Histologia dos órgãos e tecidos linfóides de galinhas poedeiras White

RPCV (2015) 110 (593-594) 74-78
Histologia dos órgãos e tecidos linfóides de galinhas poedeiras White Leghorn
Histology of organs and lymphoid tissues of white leghorn laying hens
Silas F. Eto1, Dayanne C. Fernandes1, Adriano M. Gonçalves2, Luiz F.J. dos Santos2,
Julieta R.E. de Moraes1, João M.P. Junior2, Flávio R. de Moraes*1
1
Departamento de Patologia Veterinária, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista Júlio Mesquita Filho, Unesp,
Via Prof. Paulo Donato Castellane, Km 05, Jaboticabal, SP, CEP 14870-000 - São Paulo, Brasil
2
Departamento de Tecnologia - Unesp - Jaboticabal, SP
Resumo: O sistema imune de aves é composto de células, moléculas, órgãos e tecidos linfoides primários e secundários. O presente trabalho teve como objetivo descrever as estruturas histomorfológicas dos órgãos e tecidos linfoides de galinhas poedeiras
da linhagem White Leghorn. Duas amostragens de aves foram
analisadas, a primeira com 10 dias de vida para a coleta da bursa
de Fabrícius e a segunda com 45 semanas de vida, para a retirada dos órgãos e tecidos linfoides reprodutores secundários. O
material coletado foi processado para o preparo de lâminas histológicas, coradas pelo método de hematoxilina e eosina (HE)
e as imagens capturadas em microscopia de luz e analisadas no
software Motic®.
Palavras-chave: Aves, celular, humoral, órgãos linfoides, sistema
imune.
Summary: The immune system of birds is composed of cells,
molecules, organs and primary and secondary lymphoid tissues.
Therefore the present work was to describe the structures histomorphological lymphoid organs and tissues of laying hens of White Leghorn strain. Two samples of birds were analyzed, the first
10 days of life for the collection of primary lymphoid organs and
tissues, the second with 45 weeks of life, for the removal of organs
and tissues and secondary lymphoid breeding. The collected material was processed for histology and stained with hematoxylin
and eosin (HE) and the images captured and analyzed by light
microscopy.
Keywords: Birds, cellular, immune system, humoral, lymphoid
organs.
Introdução
O sistema imune das aves e seu funcionamento normal dependem da presença de células derivadas da
medula óssea que se desenvolvem nos órgãos linfóides
primários. Os linfócitos B se diferenciam na bursa de
Fabrícius, enquanto os linfócitos T, no timo. Na bursa
de Fabrícius ocorre o desenvolvimento e a maturação
dos linfócitos B e é semelhante à medula óssea dos mamíferos com relação ao desenvolvimento de linfócitos
*Correspondência: [email protected]
Tel: (0xx16) 32092662 ramal 204 / (0xx16) 997852072;
Fax: (0xx16) 3202-5500
74
B (Sayegh e Ratcliffe, 2000; Otsubo et al., 2001; Scott,
2004).
O timo apresenta o microambiente ideal para o desenvolvimento de linfócitos T, gerando três sub-populações
destas células, quais sejam, linfócitos T auxiliares, linfócitos T citotóxicos e linfócitos T supressores, cada com
sua função nas respostas imunes humoral e celular (Erf,
2004; Scott, 2004).
Além dos órgãos linfóides primários, existem os órgãos e tecidos linfóides secundários, estrategicamente
distribuídos pelo corpo, para o melhor monitoramento
do organismo pelo sistema imune. O baço é o único
órgão linfóide secundário encapsulado encontrado em
aves, gerando resposta imune a antígenos presentes na
corrente circulatória (Ciriaco et al., 2003).
A presença de linfonodos na região poplítea, ao longo
da veia femoral em galinhas poedeiras (Gallus gallus)
foi descrita por Glick (1986).
