PAPILOMAVÍRUS HUMANO: AS TÉCNICAS MOLECULARES

PAPILOMAVÍRUS HUMANO: AS TÉCNICAS MOLECULARES: CAPTURA
HÍBRIDA E REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
Hugo Alves Magalhães¹, Jó Evangelista Batista Luz¹, Matheus Silva Correia¹, Raimundo
Faria²
¹Graduando (a) do curso de farmácia. Faculdade guanambi – fg/cesg- [email protected]
²Farmacêutico Bioquímico, Mestre em Ciências Fisiológicas, Professor. Faculdade Guanambi- fg/cesg
RESUMO: O Papiloma vírus Humano (HPV) é um organismo DNA circular de fita dupla,
não envelopada, que se reproduz no núcleo das células epiteliais da pele, mucosa ano-genital
e orofaríngea. É o principal fator de risco para as neoplasias intra-epitéliais cervicais e o
câncer cervical. Atinge grande parte da população sexualmente ativa. Exames
complementares auxiliam a produzir um diagnóstico mais preciso de infecção pelo HPV,
dentre as técnicas pode-se citar o Papanicolau, colposcopia, peniscopia e a biópsia, que apesar
de não identificarem o vírus, são eficientes em analisar as alterações locais que possam estar
sendo provocadas por uma infecção. A tipagem do HPV e sua classificação nos grupos de alto
e baixo risco são de extrema importância. Existem duas principais técnicas de tipagem do
HPV descritas na literatura, à reação em cadeia polimerase (PCR), que amplifica o DNA do
HPV e a captura híbrida, que faz uso de sondas específicas contra tipos do grupo de alto risco.
O presente estudo trata-se de uma revisão de literatura e tem como objetivo, identificar os
métodos mais eficazes no diagnóstico do HPV, buscando aumentar o conhecimento do uso
dessas técnicas no aprimoramento do diagnóstico do HPV, no qual foram analisadas as
principais técnicas moleculares na detecção do HPV. Vários estudos têm comparado às
técnicas de PCR e CH II, diversos deles apresentam resultados de sensibilidade e
especificidade semelhantes, às vezes, contraditórios, mais nada que traga uma distinção maior
sobre as técnicas. À medida que a tecnologia avança, as técnicas moleculares vão se
aprimorando na detecção do papiloma vírus humano, contudo, há necessidade de expansão do
uso das técnicas para que se realize o diagnóstico precoce e diminua a incidência de mulheres
contaminadas por HPV de alto risco.
Palavras-chave: Câncer de colo do útero. Diagnóstico Molecular. HPV.
HUMAN PAPILLOMAVIRUS: MOLECULAR TECHNIQUES: HYBRID CAPTURE
AND CHAIN REACTION OF POLYMERASE
ABSTRACT: Human papilloma virus (HPV) is a double-stranded circular DNA body not
enveloped, which is reproduced in the nucleus of epithelial cells of the skin, anogenital
mucosa and oropharynx. It is the main risk factor for cervical intraepithelial neoplasia and
cervical cancer. Reaches much of the sexually active population. Investigations help to
produce a more accurate diagnosis of HPV infection among the techniques we can mention
the Pap test, colposcopy and biopsy peniscopy, who despite not identify the virus, are
efficient in analyzing local changes that may be being caused by an infection. Typing of HPV
and its classification in high and low risk groups are of utmost importance. There are two
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major HPV typing techniques described in the literature, the polymerase chain reaction (PCR)
to amplify HPV DNA and hybrid capture, which makes use of specific probes against kinds
of high-risk group. This study deals with a literature review and aims to identify the most
effective methods to diagnose HPV, seeking to increase the knowledge of the use of these
techniques in improving the diagnosis of HPV, in which the main molecular techniques were
analyzed in HPV detection. Several studies have compared to PCR and HC II, many of them
have similar sensitivity and specificity results, sometimes contradictory, anything that brings
a greater distinction on the techniques. As technology advances, the molecu¬lares techniques
will be improving the detection of human papilloma virus, however, there is need to expand
the use of the techniques to be held early diagnosis and decrease the incidence of women
infected by HPV high risk.
