Leptodactylus Latrans - Diversidade Genética

1
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU EM CONSERVAÇÃO E MANEJO DE
RECURSOS NATURAIS – NÍVEL MESTRADO
REGINALDO RODRIGUES VICENTE
ESTRUTURA GENÉTICA DE POPULAÇÕES DE Leptodactylus latrans (STEFFEN, 1815)
(AMPHIBIA, ANURA) DE DUAS DIFERENTES PAISAGENS DOS CAMPOS GERAIS DO
PARANÁ
CASCAVEL-PR
AGOSTO/2014
2
REGINALDO RODRIGUES VICENTE
ESTRUTURA GENÉTICA DE POPULAÇÕES DE Leptodactylus latrans (STEFFEN, 1815)
(AMPHIBIA, ANURA) DE DUAS DIFERENTES PAISAGENS DOS CAMPOS GERAIS DO
PARANÁ
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação
Stricto Sensu em Conservação e Manejo de Recursos
Naturais – Nível Mestrado, do Centro de Ciências
Biológicas e da Saúde, da Universidade estadual do Oeste
do Paraná, como requisito parcial para a obtenção do título
de Mestre em Conservação e Manejo de Recursos Naturais
Área de Concentração: Conservação e Manejo de
Recursos Naturais
Orientador: Prof. Dr. Vladimir Pavan Margarido
CASCAVEL-PR
AGOSTO/2014
3
Ficha Catalográfica
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
Biblioteca Central do Campus de Cascavel – Unioeste
Vicente, Reginaldo Rodrigues
Estrutura genética de populações de Leptodactylus latrans (Steffen
1815) (Amphibia, Anura) de duas diferentes paisagens dos Campos
Gerais do Paraná / Reginaldo Rodrigues Vicente — Cascavel, PR:
UNIOESTE, 2014.
31 p.
Orientador: Prof. Dr. Vladimir Pavan Margarido
Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual do Oeste do
Paraná.
Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Conservação e
Manejo de Recursos Naturais, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde.
Bibliografia.
1. Cuidado parental. 2. FST. 3. Marcador molecular 4. Vagilidade.
Universidade Estadual do Oeste do Paraná.
4
―O que prevemos raramente ocorre; o que menos
esperamos geralmente acontece.”
(Benjamin Disraeli)
5
Agradecimentos
À Universidade Estadual do Oeste do Paraná – Unioeste, pela estrutura que possibilitou a
realização de todas as minhas atividades.
Ao Programa de Pós-Graduação em Conservação e Manejo de Recursos Naturais,
coordenação e equipe de professores, pela ajuda, auxílio e conselhos durante o meu
aperfeiçoamento no mestrado. A nossa assistente Márcia Cruz pela presteza e dedicação em nossa
passagem pelo programa.
À Fundação Araucária e ao CNPq pelo financiamento de projetos, e à CAPES pela bolsa concedida.
Ao Prof. Dr. Vladimir Pavan Margarido por ter me aceitado como seu orientando, contribuindo
grandemente para minha formação profissional e pessoal. Agradeço-o também pela dedicação dentro
e fora do laboratório, através de seus conselhos, seus encaminhamentos e sua imensa compreensão.
Muito obrigado!
À Profa. Dra. Rafaela Maria Moresco, pela paciência de lidar com minhas ansiedades, incentivar e
me “co-orientar” de forma sincera e dedicada. Foi ótimo poder contar com uma pessoa tão
carismática como você. Obrigado!
Às pessoas que de alguma forma colaboraram nessa minha caminhada, contribuindo positivamente
em minha vida. Destaco entre eles o Professor Roberto Laridondo Lui e as Professoras Jocicléia
Konerat e Vanessa Bueno. Agradeço também aos colegas de laboratório pelos dias em companhia
com sorrisos e crescimento pessoal.
Muito obrigado a minha grande colega e amiga Sama Beatriz Kuhn por estar comigo do começo ao
fim desta trajetória, se mostrando uma pessoa extremamente maravilhosa e carismática. Desejo o
melhor a você Sama!
Aos meus grandes amigos Claudecir Castilho Martins e Marco Eugênio da Silva que desde minha
chegada a Cascavel, sempre estiveram comigo em parceria.