Tecidos linfóides associados à mucosa (MALT) não
são encapsulados, têm distribuição difusa na mucosa
de vários órgãos, tais como intestino na região de íleo
quando são denominados placas de Peyer, nas tonsilas
cecais e glândula de Harderian (Ratcliffe, 2002).
No trato reprodutivo das aves são observados na região de infundíbulo, útero e vagina (Leite e Viveiros,
2009). A presença de células B e a produção marcante
de anticorpos IgY, IgM e IgA, nos tecidos linfóides associados a mucosa, aparentemente está correlacionada
com a concentração de estrógeno (Zheng et al., 2000).
Na imunidade inata de aves como na peritonite induzida pela carragenina em aves os resultados demonstraram o aumento de permeabilidade vascular de caráter
monofásico. Os leucócitos polimorfonucleares predominam no exsudato apos 2 e 4 horas. e equilibraram-se
com as mononucleares apos 24 horas, predominando o
último tipo celular após 48 h. O maior acúmulo de células polimorfo e mononucleares ocorreu após 4 e 24
horas, respectivamente (Hara et al., 1994).
A imunidade adaptativa em aves envolve os mecanismos humoral e o mediada por células. Enquanto a imunidade humoral responde particularmente a antígenos
Eto S. et al.
extracelulares, a imunidade mediada por células responde a antígenos intracelulares, vírus e bactérias intracelulares (Erf, 2004).
O conhecimento da morfologia normal dos órgãos e
tecidos linfoides primários e secundários é uma ferramenta analítica morfométrica importante para a determinação da intensidade da resposta imune nesses locais.
Material e métodos
Aves
Foram utilizadas seis galinhas da linhagem White
Leghorn, três com 10 dias de vida e três com 60 semanas de vida, adquiridas da Granja da Fazenda Escola
da Faculdade de Medicina Veterinária, da Universidade
Estadual de Londrina - PR - Brasil, que foram alimentadas com ração para aves e água a vontade. As aves
apresentavam-se em idade reprodutiva, com 60 semanas
de vida.
Coleta de amostra de sangue
A coleta de sangue foi realizada, pela punção da veia
braquial como recomendado por Zander e Mallinson
(1991). Após a coleta o sangue foi colocado em tubos de vidro com solução anticoagulante (EDTA 5%)
e processado no Laboratório de Patologia Clínica do
Departamento de Medicina Veterinária da Universidade
Estadual de Londrina - PR.
RPCV (2015) 110 (593-594) 74-78
vemente eosinofílico. O hematócrito realizado em um
animal apresentou 31% e a dosagem de hemoglobina
apresentou 8,5 g/dL.
Os heterófilos apresentaram núcleo multilobulado,
cromatina condensada e citoplasma contendo grânulos
esféricos e elípticos e representaram 80% dos leucócitos
presentes no sangue.
Os eosinófilos têm seu núcleo multilobulado heterocromatina granulada e citoplasma com grânulos que
corados em azul. A porcentagem de eosinófilos foi de
26%. Não se observou a presença de basófilos.
Os monócitos apresentaram núcleo periférico, elíptico, ou reniforme, cromatina frouxa e citoplasma azulado. Sua porcentagem no sangue foi de aproximadamente 1%.
Os linfócitos apresentaram núcleo central, cromatina
densa, citoplasma escasso e pouco corado. A porcentagem de linfócitos no sangue foi de 40%.
Os trombócitos contem núcleo que toma todo o citoplasma, e são encontrados em agregados no sangue.
A morfologia das células sanguíneas está apresentada
na (Figura 1).
Timo
Macroscopicamente o timo apresenta coloração esbranquiçada, consistência friável e aproximadamente
0,5 cm de diâmetro.
Necropsia (Coleta de órgão linfóides )
Os animais foram sedados com éter etílico e sacrificados pelo método de deslocamento cervical recomendado pela, American Veterinary Association.
