DINÂMICA MOLECULAR DA INTERAÇÃO ENTRE O - PUC-Rio

Departamento de Química
DINÂMICA MOLECULAR DA INTERAÇÃO ENTRE O
CORTICOSTERÓIDE PREDNISOLONA E MODELOS DE
SURFACTANTE PULMONAR
Aluna: Érika Murce Silva
Orientador: André Silva Pimentel
Introdução
A administração de fármacos via inalação é um método não invasivo, que vem crescendo
recentemente. É viável graças à grande área superficial do pulmão humano, e da fina barreira de
difusão do pulmão periférico. Estas características tornam o pulmão um sítio ideal de absorção, e
a administração pulmonar direta evita a metabolização da droga durante o transporte ao sítio de
ação, o que ocorre na administração intravenosa. Assim, a inalação torna-se interessante
principalmente para o tratamento de doenças respiratórias como asma, infecções pulmonares e
câncer de pulmão.
A displasia bronco pulmonar, também conhecida como doença pulmonar crônica, afeta
principalmente recém-nascidos. Utiliza-se corticosteroides em seu tratamento, devido à sua ação
anti-inflamatória. A administração sistemática desses compostos, porém, causa efeitos adversos
no cérebro, os quais poderiam ser reduzidos com a administração local no pulmão. Para isso, um
método proposto de administração seria o uso de surfactantes naturais como veículos de
espalhamento. Por se tratarem de compostos naturais, eles são biocompatíveis e biodegradáveis,
além de serem compostos capazes de aumentar a solubilidade das drogas e facilitar o
espalhamento pela superfície dos pulmões. É necessário, porém, compreender detalhadamente as
propriedades do sistema, pois a interação entre o fármaco e o surfactante natural não pode inibir a
função de nenhum dos dois, e nem do surfactante pulmonar [1].
O surfactante pulmonar é situado na superfície dos alvéolos, participando do processo
respiratório. É composto na sua maior parte de lipídios, também possuindo proteínas em sua
composição. A maioria dos lipídios são fosfatidilcolinas, moléculas que possuem uma longa
cadeia hidrofóbica e uma porção hidrofílica, que neste caso é um grupamento colina. A principal
fosfatidilcolina presente é a dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), responsável principalmente pela
redução da tensão superficial dos pulmões. Essa redução da tensão superficial é uma das
principais funções deste filme, ocorrendo durante a respiração. É fundamental no processo físicoquímico, pois viabiliza que a interface ar-água do pulmão se expanda rapidamente. Além desse
trabalho de expansão, o líquido presente nos pulmões deve ser retirado, o que é facilitado pela
ação do surfactante de diminuição da tensão superficial da água [2].
Neste trabalho, a interação entre a prednisolona (Figura 1), um fármaco corticosteroide
utilizado para o tratamento de inflamações e condições autoimunes, e um modelo de surfactante
pulmonar foram estudadas. Este modelo é composto de uma mistura das fosfatidilcolinas DPPC e
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POPC (Figura 2) em monocamada, modelando o filme de surfactante na interface entre pulmão e
ar. O trabalho foi feito in silico, utilizando simulações de dinâmica molecular.
Figura 1. Estrutura do fármaco corticosteróide prednisolona.
Figura 2. Moléculas de DPPC (acima) e de POPC (abaixo). Ambas são fosfatidilcolinas
(PC) presentes no surfactante pulmonar. A molécula de DPPC apresenta duas cadeias de ácido
palmítico (C16:0) ligadas ao grupo fosfatidilcolina, enquanto que a molécula de POPC apresenta
uma cadeia de ácido palmítico e uma de ácido oleico (C18:1). Estas cadeias são comumente
chamadas de ‘caudas’ dos fosfolipídios.
As simulações computacionais são ferramentas interessantes para o estudo destes sistemas,
pois permitem o entendimento a nível molecular de sua estrutura e de suas interações, o que não
seria possível a nível experimental. Além disso, é possível realizar simulações em escalas de
tempo e resoluções variadas, de forma a estudar diferentes processos dentro de um mesmo
sistema. Neste trabalho, dois métodos de simulação diferentes foram utilizados: o método
atomístico tradicional all atoms (AA), onde todos os átomos são parametrizados individualmente,
e o método de coarse-grained (CG), um método no qual o sistema é modelado com menor
detalhamento, de forma a possibilitar modelagens de sistemas de tamanho e escala de tempo
maiores.