Key words: Cancer of the cervix. Molecular Diagnosis. HPV.
INTRODUÇÃO
O Papiloma vírus Humano (HPV), da família papillomaviridae, é um organismo DNA
circular de fita dupla, não envelopada, com aproximadamente 8.000 pares de base e capsídeo
icosaédrico, que se reproduz no núcleo das células epiteliais da pele, mucosa ano-genital e
orofaríngea (MARTINS et al., 2008).
De acordo com Zampirolo et al. (2007), o HPV é um vírus que contamina células
epiteliais da pele e da mucosa, que pode causar vários tipos de lesões, entre elas verruga
natural e a verruga genital (condilomatose).
Existem mais de cem tipos de HPV reconhecidos, estima-se que quatorze sorotipos
que esteja relacionados com a oncogênese, e os mais comumente presentes são os HPV16 e
HPV18 sendo de alto risco (PITTA et al., 2010). O tipo mais prevalente nas infecções do
trato genital é o HPV tipo 16, aproximando a 66% acompanhado dos tipos 18 (15%), 45 (9%)
e 31 (6%) e os quatro tipos unidos, correspondem até 80% dos casos (NAKAGAWA et al.,
2010).
De acordo com Instituto Nacional do Câncer, a previsão para 2012 o câncer de colo
uterino seria o segundo tipo mais frequente entre as mulheres (INCA, 2012). Os exames
complementares auxiliam a produzir um diagnóstico mais preciso de infecção pelo HPV,
dentre as técnicas pode-se citar o Papanicolau, colposcopia, peniscopia e a biópsia, que apesar
de não identificarem o vírus, são eficientes em analisar as alterações locais que possam estar
sendo provocadas por uma infecção (VIDAL et al., 2012).
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No Brasil, a população é afetada principalmente pelo câncer cervical, que é o segundo
tumor maior ocorrência entre as mulheres, atrás apenas do câncer de mama, e a quarta causa
de morte na população, e também este câncer é mais frequente nos países em
desenvolvimento (LIMA et al., 2011).
A tipagem do HPV e sua classificação nos grupos de alto e baixo risco são de extrema
importância, já que o tratamento preventivo pode ser guiado com mais eficácia quando o tipo
de vírus é identificado, pois quando descobertos precocemente podem ser tratados, tendo
assim um prognóstico satisfatório para o paciente (XICOTENCATL et al., 2009). Existem
duas principais técnicas de tipagem do HPV descritas na literatura, à reação em cadeia
polimerase (PCR), que amplifica o DNA do HPV e a captura híbrida, método molecular mais
utilizado para detecção do HPV e faz uso de sondas específicas contra tipos do grupo de alto
risco (ZAMPIROLO et al., 2007).
Dessa forma, o presente estudo tem como objetivo, identificar os métodos mais
eficazes no diagnóstico do HPV, buscando aumentar o conhecimento do uso dessas técnicas
no aprimoramento do diagnóstico do HPV. O trabalho trata-se de uma revisão de literatura
produzida sobre o tema abordado, no qual foram analisadas as principais técnicas moleculares
na detecção do HPV. Para o levantamento bibliográfico foram utilizados Lilacs, Medlinee,
Scielo, e Periódicos da CAPES, artigos em língua portuguesa e inglesa, e publicações no
período de 2003 a 2015.
PAPILOMA VÍRUS HUMANO (HPV)
O HPV é um DNA-vírus que atinge grande parte da população sexualmente ativa,
dependendo de suas cepas, poderá além de causar lesões condilomatosas, desenvolver
neoplasias intraepiteliais (TRABULSI & ALTERTHUM, 2008). O vírus HPV tem a
capacidade de se manter em forma latente, podendo ser detectado por técnicas de biologia
molecular, suas manifestações subclínicas são identificadas com colposcopia, citologia ou
histologia, apresentando também infecção clínica (NOGUERES et al., 2010). O contágio do
órgão genital por HPV é mais comum em mulheres jovens, entre as contaminadas pelo vírus,
80% não demonstram sintomas clínicos, em 60 a 70% dos episódios, a infecção regride
automaticamente (ZAMPIROLO et al., 2007). De acordo com Wolschick et al. (2007) o HPV
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tem sido apontado como responsável pelo desenvolvimento de uma variedade de neoplasias
malignas, incluindo de regiões cérvico-vaginais, ânus, vúlva, pênis, e boca.
