ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
LABORATÓRIO DE GENÉTICA DE RECURSOS MARINHOS
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DA
PIRAÚNA (Cephalopholis fulva: SERRANIDAE) AO LONGO
DA COSTA E ILHAS OCEÂNICAS BRASILEIRAS
Allyson Santos de Souza
Natal/RN – 2011
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DA
PIRAÚNA (Cephalopholis fulva: SERRANIDAE) AO LONGO
DA COSTA E ILHAS OCEÂNICAS BRASILEIRAS
Allyson Santos de Souza
Defesa apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências Biológicas
como pré-requisito para obtenção do
título de Mestre em Ciências Biológicas
pela
Universidade Federal do Rio
Grande do Norte.
Prof. Dr. Mauro Pichorim (Orientador)
Prof. Dr. Wagner Franco Molina (Co-orientador)
Natal/RN – 2011
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ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DA
PIRAÚNA (Cephalopholis fulva: SERRANIDAE) AO LONGO
DA COSTA E ILHAS OCEÂNICAS BRASILEIRAS
Allyson Santos de Souza
Banca examinadora:
Prof. Dr. Mauro Pichorim (Orientador)
Departamento de Botânica, Ecologia e Zoologia, UFRN
Prof. Dr. Wagner Franco Molina (Co-orientador)
Departamento de Biologia Celular e Genética, UFRN
Prof. Dr. Sérgio Maia Queiroz Lima (Membro externo)
Departamento de Genética, UFRJ
Prof. Dr. Adrian Antônio Garda
Departamento de Botânica, Ecologia e Zoologia, UFRN
Nata/RN - 2011
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ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
Agradecimentos
Agradeço primeiramente à Deus e aos espíritos protetores; Aos
meus pais, Azuílo e Rosália, pelo apoio e confiança sempre dados a
mim; Ao Professor Dr. Wagner Franco Molina pela orientação desde
2003, por acreditar no desenvolvimento deste projeto e pela amizade.
Muito obrigado por tudo!; À minha esposa Cristina, a qual sempre me
incentiva, apoia e colabora nos projetos profissionais e pessoais; Ao
Professor Dr. Mauro Pichorim pela orientação durante o mestrado e pela
amizade; À Academia Brasileira de Ciências e aos professores Dr.
Horácio Schneider e Dra. Iracilda Sampáio; À tia Neide por todo
incentivo; Ao amigos e companheiros de trabalho Antônio Jales e Eurico
Jr.; À Luciano de Rio do Fogo pelo apoio logístico; À José Garcia Jr. e a
galera do LGRM; Ao Prof. Dr. Walter e Louise da PPCB; À CAPES pela
bolsa concedida e a todos que contribuíram de forma direta ou indireta
no desenvolvimento deste trabalho.
iv
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS .............................................................................................v
LISTA DE TABELAS ...........................................................................................vi
RESUMO...............................................................................................................1
ABSTRACT...........................................................................................................2
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................3
2. OBJETIVOS ......................................................................................................8
2.1 Objetivos específicos ..........................................................................8
3. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................8
3.1 Coleta de material biológico ...............................................................8
3.2 Extração de DNA ................................................................................9
3.3 Amplificação e Sequenciamento da região hipervariável 1 (RHV-1)
da alça D-Loop do DNAmt ......................................................................10
3.4 Análises das Sequências ..................................................................10
4. RESULTADOS ...............................................................................................13
4.1 Características moleculares .............................................................13
4.2 Estrutura genética populacional........................................................16
4.3 Neutralidade e história demográfica .................................................20
5. DISCUSSÃO ...................................................................................................23
6. CONCLUSÕES ...............................................................................................32
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...............................................................33
v
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Histórico da produção pesqueira marinha no Brasil. ...........................3
Figura 2 – Alguns colomorfos de Cephalopholis fulva utilizados neste trabalho .5
Figura 3 – Representação esquemática do genoma mitocondrial dos
vertebrados. ..........................................................................................................7
Figura 4 – Pontos de coleta de Cephalopholis fulva ao longo da costa brasileira
e do Arquipélago de Fernando de Noronha. .........................................................9
Figura 5 – Representação esquemática da região d-loop. .................................10
Figura 6 – Análise de saturação entre as transições e transversões das
sequências d-loop de Cephalopholis fulva ..........................................................14
Figura 7 – Estrutura populacional de Cephalopholis fulva estimada com o
modelo K = 2 .......................................................................................................16
Figura 8 – Histograma de distribuição do parâmetro Alpha (α) para K = 2, sob
análise no programa Structure, no conjunto de dados de Cephalopholis fulva ...17
Figura 9 – Dendograma de similaridade entre as sequencias de d-loop de
Cephalopholis fulva gerado pelo método de NJ ..................................................18
Figura 10 – Frequências das diferenças par-a-par entre as sequências ............21
Figura 11 – Variações no nível do oceano Atlântico e o período de expansão
populacional (entre 117.000 e 132.000 anos – em amarelo) de Cephalopholis
fulva na costa brasileira .......................................................................................28
Figura 12 – Margem continental do tipo Atlântico...............................................29
Figura 13 – A costa nordeste do Brasil e Cadeia de Fernando de Noronha ao
longo das oscilações oceânicas nos últimos 350 mil anos ..................................30
vi
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Índices de diversidade genética entre sequências da RHV1 de
diferentes amostras geográficas de Cephalopholis fulva ....................................15
Tabela 2 - Haplótipos de sequencias de d-loop da espécie Cephalopholis fulva
compartilhados dentro e/ou entre regiões geográficas........................................15
Tabela 3 - Diferenciação genética entre as populações de Cephalopholis fulva a
partir da estimativa de FST ...................................................................................16
Tabela 4 - Análise da variância molecular das populações de Cephalopholis
fulva em diferentes agrupamentos ......................................................................17
Tabela 5 - Divergência genética intrapopulacional em Cephalopholis fulva com
base em sequencias da região hipervariável 1 do d-loop (DNAmt).....................17
Tabela 6 - Índices de neutralidade e expansão populacional de Cephalopholis
fulva da costa brasileira amostradas entre 2008 e 2010 .....................................20
vii
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
RESUMO
O Brasil possui cerca de 8.500 km de litoral e diante desta dimensão, a pesca
historicamente constitui uma importante fonte de proteína animal para consumo
humano. O histórico nacional na pesca mostra um crescimento da produção pesqueira
marinha até 1985 e a partir deste período registrou-se um contínuo decréscimo. A partir
do ano de 2003 as estatísticas pesqueiras apontam para certa “recuperação” da
produção pesqueira total, o que provavelmente esta relacionada a uma mudança nas
práticas do setor. O alvo da pesca comercial passou a ser espécies menores e de baixo
valor comercial, porém muito abundantes. A piraúna, Cephalopholis fulva (Serranidae) é
uma destas espécies alvo que vem sofrendo uma maior pressão pesqueira nos últimos
anos. A fim de fornecer dados sobre a real situação da diversidade genética destas
populações, diversos marcadores moleculares vêm sendo utilizados para esta
finalidade. O prévio conhecimento da variabilidade genética é crucial para o manejo e
conservação da biodiversidade. Neste intuito, sequências da região controle (d-loop) do
DNAmt de Cephalopholis fulva (Serranidae) de cinco pontos geográficos da costa
brasileira (Ceará, Rio Grande do Norte, Bahia e Espírito Santo) e o Arquipélago de
Fernando de Noronha (FN) foram sequenciadas e sua diversidade genética analisada.
Os valores de FST se revelaram muito baixos (0.0246 a 0.000), indicando intenso fluxo
gênico entre os pontos amostrados. Os índices h e π indicam um contato secundário
entre linhagens alopátricas previamente diferenciadas ou a grandes e estáveis
populações com longa história evolutiva; Os testes de Fu e Tajima indicaram expansão
para todas as populações. Já as diferenças par-a-par e o SSD indicaram expansão
apenas para as populações costeiras. Diferentemente de outras espécies do Atlântico
que foram profundamente afetadas por eventos Pleistocênicos mais tardios, os padrões
genético-populacionais presentes em C. fulva parecem estar relacionados a eventos
mais recentes ocorridos a cerca de 130.000 anos. Além disso, os dados apresentados
pelas amostras geográficas da espécie C. fulva demonstram elevada diversidade
genética, indicando ainda a ausência de efeitos deletérios da sobrepesca da espécie,
bem como evidências de panmixia plena tanto entre as áreas continentais, como entre
estas e o regiões insulares.
Palavras-chave: DNAmt, d-loop, filogeografia, serranidae, panmixia, pleistoceno.