O método de coarse-grained MARTINI utilizado é baseado na parametrização precisa das
propriedades do sistema, em detrimento da reprodução estrutural de cada molécula deste. Desta
forma, processos como a autorganização de fosfolipídios, importante para este projeto, podem ser
estudados com precisão [3]. O estudo com diferentes metodologias permite obter uma maior
validação dos resultados, além de permitir a detecção de possíveis falhas nos métodos escolhidos,
o que não seria possível caso não houvesse outro método com o qual comparar. Este
procedimento é importante, visto que não há ainda experimentos in vitro que estudem o efeito do
fármaco escolhido em modelos de surfactante pulmonar.
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Metodologia
A simulação computacional de dinâmica molecular foi realizada no programa
GROMACS 5.0. [4] Para o modelo atomístico, o programa Cell Microcosmos foi utilizado na
construção da monocamada de fosfolipídios, que simula o surfactante pulmonar. Esta camada é
composta de uma mistura na proporção 7:3 dos fosfolipídios DPPC e POPC. Duas monocamadas
de orientação oposta foram construídas, e então exportadas para o programa GROMACS, onde
foram inseridas em uma caixa com vácuo, que simula a interface ar-água. Uma camada de água
com aproximadamente 7 nm foi inserida entre as monocamadas e as extremidades da caixa de 50
nm tem vácuo. Os arquivos de topologia e estrutura dos lipídios foram obtidos do banco de dados
Lipidbook. Já para o modelo coarse-grained, esta monocamada foi construída a partir do script
insane.py, do grupo desenvolvedor do campo de força MARTINI. As estruturas e topologias dos
fosfolipídios também foram obtidas do banco de dados deste grupo. Ambas as caixas
apresentaram simetria no eixo z.
A estrutura do fármaco prednisolona foi obtida do banco de dados DrugBank. Uma
minimização energética foi realizada no composto, utilizando o programa Ghemical. Para a
metodologia coarse-grained, o fármaco foi parametrizado a partir da molécula de colesterol,
obtida do grupo desenvolvedor do campo de força MARTINI. Foi feita uma dinâmica molecular
para garantir que a parametrização estava correta. Então, foi calculada a energia livre de partição
(
) do fármaco a partir da energia livre de solvatação do fármaco em octanol, e da energia
livre de hidratação do fármaco em água. Este parâmetro permite obter o coeficiente de partição
(log P) do fármaco, que pode ser comparado com o valor experimental, de forma a validar a
metodologia de parametrização. A fórmula para estes cálculos está apresentada nas Equações 1 e
2. O valor de
foi calculado por ambas as metodologias, atomística e coarse-grained.
Equações 1 e 2. Energia livre de partição e sua relação com o coeficiente de partição.
Inicialmente, as monocamadas com água foram simuladas sem a presença do fármaco, de
modo a garantir que o equilíbrio do filme de surfactante pulmonar fosse atingido. O sistema
passou por um processo de minimização energética, equilíbrio e então pela dinâmica molecular.
Nos sistemas atomísticos, a dinâmica simulou 200 ns do sistema, enquanto que nos sistemas
coarse-grained a simulação foi de 2 μs. Filmes com 128 fosfolipídios foram utilizados no início,
em ambos os métodos, mas verificou-se que era possível simular um sistema maior, com 1024
fosfolipídios, com o método de coarse-grained. Além disso, os sistemas foram simulados em
duas tensões superficiais diferentes, 0 e 20 mN/m, para simular as diferentes pressões presentes
no pulmão durante o movimento respiratório.