O câncer do colo do útero é uma patologia de progresso lento, que é sucedido por
lesões designadas de neoplasias intraepiteliais cervicais (NICs) ou lesões intraepiteliais
cervicais (FERRAZ et al., 2012). A patologia oncogênica do HPV é descrita como importante
fator causal para o desenvolvimento do câncer do colo uterino e com graves consequências
(ROTELI-MARTINS et al., 2007). Esse tipo de câncer é considerado como tipo de câncer
com a segunda causa mais comum em mulheres no mundo, com aproximadamente 471 mil
novas ocorrências e com 233 mil mortes relatadas a cada ano, tornando-se um dos mais
graves casos de saúde publica, principalmente para os países emergentes como o Brasil, com
40 mil novos casos por ano (INCA, 2008). Foram estimados para 2008 cerca de 530 mil
novos casos de câncer do colo do útero, podendo aumentar para 665000 até 2020 em todo o
mundo (ARBYN et al., 2008). Como o risco de câncer cervical invasivo na mulher está
diretamente relacionado à presença de HPV de alto risco, pesquisas utilizando métodos
moleculares tem tido grande relevância para o acompanhamento de mulheres com alterações
citológicas (SANTOS, 2011).
A predominância do HPV na população é elevada, as avaliações apontam que 20% da
população estão contaminados por HPV, a perspectiva é que 75% a 80% população será
contaminadas no decorrer da vida, essa elevação da incidência tem sido notada desde 1960,
com o aumento da prática do uso de anticoncepcionais orais, diminuição do uso de outros
meios de prevenção, inicio precoce da vida sexual, aumento de companheiros sexuais, e baixo
nível financeiro e social, contudo o avanço tecnológico possibilita diagnósticos facilitados,
verificando um número maior de pessoas contaminadas e, consequentemente, em risco de
desenvolver neoplasias (LINHARES et al., 2006)..
Segundo Castellsague (2003) a contaminação por relação sexual acontece porque o
homem é o principal transmissor do vírus HPV, contágio pela via sexual é capaz em certos
casos devido à fômites que agem como “carregadores” ou “vetores” de tipos oncogênicos que
colaboram para acrescentar o risco de aparecimento do câncer cervical nas companheiras,
apesar de não serem comuns, os homens podem ter câncer de pênis ou de ânus. Segundo
Urgoiti et al. (2014) a infecção por HPV em pacientes com câncer anal é causadora de grande
impacto, e não é bem estudada como pode ser verificado em pesquisas realizadas que o HPV
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de alto risco é um agente etiológico bem conhecido e que pode acarretar no desenvolvimento
de câncer anal, mas a frequência do diagnóstico depende do método empregado.
De acordo Albuquerque et al. (2009), o contágio precoce pelo Papiloma vírus tem sido
considerado a principal causa de risco para o desenvolvimento de câncer de colo do útero.
Dados divulgados pelo Ministério da Saúde estabeleceram a taxa de incidência de câncer de
colo uterino em 868/100.000 em 1999. Dados da Organização Mundial da Saúde estimam que
no mundo 500.000 novos casos de câncer de colo uterino surgem a cada ano e metade das
mulheres acometidas morrerá desta doença. Estima-se que é a causa de 11% dos cânceres
globais na mulher (SANTOS et al., 2004).
Atualmente, há mais de 200 tipos de HPV descritos, entretanto, destes, apenas metade
dos tipos de HPV foram identificados, com seus genomas isolados e completamente
sequenciados (TRABULSI & ALTERTHUM, 2008). Aproximadamente 40 tipos infectam a
região genital, sendo que pelo menos 20 está associado ao carcinoma do colo do útero, os
tipos de papiloma vírus são identificados por números que indicam a sequência histórica de
sua descrição e são classificados pela sigla HPV (FERRAZ et al., 2012).
