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Produção de acetato de butila usando lipase Novozym 435 na ausência e
na presença de solventes
Danielle S. Queiroza, Nathália G. Duartea, Cláudia O. Velosoa, Aline M. de Castrob, Marta A.P.
Langone a,*
a
Laboratório de Tecnologia Enzimática/Instituto de Química/Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro,
Brasil
b
Gerência de Biotecnologia/CENPES/PETROBRAS, Rio de Janeiro, Brasil
*E-mail: [email protected]
RESUMO
O acetato de butila é um éster de baixa massa molecular produzido a partir da esterificação do ácido
acético com o butanol e é usado em diversas indústrias. Diferentes tipos de lipases foram estudados como
biocatalisador para a produção do acetato de butila. A inibição da atividade catalítica das enzimas pela
presença dos substratos e o uso de solventes orgânicos são parâmetros importantes na obtenção deste
éster. Neste trabalho, os efeitos da concentração inicial de ácido acético, da forma de adição do ácido, da
concentração de enzima e da razão molar álcool/ácido foram investigados na reação de esterificação do
ácido acético com o butanol, na ausência e presença de solvente, usando a lipase comercial Novozym 435.
Na presença de hexano, uma conversão de ácido acético de 96 % foi obtida usando-se uma razão molar
álcool/ácido = 1/1 com concentração inicial de 0,3 mol L-1 de ácido e 5 % de enzima a 50 C, após 4 h. A
adição contínua do ácido usando-se uma bomba peristáltica preveniu a inativação da enzima e favoreceu a
formação do acetato de butila, alcançando uma conversão de 37 % a 50 C, empregando 5 % de enzima e
razão molar final álcool/ácido = 1/1.
Palavras-chave: acetato de butila, esterificação, lipase, Novozym 435.
ABSTRACT
Butyl acetate is a low molecular weight ester produced by the esterification of acetic acid with butanol and
it is used in several industries. Different types of lipases were studied as biocatalyst for the production of
butyl acetate. Inhibition of enzymes catalytic activity by the presence of substrates and the use of organic
solvents are important parameters to produce this ester. In this study, the effects of the initial acetic acid
concentration, the acid addition, the enzyme concentration, and the alcohol/acid molar ratio were
investigated on the esterification reaction of acetic acid with butanol, in the absence and presence of
solvent, using the commercial lipase Novozym 435. In the presence of hexane, an acetic acid conversion of
96 % was obtained using an alcohol/acid molar ratio = 1/1 with initial acid concentration of 0.3 mol L -1 and
5 % of enzyme at 50 C after 4 h. The continuous addition of the acid using a peristaltic pump prevented
the enzyme inactivation and favored the formation of butyl acetate, reaching a conversion of 37 % at 50 C
employing 5 % of enzyme and alcohol/acid final molar ratio = 1 /1.
Keywords: butyl acetate, esterification, lipase, Novozym 435.
1
1. Introdução
O acetato de butila é um éster de baixa
massa molecular produzido a partir da
esterificação do ácido acético com o butanol. É
um líquido límpido, incolor e com odor intenso
de frutas quando em baixa concentração. Devido
às suas características físico-químicas ele pode
ser usado como solvente com aplicações em
couro artificial, tintas de impressão, esmalte para
unhas, adesivos e também na indústria
alimentícia,
conferindo
aos
alimentos
características de sabor e odor, na produção de
perfumes e cosméticos, e na indústria
farmacêutica [1-4].
A esterificação entre o ácido acético e o
butanol pode ser catalisada por ácidos
inorgânicos e também por enzimas. Os
catalisadores ácidos demandam condições de
reação mais severas, são corrosivos e têm que ser
neutralizados após a reação, enquanto que as
enzimas imobilizadas podem ser facilmente
separadas do meio reacional e apresentam boa
reatividade em condições brandas de reação.
Diferentes tipos de lipases têm sido
estudados como biocatalisador para a produção
de ésteres de baixa massa molecular, em especial
o acetato de butila, tais como as lipases de
Rhizopus oryzae [1], Candida antarctica [2,3],
Pseudomonas aeruginosa [4], Rhizomucor miehei
[5].
A inibição da atividade catalítica das
enzimas pela presença dos substratos e o uso de
solventes orgânicos são parâmetros importantes
para o desenvolvimento de processos para a
obtenção de ésteres de baixa massa molecular.