A minha médica Dr. Yara pelo suporte prestado nesta caminhada.
Aos meus irmãos Raquel, Rafael, Robson pelos sorrisos e pela alegria em todos os dias da minha vida.
Por fim aos meus pais Ivanir e Sebastião, as pessoas mais importantes da minha vida, que revigoram
meus sonhos e engrandecem meu espírito a cada Dia. Agradeço-os pelo apoio incondicional em
minha vida em todos os sentidos.
6
Sumário
Lista de figuras ___________________________________________________________________ i
Lista de tabelas __________________________________________________________________ ii
Resumo_______________________________________________________________________ 11
Introdução ____________________________________________________________________ 12
Materiais e métodos _____________________________________________________________ 13
Resultados ____________________________________________________________________ 14
Discussão _____________________________________________________________________ 15
Referências ____________________________________________________________________ 17
Anexo I_______________________________________________________________________ 27
7i
Lista de figuras
Figura 1 - Locais de coleta de Leptodactylus latrans em São Lourenço do Oeste (SC) _________ 22
Figura 2 - Géis de agarose com os resultados do marcador ISSR em Leptodactylus latrans para os
quatro primers: (a) primer (GGAC)3A; (b) primer (GGAC)3C; (c) primer (GGAC)3T e (d) primer
(ACA)5G _____________________________________________________________________ 23
Figura 3 - Dendograma Neighbor-Joining construído a partir da análise de ISSR em Leptodactylus
latrans baseado no índice de similaridade de Jaccard com 10.000 permutações ______________ 24
Figura 4 - Gráfico de dispersão construído a partir da análise de ISSR em Leptodactylus latrans
com as principais coordenadas baseadas no índice de similaridade de Jaccard _______________ 25
8 ii
Lista de tabelas
Tabela 1 - Comparação entre pares de populações de Leptodactylus latrans baseada em análise de
ISSR ________________________________________________________________________ ___26
9
10
Análise de Inter Simple Sequence Repeat verifica alta endogamia e estruturação genética em
Leptodactylus latrans (Steffen, 1815) em curtas distâncias
Reginaldo Rodrigues Vicente e Vladimir Pavan Margarido*
Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Rua
Universitária 2069, Jardim Universitário, 85819-110 Cascavel, PR, Brasil;
*Autor para correspondência: Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Estadual do
Oeste do Paraná, Rua Universitária 2069, Cascavel, PR 85819-110, Brazil, Tel.: +55 45 3220-3235;
Fax: +55 45 3224-4566. e-mail: [email protected]
Analysis of Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) checks high inbreeding and genetic structuration
in Leptodactylus latrans (Steffen, 1815) over short distances.
Periódico: Population Ecology - http://www.springer.com/life+sciences/ecology/journal/10144
11
Resumo
Leptodactylus latrans é caracterizada como uma rã de grande porte (80 a 120 mm) que apresenta
cuidado parental. Seus ovos são depositados em ninhos de espumas preferencialmente em lagoas
permanentes, cujo comportamento favorece o aumento da sobrevivência de sua prole, podendo
refletir diretamente na estrutura genética populacional. O objetivo deste trabalho foi determinar a
diversidade e estrutura genética de Leptodactylus latrans em 4 lagoas do bioma Mata Atlântica
(Santa Catarina - SC)/Paraná - PR) através do marcador nuclear ISSR. Foram coletados 36
indivíduos (9 indivíduos/lagoa), sendo 3 lagoas em São Lourenço do Oeste [SC -Lagoa 1/Lagoa 2
(distantes 500m); Lagoa 2/Lagoa 3 (distantes 1.000m); Lagoa 1/Lagoa 3 (distantes 1.500m)]
distantes 37 km da lagoa de Francisco Beltrão - PR. Dos 91 loci obtidos, 81 loci foram
polimórficos, com 68,35% de variação intrapopulacional e 31,65% de variação interpopulacional. O
índice de diferenciação genética interpopulacional (FST) exibiu valores moderados entre as
subpopulações de São Lourenço do Oeste (0,054 ≤ FST ≤ 0,218), e alta diferenciação entre as
subpopulações de São Lourenço do Oeste e de Francisco Beltrão (0,403 ≤ FST ≤ 0,499), sendo
confirmado pelo dendograma Neighbor-joining baseado no índice de similaridade de Jaccard. Foi
verificada baixa heterozigosidade esperada nas 4 populações analisadas (0,1892≤ He ≤ 0,2485),
indicando alto grau de endogamia. Os resultados obtidos revelam a existência de baixo fluxo gênico
mesmo entre indivíduos de lagoas pouco distantes (500m), e sugerem uma alta influência na
estruturação genética populacional relacionada aos fatores ecológicos reprodutivos, tais como
cuidados parentais, que favorecem sobrevivência da prole, e a fidelidade aos sítios de vocalização.