Baseando-se na sequência de seus nucleotídeos, mais de 120 tipos de HPV foram
completamente sequenciados até então (PITTA et al., 2010). O genoma do HPV é constituído
por cerca de 8.000 pares de bases, contendo 8 esquadros de leitura (Open Reading Frames,
ORFs), estes ORFs são expressos a partir de mensagens policistrônicas de mRNA transcritos
a partir de uma única fita de DNA, funcionalmente o genoma do HPV pode ser dividido em
região precoce (E ou Early), região tardia (L ou Late) e região de controle (LCR ou Long
control region) (FERRAZ et al., 2012). A região E codificam os genes E1, E2, E4, E5, E6 e
E7 responsáveis pela síntese das proteínas de mesmo nome, e a região L codifica os genes L1
e L2 relacionados à formação e maturação do capsídeo viral, os genes E são expressos
imediatamente após a infecção, e apresentam nos seus produtos a função de regular a
replicação e a expressão do DNA viral, nos casos dos HPVs com potencial oncogênico,
alguns destes genes precoces (E5, E6 e E7) estão envolvidos na transformação celular
(MARTINS et al., 2008).
Os genótipos do HPV foram agrupados em quatro categorias exclusivas baseadas no
risco de câncer cervical: (1ª) positivo para HPV16, (2ª) negativo para positivo para HPV16,
mas um ou mais outros tipos de HPV de alto risco (HPV18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56,58,
59 ou 68), (3ª) negativo para qualquer tipo de HPV de alto risco, mas positivo para um ou
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mais tipos de HPV de baixo risco (HPV6, 11, 26,40, 42, 53, 54, 55, 61, 62, 64, 66, 67, 69, 7073, 81-84, e 39 ou 89), ou (4ª) negativo para HPV (WHEELER et al., 2014).
Os tipos de HPV com localização cutânea são 1, 4, 41, 48, 60, 63, 65, 76, 77, 88, 95.
Os vírus do HPV com predomínio na mucosa são 6, 11, 13, 16, 18, 26, 30, 31, 32, 33, 34. 35,
39, 42, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 72, 73, 74, 81, 82, 83, 84,
86, 87, 89, os encontrados na região Cutânea e ou Mucosa são os tipos 2, 3, 7, 10, 27, 28, 29,
40, 43, 57, 61, 62, 78, 91, 94, 101, 103. Em região cutânea associada à Epidermodisplasia
Verruciforme (EV) são os tipos 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19, 20/46, 21, 22, 23, 24, 25, 36, 37,38,
47, 49, 50, 80, 75, 92, 93, 96, 107 (PITTA et al., 2010).
A infecção pelo HPV ocorre pela penetração do vírus no epitélio, através de
microfissuras na superfície do mesmo, atingindo e infectando as células da camada basal, e a
maior parte das neoplasias malignas relacionadas ao HPV apresenta o DNA de algum tipo de
HPV de alto risco integrado ao genoma das células do hospedeiro (GAGE et al., 2011).
Ainda não estão disponíveis reagentes sorológicos de rotina para distinguir as
diferentes espécies de HPV, portanto, a distinção entre elas é feita por meio da análise das
sequências do DNA viral (DEMATHE et al., 2011).
DIAGNÓSTICO
O diagnóstico da infecção por HPV leva em conta os dados da história, exame físico e
exames complementares com a pesquisa direta do vírus ou indiretamente através das
alterações provocadas pela infecção nas células e no tecido (DEMATHE et al., 2011). Dentre
as técnicas utilizadas para o diagnóstico, o Papanicolau é o exame preventivo mais comum,
ele não detecta o vírus, mas sim as alterações que ele pode causar nas células, indicado na
rotina de rastreio para o câncer cervical ou na presença, nos genitais, de lesão HPV induzida
no sentido de diagnóstico de neoplasia intra-epitelial ou câncer invasor associado (JENSEN et
al., 2012). O método citopatológico de Papanicolau é uma técnica simples, de fácil execução,
permitindo detectar anomalias da cérvice uterina, através de células descamadas do epitélio, e
tem se mostrado eficaz e apto para aplicação em larga escala, além do baixo custo
(GREENWOOD et al., 2006).
