do nosso estudo foi investigar os efeitos dos AO e AD sobre alguns
parâmetros de estresse oxidativo em homogeneizados de fígado e músculo esquelético.
Enfatiza-se que alterações mitocondriais, especialmente inibições de complexos da cadeia
respiratória, podem levar a um aumento na geração de espécies reativas de oxigênio e
nitrogênio (Halliwell & Gutteridge, 1999). Observamos que os AO e AD aumentaram os
níveis de TBA-RS e o conteúdo de carbonilas no fígado e músculo esquelético. Como os
níveis de TBA-RS refletem a quantidade de malondialdeído (MDA) formado, um produto da
oxidação de ácidos graxos poliinsaturados de lipídios complexos (Halliwell & Gutteridge,
1999), e o conteúdo de carbonilas é um marcador para avaliar a oxidação protéica, pode-se
concluir que esses ácidos graxos causam dano oxidativo em lipídeos e proteínas do fígado e
músculo esquelético. No que diz respeito aos mecanismos pelos quais os AO e AD exercem
seus efeitos, foi demonstrado que a adição de melatonina e trolox foi capaz de impedir a
peroxidação lipídica causada por esses ácidos graxos de cadeia média no cérebro (Schuck et
al., 2009a), reforçando a idéia de um envolvimento de espécies reativas nos efeitos dos AO e
AD. Neste cenário, é tentador especular que o mesmo mecanismo ocorra no fígado e no
músculo esquelético. No entanto, não se pode excluir a participação de mecanismos
adicionais que levam ao dano oxidativo.
No que diz respeito às concentrações de GSH, o maior contribuinte para o estado
redox das células, o AD ocasionou uma diminuição nos níveis de GSH no músculo
esquelético, mas não no fígado. Em contraste, o AO não alterou os níveis de GSH em nenhum
dos tecidos estudados. Uma vez que este parâmetro é usado para avaliar a capacidade de um
tecido em responder e prevenir os danos causados pelos radicais livres (Lisse et al., 1995;
Halliwell & Gutteridge, 1999; Evelson et al., 2001), pode-se concluir que as defesas
antioxidantes do músculo esquelético foram comprometidas pelo AD. Visto que níveis
adequados de antioxidantes são essenciais para a proteção da célula contra dano oxidativo, e
85
que um desequilíbrio na homeostase entre pró-oxidantes e antioxidantes induz estresse
oxidativo, é possível que a diminuição significativa dos níveis de GSH ocasionada pelo AD
esteja relacionada ao aumento da lipoperoxidação in vitro ocasionado por este ácido graxo.
Isto está de acordo com as observações de que o GSH é considerado uma importante defesa
contra o dano oxidativo a lipídios eliminando o peróxido de hidrogênio e radicais peroxil
formados durante este processo e que a suplementação de GSH em homogeneizados de córtex
atenuou o dano oxidativo induzido pelo AD (Schuck et al., 2009a). Por outro lado, não
podemos descartar a possibilidade de que o decréscimo nos níveis de GSH se deva a um
aumento na geração de espécies reativas causado pelo AD.
Embora tenha sido sugerido que os AO e AD exerçam efeitos neurotóxicos
importantes, afetando principalmente o metabolismo energético, muito pouco se sabe sobre a
contribuição da hiperamonemia para o dano neurológico, a hepatopatia e as alterações
musculares encontradas nos pacientes, uma vez que a hiperamonemia está relacionada com
uma série de condições patológicas. Neste contexto, decidiu-se avaliar os efeitos da amônia
sobre para parâmetros do metabolismo energético. Investigou-se a hipótese de que a amônia
pudesse alterar as atividades de enzimas do ciclo de Krebs, dos complexos da cadeia
respiratória mitocondrial e da creatina quinase em ratos jovens, e se essa atuaria
sinergicamente com os AO e AD, potencializando a inibição que esses ácidos causam.
Apesar dos mecanismos básicos pelos quais a amônia induz neurotoxicidade ainda não
estarem completamente esclarecidos, existem evidências de que tais mecanismos envolvam
falência no metabolismo energético e depleção de ATP (Felipo et al., 1994; Kosenko et al.,
1994; 1995; Ratnakumari et al., 1995), inibição de enzimas do ciclo de Krebs e sweeling
mitocondrial (Cooper & Plum, 1987; Lai & Cooper, 1987; Felipo et al., 1994; Dolisnka et al.,
1996), bem como a potenciação da inibição da α-cetoglutarato desidrogenase provocada pelos
acil-CoA graxos (McNaught et al., 1995), ativação de receptores glutamatérgicos (Felipo et
86
al., 1994; Zhou et al., 1999; Bosman et al., 1992), geração de radicais livres (Kosenko et al.,
1997; 1999), alterações nas funções dos neurotransmissores (Cooper & Plum, 1987; Felipo et
al., 1994; Zhou et al., 1999), dentre outras alterações.