A necropsia foi realizada pelo método recomendado
por Zander; Mallinson, (1991). O animal foi colocado
em decúbito dorsal, realizando uma incisão desde a cloaca até a comissura do bico, dissecando a pele e musculatura expondo o abdômen e a região torácica.
Após a retirada os órgãos foram fixados em solução
de Bouin aquoso e formol a 10% tamponado.
Exame histológico
Os órgãos foram fixados por 24 horas, e submetidos a
desidratação, diafanização e inclusão em Paraplast, cortados em secções de 7 mm, corados com hematoxilina e
eosina e analisados por microscopia de luz.
Resultados
Células Sanguíneas
As células mais abundantes nas aves são as hemácias.
Estas células apresentam aproximadamente 12 mm de
diâmetro, presença de núcleo central elíptico de cromatina condensada levemente basofílico e citoplasma le-
Fig. 1 - Esfregaço sanguíneo de aves corado com H&E analisado em maior aumento. a) Monócito apresenta núcleo periférico de forma elíptica, cromatina frouxa e citoplasma azulado.
b) Agregados de trombócitos com núcleos que tomam todo o
citoplasma. c) Linfócito com núcleo central, cromatina condensada, citoplasma escasso e pouco corado (seta fina), a seta grossa aponta uma hemácia com presença de núcleo central elíptico
com cromatina condensada levemente basofílico e citoplasma
levemente basofílico. d) A direita a flecha aponta um eosinófilo
com núcleo multilobulado, heterocromatina granulada, citoplasma com grânulos que se tigem em azul rosado, a esquerda a seta
grossa aponta um heterófilo com núcleo multilobulado, cromatina condensada e citoplasma com grânulos esféricos e elípticos.
75
Eto S. et al.
RPCV (2015) 110 (593-594) 74-78
Ao exame microscópico foi observada presença de
uma cápsula de tecido conjuntivo denso envolvendo o
órgão e septos do mesmo tecido que invadem o timo
dividindo-o em lóbulos. A região mais externa chamada cortical é rica em linfócitos e apresenta extensa
rede vasos sanguíneos, quando comparada com a região medular (Figura 1). Em um dos animais o timo
apresentava redução progressiva de células da região
cortical e medular (Figura 2).
Fig. 2 - Corte histológico do timo corado com H&E visualizado em pequeno aumento. a) A seta mostra degeneração progressiva da região cortical (C) para a medular (M). b) A seta
fina mostra a cápsula de tecido conjuntivo denso, que invade o
timo dividindo em lóbulos mostrados pela seta grossa, presença de região cortical (C) rica em linfócitos quando comparada
com a medular (M).
Fig. 3 - Corte histológico da Bursa de Fabrícius corado por
H&E. a) Bursa de Fabrícius mostrada em pequeno aumento, a
Bursa é revestida internamente por tecido epitelial simples colunar (seta fina), apoiado por tecido conjuntivo frouxo, mostrado
pelo asterisco, a seta grossa aponta a dobra de tecido epitelial,
local onde se localiza os folículos linfoides sub-epitelias. b) A
seta mostra o tecido epitelial simples colunar em médio aumento. c) Infiltrado de linfócitos, no estroma em evidencia as seta
aponta dois plasmócitos.
Bursa de Fabrícius
Macroscopicamente a bursa é um órgão em forma
de bolsa localizada na região dorsal, na porção final da
cloaca. Em um doa animais examinados a bursa apresentava aspecto de bolha, medindo aproximadamente
1,0 cm de diâmetro. Microscopicamente a bursa de
Fabrícius é revestida internamente por um tecido epitelial de revestimento simples e colunar, apoiado sobre
tecido conjuntivo frouxo, com pouco colágeno e celularidade abundante, infiltrado por linfócitos e alguns
plasmócitos (Figura 3).
Baço
O baço macroscopicamente apresenta coloração
marrom avermelhada com aproximadamente 1,5 cm
de comprimento e 0,5 cm de diâmetro.