Os ácidos e os alcoóis utilizados como
reagentes para a obtenção de ésteres de baixa
massa molecular podem inibir o desempenho
catalítico das enzimas. De acordo com a literatura
[6,7], os alcoóis agem como inibidores para as
lipases, assim como os ácidos, que acidificam a
interface aquosa da enzima inativando-a.
A toxicidade dos solventes orgânicos e o
alto custo de produção acarretado pelos
processos de separação dos produtos são fatores
que têm motivado a produção de ésteres de
baixa massa molecular na ausência de solventes
[1,5,7,8].
Martins et al. [2,3] estudaram a
esterificação do ácido acético com o butanol para
a produção de acetato de butila catalisada pela
lipase B de Candida antarctica (Novozym 435) na
presença de hexano usando um planejamento
composto central e a metodologia de superfície
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de resposta para otimizar as seguintes condições
experimentais: temperatura de reação, razão
molar entre os substratos, teor de enzima e teor
de água adicionada. A melhor concentração de
ácido acético para a reação, sem que haja
inativação da enzima, foi 0,3 mol L-1 [2]. As
condições ótimas encontradas para a síntese de
acetato de butila foram: temperatura de 40 C;
razão molar butanol/ácido acético de 3/1;
concentração de enzima de 7,5 % em massa de
substrato; e 0,25 % (em massa de substrato) de
água adicionada. Nestas condições, foi obtida
uma conversão de 91,5 % após 2,5 h. Na
presença de ultra-som de baixa frequência (40
kHz) [3], a concentração de ácido acético ótima
para a reação foi de 2,0 mol L-1. É importante
observar que esta concentração é muito mais
elevada do que a maioria citada na literatura. Isto
pode ser explicado pela melhor mistura do ácido
acético no solvente orgânico, devido ao uso do
ultra-som, evitando o acúmulo de ácido e
possivelmente também devido à formação de
uma fase de água no microambiente da enzima, o
que poderia inativar a enzima (Martins et al.,
2011)[2].
A reação de esterificação entre ácido
acético e butanol para produzir acetato de butila
foi estudada na ausência de solvente usando
lipases de Rhizopus oryzae imobilizada em Celite
545 [1] e de Rhizomucor miehei comercial e
imobilizada (Lipozyme RM IM) [5]. As melhores
condições experimentais para a produção de
acetato de butila foram: quantidade de lipase
imobilizada, 500 UI; quantidade de água
adicionada inicialmente, 45 %; razão molar ácido
acético/butanol, 1/1; e temperatura de
incubação, a 37 C, quando se obteve uma
conversão de 60 % [1], e 25 % de enzima (m/m
em relação à quantidade total de substrato) a 37
C por 18 h de reação, na qual se encontrou uma
conversão de ácido superior a 78 %.
Neste trabalho, os efeitos da concentração
inicial de ácido acético, da forma de adição do
ácido, da concentração de enzima e da razão
molar álcool/ácido foram investigados na reação
de esterificação do ácido acético com o butanol,
na ausência e na presença de solvente, usando
como catalisador a lipase comercial Novozym
435.
2
2. Experimental
2.1. Materiais
Ácido acético P.A. ACS, 1-butanol P.A. ACS,
etanol P.A. e acetona P.A. utilizados foram
fornecidos pela Vetec Química Fina Ltda (Brasil).
A lipase comercial Novozym 435 foi obtida
da Novozymes Latin America Ltda (Brasil). A
Novozym 435 é uma lipase de Candida antarctica
B produzida por fermentação do microrganismo
Aspergillus oryzae geneticamente modificado e
adsorvida em resina acrílica macroporosa. As
partículas da enzima imobilizada possuem de 0,3
a 0,9 mm de diâmetro e 1 a 2 % m/m de água. Em
relação à especificidade da lipase imobilizada, a
Novozym 435 apresenta especificidade para as
posições 1 e 3, mas também atua como uma
lipase não específica [9].
2.2. Reações de esterificação
A reação de esterificação entre o ácido
acético e o butanol foi conduzida em reator
batelada fechado de capacidade de 15 mL,
provido de agitação magnética e condensador. A
temperatura do meio reacional foi mantida a 50
C através da circulação de etileno glicol,
proveniente de banho termostático (Haake D10),
pela camisa do reator.
O meio reacional consistiu na mistura de
ácido acético, butanol e da lipase imobilizada. O
meio reacional composto pela mistura de
quantidades equimolares de ácido acético e
butanol resultou em uma concentração de ácido
acético de 6,7 mol L-1. Em alguns experimentos
foram avaliados os efeitos da concentração de
ácido acético na conversão da reação. Assim,
concentrações menores de ácido acético (3,0;
0,3; 0,03 mol L-1) foram testadas pela adição de
solvente ao meio. Os solventes testados foram o
hexano e o próprio reagente butanol, usado em
excesso (razão molar álcool/ácido = 3/1; 36/1 e
360/1).