A inspeção com ácido acético a 5%, colposcopia, peniscopia e biópsia constituem
outras técnicas de detecção clínica e anatomopatológica da lesão, identificando e
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determinando o grau de atipia celular e para a classificação do tipo de vírus, podendo diminuir
o número de citologias falso-negativas, existem os métodos moleculares de diagnóstico do
HPV (MASSAD et al., 2013).
O vírus HPV não pode ser cultivado in vitro, ele possui DNA de cadeia dupla, dessa
forma vários testes foram desenvolvidos para detectar a sua presença, os principais métodos
de detecção incluem avaliação citomorfológicas por citologia e detecção de DNA do HPV de
alto risco por vários ensaios moleculares, pode ocorrer em alguns casos, à citologia cervical
detectar o efeito morfológico citopático viral de HPV, algumas técnicas de detecção envolvem
a hibridação de DNA complementar ou RNA, as sondas para os segmentos de DNA viral
combinado com qualquer uma amplificação do sinal ou a amplificação do alvo (NISHINO, et
al., 2011).
Segundo Rama et al. (2006) algumas técnicas de diagnostico molecular são de grande
importância para a triagem do vírus na infecção do HPV, tal diagnóstico é baseado em
técnicas como: captura hibrida (CH), southern blot, hibridização in situ, hibridização em fase
solida (microarrays)e reação em cadeia da polimerase (PCR).
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma das técnicas moleculares comumente
utilizadas para detecção do HPV, sendo um método de biologia molecular baseado na
amplificação seletiva de uma sequência de DNA específica (GUTIERREZ-XICOTENCATL
et al., 2009). A técnica de PCR aproveita, como iniciadores (primers), seguimentos mantidos
da região L do HPV (BRINGHENTI, et al., 2010). Nas amostras com DNA identificado,
permite a detecção do genótipo do HPV através da ampliação de regiões específicas para cada
tipo de vírus, sendo esses de alto ou baixo grau, a análise do DNA do HPV, empregada em
associação à citologia, torna-se consideradamente eficiente, especialmente para análise
precoce, sendo possível realizar assistências clínicas ou terapêuticas para a continuação das
pacientes que contem o DNA de HPV de alto grau e impedir o progresso para o câncer
(BURD, 2003).
A análise dos produtos amplificados da PCR pode ser realizada de diferentes formas,
incluindo a eletroforese em gel (agarose ou poliacrilamida), hibridização em pontos (dot blot),
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hibridização reversa em linhas (reverse line-blot method), e o sequenciamento direto do DNA
(GUTIERREZ-XICOTENCATL et al., 2009).
O método PCR, um procedimento que inovou a virologia, pelo fato de ser muito
sensível, pode identificar até um genoma viral em 100.000 células, com excelentes condições
experimentais, é a técnica de identificação com mais sensibilidade, contudo atualmente, as
duas técnicas mais largamente utilizadas, possuindo semelhança em termos de sensibilidades,
são o de captura hibrida e PCR com primers gerais, esse tipo de PCR tem potencial apto de
identificar todos os HPV mucosos (OLIVEIRA et al., 2003).
CAPTURA HÍBRIDA (CH) e CAPTURA HÍBRIDA (CH II)
De acordo com Zampirolo et al. (2007), outro método molecular utilizado é a Captura
Híbrida (CH). A Captura Híbrida é um sofisticado teste de hibridização molecular, com
amplificação do sinal dos híbridos formados, que são detectados através de reação enzima
substrato e leitura por quimioluminescência (BAGARELLI et al., 2004).
O diagnóstico do HPV, pelo método de captura híbrida é um instrumento de baixa
relevância, capaz de adicionar conhecimentos significativos na condução de casos de
Neoplasia Intra-epitelial Cervical (NIC) (MARTIN et al., 2010). Nesse método utiliza-se o
fato de haver anelamento (acoplamento) entre as bases complementares do DNA, o
processamento do material a ser analisada passa pelas seguintes etapas: desnaturação,
hibridização, captura de híbridos, reação dos híbridos com o conjugado e detecção dos
híbridos por quimioluminescência (WOLSCHICK et al., 2007).
