da região de transposição do rio Piumhi (Mg)

Variação genética em locos mitocondriais na tabarana (Salminus hilarii,
Characiformes) da região de transposição do rio Piumhi (MG).
Sarah B P Leite *, Pedro M Galetti Jr
Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos,
Via Washington Luis Km 235, São Carlos, SP, Brasil. [email protected]
*Autor para correspondência: +55 16 33518309. [email protected]
Palavras chave: transposição de águas, citocromo b, região controle, genética da
conservação
Título abreviado: Variação genética em locos mitocondriais de Salminus hilarii
RESUMO
No início dos anos 60, com a construção da usina hidrelétrica de Furnas sobre o rio
Grande (Bacia do Alto Paraná) e a construção de um dique em Capitólio (MG) para
conter as águas da represa, represaram-se também as águas do rio Piumhi (afluente da
margem direita do rio Grande). Em razão disso, o rio Piumhi teve seu curso médio
alterado, sendo desviado para afluentes da margem esquerda do rio São Francisco. Essa
transposição acarretou diversas alterações ambientais locais e o contato das ictiofaunas
das bacias envolvidas. O peixe tabarana (Salminus hilarii) é uma espécie reofílica de
grande importância ecológica distribuída por diversas bacias brasileiras, entre elas a do
São Francisco e do Alto Paraná. Embora apresente o comportamento de migração,
estudos atuais mostram que espécies com essa característica podem apresentar padrões
distintos de estrutura genética populacional. Análises moleculares são fundamentais
para conhecer a estrutura populacional e a distribuição geográfica dessas linhagens para
definição de políticas de conservação da espécie. Pela análise da variação genética dos
locos mitocondriais do gene do citocromo b e da região controle, obtivemos marcadores
moleculares que auxiliarão nos estudos filogeográficos deste grupo. Os 14 exemplares
1
de S. hilarii foram coletados na foz do rio Piumhi (MG). Foram extraídas partes do
tecido hepático usadas para a extração do DNA total e para a amplificação das
seqüências por PCR (reações em cadeia da polimerase) com pares de primers descritos
na literatura. Em seguida, as amostras foram purificadas e seqüenciadas, totalizando
1012 pares de base para o gene do citocromo b e 568 para a região controle. Analisamos
diversidade haplotípica (Hd) e nucleotídica (Pi), distância genética e agrupamos as
seqüências utilizando Salminus brasilienses (dourado) como grupo externo. Os
resultados evidenciaram oito haplótipos, Hd: 0,868 e Pi: 0,01077 para o citocromo b e
sete haplótipos, Hd: 0,872 e Pi: 0,01689 para a região controle. As árvores gênicas
obtidas para cada loco evidenciaram a presença de dois clados (distância genética de
1,8% para o citocromo b e 2,8% para a região controle), apoiados por altos valores de
bootstrap, habitando a região de transposição, podendo significar uma sobreposição
entre populações originalmente provenientes do rio Grande e do rio São Francisco.
Futuras análises são necessárias para uma conclusão mais definitiva sobre a origem
desses grupos na região do Piumhi e o impacto da transposição sobre a tabarana que
habita o São Francisco, fornecendo bases para futuras medidas de manejo e conservação
da espécie nessa bacia.
INTRODUÇÃO
A cabeceira do rio Piumhi está localizada na divisa entre os municípios de
Vargem Bonita e Piumhi, ao centro oeste do estado de Minas Gerais (Moreira-Filho &
Buckup, 2005). No início dos anos 60, com a construção da usina hidrelétrica de Furnas
sobre o rio Grande (afluente da Bacia do Alto Paraná) havia grande risco de quando as
comportas da usina fossem fechadas o nível da água da represa alagasse a cidade de
Capitólio em Minas Gerais (Moreira-Filho, 2006). Logo, o governo decidiu pela
construção de um dique na cidade para conter as águas da represa, e com isso
2
represaram-se as águas do rio Piumhi até então afluente da margem direita do Rio
Grande (Moreira-Filho, 2006). Em razão disso, o rio teve seu curso médio alterado,
sendo desviado para afluentes da margem esquerda do rio São Francisco.