A influência da concentração de lipase na
conversão da reação foi estudada empregando
concentrações de biocatalisador iguais a 5, 10 e
15 % m/m em relação à massa de ácido acético.
A forma de adição do ácido acético
também foi avaliada. Três estratégias foram
usadas: o volume total de ácido foi adicionado no
início da reação; adição escalonada, na qual
quantidades iguais de ácido foram adicionadas
nos tempos 0, 30 e 60 min; adição contínua com
uso de bomba peristáltica.
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O progresso da reação foi acompanhado
por titulometria de neutralização (titulador
automático Mettler modelo T50), determinandose o consumo de ácido acético no meio reacional
através da titulação de aproximadamente 0,03 g
de meio reacional contra uma solução de NaOH a
0,02 mol L-1. Alíquotas de 50 μL foram retiradas
usando-se pipeta automática, pesadas, e,
imediatamente, adicionadas a uma mistura
acetona/etanol (1/1), sem a separação do
biocatalisador. As análises foram feitas em
duplicata. O acompanhamento da reação foi
expresso através da conversão de ácido acético.
3. Resultados e discussão
3.1. Reação de esterificação do ácido acético e
do butanol na presença de solvente
Dois solventes foram usados para
minimizar a desativação da enzima, o hexano e o
butanol.
O
hexano
é
um
solvente
frequentemente utilizado para a produção de
ésteres de baixa massa molar [1-3,6]. No
entanto, seu uso aumenta os custos de operação
do processo. Como o butanol é o álcool usado
como reagente, sua utilização como solvente
poderia ser interessante e, portanto, foi avaliada.
A atividade enzimática em solventes
orgânicos varia significativamente com o
solvente utilizado [10], o que está relacionado
com vários fatores. O solvente pode alterar a
conformação nativa da proteína através do
rompimento das interações hidrofóbicas e das
ligações de hidrogênio, reduzido a atividade e a
estabilidade da enzima. A influência do solvente
orgânico na atividade enzimática também pode
ser explicada através da habilidade do solvente
em afetar as interações água–enzima e remover
a camada essencial de água que estabiliza a
conformação nativa da enzima.
Os solventes mais prejudiciais às enzimas
são aqueles altamente polares e mais hidrofílicos
(que têm afinidade pela água), pois são capazes
de remover a camada de água essencial da
superfície da enzima e de competir pelas ligações
de hidrogênio entre os átomos da proteína,
causando desnaturação do biocatalisador, com
perda da atividade catalítica [11]. Geralmente, os
solventes apolares e os solventes hidrofóbicos
causam menor desativação. Um dos mais
importantes indicadores da hidrofobicidade de
um solvente é o coeficiente de partição
octanol/água (P). Os solventes com log P maior
que 4 permitem expressar melhor a atividade
3
catalítica da maioria das enzimas, pois são mais
hidrofóbicos [12]. No caso dos solventes
testados, n-butanol tem log P = 0,79, enquanto
que o n-henaxo possui log P = 3,5.
3.1.1. Concentração inicial de ácido acético igual
a 3,0 mol L-1
As reações de esterificação do ácido
acético, com concentração inicial de ácido igual a
3,0 mol L-1, e o butanol foram realizadas a 50 C
com concentração de enzima de 5, 10 e 25 %
m/m. Quando o butanol foi testado como
solvente, foi necessário o uso de uma razão
molar álcool/ácido igual a 3/1 para que a
concentração inicial de ácido acético fosse igual
a 3,0 mol L-1. A Figura 1 A e B apresenta a
variação da conversão de ácido acético com o
tempo de reação na presença de excesso de
butanol e de hexano com razão molar
álcool/ácido igual a 1/1, respectivamente. Notase que para ambos os solventes só houve
formação de acetato de butila quando a
concentração de enzima foi igual a 25 % m/m.
Quando uma grande quantidade de
enzima é utilizada (25 %), parte dela é desativada
pela presença do ácido, porém alguns sítios
ativos
ainda
permanecem
inalterados
possibilitando a formação do acetato de butila.
3.1.2. Concentração inicial de ácido acético igual
a 0,3 mol L-1
As reações de esterificação entre o ácido
acético, com concentração inicial de ácido igual a
0,3 mol L-1, e o 1-butanol foram realizadas a 50
C com concentração de enzima de 5 % m/m.