Este método utiliza-se de uma microplaca onde anticorpos capturam espécimes
híbridos de DNA fragmentado hibridizado com RNA complementar ao DNA do HPV (PARK
et al., 2012). Ferraz et al. (2012) afirma que os anticorpos monoclonais para os híbridos
RNA/DNA do HPV, conjugados com fosfatase alcalina são detectados por um substrato
quimioluminescênte, sendo colocado sobre a placa, um anticorpo possui várias moléculas de
fosfatase alcalina acoplada, assim como, vários anticorpos conjugados ligam-se a um hibrido
formando um complexo, tal complexo fixa na parede da placa, a detecção do complexo é
realizada por quimioluminescência ultrassensível, a unidade luz relativa (RLU) é a medida
utilizada para se quantificar a luz emitida, através do aparelho luminometro.
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Pitta et al. (2010) descreve que na captura híbrida utiliza-se dois grupos de sondas, o
grupo A que possui sondas para HPV de baixo risco e o grupo B utilizados para HPV de alto
risco, o material a ser colhido para a realização da captura CH deve ser acondicionado em kit
apropriado.
Ensaios de captura híbrida estão disponíveis comercialmente para detecção de agentes
microbianos, a CH é o principal ensaio para detecção do papiloma vírus humano (HPV) no
Brasil e vem sendo gradativamente substituída por técnicas mais modernas e que incluem a
genotipagem do HPV (GUTIERREZ-XICOTENCATL et al., 2009).
O teste de Captura Híbrida é tanto qualitativo quanto quantitativo, embora a
quantidade de HPV em uma amostra guarde também relação com o volume de material
coletado, a quimioluminescência é medida e estabelecido o valor de corte de 1,0 RLU
(ZAMPIROLO et al., 2007). Se o valor medido pelo luminometro for maior que 1,0, o
resultado é considerado positivo, os dois grupos de vírus devem estar contidos nos resultados
(GAGE et al., 2011). O resultado é considerado positivo quando as relações unidade luz
relativa RLU/PCA para os vírus do grupo A (6, 11, 42, 43 e 44) e/ou RLU/PCB para os vírus
do grupo B (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68) forem iguais ou maiores que 1
(ZAMPIROLO et al., 2007).
A Captura Híbrida contém sondas gênicas de 70% dos tipos de HPV de baixo risco e
99% dos oncogênicos, indicando pequeno número de cópias virais por célula podem significar
infecção inicial ou fase de remissão espontânea (BORGES et al., 2004). Nesses casos, a
critério clínico, sugere-se, antes de qualquer tratamento, confirmar a presença de infecção
ativa com nova coleta, após intervalo de três meses, para verificar a eficácia do tratamento,
indica-se colher nova amostra após três meses do término (WOLSCHICK et al., 2007).
De acordo Arbyn et al. (2004) a técnica de captura híbrida (CH) é muito sensível para
lesões de alto risco chegando a 94,8%, e a citologia é de 81,8%. O teste de captura híbrida
para identificar o HPV, é apto de ser aplicado como análise de rastreamento primário,
secundário e no seguimento de casos tratados por lesão cervical intra-epitelial de alto grau
(RONCAGLIA, 2012).
Diversos testes de HPV são comercialmente encontrados, sendo o método mais
utilizado, a Captura Híbrida II, que diagnóstica uma combinação de 13 genótipos sem
genotipagem individual (BONDE et al, 2014). De acordo Rodrigues et al. (2009), entre as
técnicas, a captura hibrida II é a técnica molecular mais empregado para o diagnóstico do
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HPV. Este método de CH II é baseado na hibridização de DNA, utilizando sondas especificas
contra o HPV apontado de alto risco (BAGARELLI et al., 2004).