1
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
ABSTRACT
Brazil has about 8,500 km of coastline and on this scale, fishing is a historically
important source of animal protein for human consumption. The national fishing background
shows a growth of marine fishery production until 1985 and within this period it was recorded
a steady decline. From the year 2003 fishing statistics aim to some "recovery" of the total
fisheries production, which probably is related to a change in industry practice. The target of
commercial fishing became smaller species with low commercial value, but very abundants.
The coney, Cephalopholis fulva (Serranidae), is one of these species that have been
suffering a greater fishing pressure in recent years. In order to provide data about the current
situation of the genetic diversity of these populations, several molecular markers have been
being used for this purpose. The prior knowledge of genetic variability is crucial for
management and biodiversity conservation. To this end, the control region sequences (dloop) of mtDNA from Cephalopholis fulva (Serranidae) from five geographical points of the
coast of Brazil (Ceará, Rio Grande do Norte, Bahia and Espírito Santo) and the Archipelago
of Fernando de Noronha (FN) were sequenced and their genetic diversity analyzed. The FST
values were very low (0.0246 to 0.000), indicating high gene flow between the sampled
spots. The indices h and π indicate a secondary contact between previously allopatric
lineages differentiated or large and stable populations with long evolutionary history. Tests of
Tajima and Fu showed expansion for all populations. In contrast, the mismatch distribution
and SSD indicated expansion just for coastal populations. Unlike other species of the Atlantic
which have been deeply affected by events on later Pleistocene, the population-genetic
patterns of C. fulva may be related to recent events occurred approximately 130,000 years
ago. Moreover, the data presented by geographical samples of the specie C. fulva showed
high genetic diversity, also indicating the absence of deleterious effects of over-exploitation
on this specie, as well as evidence of complete panmixia between all sampled populations.
Keywords: DNAmt, d-loop, filogeography, serranidae, panmixia, pleistocene.
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ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
1. INTRODUÇÃO
O Brasil possui cerca de 8.500 km de área costeira com algumas ilhas
oceânicas, as quais as principais são Fernando de Noronha, Atol das Rocas,
Arquipélago de São Pedro e São Paulo, Abrolhos, Trindade e Martin Vaz, totalizando
3,5 milhões de km² de ZEE (Zona Econômica Exclusiva), que se estende desde o
Cabo Orange (5º N) até o Chuí (34º S) e encontra-se, em sua maior parte, em
regiões tropicais e subtropicais (CNIO, 1998). Diante desta dimensão, a pesca situase entre as quatro maiores fontes de proteína animal para consumo humano no
país. O histórico oficial sobre a produção brasileira de pescado marinho para o
período de 1960 a 2009 mostra uma tendência de crescimento até 1985, quando
atingiu cerca de 760.400 toneladas. A partir de então, registrou-se um contínuo
decréscimo. Em 1990, o total pescado foi de apenas 435.400 t, uma queda de 57%
na produção. Apesar de alguma flutuação entre 1990 e 2002, a produção pesqueira
marinha parece ter ficado estagnada. Desde o ano de 2003 as estatísticas
pesqueiras apontam para certa recuperação da produção pesqueira total, chegando
a 585.000 toneladas no ano de 2009, como pode ser vista na Figura 1 (IBAMA,
2000, 2001, 2002a, 2002b, 2003, 2004, 2005, 2006 2007, 2008, 2009).
Figura 1. Histórico da produção pesqueira marinha no Brasil nos últimos
50
anos.
Fonte:
IBAMA
(http://www.ibama.gov.br/recursospesqueiros/documentos/estatistica-pesqueira/)
A exploração desordenada desses estoques pode acarretar sérios
problemas nas populações naturais. Essa exploração pode ultrapassar a produção
máxima sustentável (FAO, 1996), causando impacto na abundância das espécies
alvo e expondo-as à ameaça de extinção (Casey & Myers, 1998; Dulvy et al., 2004).
3
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
As espécies mais suscetíveis à sobrepesca são aquelas que apresentam
alto valor comercial, maturam tardiamente, possuem limitações geográficas e/ou
recrutamento esporádico (Sadovy, 2000; Dulvy et al., 2004). A sobrepesca provém
da redução significativa do número de adultos e da captura progressiva dos
indivíduos juvenis, o que compromete o recrutamento nos anos posteriores (Paes,
2002).
Outros fatores também tendem a influenciar a diversidade genética e o
tamanho das populações ao longo dos oceanos, tais como duração do período larval
pelágico e estratégia de reprodução das espécies, dinâmica das correntes oceânicas
e eventos históricos (Shulman & Bermingham, 1995; Shulman, 1998; Barber et al.,
2000; Nelson et al., 2000), tais como a série de períodos glaciais e interglaciais
ocorridas durante o período Pleistoceno (Imbrie et al., 1992).
Algumas espécies da família Serranidae apresentam características
biológicas peculiares que as tornam particularmente vulneráveis às mudanças
climáticas, à pressão da pesca e à degradação do habitat, tais como alta
longevidade, maturação sexual tardia, hermafroditismo, agregação reprodutiva e a
necessidade de "berçários" para os juvenis em regiões estuarinas (Coleman, 1999;
Morris et al., 2000). Segundo Morris et al. (2000), cerca de 40% das espécies dessa
família foram consideradas sob algum nível de ameaça diante da pressão antrópica.
Na subfamília Epinephelinae, com cerca de 159 espécies distribuídas em 15
gêneros (Nelson, 2006), estão presentes grandes serranídeos como o sirigado,
Mycteroperca bonaci (Poey, 1860) e o mero, Epinephelus itajara (Lichtenstein,
1822), espécies que possuem um grande valor econômico e ecológico, com
indicações que esta última esteja ameaçada de extinção no Brasil (MMA, 2004).
Pertencente a esta subfamília, a espécie Cephalopholis fulva (Linnaeus,
1758), popularmente conhecida como piraúna, apresenta uma ampla distribuição
geográfica na costa ocidental do Atlântico, desde as Bermudas e Carolina do Sul até
o sudeste do Brasil, incluindo o Atol das Rocas, o Arquipélago de Fernando de
Noronha (Heemstra & Randall, 1993; Freitas et al., 2003; Sazima et al., 2005) e as
Ilhas de Trindade e Martim Vaz (Gasparini & Floeter, 2001).
Ao longo da costa e ilhas oceânicas, podem ser encontradas piraúnas com
diferentes padrões de coloração (colomorfos), variando desde o amarelo até o
marrom-escuro (Figura 2)
4
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
Figura 2. Alguns colomorfos de Cephalopholis fulva utilizados neste trabalho (exceto o colomorfo A amarelo). A barra possui 1 cm.
A espécie Cephalopholis fulva é hermafrodita protogínica, ou seja, todos os
indivíduos nascem fêmeas. As fêmeas atingem a maturação sexual com um
comprimento total de 160 mm e a partir de 200 mm pode ocorrer reversão sexual,
onde os indivíduos tornam-se machos, apresentando territorialidade e formando
haréns (Heemstra & Randall, 1993; Coelho, 2001; Araújo & Martins, 2006).
Além disso, esta espécie apresenta alta variabilidade na relação entre idade
e comprimento. Araújo e Martins (2006) ao analisar essa relação em exemplares de
piraúna coletados ao longo da costa do Espírito Santo, encontraram indivíduos com
comprimento mínimo de 172 mm e máximo de 428 mm e idade mínima e máxima de
2 e 25 anos, respectivamente. Ainda segundo estes autores, a estimativa teórica dos
parâmetros de crescimento mostra que a piraúna cresce rapidamente no início da
vida, chegando a 60% do tamanho teórico máximo no primeiro ano e então segue
crescendo lentamente.
Entre 1996 e 2000 a piraúna representou 2,4% da produção total
desembarcada pela frota pesqueira no nordeste do Brasil (Frédou et al., 2006) e foi
a espécie mais abundante nas amostras coletadas entre os pescadores que fazem
pesca de linha na costa central do Brasil, entre 1997 e 1998 (Martins et al., 2007).
Klippel et al (2005) estimaram um desembarque médio de 1.116 toneladas/ano entre
1997 e 2000 naquela região. Martins et al. (2005) citam que o desembarque de C.
fulva, por parte dos barcos que realizam pesca de linha e anzol, tem aumentado
5
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
desde o início da década de 1990, nos portos do Espírito Santo, e seu principal
destino é a exportação para consumo nos Estados Unidos.