Quando o butanol foi testado como solvente, foi
necessário o uso de uma razão molar
álcool/ácido igual a 36/1 para que a
concentração inicial de ácido acético fosse igual
a 0,3 mol L-1. A Figura 2 apresenta a variação da
conversão de ácido acético com o tempo de
reação na presença de excesso de butanol, de
hexano usando uma razão molar álcool/ácido
igual a 1/1 e de hexano usando uma razão molar
álcool/ácido igual a 3/1.
Conversão de ácido acético (%)
80
A
5%
10 %
25 %
60
40
20
80
hexano, razão 1/1
hexano, razão 3/1
butanol em excesso
60
40
20
0
1
0
1
2
3
100
B
5%
10 %
25 %
80
2
3
4
Tempo de reação (h)
4
Tempo de reação (h)
Conversão de ácido acético (%)
Conversão de ácido acético (%)
100
100
Figura 2. Resultados do progresso da reação entre o
ácido acético e o 1-butanol a 50 C usando 5 % m/m
de Novozym 435 com concentração inicial de ácido de
0,3 mol L-1 em excesso de butanol (razão molar
álcool/ácido = 36/1) e na presença de hexano (razão
molar álcool/ácido = 1/1 e 3/1).
60
40
20
0
1
2
3
4
Tempo de reação (h)
Figura 1. Resultados do progresso da reação entre o
ácido acético e o 1-butanol a 50 C usando 5, 10 e 25
% m/m de Novozym 435 com concentração inicial de
ácido de 3,0 mol L-1. A: excesso de butanol (razão
molar álcool/ácido = 3/1). B: presença de hexano.
XXV Congreso Iberoamericano de Catálisis
Para a concentração de enzima igual a 5 %
m/m, observa-se que quando o butanol foi
usado como solvente não houve conversão de
ácido acético, porém na presença de hexano
empregando a razão molar álcool/ácido de 1/1
foi obtida uma conversão de 96 % após 4 h de
reação. De acordo com estes resultados, pode-se
inferir que o butanol apresenta um efeito de
desativação da lipase e que o decréscimo da
concentração inicial de ácido acético possibilitou
a reação entre este ácido e o butanol (Figura 1B
e Figura 2). Na presença de hexano, também foi
4
verificada a inativação da enzima pela presença
de excesso de butanol na reação conduzida com
razão molar álcool/ácido de 3/1, visto que a
conversão alcançada foi de 43 %.
3.1.3. Concentração inicial de ácido acético igual
a 0,03 mol L-1
As reações de esterificação entre o ácido
acético, com concentração inicial de ácido igual a
0,03 mol L-1, e o 1-butanol foram realizadas a 50
C com concentração de enzima de 5 % m/m.
Quando o butanol foi testado como solvente, foi
necessário o uso de uma razão molar
álcool/ácido igual a 360/1 para que a
concentração inicial de ácido acético fosse igual
a 0,03 mol L-1. A Figura 3 apresenta a variação da
conversão de ácido acético com o tempo de
reação na presença de excesso de butanol e de
hexano com razão molar álcool/ácido igual a 1/1.
Conversão de ácido acético (%)
100
80
60
butanol
hexano
40
20
0
1
2
3
4
Tempo de reação (h)
Figura 3. Resultados do progresso da reação entre o
ácido acético e o butanol a 50 C usando 5 % m/m de
Novozym 435 com concentração inicial de ácido de
0,03 mol L-1 e em excesso de butanol (razão molar
álcool/ácido = 360/1) e na presença de hexano (razão
molar álcool/ácido = 1/1).
Quando o butanol foi usado como
solvente não houve conversão de ácido acético,
porém na presença de hexano com a razão molar
álcool/ácido de 1/1 foi obtida uma conversão de
93 % após 4 h de reação. Estes resultados
mostram, assim como os resultados obtidos com
a concentração inicial de ácido acético de 0,3
mol L-1, que o excesso de butanol inativa a lipase
Novozym 435, o que pode ser justificado pela
sua maior hidrofilicidade, comparada a do nhexano.
O n-hexano se mostrou um melhor
solvente para a reação de esterificação do ácido
acético com o 1-butanol, pois uma alta
conversão foi obtida quando a concentração
inicial de ácido era de 0,3 mol L-1.
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3.2. Reação de esterificação do ácido acético e
do butanol na ausência de solvente
Sistemas reacionais para a produção de
acetato de butila na ausência de solventes
acarretariam em menor custo operacional e
também seriam considerados ambientalmente
mais seguros, pois um reagente de alta
toxicidade seria removido do processo.