Ao exame microscópico o baço apresentava uma
cápsula de tecido conjuntivo denso, da qual partem
septos. Observou-se regiões ricas em sinusóides, macrófagos e hemácias, correspondente a polpa vermelha
e regiões onde há acúmulo de linfócitos, especialmente
ao redor de pequenas arteríolas. Em alguns locais observaram-se regiões mais claras, correspondentes aos
centros germinativos, circundados por linfócitos com
núcleo fortemente corado. Estes acúmulos de linfócitos próximos a arteríola correspondem à polpa branca.
(Figura 4).
76
Fig. 4 - Corte histológico do Baço corado com H&E. a) Cápsula de
tecido conjuntivo denso, a qual adentra o órgão formando septos
(seta), região de polpa branca (PB) e polpa vermelha (PV) (menor
aumento). b) A seta mostra a formação de septos, pela invasão do
tecido conjuntivo denso (*) e região de polpa vermelha com presença e hemácias coradas em vermelho intenso (médio aumento).
c) Região de polpa branca (PB) e polpa vermelha (PV), arteríola
central (seta grossa), com acúmulo de linfócitos formando a bainha linfoide periarteríolar (setas finas). Na região clara mostrada
pelo asterisco, corresponde ao centro germinativo, circundado por
linfócitos fortemente corados (maior aumento).
Órgãos linfóides associados às mucosas
Os órgãos linfóides associados à mucosa (MALT) foram observados na região de tonsilas cecais, íleo e sistema reprodutor.
Eto S. et al.
Em alguns locais das tonsilas cecais e placa de Peyer
havia saliências de coloração rosa pálido na superfície dos órgãos nos locais correspondentes aos MALT.
Microscopicamente o MALT é um aglomerado de tecido linfóide não encapsulado, localizados no tecido
conjuntivo abaixo do epitélio. Em alguns havia centros
germinativos (Figura 5).
No sistema reprodutivo, na região de infundíbulo,
observou-se tecido linfóide não encapsulado, com presença de linfócitos e plasmócitos no interstício (Figura
6). Na vagina foi detectada a presença de linfócitos e
plasmócitos no estroma (Figura 6).
Fig. 5 - Cortes histológico tonsilas cecais (a,b) e íleo (c,d) corados
por H&E. a) O asterisco (*) mostra a região de mucosa e submucosa, a seta aponta aglomerados de tecido linfóide não encapsulado
(pequeno aumento). b) O tecido linfóide não encapsulado, esta difusamente distribuído (asterisco) com presença de centros germinativos mostrado pela seta (médio aumento). c) Presença de Placas
de Peyer no íleo, mostrado pelas setas. d) em maior aumento, a presença de linfócitos e plasmócitos (seta), infiltrados no conjuntivo.
Fig. 6 - Corte histológico da região de infundíbulo (a,b) e vagina (c,d) corados por H&E. a) A seta aponta para um tecido
linfóide não encapsulado no infundíbulo (pequeno aumento). b)
Presença de plasmócitos (seta) e vários linfócitos distribuídos no
conjuntivo, tecido linfóide não encapsulados (asterisco) (grande
aumento). c) corte histológico da vagina em pequeno aumento,
epitélio ciliado pseudo estratificado colunar (asterisco), muscular do órgão e submucosa (seta). d) Presença de plasmócitos
(seta) no tecido conjuntivo (grande aumento).
RPCV (2015) 110 (593-594) 74-78
Discussão
Nos estudos hematológicos, os valores do hemograma, leucograma e análise morfológica foram compatíveis com a literatura consultada (Campbell, 2004).
Os estudos histológicos do timo mostraram a presença de região de córtex e medula, com presença de
cápsula de tecido conjuntivo, como mostrado na figura
1.1, como descrito por Glick (1986) e Ciriaco et al.
(2003).