Após o equilíbrio dos filmes, a molécula de prednisolona foi inserida aleatoriamente, por
meio de um script, no vácuo do sistema. Sistemas com 2 moléculas do fármaco e sistemas com
20 moléculas foram concebidos, de modo que possuíssem simetria no eixo z. Então, os sistemas
foram minimizados, equilibrados e a dinâmica molecular foi realizada. Os algoritmos de
dinâmica molecular para acoplamento de temperatura e pressão usados foram Nose-Hoover e
Parrinello. A temperatura foi mantida a 310 K, e a pressão a 1 atm. Os acoplamentos garantem o
controle desses parâmetros durante a simulação. Em algumas condições, porém, os sistemas
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coarse-grained não atingiram o equilíbrio. Assim, foi necessária uma troca, e foram testados os
algoritmos V-rescale e Berendsen, respectivamente. Foi também testado o ensemble NpT para o
tipo de acoplamento de pressão, no lugar do acoplamento semi-isotrópico. Diferentes cut-offs
para as interações entre as moléculas também foram testados. Este parâmetro indica até que
distância do átomo atual as interações com os átomos vizinhos será considerada, ou seja, quando
seu valor é muito baixo, apenas as interações com átomos muito próximos são consideradas,
desprezando as interações com os átomos mais distantes. Foram modificados os cut-offs das
interações de Coulomb e de van der Waals.
Os sistemas foram analisados para a obtenção da área média por fosfolipídio e do
parâmetro de ordem dessas moléculas. A área média é um valor que pode ser obtido
experimentalmente, enquanto que o parâmetro de ordem indica o grau de organização das
moléculas de fosfolipídio no filme. Além disso, nos sistemas com a inclusão do fármaco, foi
analisada a agregação de suas moléculas.
Resultados
Os valores de energia livre de partição obtidos em ambas as simulações estão
apresentados na Tabela 1. O valor de log P experimental para a prednisolona é de 1,46. Os
valores diferem em aproximadamente uma ordem de grandeza, mostrando a presença de
possíveis erros nos cálculos teóricos na entropia do sistema e, portanto, ser melhor avaliado com
outra metologia. Os valores das duas simulações são mais próximos entre si, e a divergência pode
ser atribuída a diferença entre a metodologia atomística e de coarse-grained. Como o valor entre
as duas simulações é próximo, pôde-se validar a parametrização coarse-grained do fármaco.
(kJ.mol-¹)
(kJ.mol-¹)
(kJ.mol-¹)
log P
Atomístico
-75,37 ± 1,37
0,94 ± 0,40
-76,31 ± 1,42
13,28
Coarse-grain
-227,42 ± 0,06
-178,49 ± 0,34
-48,93 ± 0,35
8,51
Tabela 1. Valores de log P calculados para a prednisolona por meio das metodologias atomística
e de coarse-grained, obtidos a partir da energia livre de partição.
Todos os filmes atingiram o equilíbrio antes da adição de fármaco no sistema. Após a sua
adição, observou-se que durante os estágios iniciais de equilibração, as moléculas já se dirigiam
ao filme e o adentravam, permanecendo alinhadas entre os fosfolipídios. A Figura 3 mostra as
moléculas de fármaco alinhadas no filme. Durante a simulação de dinâmica molecular, o fármaco
permaneceu nesta posição, porém mostrando rearranjos conformacionais. Nos sistemas com a
presença de várias moléculas de fármaco, a formação de agregados de 2 a 4 moléculas foi
observada.
Os resultados de área por lipídio e parâmetros de ordem para as simulações atomísticas
(AA) estão dispostos na Tabela 2. Para todas as simulações, os mesmos algoritmos (Nose-Hoover
e Parrinello), número de lipídios (128) e cut-off (1.2) foram utilizados, com exceção de duas
simulações feitas para a comparação com os resultados de coarse-grained. Os valores de área por
lipídio obtidos foram semelhantes para as mesmas tensões, mesmo com adição do fármaco, mas o
aumento de tensão acarretou grande aumento da área. Observou-se também diminuição da ordem
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das caudas dos fosfolipídios com o aumento da tensão.
Figura 3. Sistema coarse-grained representando as moléculas de prednisolona (em verde)
alinhadas ao filme de fosfolipídios (em azul). As monocamadas de fosfolipídios são separadas
por água (em roxo).
Algoritmo
Nº lipídios
Nº mol. Tensão
fármaco (mN/m)
Área
(Ų/lipídio)
0
57.87+1.44
20
66.93+2.77
0
57.83+1.25
20
68.47+1.56
0
58.95+1.38
20
69.78+3.81
0
NoseHoover/
Parrinello
Sistemas
AA
2
128
20
NoseHoover/
Parrinello
cut-off 1.0
0
0
60.19+1.82
NpT
0
-
50.56+0.10
Parâmetros de
Ordem
0,265; 0,266;
0,117; 0,195
0,176; 0,180;
0,078; 0,140
0,268; 0,272;
0,116; 0,196
0,164; 0,170;
0,076; 0,138
0,274; 0,259;
0,135; 0,198
0,177; 0,180;
0,077; 0,137
0,245; 0,251;
0,110; 0,189
0,340; 0,341;
0,163; 0,256
Tabela 2. Valores de área por lipídio e parâmetros de ordem das simulações atomísticas.