No porto de Natal, Rio Grande do Norte, ocorre algo semelhante. Apesar dos
barcos também utilizarem linha e anzóis, as piraúnas são principalmente pescadas
com armadilhas chamadas “covos”. Durante o presente estudo, foi consultada uma
empresa local a qual exporta a piraúna. Esta empresa informou que, apenas ela,
exporta em média duas toneladas de piraúna por mês, tendo como principais
destinos as cidades de Miami e Nova Yorque (EUA).
Apesar dos dados pesqueiros, Cephalopholis fulva é citada pela IUCN
(International Union for Conservation of Nature and Natural Resources) como
espécie “não ameaçada”, porém, em processo de “redução”. A pesca sobre esta e
várias outras espécies parece ter aumentado continuamente devido a um
deslocamento da pressão pesqueira sobre espécies de menor porte, tendo em vista
a diminuição das populações de peixes maiores e comercialmente mais valiosos
(IUCN, 2010). O aumento da produção pesqueira a partir do ano de 2003 (Figura 1)
pode estar relacionado a esse deslocamento da pressão pesqueira sobre espécies
que não eram atraentes do ponto de vista comercial.
Estudos sobre a biologia, ecologia e particularmente genética populacional
são extremamente escassos em Epinephelinae. Esta última abordagem tem sido
empregada de forma recente e crescente em serranídeos, peixes com alto valor
comercial e ecológico (Rivera et al., 2004; Zatcoff et al., 2004; Maggio et al., 2006;
Silva-Oliveira et al., 2008).
Para C. fulva existe um único estudo genético populacional, através de
isoenzimas, envolvendo as populações da costa do Ceará (n = 20) e do Atol das
Rocas (n = 5) (Freitas et al., 2003), embora de amplitude geográfica e amostral
restrita. Apesar de pioneiro, este estudo teve pequena capacidade explicativa sobre
as relações existentes entre as populações litorâneas e as das ilhas oceânicas
brasileiras, mediadas pelo cenário dinâmico das correntes oceânicas reinantes no
Atlântico Ocidental.
Nesse contexto, é imprescindível a realização de estudos que demonstrem a
real situação da variabilidade genética das populações de C. fulva para,
consequentemente, fornecer subsídios técnicos para a formulação de estratégias de
gestão dos recursos pesqueiros. O conhecimento prévio da variabilidade genética a
nível populacional é fundamental para a conservação dos recursos genéticos
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ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
naturais e da biodiversidade (Tzeng et al., 2004; Zhang et al., 2006) seja com fins
conservacionistas ou exploratórios (Begg & Waldmam, 1999).
A identificação de estoques pesqueiros e sua variabilidade genética tem sido
realizada de forma crescente e eficaz pela utilização de marcadores moleculares
altamente polimórficos (Blaber et al., 2005; Caddy & Seijo, 2005; Carmen & Ablan,
2006; Santos et al., 2006), como de sequências da região D-loop, também
conhecido como região controle do DNAmt. Esta região (Figura 3), por ter uma taxa
evolutiva duas a cinco vezes mais rápida que o restante do genoma mitocondrial
(Meyer, 1993), fornece informações genéticas que permitem inferir relações entre
táxons próximos e a história de populações através de estudos de fluxo gênico,
especiação, sistemática e estrutura de populações (Avise, 1994).
Figura 3. Representação esquemática do genoma mitocondrial dos vertebrados. Em destaque a
região D-loop, utilizada para inferir relações populacionais. Modificado de Shadel e Clayton
(1997).
7
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
2. OBJETIVOS
Quantificar a diversidade e conectividade genética entre populações de
Cephalopholis fulva, provenientes de diferentes regiões geográficas brasileiras,
costeiras e insulares, por meio da análise de sequências parciais da região D-loop
do seu genoma mitocondrial.
2.1. Objetivos específicos
• Estimar os índices de diversidade genética intra e interpopulacional de C. fulva
ao longo da costa do Brasil e Arquipélago de Fernando de Noronha;
• Analisar possíveis estruturações genéticas populacionais da espécie ao longo
do litoral brasileiro e/ou no Arquipélago de Fernando de Noronha;
• Inferir sobre a história demográfica das populações estudadas;
• Verificar, através de dados genéticos, indícios de sobrepesca para a espécie C.
fulva no Brasil.
• Verificar a eficiência do marcador mitocondrial D-loop para caracterização de
populações de Cephalopholis fulva.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Coleta de material biológico
Os pontos de coleta abrangeram mais de 2.700 km de litoral ao longo da
costa brasileira e os exemplares coletados foram identificados de acordo com
Heemstra e Randall (1993). Ao todo foram utilizados 189 indivíduos capturados com
o uso de anzóis, tarrafas ou covos no litoral brasileiro e no Arquipélago de Fernando
de Noronha.
Dos 189 indivíduos coletados, 37 foram provenientes da costa de Fortaleza
(CE) (3º42’S - 38º30’O), 36 do litoral de Rio do Fogo (RN) (5º16’S - 35º22’O)
(Licença IDEMA Dec. Nº 15.746/2001, Ofício Nº 574/2002-DG), 50 indivíduos de
Salvador (BA) (13º00’S - 38º29’O), 30 indivíduos da costa de Vila Velha (ES)
(20º20’S - 40º14’O) e 36 exemplares provenientes do Arquipélago de Fernando de
Noronha (FN, pertencente ao estado do Pernambuco) (3º50’S - 32º24’O), neste
último ponto sob a licença do IBAMA Nº 02001.001902/06-82 (Figura 4).
Fragmentos de tecido hepático e/ou nadadeiras foram retirados dos
exemplares, acondicionados em microtubos (1,5 ml) contendo solução fixadora de
DNA composta por álcool etílico e álcool metílico (1:1) e armazenados a temperatura
de -20°C.
8
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
3.2. Extração de DNA
A partir dos fragmentos de tecido obtidos de cada animal foi realizada a
extração de DNA, de acordo com o protocolo de Sambrook et al., (1989). As
amostras foram maceradas após imersão em nitrogênio líquido e homogeneizadas
em tampão de extração adicionado de Proteinase K. O DNA foi extraído com fenol,
clorofórmio e álcool isoamílico (25:24:1) e precipitado com NaCl 5M e isopropanol
100% gelado, recebendo ainda uma lavagem com etanol 70% gelado para retirada
do excesso de sal; e ressuspenso com água ultrapura. Após a extração, o DNA foi
quantificado a partir de comparação visual com auxilio de marcador de 100 pares de
bases em gel de agarose 0,8%. A corrida eletroforética teve duração de
aproximadamente 30 min de migração sob voltagem de 85 V, a partir da qual o gel
foi corado com brometo de etídio e observado com o auxílio do trans-iluminador de
luz ultravioleta.
Figura 4. Pontos de coleta de Cephalopholis fulva ao longo da costa brasileira e do Arquipélago
de Fernando de Noronha. CE = Ceará, RN = Rio Grande do Norte, FN = Arquipélago de
Fernando de Noronha, BA = Bahia e ES = Espírito Santo. O tracejado em vermelho destaca a
Cadeia de Fernando de Noronha com (acima) e sem batimetria (abaixo). Batimetria modificada
de Vital et. al. (2010). As estrelas vermelhas indicam os pontos onde as coletas foram
realizadas.
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ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
3.3. Amplificação e Sequenciamento da região hipervariável 1 (RHV-1) da alça
D-Loop do DNAmt.
A região controle do DNAmt foi amplificada, utilizando os primers Lee-CR-A
e Lee-CR-E descritos em Lee et al. (1995) (Figura 5).
Reações com volume total de 25 µl contendo 4 µl de DNTP (1,25 mM), 2,5 µl
de tampão (10x), 1 µl de MgCl2 (50 mM), 2,0 µl de cada primer (10 pmol/µl), 1-1,5 µl
de DNA total, 0,3 µl de Taq DNA Polimerase (5U/µl) (Invitrogen, EUA) e água
purificada para completar o volume final, foram realizadas nas seguintes condições:
desnaturação inicial a 94 ºC por 2 minutos; 30 ciclos de desnaturação a 94 ºC por 45
segundos, hibridização a 52 ºC por 45 segundos, extensão a 72 ºC por 1 minuto; e
extensão final a 72 ºC por 2 minutos. Os produtos da PCR foram purificados com as
enzimas exonuclease I e fosfatase alcalina de camarão (GE Healthcare), com o
auxílio do termociclador, submetendo-se o DNA amplificado a uma ciclagem de 30
minutos a 37 ºC e 15 minutos a 80 ºC para ação das enzimas.