A transposição do Rio Piumhi, acarretou diversas alterações ambientais locais e
o contato da ictiofauna das bacias, até então isoladas há milhões de anos (Moreira-Filho,
2006). Tais ações antrópicas causam o comprometimento ou desequilíbrio dos
ambientes naturais nos quais esses peixes ocorrem já que influenciam a dinâmica de
migração de muitas espécies, e, de acordo com Moreira-Filho & Buckup (2005), podem
até levar a extinção de espécies endêmicas da bacia receptora por possíveis eventos de
competição e predação dos táxons invasores.
Os peixes compreendem um importante grupo dos vertebrados, com muitas
espécies e/ou populações distribuídas ao longo dos ecossistemas aquáticos. Os impactos
das ações humanas, como a construção de barragens de hidrelétricas, estão
correlacionados à redução e extinção de muitas espécies. Entretanto, apesar da grande
importância econômica deste grupo e o risco de extinção, pouco se conhece sobre a
diversidade genética de suas populações naturais, mesmo até que tais informações sejam
criticas para sua sobrevivência e conservação (Wasko et al., 2004).
A Ordem Characiformes é o grupo dominante entre os peixes de água doce da
América do Sul (Britski et al.,1988). Dentro desta ordem encontram-se o dourado
(Salminus brasilienses e Salminus franciscanus) e a tabarana (Salminus hilarii) que
juntos constituem um grupo de peixes de grande importância ecológica, muito
apreciado na pesca esportiva e na gastronomia. De acordo com Godoy (1975), estes
grupos estão amplamente distribuídos pelas bacias hidrográficas brasileiras, entre elas a
do São Francisco e a do Paraná. A tabarana, espécie de estudo deste projeto, tem
3
comportamento reofilico, apresenta hábitos ictiófagos e pode ser encontrada em águas
limpas e de corredeira, vivendo em cardumes (Godoy, 1975).
Embora apresente o comportamento de migração, estudos atuais mostram que
espécies com essa característica podem apresentar padrões distintos de estrutura
genética em suas populações, já que em diferentes bacias hidrográficas podem se
apresentar em grandes e únicas populações genéticas (Revaldaves et al., 1997) ou em
populações geneticamente diferenciadas conhecidas por metapopulação (Wasko &
Galetti, 2002; Hatanaka & Galetti, 2003; Hatanaka et al., 2006).
Análises moleculares são fundamentais para conhecer a estrutura populacional e
a distribuição geográfica dessas linhagens. Os marcadores mitocondriais tem se
mostrado uma importante ferramenta na detecção de variabilidade genética em peixes,
além de permitirem inferências sobre as relações evolutivas entre populações que são de
grande utilidade para estudos filogeográficos (Avise, 1994).
Os locos mitocondriais do gene do citocromo b e da região controle (DLoop)
apresentam algumas peculiaridades em sua taxa de evolução devido suas diferentes
funções dentro da mitocôndria. Segundo Avise (2004), o sucesso desses locos para
estudos populacionais se deve ao fato da maioria das espécies apresentarem algum grau
de estruturação genética nestes marcadores ao longo de uma área geográfica.
Tendo em vista a importância ecológica e econômica da espécie, o isolamento de
marcadores mitocondriais para o acesso a variação genética deste grupo será importante
para reconhecermos as possíveis linhagens genéticas existentes na região de
transposição do rio Piumhi e na bacia do São Francisco e, com isso, contribuirmos em
programas de manejo e conservação da tabarana.
METODOLOGIA
4
Quatorze exemplares de tabaranas foram coletados na foz do rio Piumhi (Bacia
do São Francisco) na cidade de Piumhi (MG) no ano de 2007. Em laboratório, foram
retiradas partes do tecido hepático que foram utilizadas para a obtenção do DNA total
pela técnica de extração fenol-clorofórmio (Sambrook et al., 1989) com modificações.