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Os resultados para as simulações de coarse-grained (CG) estão apresentados na Tabela 3.
Inicialmente, os algoritmos Nose-Hoover e Parrinello foram utilizados, porém ao variar a tensão
de 0 a 20, a dinâmica molecular apresentou problemas, e não foi possível finalizá-la corretamente.
Além disso, ao adicionar o fármaco nos sistemas, também houve erros na dinâmica. Estes
problemas justificaram a troca para os algoritmos V-rescale e Berendsen. Uma vez que foi
possível realizar as dinâmicas, sistemas maiores, com 1024 fosfolipídios, foram testados, já que o
método de coarse-grained reduz significativamente o custo computacional. As simulações
utilizando o método NpT e com cut-off reduzido de 1.2 a 1.0 foram realizadas como testes, e
comparadas com os resultados atomísticos.
Algoritmo
Nº lipídios
NoseHoover/
Parrinello
126
126
Nº mol. Tensão
fármaco (mN/m)
0
Área
(Ų/lipídio)
0
47.12+0.61
20
-
0
49.83+0.70
20
55.25+0.78
0
48.43+0.16
20
55.14+0.31
0
48.39+0.16
20
-
0
48.56+0.14
20
55.15+0.44
0
0
Sistemas
CG
V-rescale/
Berendsen
1024
2
20
Parâmetros de
Ordem
0,845; 0,845;
0,845; 0,817
0,768; 0,773;
0,645; 0,716
0,559; 0,584;
0,500; 0,564
0,809; 0,820;
0,709; 0,764
0,597; 0,583;
0,496; 0,560
0,822; 0,833;
0,726; 0,777
0,816; 0,829;
0,728; 0,781
0,611; 0,598;
0,505; 0,569
V-rescale/
Berendsen
cut-off 1.0
1024
0
0
58.22+0.23
0,555; 0,542;
0,450; 0,501
NpT
1024
0
-
47.76+0.25
0,823; 0,837;
0,743; 0,798
Tabela 3. Valores de área por lipídio e parâmetros de ordem das simulações de coarse-grained.
Como nas simulações atomísticas, observa-se uma tendência ao aumento da área por
lipídio ao aumentar a tensão de 0 a 20 mN/m, com a adição do fármaco ao sistema pouco
influenciando a área. Os parâmetros de ordem também apresentaram decréscimo com o aumento
da tensão. Os valores de ambas as simulações, porém, diferem bastante entre si, com valores de
área por lipídio muito superiores na simulação atomística, e de parâmetro de ordem
significativamente inferiores. De forma a avaliar a causa desta discrepância, foi modificado o tipo
de acoplamento de pressão para NpT e o cut-off das interações foi reduzido. Os sistemas com
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acoplamento NpT apresentaram valores de área por lipídio mais próximos entre si, mostrando
que esta metodologia pode ser eficaz para as simulações. Já para a redução do cut-off, observouse que em ambos os casos a área por lipídio aumentou. O cut-off de 1.0, porém, é muito baixo, o
que significa que menos interações no sistema são consideradas, fornecendo resultados menos
precisos.
Além de comparar as duas metodologias entre si, os resultados obtidos foram comparados
com a literatura (Tabela 4) [5]. Apenas sistemas com a mistura DPPC e POPG, na proporção 8:2,
foram encontrados, dificultando a comparação dos resultados. O POPG é um fosfolipídio que
difere do POPC apenas pelo grupamento fosfatidilcolina, que é substituído pelo grupo
fosfatidilglicerol. Apesar de os dados da literatura não serem correspondentes, é possível ter uma
ideia aproximada de valores de área por lipídio.
Tensão (mN/m)
Atomístico
Coarse-grained
Área (Ų/lipídio)
0
20
48.0 + 1.0
52.7 + 1.2
51.3 + 0.6
54.5 + 0.7
Tabela 4. Valores de área por lipídio obtidos da literatura. Filmes de DPPC e POPG na proporção
8:2 puros, avaliados em diferentes tensões superficiais.