Segundo Ciriaco (2003) informações a respeito de
mudanças estruturais e funcionais na involução do
timo de aves são escassas e fragmentadas, mas nas
galinhas estas alterações começam a aparecer com
três meses de idade, com progressiva perda na área
cortical. No entanto em um dos animais necropsiados
observamos ainda a presença de região cortical bem
organizada, enquanto em outro o timo havia sofrido
completa involução. Em outro parte do órgão havia
sido substituído por tecido adiposo. Isto sugere que
mesmo entre galinhas de mesma idade e mesma raça a
involução do timo ocorre de forma heterogênea entre
os animais. Mas são necessários maior número de aves
para confirmar esta hipótese.
A bursa de Fabrícius apresentava epitélio simples
prismático, tecido conjuntivo frouxo e infiltrados de
linfócitos e plasmócitos, mas não foi detectada a presença de tecido linfóide associado ao epitélio. Este
resultado é devido a involução deste órgão, já que os
animais em estudo tinham 60 semanas de idade . Estes
resultados corroboram os de Ciriaco et al. (2003).
O timo e a bursa de Fabrícius são os órgãos responsáveis pela maturação dos linfócitos B e T, mas apesar
da involução com a idade, as galinhas apresentaram valores leucocitários normais para animais não infectados que foram de 4.850 leucócitos totais/mm³ obtidos.
A histologia do baço revelou a presença de cápsula
conjuntiva que penetrava no parênquima do órgão formando pequenas trabéculas. Observou-se a presença
de polpa branca composta de artéria trabecular que se
ramificava em arteríolas centro foliculares, envolvidas
por bainha linfóide periarteriolar, formando centro
germinativo adjacente à bainha linfóide periarteriolar
eram semelhantes ao descrito por Yasuda et al. (2003).
A polpa vermelha é formada por sinusóides, cordões
celulares, macrófagos, granulócitos, plasmócitos e células interdigitais (Figura 1.3) (Yasuda et al., 2003).
Nas tonsilas cecais foram encontradas na mucosa e
submucosa, regiões de criptas, muscular do órgão, células epiteliais e presença de nódulos linfáticos não encapsulados distribuídos difusamente, com presença de plasmócitos migrando para o conjuntivo como descritos por
(Glick, 1986; Hiroshi et al., 2000). Os nódulos linfáticos
não encapsulados são importantes na defesa local contra
a proliferação de microrganismos residentes. O baixo
peristaltismo com acúmulo destes microrganismos seria
a razão para este estrutura conter quantidade significativa de tecido linfóide (Hiroi et al., 2000).
77
Eto S. et al.
A presença de nódulos linfáticos não encapsulados,
e plasmócitos foram detectadas na região de íleo das
aves como relatado por Payne (1971); Befus et al.
(1980).
Nas observações do sistema reprodutivo das galinhas
havia nódulos linfáticos não encapsulados na região de
infundíbulo com presença de plasmócitos no estroma
da mucosa, concordando com estudos realizados por
(Zheng et al., 2000).
Na região de vagina foi detectada a presença de plasmócitos no estroma da mucosa vaginal, comprovando a produção de imunoglobulinas nesta região e seu
papel na defesa local como descrito por (Khan, et al.,
1997; Zheng, et al., 2000).
No útero, no istmo e magno não foram encontrados
presença de plasmócitos, sendo estas regiões responsáveis pela deposição de elementos ao ovo (Zheng, et
al., 2000).
Os órgãos linfoides secundários provavelmente assumem o papel de manter os de linfócitos no sangue, já
que os animais estudados mostraram valores normais
no leucograma.
Bibliografia
Befus AD, Johnston N, Leslie GA, Bienenstock J (1980). Gutassociated lymphoid tissue in the chicken. Morphology,
ontogeny, and some functional characteristics of Peyer’s
patches. Journal of Immunology, 125, 2626-2632.
Campbell TW (2004). Hematology of Birds Veterinary
Hematology and Clinical Chemistry. In: Thrall MA.