Em seguida as amostras seguiram para a reação de sequenciamento do
DNA que foi realizada na Plataforma de Sequenciamento da EMBRAPA
(Brasília/DF).
Figura 5. Representação esquemática da região d-loop. Setas com letras acima indicam o local onde
o respectivo primer se anela e sentido da síntese do DNA; RHV (Região Hipervariável); “CytB” indica
o final do fragmento de Citocromo B; “12S rRNA” indica o início do gene 12S. No retângulo, as
sequências dos primers A (Lee-CR-A) e E (Lee-CR-E) utilizados neste estudo.
3.4. Análises das Sequências
Após o sequenciamento, os cromatogramas obtidos foram visualizados para
conferência e as sequências de bases nucleotídicas alinhadas através do programa
BIOEDIT (Hall, 1999).
A existência de saturação entre as transições e transversões ao longo das
sequências foi analisada através do programa DAMBE (Xia & Xie, 2001). Este teste
verifica a ocorrência de mais de uma substituição em determinados sítios. Como
10
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
resultado tem-se um gráfico onde a coordenada representa os valores das
distâncias de cada par de táxons usados e a abscissa o número de transições (Xs)
ou de transversões (∆v) presentes em cada par de táxons. No caso de não haver
saturação, a relação entre estes parâmetros é linear, isto é, com o aumento da
distância, há o aumento do número de Xs ou ∆v. Se houver substituições múltiplas,
o gráfico atinge um platô no qual, aumentando-se a distância, não há o aumento no
número de Xs ou ∆v (Pereira, 2000).
Pelo programa ARLEQUIN 3.5 (Excoffier & Lischer, 2010) foram calculados
os índices de diversidade genética haplotípica (h; Nei, 1987), nucleotídica (π; Nei,
1987) e a diferenciação genética entre as populações a partir da estimativa de FST
(Wright, 1978) com testes de significância dos resultados baseados em 10.000
permutações. O índice FST de Wright representa uma medida do grau de
diferenciação genética ou de subdivisão interpopulacional (Slatkin, 1993). Segundo
Wright (1978), valores entre 0 e 0.05 indicam pouca diferenciação genética, entre
0.05 e 0.15 indicam diferenciação moderada, entre 0.15 e 0.25, alta diferenciação e
valores acima de 0.25 representariam diferenciação genética muito alta.
Como abordagem complementar para explorar a estrutura genética das
populações, uma análise Bayesiana, implementada no programa Structure v2.2
(Pritchard et al. 2000), foi realizada para inferir o número mais provável de grupos
genéticos representados nas amostras (K). O método de atribuição Bayesiana
delineia grupos de indivíduos com base em múltiplos loci do genótipo sem a
utilização de qualquer informação geográfica ou fenotípica.
Vinte corridas foram realizadas no programa Structure para cada K. Foram
testados K = 1 – 12, assumindo o “modelo de mistura” e “frequências alélicas
correlacionadas”. Para cada corrida, 100.000 interações MCMC (Markov Chain
Monte Carlo) foram realizadas após um período burn-in de 50.000 interações. Além
disso, foi seguida a recomendação de Evanno et al. (2005) e calculada a estatística
de ∆K para detectar o verdadeiro K, baseado na taxa de mudança de segunda
ordem em LnP(D), que é uma estimativa da probabilidade posterior dos dados para
um dado K. Nesta análise, o nível de mistura dentro de cada população foi avaliado
ao estimar a percentagem média de adesão (Q) em cada grupo genético, o qual foi
obtido pela média dos coeficientes de adesão individual (q). A média do LnP(D) das
vinte corridas realizadas para cada K foram utilizadas na determinação do K
verdadeiro.
11
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
A fim de evidenciar possíveis agrupamentos genéticos entre os indivíduos
amostrados, utilizou-se o programa MEGA4 (Tamura et al., 2007) para verificar a
porcentagem de divergência genética entre as sequências e para a confecção de um
dendograma de similaridade genética utilizando o método de agrupamento de
vizinhos (neighbor-joinning). A confiabilidade dos ramos foi testada pela análise de
bootstrap utilizando 1000 replicações.
Para avaliar a diversidade na estrutura genética populacional, foi empregada
a análise hierárquica da variância molecular (AMOVA) através de seus índices
(Excoffier et al., 1992) e para verificar a possível ocorrência de eventos de expansão
demográfica histórica foram examinadas por diferentes abordagens, ambas as
análises utilizando o programa ARLEQUIN 3.5 (Excoffier e Lischer, 2010).
Um conjunto de testes foi empregado para evidenciar possíveis eventos de
expansão populacional. Os testes Fs (Fu, 1997) e D (Tajima, 1989) foram utilizados,
com 10.000 permutações, para verificar se a neutralidade se mantém. Estes testes
analisam a influência das mutações sobre a história de vida das populações. O
desvio do equilíbrio neutro só ocorre quando estes valores são significativamente
maiores ou menores que zero. Os valores positivos de Fs sugerem seleção
balanceadora, subdivisão populacional ou efeito gargalo; valores negativos sugerem
seleção direcional recente, seleção de alelos ligeiramente deletérios, expansão
populacional ou efeito carona (hitchhiking) (Fu, 1997). Valores positivos de D
sugerem a existência de um gargalo populacional recente ou alguma forma de
seleção balanceadora; valores negativos de D sugerem expansão populacional
(Tajima, 1989). O índice de raggedness (Harpending, 1994) e a Soma dos Desvios
Quadrados (Sum of Square Deviations - SSD; Schneider & Excoffier, 1999) entre a
distribuição observada e esperada também foram utilizados como testes estatísticos
para validar ou não o modelo de expansão estimado pelos testes de Fu e Tajima.
Populações em expansão exibem baixos valores de raggedness, enquanto, o oposto
é observado em populações estáveis ao longo do tempo (Harpending, 1994). A
significância do SSD (valor p) foi obtida com 10.000 réplicas de bootstrap
paramétrico. Neste teste, se 95% ou mais da distribuição mismatch simulada
mostram um melhor ajuste da curva que o observado, a hipótese de expansão é
rejeitada. Tanto o índice de raggedness quanto o SSD indicam a existência ou não
de expansão populacional utilizando como hipótese nula a não ocorrência de
expansão da população. Complementarmente, a condição de crescimento
populacional foi investigada através da análise das frequências das diferenças par-a12
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
par (distribuição mismatch) com base em três parâmetros, θ0, θ1 (frequências das
diferenças par-a-par entre as sequências antes e após a expansão da população) e
τ (tempo de expansão expressa em unidades de tempo mutacional e representada
pela letra grega Tau) (Rogers & Harpending, 1992; Rogers, 1995). Os parâmetros de
expansão demográfica τ, θ0 e θ1 foram estimados através de uma abordagem não
linear de mínimos quadrados generalizados e os intervalos de confiança dos
parâmetros foram calculados utilizando uma abordagem paramétrica de bootstrap
(Schneider & Excoffier, 1999). Valores de τ foram transformados em tempo real,
desde o tempo estimado de expansão, através de duas equações: Primeiramente, u
= µ . mt, onde “u” é a taxa mutacional por geração, "µ" (mi) taxa de mutação
estimada para o segmento analisado; "mt" é a quantidade de bases nucleotídicas
analisadas. Posteriormente, τ = 2ut, onde "t" é o tempo estimado de ocorrência da
expansão desde então. O tempo de geração adotado para a espécie C. fulva foi de
um ano, com base em Heemstra e Handall (1993) e Araújo e Martins (2006, 2009).
Para datar os eventos de expansão populacional utilizou-se a diferenciação entre
Chromis multilineata e Chromis atrilobata, ambos Perciformes, assim como C. fulva
após o surgimento do Istmo do Panamá. Este evento vicariante tem sido usado em
vários estudos para calibrar e estimar as taxas de mutação (µ) em linhagens
estreitamente relacionados (Bermingham & Lessios, 1993; Knowlton et al., 1993;
Bermingham & Lessios, 1993; Bermingham et al., 1997; Donaldson & Wilson, 1999;
McCartney et al., 2000, Domingues et al., 2006; Craig, et al., 2009), bem como os
mesmos primers utilizados no presente estudo (CR-A e CR-E) para amplificar a
RHV1 do D-Loop das espécies C. multilineata e C. atrilobata, da costa oeste do
México (Oceano Atlântico) e costa leste do Panamá (Oceano Pacífico),
respectivamente (Domingues et al., 2005). Com base na divergência nucleotídica
das sequências RHV1 entre estas duas espécies e no tempo de separação entre
elas devido ao surgimento do Istmo do Panamá (3.1–3.5 Ma; Coates e Obando,
1996), estabeleceu-se uma taxa mutacional (µ) entre 8.24 x 10-8 e 9,30 x 10-8
(mutação/ano). Estas taxas foram utilizadas para estimar o tempo da possível
expansão demográfica nas populações de Cephalopholis fulva.