Após a quantificação do DNA extraído, as amostras foram submetidas a PCR
(reação em cadeia da polimerase) para a amplificação das sequências mitocondriais com
pares de primers descritos na literatura (Tabela 1). As condições das duas reações foram
estabelecidas por testes de gradiente de temperatura em termociclador Mastercycle
Gradient (Eppendorf) e em seguida padronizadas com as condições apresentadas na
Tabela 2. Os produtos da PCR purificados pelo protocolo PEG (Polietilenoglicol 8000)
desenvolvido por Lis (1980) foram seqüenciados em seqüenciador MegaBACE 1000.
Th
Primer
Orientação
Seqüência
Referência
5’ AAA AAG CTT CCA TCC AAC
Kocher et al.,
ATC TCA GCA TGA TGA AA 3’
1989
5’AAC TGC CAG TCA TCT CCG
Irwin et al.,
GTT TAC AAG AC 3’
1991
5’ AGA GCG TCG GTC TTG TAA
Cronin et al.,
ACC 3’
1993
5’ CCT GAA GTA GGA ACC AGA
Meyer et al.,
TG 3’
1990
(ºC)
L14841
53
Forward
(A)
H15915
53
Reverse
(A)
DloopL
54
Forward
(B)
H16498
54
Reverse
(B)
Tabela 1. Relação dos pares de primers utilizados na amplificação do gene citocromo b
(A) e da região controle (B), suas temperaturas de hibridação, orientação, seqüência e
referência.
Ciclo da reação para o gene Ciclo da reação para o loco da região
Passos
citocromo b
controle
5
Passo 1
5 minutos à 94oC
2 minutos à 94oC
Passo 2
30 ciclos de
30 ciclos de
Passo 3
30 segundos à 94oC
15 segundos à 94oC
Passo 4
45 segundos à 53oC
15 segundos à 54oC
Passo 5
45 segundos à 72oC
30 segundos à 72oC
Passo 6
1 ciclo de
1 ciclo de
Passo 7
10 minutos à 72oC
5 minutos à 72oC
Passo 8
24 horas à 4oC
24 horas à 4oC
Tabela 2. Ciclos adotados na amplificação dos locos mitocondriais do gene citocromo b
e da região controle.
A edição, alinhamento e caracterização do polimorfismo das seqüências foram
conduzidas pelos programas BioEdit Sequence Alignment Editor (Hall, 1999),
ClustalW (Thompson et al., 1994) e DNAsp v5 (Rozas et al, 2003). A quantificação da
variação genética resumiu-se na identificação dos haplótipos, diversidade haplotípica e
nucleotídica, razão transição/transversão e mudanças sinônimas e não sinônimas (para o
gene codificador citocromo b).
Para os testes de neutralidade seletiva, que verificam se a variabilidade
encontrada foi influenciada pela seleção natural, realizaram-se os testes estatísticos D*
(Fu & Li, 1993), F* (Fu & Li, 1993) e para as seqüências codificadoras, o teste Codonbased Z (Nei & Gojobori , 1986), todos presentes no programa MEGA versão 4.0
(Tamura et al., 2007).
As estimativas de distância genética e a construção das árvores gênicas dos dois
locos pelo método de Neighbor-Joining (Saitou & Nei, 1987) também foram conduzidas
pelo programa MEGA versão 4.0 (Tamura et al., 2007).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
6
Com os pares de primers escolhidos, isolamos 1012 pares de base para o gene do
citocromo b e 568 pares de base para a região controle. Para as 14 seqüências analisadas
do citocromo b encontrou-se 8 haplótipos, diversidade haplotípica de 0.868, diversidade
nucleotídica de 0.01077, número médio de diferenças nucleotídicas de 10.901 e razão
transição-transversão de 2.86. Enquanto que na caracterização do polimorfismo para as
13 seqüências da região controle encontrou-se 7 haplótipos, diversidade haplotípica de
0.872, diversidade nucleotídica de 0.01689, número médio de diferenças nucleotídicas
de 9.5769 e razão transição-transversão de 13.436.