Os valores obtidos nas simulações de coarse-grained para a tensão de 20 mN/m são muito
próximos aos da literatura. Os valores para a tensão de 0 mN/m também estão próximos, apesar
de estarem um pouco abaixo. Para as simulações atomísticas, porém, observa-se uma grande
discrepância de valores, indicando que os valores obtidos superestimam a área por lipídio. Além
disso, observa-se pela literatura que as áreas apresentam valores próximos mesmo quando
calculadas pelos diferentes métodos, o que não foi obtido neste estudo. Apenas nas simulações
que utilizam o ensemble NpT os valores de ambas as metodologias foram semelhantes e se
aproximaram aos dados da literatura.
A partir destes resultados preliminares, verificou-se que a metodologia de coarse-grained
permitiu obter dados mais próximos dos disponíveis na literatura, mostrando maior precisão.
Além disso, o ensemble NpT representa uma metodologia promissora que ainda necessita ser
testada mais a fundo. Outro parâmetro que será calculado e permitirá a comparação com dados
experimentais é a compressibilidade da monocamada, obtida a partir de uma isoterma de pressãoárea. É necessário simular sistemas com diferentes tensões superficiais para obter este parâmetro,
pois a pressão é obtida a partir da tensão.
Experimentos com surfactantes disponíveis comercialmente e o fármaco serão também
realizados in vitro, para que os resultados teóricos obtidos no estudo possam ser comparados com
os experimentais. Uma vez possuindo todos estes dados, planeja-se expandir o projeto, testando a
compatibilidade entre diferentes corticosteroides e outros tipos de fármacos com o modelo de
surfactante pulmonar.
Conclusão
A administração de fármacos pela via inalação é um método promissor, que requer estudos de
compatibilidade entre o fármaco a ser administrado e o surfactante pulmonar, de forma que a função deste
não seja inibida. As simulações computacionais oferecem ferramentas para o estudo dessas interações,
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pois permitem visualizar a estrutura e o comportamento do sistema ao longo do tempo. Dessa forma, um
modelo em monocamada com os fosfolipídios DPPC e POPC, simulando o surfactante pulmonar, foi
concebido, e o fármaco prednisolona foi adicionado ao sistema. Os métodos atomístico e coarse-grained
foram usados no estudo. Os sistemas foram analisados para área por lipídio e parâmetro de ordem, e os
resultados comparados entre si. Os sistemas atomísticos apresentaram valores superiores aos dos coarsegrained de área por lipídio, sendo também superiores aos valores já existentes na literatura, o que mostra
que o sistema coarse-grained foi mais preciso. Para melhor avaliar as diferenças de metodologias,
diversos algoritmos e condições do sistema foram testadas, como o uso de diferentes tensões superficiais e
diferentes cut-offs. O ensemble NpT, um dos tipos de acoplamento de pressão utilizados, apresentou
resultados próximos aos encontrados na literatura. A partir destes resultados, serão testadas ainda
diferentes metodologias, e parâmetros adicionais como a compressibilidade serão calculados. Finalmente,
experimentos serão realizados de forma a complementar o estudo teórico, possibilitando uma maior
compreensão das interações que ocorrem entre este fármaco e o filme de surfactante pulmonar.
Referências
[1] Wang, Y.E. et al. Biophysical interaction between corticosteroids and natural surfactant
preparation: implications for pulmonary drug delivery using surfactant as a carrier. Soft Matter,
2012, 8, 504–511.
[2] Duncan, S and Larson, R. Comparing Experimental and Simulated Pressure-Area Isotherms
for DPPC. Biophysical Journal, 2008, 94, 2965-2986.
[3] de Vries, A. et al. The MARTINI force field: coarse grained model for biomolecular
simulations. J. Phys. Chem. B, 2007, 111 (27), 7812–7824.
[4] Abraham, M. et al. GROMACS: High performance molecular simulations through multi-level
parallelism from laptops to supercomputers. Soft. X., 2015, 1-2, 19-25.
[5] Tieleman, D. et al. Molecular dynamics study of the effect of cholesterol on the properties of
lipid monolayers at low surface tensions. Phys. Chem. Chem. Phys., 2009, 11, 1916-1922.