4. RESULTADOS
4.1. Características moleculares
A amostragem abrangeu pontos geográficos em praticamente toda a área de
distribuição de Cephalopholis fulva na costa brasileira, incluindo o Arquipélago de
13
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
Fernando de Noronha. Um total de 5% das sequências obtidas foram repetidas,
indicando completa concordância entre as amostras. As sequências da região HVR1
aqui analisadas não apresentaram indícios de saturação entre as transições e
transversões (Figura 6).
Figura 6. Análise de saturação entre as transições e transversões das sequências d-loop de
Cephalopholis fulva.
Ao todo, 189 amostras da espécie foram sequenciadas, produzindo
fragmento de 431 pares de base (pb). Para um melhor alinhamento entre as
sequências foi estabelecida uma sequência consenso de 436pb devido à inserção
de gaps (ocasionado pelas inserções ou deleções nucleotídicas). Foram
encontrados 89 sítios parcimônia-informativos dentre 153 substituições nucleotídicas
(23 transversões e 130 transições). Entre as sequências analisadas, o conteúdo A/T
foi claramente maior (72,74%) do que o G/C (médias: G = 10,86%, C = 16,39%, T =
28,43% e A = 44,31%). Outros autores já haviam descrito que o D-Loop é uma
região do genoma mitocondrial rica em bases A/T (Brown et al., 1986; Saccone et
al., 1987; Chiang et al., 2006; Kong et al., 2010). Além disso, a quantidade de bases
nucleotídicas da região D-Loop de C. fulva seguiu a regra A > T > C > G, o que
parece ser uma característica comum para organismos distintos (Sbisà et al., 1997).
Encontramos 160 haplótipos únicos dentre as 189 amostras sequenciadas
com similaridade que variava de 95,4% a 100%. A diversidade haplotípica (h), para
as amostras, por sua vez, variou de 0,977 a 0,998 e a diversidade nucleotídica (π)
de 0,062 a 0,070 entre os sítios (Tabela 1).
14
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
Tabela 1. Índices de diversidade genética entre sequências da RHV1 de diferentes amostras
geográficas de Cephalopholis fulva.
Pontos amostrais
N
H
h* ± DP
π* ± DP
CE
37
36
0,998 ± 0,006
0,066 ± 0,034
RN
36
32
0,992 ± 0,009
0,062 ± 0,033
FN
36
34
0,996 ± 0,007
0,063 ± 0,033
BA
50
46
0,995 ± 0,005
0,065 ± 0,034
ES
30
22
0,977 ± 0,014
0,070 ± 0,037
Todos
189
160
0,997 ± 0,001
0,064 ± 0,033
N = Número amostral; H = Número de haplótipos; h = Diversidade haplotípica; π = Diversidade
nucleotídica; *sem correção Gamma; DP = Desvio Padrão.
Todas as populações apresentaram ao menos um haplótipo compartilhado
com outra população, exceto o Espírito Santo que não compartilhou nenhum com
Fernando de Noronha, Rio Grande do Norte e Ceará (Tabela 2).
Tabela 2. Haplótipos de sequencias de d-loop da espécie Cephalopholis fulva compartilhados dentro
e/ou entre regiões geográficas.
NÚMEROS DE CADA HAPLÓTIPOS POR POPULAÇÃO
HAPLÓTIPOS
Ceará
Hap_7 (6)
Hap_10 (3)*
1
Hap_15 (2)*
Hap_16 (2)*
Rio Grande
do Norte
Fernando de
Noronha
Bahia
3
2
1
1
1
Espírito Santo
2
1
Hap_22 (2)*
1
2
Hap_49 (2)*
1
Hap_52 (2)*
2
Hap_57 (2)*
1
1
1
Hap_67 (2)*
2
Hap_96 (4)*
1
3
Hap_99 (2)*
2
Hap_100 (2)*
2
Hap_106 (2)*
1
1
Hap_109 (2)*
1
1
Hap_142 (2)*
2
Hap_144 (3)*
3
Hap_145 (2)*
2
Hap_147 (2)*
2
Hap_151 (2)*
2
Hap_157 (3)*
*total de haplótipos.
3
15
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
4.2. Estrutura genética populacional
O FST de Wright (1978) se mostrou negativo ou não significativo para a
maioria das populações. Entre as populações do nordeste brasileiro (Ceará, Rio
Grande do Norte e Bahia) incluindo as ilhas de Fernando de Noronha, o fluxo gênico
é irrestrito, porém, a população do Espírito Santo apresentou pequena diferenciação
genética em relação às demais, exceto com o Ceará (Tabela 3).
Tabela 3. Diferenciação genética entre as populações de Cephalopholis fulva a partir da
estimativa de FST.
Rio Grande do Norte
Ceará
Fernando de Noronha
Bahia
Espírito Santo
Rio Grande do Norte
Ceará
Fernando de Noronha
-0,0218
-0,0044
0,0018
0,0246*
0,0043
0,0035
0,0057
0,0028
0,0199*
Bahia
0,0171*
*Significativo para 95% de confiabilidade (p < 0,05);
A análise de agrupamento onde apenas os valores de LnP(D) para os
diferentes Ks foram considerados, não foi clara em relação ao melhor número de
grupos genéticos para os dados. Porém, a estatística ∆K (Evanno et al., 2005)
indicou a existência de dois agrupamentos distintos (o mais alto ∆K foi obtido para K
= 2) (Figura 7). Os valores de α para o conjunto de dados variou de 0,04 a 0,22
(Figura 8).
Figura 7. Estrutura populacional de Cephalopholis fulva estimada com o modelo K = 2. Cada
indivíduo é representado por uma linha vertical e dividido em duas cores (referentes aos dois Ks, ou
dois agrupamentos, evidenciados nesta análise). A fração de cada cor é proporcional à estimativa
daquele indivíduo pertencer ao agrupamento verde ou vermelho. Linhas verticais pretas separam os
indivíduos por populações.
16
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
Figura 8. Histograma de distribuição do parâmetro Alpha (α) para K = 2, sob análise no programa
Structure, no conjunto de dados de Cephalopholis fulva.
O dendograma de similaridade, utilizando o método de agrupamento de
vizinhos (NJ), apresentou a grande maioria dos ramos com baixos valores de
bootstrap, exibindo ausência de qualquer forma de estruturação populacional. Podese constatar pelo dendograma gerado que não há qualquer indício de diferenciação
populacional e que 87% dos indivíduos analisados apresentam uma relação
politômica (Figura 9).
17
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
Figura 9. Dendograma de similaridade entre as sequencias de d-loop de Cephalopholis fulva gerado
pelo método de NJ. Valores de bootstrap acima de 70 são mostrados nos ramos correspondentes.
Cada ramo da árvore representa um indivíduo. As letras representam as populações e os números
são referentes à sua identificação na amostragem.
Análises levando-se em consideração os colomorfos não evidenciaram
qualquer relação com possíveis diferenciações genéticas entre eles.
Diferentes agrupamentos populacionais foram testados por meio da Análise
da Variância Molecular (AMOVA) com base nos indícios de estruturação exibidos
pelos valores de FST (Tabela 3).
Ao confrontar a população do Espírito Santo contra as demais populações
individualmente, verificamos que o ela difere 1,72%, 2,00% e 2,46% da Bahia,
Arquipélago de Fernando de Noronha e Rio Grande do Norte. Porém, os valores de
FST apresentaram diferenciação de 0,5% entre o Espírito Santo e o Ceará, no
entanto, esta não foi significativa (p = 0,2). Para os agrupamentos “(ES) x (RN, FN,
BA)” e “(ES) x (RN, FN, BA, CE)” não foram encontradas diferenciações
significativas. Em todos os agrupamentos testados, as maiores variações ocorreram
entre os indivíduos dentro das populações (entre 97,54 e 98,28%) (Tabela 4).
18
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
Tabela 4. Análise da variância molecular das populações de Cephalopholis fulva em diferentes
agrupamentos.