Editores: Lippincott Williams e Wilkins (Philadelphia),
17, 225-257.
Ciriaco E, Pínera P, Diaz-Esnal B, Laura R (2003). AgeRelated Changes in the Avian Primary Lymphoid Organs
(Thymus and Bursa of Fabrícius). Microscopy Research
and Technique, 62, 482-487.
Erf GF (2004). Cell-Mediated Immunity in Poultry. Poultry
Science, 83, 580-590.
Glick B (1986). Immunophysiology. In: STURKIE PD.
Avian Physiology, Editora: Springer-Verlag (New York,
Berlin, Heidelberg, Tokyo), 4, 87-101.
Hara CM, Klein Júnior M, Moraes JRE, Moraes FR, Paulillo
AC (1994). Cinática das alterações vasculares e celulares
na peritonite induzida pela carragenina em aves. Efeito
de drogas antiinflamatórias estroidais e não esteroidais.
Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal
Science, 31, 173-180.
78
RPCV (2015) 110 (593-594) 74-78
Hiroi TM, Yanagita N, Ohta G, Sakaue G, Kiyono H (2000).
IL-15 and IL-5 receptor selectively regulate differentiantion of common mucosal immune system-independent
B-1 cells for IgA responses. Journal of Immunology, 162,
4329-4337.
Hiroshi K, Shigekazu S, Tomohiro I, Masato U (2000).
Ultrastructural characteristics and lectin-binding properties of M cells in the follicle-associated epithelium of chicken caecal tonsils. Journal of Anatomy, 196, 607-616.
Khan MZI, Hoshimoto Y, Iwami Y, Iwanaga T (1997).
Postnatal development of B lymphocytes and immunoglobulin-containing plasma cells in the chicken oviduct:
studies on cellular distribution and influence of sex hormones. Veterinary Immunology and Immunopathology,
56, 329-338.
Leite MAS, Viveiros ATM (2009). Coleta de sêmen e inseminação artificial em galinhas. Boletim Técnico
Universidade Federal de Lavras. Boletim Técnico, 71,
1-19.Otsubo Y, Chen N, Kajiwara E, Horiuchi H, Matsuda
H, Furusawa S (2001). Role of bursin in the development of B lymphocytes in chicken embryonic bursa of
Fabricius. Developmental and Comparative Immunology,
25, 485-493.
Payne LN (1971). The lymphoid system. Page 985 in
Physiology and Biochemistry of the Domestic Fowl.
Editors: D. J. Bell and B. M. Freeman, Academic Press,
New York.
Ratcliffe MJ (2002). B cell development in gut associated lymphoid tissues. Veterinary Immunology and
Immunopathology, 87, 337-340.
Sayegh CE e Ratcliffe JH (2000). Perinatal deletion of B cells
expressing surface Ig molecules that lack V (D) J-encoded
determinants in the bursa of Fabricius is not due to intrafollicular competition. Journal of Immunology, 164, 50415048.
Scott TR (2004). Our Current Understanding of Humoral of
Poultry. Poultry Science, 83, 574-579.
Yasuda Y, Kajiwara E, Ekino S, Taura Y, Hirota Y, Horiuchi
H, Matsuda H, Furusawa S (2003). Immunobiology of
chicken germinal center: I. Changens in surface Ig class
expression in the chicken splenic germinal center after
antigenic stimulation. Developmental & Comparative
Immunology, 27, 315-330.
Zander D e Mallinson E (1991). Principles of disease prevention: diagnosis and control. In Disease of Poultry, 9ª
edição. Ames, IA: Iowa State Univ. 3-44.
Zheng WM, Izaki J, Furusawa S, Yoshimura Y (2000).
Localization of Immunoglobulin G g-Chain mRNA
Expressing Cells in the Oviduct of Laying and
Diethylstilbestrol-Treated Immature Hens. General and
Comparative Endocrinology, 120, 345-352.