Os efeitos da concentração de enzima, da
razão molar álcool/ácido e da forma de adição
do ácido foram avaliados a 50 C.
O efeito da concentração de enzima foi
estudado usando-se 5, 10 e 25 % m/m de enzima
em relação à quantidade de ácido acético, na
concentração inicial de 6,7 mol L-1, equivalendo a
razão molar álcool/ácido de 1/1. Não houve
conversão de ácido acético para os três níveis de
concentração de enzima testados.
Duas razões molares álcool/ácido foram
testadas: 1/1 e 3/1. A variação da razão molar
entre os substratos acarretou em diferentes
concentrações iniciais de ácido acético, 6,7 e 3,2
mol L-1, respectivamente. Nenhuma conversão
de ácido acético foi observada quando 5 % m/m
de enzima foi usada.
Segundo a literatura [2,6,7,13], a presença
de ácidos carboxílicos de cadeia curta como o
ácido acético inativa as lipases usadas como
catalisador para reações de esterificação. Sendo
assim, a concentração inicial de ácido acético
deve ser controlada.
De acordo com os resultados anteriores,
pode-se concluir que a enzima Novozym 435 foi
inativada na presença de ácido acético nas
concentrações de 6,7 e 3,2 mol L-1 e que o
aumento da concentração de enzima na faixa
estudada não favoreceu a reação. Martins et al.
[2] relataram que a melhor concentração inicial
de ácido acético para a reação esterificação com
butanol na presença de Novozym 435, sem
inativação da enzima, foi de 0,3 mol L-1.
De modo a manter a concentração de
ácido acético no meio reacional baixa, foram
testadas a adição escalonada de ácido, isto é, o
ácido foi adicionado em três etapas após 0, 30 e
60 min de reação, e a adição de ácido usando-se
uma bomba peristáltica, onde a quantidade total
de ácido necessária para a reação foi adicionada
ao longo de 4 h de reação. Estes experimentos
foram realizados a 50 C com uma razão molar
álcool/ácido igual a 1/1 e 5 % m/m de
concentração de enzima. A adição escalonada
não favoreceu o consumo de ácido acético,
possivelmente porque a concentração de ácido
5
acético após a primeira adição de ácido já era de
2,7 mol L-1. Já o uso da bomba peristáltica
proporcionou uma conversão de ácido acético de
37 % após 4 h de reação.
A forma de adição do ácido acético através
do uso de uma bomba peristáltica foi uma
alternativa interessante, pois possibilitou uma
baixa concentração de ácido no meio reacional
evitando a desativação da enzima.
4. Conclusões
O estudo da esterificação do ácido acético
com o butanol para produção de acetato de
butila usando a lipase Novozym 435 mostrou que
esta enzima foi inativada na presença de excesso
de butanol e de concentrações elevadas de ácido
acético. O controle da concentração inicial deste
ácido pode ser feito através do uso de solventes
ou de diferentes formas de adição do ácido ao
meio reacional.
Na presença de hexano, a maior conversão
de ácido acético (96 %) foi obtida em um meio
reacional com uma razão molar álcool/ácido =
1/1 contendo 0,3 mol L-1 de ácido acético e 5 %
m/m de enzima a 50 C, após 4 h de reação.
Porém foi possível verificar a conversão de ácido
acético em acetato de butila em um meio
reacional cuja concentração inicial de ácido
acético foi de 3,0 mol L-1 tanto na presença de
hexano (41 %) quanto em excesso de butanol (50
%) a 50 C após 4 h empregando 25 % m/m de
Novozym 435 (em relação à quantidade inicial de
ácido).
A forma de adição do ácido acético ao
meio reacional é uma alternativa para prevenir a
inativação da enzima. A adição contínua do ácido
usando-se uma bomba peristáltica favoreceu a
formação de acetato de butila, tendo sido
alcançada uma conversão de 37 % a 50 C,
empregando 5 % m/m de concentração de
enzima e razão molar final álcool/ácido = 1/1.
6. Referências
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Bioengineering 103 (2007) 368-372.
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13. M. Nordblad, P. Adlercreutz. Journal of
Biotechnology 133 (2008) 127-133.
5. Agradecimentos
Os autores agradecem a Novozymes Latin
America Ltda (Brasil) pela doação da enzima
Novozym 435 e ao CENPES/PETROBRAS pelo
apoio financeiro.
XXV Congreso Iberoamericano de Catálisis
6