Grupos
Fonte de Variação
Variação
Estatística F
Valor p
(ES, RN)
(ES, FN)
(ES, BA)
(ES, CE)
((ES) x (RN, FN, BA))
((ES) x (CE, RN, FN, BA))
(ES, CE, RN, FN, BA)
Entre populações
2,46%
ɸ/FST=0,024
p=0,01*
Entre indivíduos dentro das
populações
97,54%
-
Entre populações
2,00%
ɸ/FST=0,019
Entre indivíduos dentro das
populações
98,00%
-
Entre populações
1,72%
ɸ/FST=0,017
Entre indivíduos dentro das
populações
98,28%
-
Entre populações
0,57%
ɸ/FST=0,,005
Entre indivíduos dentro das
populações
99,43%
-
Entre grupos
2,12%
ɸ/FCT=0,021
p=0,25
Entre as populações dentro
dos grupos
0,01%
ɸ/FSC=0,000
p=0,40
Entre indivíduos dentro das
populações
97,87%
ɸ/FST=0,021
p=0,02*
Entre grupos
1,97%
ɸ/FCT=0,019
p=0,19
Entre as populações dentro
dos grupos
0,00%
ɸ/FSC=0,000
p=0,60
Entre indivíduos dentro das
populações
98,2%
ɸ/FST=0,018
p=0,08
Entre populações
0,5%
ɸ/FST=0,005
p=0,08
Entre indivíduos dentro das
populações
99,5%
-
p=0,02*
p=0,02*
p=0,20
-
-
ɸ/FST = Diferença genética entre populações, ɸ/FCT = ,= entre grupos definidos a priori e ɸ/FSC = entre populações
dentro dos grupos. *significativo (p < 0,05).
A divergência entre as sequências foi estimada para cada população
individualmente. A menor divergência foi encontrada para as populações do CE e
ES, onde ambas variaram entre 0,00 e 3,7%, e a maior divergência foi encontrada
entre as sequências de FNoronha (0,00 a 4,6%) (Tabela 5).
Tabela 5 – Divergência genética intrapopulacional em Cephalopholis fulva com base
em sequencias da região hipervariável 1 do d-loop (DNAmt).
Populações
Divergência entre sequências
RN
0,0 – 4,1%
CE
0,0 – 3,7%
FN
0,0 – 4,6%
BA
0,0 – 4,3%
ES
0,0 – 3,7%
19
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
4.3. Neutralidade e história demográfica
Os testes de neutralidade Fs e D apresentaram valores negativos e
significativos para todas as populações analisadas, exceto a população do Espírito
Santo que apresentou valor D negativo, porém não significativo (Tabela 6).
A análise dos histogramas de frequência das diferenças par-a-par
(distribuição mismatch) das populações revelou um padrão suave e unimodal para
todos os locais amostrados (Figura 10 a, b, c, e, f), exceto para a população de
Fernando de Noronha, que apresentou tendência a formar um padrão bimodal de
distribuição (Figura 10 d), típico de populações estáveis.
O índice de raggedness (Harpending, 1994) e o teste da Soma dos Desvios
Quadrados (SSD) exibiu valores p não significativos (p > 0,05) para todas as
populações analisadas, indicando expansão populacional exceto a população de
Fernando de Noronha, onde a hipótese nula de estabilidade populacional foi aceita
(Tabela 6).
Com base nos valores τ, as populações costeiras apresentaram valores
semelhantes, senão iguais deste índice (Tabela 6). A expansão da população do
Espírito Santo teria ocorrido entre 143 e 127 mil anos (média de 135 mil anos),
enquanto na costa nordeste do Brasil (Ceará, Rio Grande do Norte e Bahia), a
expansão teria ocorrido entre 132 e 117 mil anos (média de 124,5 mil anos).
20
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
Figura 10. Frequências das diferenças par-a-par entre as sequências. A, Rio Grande do
Norte; B, Ceará; C, Bahia; D, Arquipélago de Fernando de Noronha; E, Espírito Santo e
F, todas as populações.
21
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
Tabela 6. Índices de neutralidade e expansão populacional de Cephalopholis fulva da costa brasileira amostradas entre 2008 e 2010.
Tajima´s D
FS Fu
Distribuição Mismatch
Locais
D
p
Fs
p
Rag, (p)
SSD (p)
Ɵ0
Ɵ1
τ
Tempo da expansão (Ma)
Ceará
-1,70
0,02
-24,78
0,00
0,006 (0,73)
0,001 (0,60)
0,010
234,843
9,4
0,132 - 0,117
RGNorte
-1,66
0,02
-22,60
0,00
0,008 (0,68)
0,003 (0,45)
0,000
69,921
9,4
0,132 - 0,117
FNoronha
-1,66
0,02
-24,80
0,00
0,005 (0,84)
0,037 (0,00)
-
-
-
-
Bahia
-1,71
0,01
-24,76
0,00
0,005 (0,84)
0,000 (0,83)
0,015
98,046
9,4
0,132 - 0,117
ESanto
-1,04
0,14
-6,58
0,01
0,015 (0,11)
0,007 (0,10)
0,000
9999,00
10,2
0,143 - 0,127
Todos
-1,93
0,00
-24,35
0,00
0,004 (0,73)
0,000 (0,62)
0,047
121,718
9,4
0,132 - 0,117
Tajima´s D = Estatística de Tajima (Tajima, 1989); FS Fu = Estatística de Fu (Fu, 1997); Rag, = Índice Raggedness; τ = (tau) Unidade de crescimento
populacional; Ɵ0 e Ɵ1 = Frequências das diferenças par-a-par entre as sequências antes e após o crescimento da população; Ma = Milhões de anos,
respectivamente, Ceará = Estado do Ceará, RGNorte = Estado do Rio Grande do Norte, FNoronha = Arquipélago de Fernando de Noronha, Bahia = Estado da
Bahia, ESanto = Estado do Espírito Santos.
22
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
5. DISCUSSÃO
As amostras geográficas de piraúna apresentaram altos valores de
diversidade haplotípica (0,998 - 0,977) e nucleotídica (6% - 7%). De acordo com
Grant e Bowen (1998), alta diversidade haplotípica acompanhada de alta
diversidade nucleotídica pode ser atribuída à contato secundário entre linhagens
alopátricas previamente diferenciadas ou à grandes e estáveis populações com
longa história evolutiva. Contudo, diante dos dados obtidos neste estudo, a segunda
condição parece mais parcimoniosa.
Para todas amostras geográficas, os diferentes índices apontam expansão
populacional, exceto Fernando de Noronha. Dentre todas regiões analisadas, a
amostra do Espírito Santo apresentou a menor diversidade haplotípica (h = 0,977).
Apesar de não se descartar a existência da maior frota pesqueira e, consequente
maior pressão sobre a espécie naquela região, a diversidade haplotípica, quando
comparada com outras espécies ainda é elevada, mesmo entre espécies que não
são alvos de exploração, como Scarus psittacus (Winter et. al,. 2010) com h = 0,83,
Chromis chromis com h = 0,79 (Domingues et al., 2005) e Ophioblennius atlanticus
exibindo h = 0,80 (Muss et al., 2001).
Valores de diversidade semelhantes aos encontrados para piraúna são
reportados para representantes das mais diversas famílias, tais como Lutjanidae Lutjanus erythropterus (h = 0,94 – 0,99; π = 0,02 – 0,03; Zhang et al., 2006),
Pomacentridae - Chromis limbata (h = 0,94 – 1,00; π = 0,03 – 0,05; Domingues et
al., 2006), Scombridae - Thunnus obesus (h = 0,99 – 1,00; π = 0,03 – 0.04; Chiang
et al., 2006), Scaridae - Chlorurus sordidus (h = 0,97 – 1,00; π = 0,02 – 0,04; Bay et
al., 2004), entre outros. Geralmente estes valores são encontrados em espécies
amplamente distribuídas e que ainda não sofreram, pelo menos em grande
extensão, pressão da sobrepesca.
O FST de Wright (1978) revelou um fluxo gênico intenso entre as populações
do nordeste brasileiro e valores um pouco maiores na população do Espírito Santo,
sugerindo algum grau de isolamento. Porém, curiosamente, mesmo sem haplótipos
compartilhados, os dados entre Espírito Santo e Ceará indicaram um alto fluxo
gênico. Esta condição é peculiar tendo em vista as populações intermediárias,
seguindo a linha da costa no sentido sul/norte, da Bahia e Rio Grande do Norte entre
estas regiões. Cenários complexos de restrições populacionais poderiam gerar um
padrão deste tipo, contudo, diante de uma história geomorfológica mais ortodoxa em
23
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
relação a outras áreas do Atlântico, parece pouco provável, possivelmente estando
relacionado a efeitos amostrais.