Neste contexto, decidiu-se no presente estudo, avaliar os efeitos do AO, AD e/ou AA
em vários parâmetros do metabolismo energético. Foi inicialmente verificado que o AO e AD
separadamente causaram uma inibição da atividade dos complexos da cadeia respiratória
mitocondrial no cérebro, fígado e músculo esquelético semelhante aos resultados obtidos em
estudos anteriores (de Assis et al., 2003; Reis de Assis et al., 2004). Posteriormente, foi
verificada a influência do AA sobre esses efeitos em diferentes estruturas centrais e
periféricas. Quando adicionado sozinho no meio de incubação, o AA inibiu a atividade dos
complexos II-III no fígado, e a atividade do complexo IV no músculo esquelético, cérebro e
fígado. Por outro lado, houve um aumento na atividade do complexo II no fígado. Quanto à
associação entre AA e os ácidos graxos, observamos uma inibição do complexo I-III e II no
cérebro, e do complexo II no músculo esquelético quando o AD e o AA estiveram presentes
simultaneamente no meio de incubação, sugerindo uma ação sinérgica entre AA e AD. Além
disso, as evidências de efeitos aditivos entre AA e os ácidos graxos foram observadas, uma
vez que AA potencializou os efeitos do AO e AD sobre a atividade do complexo IV em
diferentes estruturas. Tomados em conjunto, podemos verificar que a amônia potencializa os
efeitos dos AO e AD e que o complexo IV apresenta uma maior vulnerabilidade a esses
metabólitos, em comparação com os outros complexos da cadeia respiratória.
Nosso próximo passo foi investigar o efeito do AO, AD e AA sobre a atividade da
citrato sintase e da succinato desidrogenase, enzimas importantes do ciclo de Krebs.
Observou-se que o AO, AD e AA, sozinhos ou associados, inibiram a atividade da citrato
sintase no cérebro, mas somente a combinação do AD com AA inibiram a atividade da citrato
sintase no fígado. Por outro lado, a atividade da citrato sintase não foi afetada por esses
87
compostos no músculo esquelético. A atividade da succinato desidrogenase no córtex cerebral
foi reduzida pelo AD isolado, e a sua associação com o AA não reforçou tal inibição. Nossos
dados sugerem que a atividade do ciclo de Krebs é prejudicada pela presença de AO, AD e/ou
AA, provavelmente gerando uma produção reduzida de NADH e FADH2 para alimentar a
cadeia respiratória, consequentemente, potencializando a depleção de ATP causada pela
inibição direta provocada pelos AO, AD e/ou AA. Finalmente, observamos que a creatina
quinase, uma enzima crucial para a homeostase energética, não foi afetada pelo AO, AD e
AA, estando esses resultados em concordância com os resultados obtidos anteriormente (Reis
de Assis et al., 2004).
Tem sido proposto que a amônia inibe a recaptação de glutamato e leva a um aumento
na concentração extracelular deste neurotransmissor (Felipo et al., 1994, Zhou & Noremberg,
1999), o que leva à ativação nos receptores glutamatérgicos NMDA. A ativação destes
receptores tem sido associada com a depleção de ATP induzida pela amônia, geração de
radicais livres e neurotoxicidade (Felipo et al., 1994; Kosenko et al., 1997). A amônia e o
glutamato induzem a conversão da enzima Na+,K+-ATPase para o estado ativo
(desfosforilado) (Marcaida et al., 1996), o que leva à depleção de ATP devido ao aumento do
consumo deste nucleotídeo. Segundo alguns autores, a atividade da Na+,K+-ATPase cerebral
está aumentada no cérebro de ratos com síndromes hiperamonêmicas congênitas ou
adquiridas (Ratnakumari et al., 1995). Além disso, tem sido demonstrado que a amônia inibe
algumas enzimas do ciclo de Krebs (Lai & Cooper, 1991), potencializa o efeito inibitório de
vários ésteres de CoA sobre a atividade da α-cetoglutarato desidrogenase (McNaught et al.,
1995), inibe a lançadeira malato-aspartato (Siegel et al., 1994) e induz swelling mitocondrial
em astrócitos devido ao acúmulo excessivo de glutamina na matriz e ativação do poro de
transição de permeabilidade, o qual colapsa o potencial de membrana (Schinlder et al., 1996;
White & Reynolds, 1996), um efeito que pode ser compartilhado pelo AO e AD, uma vez que
88
esses alteram a homeostase energética mitocondrial (de Assis et al., 2003; 2006; Reis de Assis
et al., 2004; Schuck et al., 2007; 2009b) o que contribui para a depleção de ATP (Dolinska et
al., 1996).
Em conclusão, o presente estudo fornece evidências de que os AO e AD, os principais
metabólitos acumulados na MCADD, alteram a bioenergética mitocondrial e causam estresse
oxidativo em tecidos periféricos de ratos jovens em concentrações semelhantes (0,5 mM e
superior) aos encontrados nos pacientes com MCADD (cerca de 0,7 mM). Além disso,
durante as crises metabólicas as concentrações desses ácidos aumentam drasticamente nestes
pacientes, devido a uma lipólise aumentada e um bloqueio na reação da MCAD (Martínez et
al., 1997; Roe & Ding, 2001). Esse estudo também demonstrou um efeito sinérgico/aditivo
entre o AO, AD e a amônia, prejudicando a bioenergética mitocondrial no cérebro, fígado e
músculo esquelético de ratos.
Tomados em conjunto, nossos resultados dão origem à hipótese de que a
hiperamonemia, que é comumente encontrada em pacientes que sofrem de MCADD, agrava o
dano a células causado pelos ácidos graxos de cadeia média. No caso de nossos resultados
serem extrapolados para a condição humana, presume-se que estes efeitos poderiam ser
envolvidos no dano cerebral, na hepatopatia e nas alterações musculares, freqüentemente
encontradas em pacientes MCADD (Roe & Ding, 2001). Embora não sejam conhecidos os
mecanismos de interação entre a amônia e os ácidos graxos de cadeia média, o presente
achado pode ser de grande valor para a compreensão da fisiopatologia dos sintomas
observados nos pacientes e pode contribuir para o desenvolvimento de novas condutas para o
tratamento dos pacientes afetados.
89
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