A CH II leva vantagem quando se comparada com a CHI, pois detecta maior
quantidade de tipos virais com ampla sensibilidade, contudo diminuindo a especificidade
(BORGES et al., 2004). Entretanto segundo Rodrigues et al. (2009), a captura hibrida CH II
somente identifica os HPVs de alto risco, não identificando o tipo viral específico, a técnica
não identifica todos os tipos virais de alto risco e com sensibilidade da técnica (cerca de 5.000
copias/ml) podendo não ser apropriada para mostrar a presença do vírus no começo da
infecção. Os vírus de baixo risco são examinados como sonda A e os tipos de vírus avaliados
de alto risco são examinados como sonda B, as sondas não apontam os tipos de HPV dentro
do tipo de grupos, a sensibilidade do método assemelha-se à do PCR, reservado para
identificar lesões de alto grau (BRINGHENTI, et al., 2010).
COMPARAÇÃO ENTRE AS TECNICAS DE CH II E PCR
Vários autores tem demonstrado a alta concordância comparando os métodos de CH II
e PCR, Segundo Santos (2011) a CH II apresentam sensibilidade de 91,7% e especificidade
de 95,4%, comparando com o método de reação em cadeia da polimerase (PCR).
Para Saini et al. (2007) o método de PCR mostra-se mais sensível para detectar o
HPV, cerca de (81,8%) comparando com a CH II (36,4%), contudo a especificidade da CH II
é muito maior (96,6%) do que a da PCR (58,6%).
Em um estudo realizado por Nomelinil et al. (2007) onde participaram 80 pacientes
com media de idade entre 15 a 75 anos, confrontando as técnicas de CH II e PCR, a captura
híbrida diagnosticou 38 pacientes com HPV de alto risco (47,5%), enquanto a PCR
diagnosticou 70 casos positivos (87,5%), em relação à distribuição dos casos de acordo com
o tipo de HPV diagnosticado por PCR, 14 (17,5%) eram pacientes positivo para HPV 16,
enquanto 56 pacientes (70%) mostrar-se dois tipos de HPV 16 e 18 simultaneamente, contudo
o performance de PCR para a detecção de NIC apresentou sensibilidade de 83,33%, e
especificidade de 13,33%; com a eficiência de 25%, já o método de captura híbrida
apresentou sensibilidade de 66,67%, e especificidade 56,67% e com 58.33% de eficiência,
mostrando 40% de concordância entre a PCR e captura híbrida HCII. Contudo Kulmala et al.
(2004) mostrou concordância de 85% entre os dois métodos, onde o seu estudo comparou o
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desempenho da captura II com o de PCR para a detectar lesões cervicais significativas em
1511 mulheres com riscos diferentes para as infecções por HPV em três Estados da antiga
União Soviética, os resultados apresentaram que o grau de concordância entre o ensaio HC II
e PCR foi substancial, das 228 amostras com resultados discrepantes, 92 foram positivos pelo
ensaio HC II mas negativas para PCR, enquanto que 136 amostras foram positivas para PCR,
mas negativo para HC II, com a sensibilidade de detecção de 85,2 para CH II e 74,0% para
PCR, e especificidade de 67,2% e 64,1% respectivamente, as duas técnicas apresentaram
baixos especificidades, mas a sensibilidade do ensaio HC II foi ligeiramente melhor.
A taxa de contradição e da diferença de detecção positiva entre os dois testes podem
ser explicadas por diferença nas sensibilidades analíticas, embora um estudo anterior
demonstrar que PCR detecta menos cópias e linhas de células para HPV-16 e 18 comparando
com a HC II (PARK et al., 2013). Alguns estudos têm relatado que a identificação do HPV de
alto risco pelo PCR apresentaram menores taxas positivas do que o HC II (SZAREWSKI et
al., 2012; PARK et al., 2012).
Em um estudo comparativo entre as técnicas as técnicas de captura Híbrida II e PCR,
onde se observou que a prevalência do HPV obtida com o método de PCR é mais alta que
aquela obtida com o método de HC II, de forma que o PCR parece ser mais ter maior
sensibilidade para diagnosticar o HPV, e somente em dois grupos de mulheres a relação se
inverteu, no entanto, como já investigado anteriormente, cabe discutir se o tamanho da
amostra comprometeu a precisão e o da informação, a prevalência elevada obtida com uso do
método de PCR encontra-se em concordância com as observações de estudos internacionais
desenvolvidos na Coréia do Sul, Tailândia, Costa Rica e Estados Unidos (AYRES et al.,
2012).