Os testes de neutralidade seletiva não foram significativos para a atuação da
seleção natural sobre a variação genética encontrada à exceção do teste Codon-based Z
(Nei & Gojobori , 1986) que não foi capaz de rejeitar a hipótese de seleção purificadora
sobre o gene do citocromo b. A seleção purificadora costuma eliminar mutações
desvantajosas, diminuindo assim a taxa de evolução gênica em genes codificantes como
o citocromo b (Evanovich, 2004).
Assim como a análise do polimorfismo demonstrou a diferenciação entre as
seqüências, a construção da árvore gênica pelo modelo de Neighbor-Joining (Saitou &
Nei, 1987) para o citocromo b (Figura 1) e para a região controle (Figura 2) demonstrou
uma diferenciação evidente entre os indivíduos coletados naquele local, evidenciando a
presença de dois clados distintos, apoiados por altos valores de bootstrap, convivendo
naquela região.
As distâncias genéticas de 1,8% para o citocromo b e 2,8% para a região
controle, entre os clados agrupados pela árvore, são consideradas altas por se tratarem
de indivíduos de uma mesma espécie encontrados num mesmo local. Assim como
encontrado por Carvalho-Costa (com pess) para a espécie Pseudoplatystoma corruscans
entre as bacias do São Francisco e Paraguai (1,9%), esses valores de distância genética
7
indicam um tempo substancial de isolamento entre as seqüências e dessa forma,
assume-se ou uma estruturação genética populacional desses grupos habitando a foz do
rio Piumhi ou mistura de faunas, com cada clado representando uma população de cada
bacia.
68
15
S. hilarii Citb-1
S. hilarii Citb-11
7
S. hilarii Citb-14
6
S. hilarii Citb-5
Clado 1
13
S. hilarii Citb-10
88
S. hilarii Citb-8
99
S. hilarii Citb-9
S. hilarii Citb-7
97
S. hilarii Citb-3
S. hilarii Citb-12
S. hilarii Citb-4
79
Clado 2
S. hilarii Citb-6
99
S. hilarii Citb-2
74
74
S. hilarii Citb-13
S. brasilienses Citb
Grupo externo
Figura 1: Árvore de Neighbor-Joining das seqüências do citocromo b tendo como
grupo externo enraizador S. brasilienses.
24
64
S. hilarii Dloop-14
S. hilarii Dloop-11
9
S. hilarii DLoop-1
8
S. hilarii Dloop-5
Clado 1
13
S. hilarii Dloop-8
98
S. hilarii Dloop-10
98
S. hilarii Dloop-9
S. hilarii Dloop-7
99
S. hilarii Dloop-3
S. hilarii Dloop-12
S. hilarii Dloop-2
99
Clado 2
S. hilarii Dloop-6
67
66
S. hilarii Dloop-13
S.brasilienses DLoop
Grupo externo
8
Figura 2: Árvore de Neighbor-Joining das seqüências da região controle tendo como
grupo externo enraizador S. brasilienses.
CONCLUSÕES
Com base nos resultados apresentados, o projeto conseguiu isolar marcadores
mitocondriais a partir do seqüenciamento dos locos do gene citocromo b e da região
controle com conseqüente caracterização do polimorfismo genético encontrado em
Salminus hilarii na região de transposição do rio Piumhi (MG).
Os resultados de diversidade haplótipica e nucleotídica, distância genética e as
árvores gênicas tornaram evidentes a diversidade genética dessa população,
evidenciando a presença de dois clados de linhagens distintas convivendo no mesmo
local.
Esse cenário aponta para o contato entre as ictiofaunas das bacias do Alto Paraná
e do São Francisco ou para uma profunda estruturação populacional no São Francisco.
Porém, para a resolução da origem desses dois acervos populacionais da tabarana nessa
região, serão necessárias novas coletas em ambas as bacias para determinar a
procedência dessas linhagens.
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