No único trabalho anterior abordando a genética populacional de C. fulva,
através de isoenzimas, apesar de um número limitado de indivíduos analisados as
amostras do Atol das Rocas (n = 5) e do Ceará (n = 20), indicaram para aquelas
localidades a ocorrência de fluxo gênico irrestrito (FST = 0,048, p > 0,05) (Freitas et
al., 2003),
Diante das similaridades genéticas entre Atol das Rocas e Ceará e entre
Ceará e Fernando de Noronha (Tabela 3) é provável que os indivíduos de C. fulva
do Atol das Rocas e de Fernando de Noronha constituam um mesmo pool gênico
com acentuadas similaridades entre si. Além disso, dois fatores tendem a contribuir
para este cenário: as montanhas submersas da “Cadeira de Fernando de Noronha”
e as correntes oceânicas daquela região, principalmente as correntes Sul Equatorial
e Equatorial Atlântica.
A maior divergência genética encontrada envolveu as amostras do Espírito
Santo e Rio Grande do Norte (2,46%) (Tabela 3), porém, entre as sequencias de
Fernando de Noronha foram encontradas diferenças de até 4,6% apesar do reduzido
espaço geográfico (Tabela 5).
Apesar de não se descartar o envolvimento de contingências históricas e
paleogeológicas, a similaridade genética encontrada entre Espírito Santo e Ceará
parece estar relacionada a casualidade amostral, entre amostras que exibem altos
valores de diversidade e baixo limite de diferenciação genética. Assim, mesmo
quando se comparam os valores de FST para a população de C. fulva do Espírito
Santo, em relação às demais áreas, com os exibidos por outras populações de
outros Serranídeos, percebe-se que estes são realmente baixos. Isto é evidenciado
entre populações das espécies Epinephelus akaara (FST ≤ 0,379; p < 0,001), (Chen
et al., 2008) e E. itajara (FST ≤ 0,287; p < 0,010) (Silva-Oliveira et al., 2008) utilizando
sequências D-Loop, ou mesmo em E. labriformis (FST ≤ 0,661; p = 0,001), analisando
sequências do citocromo b (Craig et al., 2006) onde fica demonstrada uma alta a
muito alta diferenciação genética.
A análise desta estrutura populacional pelo método de agrupamento
bayesiano através da estatística ∆K indicou a existência de dois agrupamentos, o
que não foi possível distinguir graficamente (Figura 7). Isto corrobora a pequena
diferenciação genética evidenciada pelos valores de FST.
24
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
Condição semelhante foi observada em populações de Syngnathus floridae
do Atlântico e do Golfo do México que revelaram resultados semelhantes ao
presente trabalho. Nesta espécie baixos valores de FST ocorrem entre as
populações, os quais variaram entre 0,001 e 0,054, com um K = 2 (Mobley et al.,
2010). No entanto, diferentemente de C. fulva, as análises pelo Structure
evidenciavam
claramente
dois
agrupamentos
distintos,
um
formado
pelas
populações do Atlântico e outro pelas do Golfo do México. Como poderiam os
valores baixos de FST resultar em clara diferenciação populacional pelo método
bayesiano em S. floridae e não em C. fulva? Esta incoerência exibida entre esses
dois conjuntos de dados, pode ser aparentemente explicado para C. fulva pelo
isolamento pela distância dos dados e se refere à ideia de que indivíduos podem
estar espacialmente distribuídos em uma região, mas com dispersão local (Pritchard
et al., 2007. Nesta situação as frequências alélicas variam gradualmente nas regiões
e quando isto ocorre, o valor de K inferido e suas frequências alélicas para cada
grupo podem ser bastante arbitrárias. Em casos como este sugere-se analisar
“pontos informais” para a escolha do K real (Pritchard et al., 2007). Um destes
pontos é o parâmetro α (alpha). Se as populações são realmente separadas, α se
manterá relativamente constante, muitas vezes com um intervalo de 0,2 ou menos.
Entretanto, se não há uma estrutura populacional real, α normalmente irá variar
muito (Pritchard et al. 2007). De fato esta foi a condição encontrada entre as
amostras geográficas de C. fulva, pois, α variou bastante, num intervalo entre 0,04 e
0,22. Estes dados corroboram os resultados do FST, onde o alto fluxo gênico entre os
pontos amostrados mantém a ausência de forte diferenciação genética ao longo da
costa e ilhas oceânicas, favorecendo um quadro de panmixia.
A falta de diferenças significativas dentro dos agrupamentos “(ES) x (RN,
FN, BA)” e “(ES) x (RN, FN, BA, CE)” apontada pela AMOVA, isto indica um cenário
de panmixia recente, embora pouco claro se em processo de homogeneização ou
de divergência genética. As condições físicas presentes entre as regiões
continentais analisadas para a piraúna apresentam algumas características que
favorecem a coesão genética entre os indivíduos e favorecem a existência de fluxo
gênico regular entre todas as regiões amostradas.
Cephalopholis fulva exibe alta produção larval, com liberação de 150.000 a
282.000 ovos por fêmea (Heemstra & Randall, 1993); grande capacidade de
dispersão e colonização, diante da distribuição a qual a espécie é encontrada
(Nelson, 2006; Heemstra & Randall, 1993); mesmo sem dados específicos, pertence
25
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
a uma família a qual o período larval pelágico pode ser de até 80 dias em algumas
espécies (Lara et al., 2009) e, associado a estes fatores, no litoral Atlântico brasileiro
está submetida a influência de correntes oceânicas que favorecem a dispersão larval
e a consequente homogeneização populacional.
Na região de abrangência dos pontos amostrados para C. fulva, a corrente
Sul-Equatorial flui no sentido Leste/Oeste e se bifurca entre as latitudes 12 e 14,
formando a Corrente Norte do Brasil e a Corrente do Brasil. A Corrente do Brasil flui
paralela à plataforma continental, no sentido nordeste/sudeste enquanto a Corrente
Norte do Brasil no sentido nordeste/norte (Castro & Miranda, 1998; Lumpkin &
Garzoli, 2005). Já na região da cadeia de montanhas de Fernando de Noronha, a
Corrente Equatorial Atlântica, originada entre a costa norte e nordeste do Brasil, flui
por baixo e em sentido oposto à Corrente Sul Equatorial (Mendes, 2006). Os dados
encontrados indicam que estas correntes desempenham um papel importante na
dispersão larval de diversas espécies de peixes ao longo da costa e ilhas emersas e
submersas da cadeia de Fernando de Noronha.
O índice de raggedness (Harpending, 1994) se mostrou baixo e não
significativo (p > 0,05) para todas as populações, sugerindo expansão populacional.
Os testes de neutralidade de Fu (Fs) (Fu, 1997) e Tajima (D) (Tajima, 1989) para as
amostras apresentaram valores negativos e significativos para todas as populações
de C. fulva, exceto para o Espírito Santo cujo valor D negativo não era significativo,
indicando que na região do CE, RN, BA e FN as populações de C. fulva teriam
sofrido expansão populacional.
A inferência de expansão através de análise das diferenças par-a-par
(mismatch distribution) também indicam ter havido expansão populacional em todos
os pontos amostrado, que apresentaram histogramas suaves e unimodais, exceto
em Fernando de Noronha, que mostrou tendência a formar um padrão bimodal,
característico de populações estáveis (Slatkin & Hudson, 1991; Rogers &
Harpending, 1992; Ray et al., 2003; Excoffier, 2004), o mesmo revelado através da
analise da Soma dos Desvios Quadrados (SSD), a partir da qual foi testada a
hipótese de expansão populacional súbita. Esta análise indicou valores de SSD
baixos e não significativos diretamente relacionados a populações que passaram por
expansão súbita recente (Schneider e Excoffier, 1999), exceto também para a
população de Fernando de Noronha, onde o SSD se mostrava significativo.
É possível que esta estabilidade populacional em Fernando de Noronha
esteja relacionada a limitações físicas do ambiente e, sobretudo, menor amplitude
26
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
de mudanças, mesmo diante das oscilações no nível do oceano ao longo das
glaciações pleistocênicas.
Analisando os períodos de expansão na costa brasileira como um todo,
observa-se que os valores médios de expansão para as populações do Nordeste do
Brasil são mais recentes (124,5 mil anos) do que aquela para o ES, onde este
evento poderia ser mais antigo (135 mil anos). Contudo, os valores máximos e
mínimos apresentam larga faixa de sobreposição sugerindo que apesar das
especificidades em geral as populações podem ter sido submetidas a processos,
geologicamente, quase simultâneos de expansão. Em concordância, os valores de
θ0 (frequência das diferenças par-a-par antes da expansão populacional) se
mostraram semelhantes e muito baixos para todas as populações costeiras,
sugerindo que Cephalopholis fulva tenha sido submetida à “gargalos populacionais”
(efeito bottleneck) antes da expansão.