Vários estudos compararam as técnicas e apresentaram à mesma conclusão, ainda que
contenham delineamentos e características heterogêneos (HONG et al., 2009; HUANG et al.,
2006). Já estudos realizados na Dinamarca e Itália apresentaram diferença na identificação do
HPV entre PCR e HC II é discreta. Contudo, seria suficiente para considerar o PCR mais
eficiente no sentido de identificar grupos específicos de tipos de HPV oncogênicos (IFTNER
et al., 2009).
Os resultados dos estudos brasileiros mostram-se bastante divergentes, comparados às
referências internacionais (AYRES et al., 2012). No Brasil, chegou a 40% de diferença entre
estimativas obtidas com HC II e PCR (NOMELINI et al., 2007). Nos estudos realizados em
12
outros países, esta diferença foi de até 11% entre os resultados de um método e outro,
comparando os resultados destas análises com exames citológicos, que avaliam a qualidade do
exame, adotando o PCR como o método de referência (padrão ouro) (AYRES et al., 2012).
A técnica de PCR diagnosticou mais casos de HPV de alto risco em relação à captura híbrida
II, contudo o método de PCR deve ser o de escolha, sendo o método mais barato, e apresenta
melhor sensibilidade e um alto valor preditivo negativo (NOMELINII et al., 2007).
Os métodos de CH2 e PCR mostraram-se uteis e eficazes para detectar o HPV
precocemente, entretanto, o teste de CH2 é um método mais demorado (RODRIGUES et al.,
2009). No entanto segundo Barra et al. (2011) A captura híbrida é o principal exame para a
identificação do Papilomavirus humano no Brasil. Entre as técnicas de biologia molecular
utilizadas, a captura híbrida II (CH II) apresenta ser mais apropriada para este propósito, pois
é de simples execução e leitura e não tem influência como presença de contaminação,
inflamação, atrofia ou sangue (SANTOS, 2011).
Segundo Santos (2011) a Captura hibrida II É um método quantitativo, sendo a única
técnica com aprovação pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) para
detectar o HPV. Sendo atualmente o único método para detectar o HPV, que é aprovado e
recomendado nos Estados Unidos pela Food and Drug Administration para utilização como
padrão ouro para o diagnóstico de HPV em amostras clinica nos Estados Unidos
(STILLMAN et al., 2009; PINO et al., 2011; MICHELLI et al., 2011). A CH II detecta a
presença de qualquer um dos 13 tipos de HPV de alto risco e é atualmente um dos os meios
mais utilizados para detectar HPV de alto risco em clínica prática (PINO et al., 2011).
Portanto, este se tornou o padrão para que os testes mais recentes sejam comparados
(STILLMAN et al., 2009).
CONSIDERAÇOES FINAIS
Em virtude do impacto na Saúde publica há a necessidade de conhecer os métodos
mais usados no diagnóstico de HPV e sua eficácia, enfatizando as técnicas moleculares, que
complementam o rastreamento do vírus. Tais técnicas demostram a capacidade de identificar
o HPV antes mesmo de manifestação clínica dos sintomas, e sua classificação em grupos de
alto e baixo risco. O grande diferencial destas técnicas está na maior sensibilidade e
especificidade entre os testes para o diagnóstico do HPV. Não há ainda na literatura uma clara
13
distinção sobre a maior eficiência do método de PCR sobre a Captura Híbrida, visto os
diversos estudos apresentam resultados semelhantes, às vezes, contraditórios. À medida que a
tecnologia avança, as técnicas moleculares vão se aprimorando na detecção do papiloma vírus
humano, contudo, há a necessidade de expansão do uso das técnicas para que se realize o
diagnóstico precoce, dessa forma evitando a evolução para neoplasia intra-epitelial cervical,
devido a contaminação feminina por HPV de alto risco.
14
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