As glaciações do Pleistoceno têm sido apontadas como eventos relevantes
para o estabelecimento dos padrões filogeográficos e populacionais exibidos
atualmente pelos peixes marinhos (Domingues et al., 2005, 2006, 2007; Santos et
al., 2006; Craig et al., 2006; Zhang et al., 2006; He et al., 2010; Mobley et al., 2010;
Viñas et al., 2010). Da mesma forma, a atual modelagem populacional da espécie
Cephalopholis fulva no litoral brasileiro demonstra ter sido afetada por estes eventos
Pleistocênicos. Provavelmente, as populações brasileiras de C. fulva devem ter
sofrido sua última expansão demográfica após a penúltima Máxima Glacial.
Períodos de Máxima Glacial são marcados por grande acúmulo de água, na forma
de gelo, nos pólos e consequente redução do nível dos oceanos (regressão
marinha).
A datação por termoluminescência de isótopos de oxigênio em dois terraços
marinhos na costa do Rio Grande do Norte constatou que o nível do Atlântico
chegou a 8 ± 2 m acima do nível atual por volta de 123,5 ± 5,7 mil anos atrás (Figura
11), praticamente o mesmo período identificado como o valor médio da expansão
populacional de C. fulva nas áreas do Nordeste do Brasil. Níveis semelhantes de
elevação do oceano foram determinados para os terraços marinhos localizados na
costa da Bahia (Bernat et al., 1983). Esta datação corresponde exatamente ao
período da penúltima transgressão marinha do Pleistoceno (Barreto et al., 2002).
Transgressões marinhas são precedidas por regressões e nesta penúltima
regressão (durante a Máxima Glacial) do Pleistoceno, em algumas áreas litorâneas,
27
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
os níveis dos oceanos chegaram a atingir até 100 metros abaixo do atual (Hearty,
1998).
A penúltima máxima regressão marinha do Pleistoceno ocorreu por volta de
140 mil anos atrás e deixou toda a plataforma continental brasileira exposta (Figuras
11, 12C e 13C). A redução de largas áreas de habitat natural foi provavelmente
causa do efeito gargalo evidenciado pelos baixos valores de θ0 (Tabela 6) obtidos
para Cephalopholis fulva. Esta espécie habita áreas em profundidades de 2 a 35
metros (Gasparini & Floeter, 2001), embora já tenha sido registrada em até 150
metros de profundidade (Smith, 1997; Figura 12B). A perda de áreas da plataforma
continental pode ter obrigado a espécie a ocupar a estreita margem do talude
continental e/ou montes submarinos que então tenham ficado em profundidades
acessíveis (Figuras 12C e 13C), como aqueles da Cadeia de Fernando de Noronha.
Figura 11. Variações no nível do oceano Atlântico e o período de expansão populacional (entre
117.000 e 132.000 anos – em amarelo) de Cephalopholis fulva na costa brasileira (modificado de
Barreto et al. (2002).
28
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
Figura 12. Margem continental do tipo Atlântico. A = Indicação das partes da margem
continental. Ilha representando Fernando de Noronha, apoiado sob o assoalho abissal;
B = Nível do oceano atual; C = Nível do oceano há 140.000 anos atrás. Em vermelho
está destacada a área provavelmente ocupada pela piraúna nos dois períodos.
Em sentido oposto, com o progresso da penúltima transgressão, o qual
atingiu seu ápice por volta dos 123,5 ± 5,7 mil anos atrás, a plataforma continental e
várias montanhas marinhas voltaram a ser submersas (Figura 12B; 13B),
disponibilizando novos habitats a serem ocupados e consequentemente provocando
a expansão populacional evidenciada. Estes penúltimos eventos glaciais, tanto a
regressão quanto a transgressão marinha, parecem ter ficados registrados nas
sequências nucleotídicas da região D-loop do DNAmt da espécie Cephalopholis
fulva.
Porém, diante das oscilações oceânicas durante o Pleistoceno, como se
explica a estabilidade populacional evidenciada no Arquipélago de Fernando de
Noronha? Basicamente, três fatores, um geológico, um geográfico e um físico
parecem ter contribuído para a ausência de crescimento populacional, verificado em
populações continentais de C. fulva no Arquipélago de Fernando de Noronha. A
forma geológica e a posição geográfica na qual se encontra o arquipélago parece
ser a responsável por sua estabilidade populacional ao longo das glaciações. É
constituído por ilhas oceânicas não apoiadas sobre a plataforma continental, a partir
de um monte cônico com cerca de 60 km de diâmetro na base, apoiado no assoalho
29
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
oceânico a 4.000 metros de profundidade. Do ponto de vista geológico este
arquipélago, juntamente com o Atol das Rocas e pelo menos mais seis montes
oceânicos, participa de um alinhamento de montes vulcânicos submarinos
chamados de Cadeia de Fernando de Noronha. Desta cadeia, atualmente apenas o
Atol das Rocas e o próprio Arquipélago de Fernando de Noronha encontram-se
emersos (Almeida, 2002) (Figura 13B). Apesar da distância atual do continente
(aproximadamente 360 km), geograficamente em períodos de máxima regressão a
cadeia de elevações oceânicas a qual faz parte devem ter garantido algum aumento
no grau de conectividade com o talude continental.
Figura 13. A costa nordeste do Brasil e Cadeia de Fernando de Noronha ao longo das oscilações
oceânicas nos últimos 350 mil anos. A = Baseado em Barreto et al., 2002; B e C = Batimetria em três
dimensões. Modificado de Vital et al. (2010).
O período de transgressão marinha relacionado à expansão populacional
percebida nas populações continentais de C. fulva tenderia a provocar, e conforme
foi comprovado pelos dados, um efeito contrário em regiões insulares como o
Arquipélago de Fernando de Noronha, com perda de espaço físico e diminuição do
nicho ecológico, pela perda de habitats, devido ao aumento da profundidade.
Os dados apresentados pelas amostras geográficas da espécie C. fulva
demonstram elevada diversidade genética, indicando ainda a ausência de efeitos
deletérios da sobrepesca da espécie, bem como evidências de panmixia plena tanto
entre as áreas continentais, como entre estas e o regiões insulares.
30
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
Os padrões demográficos históricos desta espécie no Atlântico, envolvendo regiões
oceânicas, sugerem efeitos históricos de não expansão ou tendência à retração
populacional durante eventos de transgressão marinha. Ambientes insulares estão
entre as principais áreas mapeadas como hotspots de biodiversidade. Diante de
fatores climáticos atuais, como o aquecimento global, os dados evidenciados em C.
fulva, demonstram um claro modelo do impacto da elevação do nível do mar sobre
uma grande parcela da biodiversidade, em grande parte endêmica.
31
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
6. CONCLUSÕES
• Os índices de diversidade genética de Cephalopholis fulva são típicos de
populações naturais amplamente distribuídas ao longo dos oceanos e que não
sofrem qualquer tipo pressão antrópica, como a realizada pela pesca
comercial;
• As análises do DNA mitocondrial revelaram que ao longo da costa brasileira e
no Arquipélago de Fernando de Noronha a espécie C. fulva representa uma
população panmítica com intenso fluxo gênico entre os pontos amostrados no
litoral do Brasil;
• Além de outros fatores, como correntes marinhas e dispersão larval, a condição
geológica do Arquipélago de Fernando de Noronha situado sobre uma cadeia
de montanhas oceânicas que se estende sequencialmente até a plataforma
continental, deve ter contribuído durante eventos regressivos, para a atual
conectividade genética populacional com as áreas continentais;
• Os colomorfos de Cephalopholis fulva (piraúna) não evidenciaram qualquer
diferenciação genética entre si, indicando tratar-se de um polimorfismo
cromático;
• Os índices de neutralidade e demografia indicam que as populações da costa
brasileira parecem ter sofrido expansão populacional entre 117 e 132 mil anos
atrás,
período
este
correspondente
ao
final
da
penúltima
glaciação
pleistocênica;
• Os dados da demografia histórica da espécie C. fulva traz indicações sobre a
ação potencialmente restritiva das transgressões marinhas em regiões
insulares e fornece parâmetro sobre os efeitos do aquecimento global sobre a
maior parcela de vertebrados, os peixes, habitantes endêmicos de ilhas e atóis.
32
ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA POPULACIONAL DE Cephalopholis fulva (SERRANIDAE)
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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