Palavras-chave: Cuidado parental, FST, Marcador molecular, Vagilidade
12
Introdução
Ao longo do tempo e espaço, o processo de evolução biológica resultou numa alta gama de
biodiversidade, a qual traz consigo o acúmulo de variações hereditárias polimórficas que acabam se
fixando e estabelecendo novas unidades taxonômicas como as espécies (Santos et al. 2009).
Atualmente, porém, se observa que conservar toda essa biodiversidade tem sido um árduo trabalho
para a comunidade científica, que tem visado minimizar e compreender os impactos das ações
antrópicas responsáveis por formar pequenos e isolados fragmentos dos ecossistemas naturais, que
se tornaram importantes loci de conservação das espécies e suas populações (Costa & Scariot 2003;
Ficetola & Bernardi 2004; Ewers 2005).
Embora a diversidade genética possibilite as populações se adaptarem diante das alterações
ambientais de variadas origens, para se determinar a diversidade genética de uma espécie é preciso
compreender a sua estrutura populacional, ou seja, a distribuição heterogênea de seus alelos e
genótipos no tempo e espaço, seu fluxo gênico, seleção natural, deriva genética, sendo notadamente
importante correlacionar estes fatores aos aspectos ecológicos da espécie (Hamrick 1982; Costa &
Scariot 2003; Telles 2005). Assim, percebe-se que fatores evolutivos e ecológicos também se
estabelecem como responsáveis pela compreensão da diferenciação genética presente nas
populações (Epperson 2003; Rousset 2004).
Em populações de anfíbios vários estudos vêm gradativamente contribuindo para o melhor
entendimento dos seus fatores evolutivos e ecológicos (Wilbur 1997; Funk et al. 2005; Wagner et
al. 2005). No entanto, embora vários anfíbios apresentem alta distribuição e expansão geográfica,
este grupo se caracteriza com perfil filopátrico de baixa dispersão populacional e dependência de
ambientes úmidos ou aquáticos devido a seu pequeno porte e permeabilidade da pele (Blaustein et
al. 1994; Oliveira 2011). Dentro do grupo de anfíbios, ordem Anura e família Leptodactylidae,
Leptodactylus latrans (Stefeen, 1815) (=Leptodactylus ocellatus) é caracterizada como uma rã de
grande porte (80 a 120 mm) e de hábitos carnívoros, cujos estudos são basicamente voltados a
relatos de sua ocorrência, dieta e análises morfológicas, deixando assim uma lacuna de
conhecimento no que se refere aos seus hábitos ecológicos e comportamentos reprodutivos
atrelados a sua estrutura populacional (Scott et al. 1987; Santos et al. 2009; Lavilla et al. 2010;
Pazinato et al. 2011; Borges 2012).
Com o surgimento e avanço da biologia molecular, alguns estudos feitos em populações de
anfíbios, como os de Silva et al. (2007) e Moresco et al. (2013), vêm mostrando a praticidade de se
usar marcadores moleculares para analisar a diversidade genética de populações de anfíbios
13
relacionando seus resultados a suas características ecológicas e evolutivas. Telles et al. (2006), em
um estudo de genética de paisagem, ressaltam que o uso de marcadores moleculares possibilita
visualizar regiões polimórficas, ou seja, variabilidade genética intra e interpopulacional, sendo
muito útil nos estudos de monitoramento de diversidade genética de populações de anfíbios.
Diante dos vários marcadores moleculares existentes, alguns têm sido amplamente
utilizados em estudos de anfíbios, como as isoenzimas (Bisconti et al. 2011), RAPD (Telles et al.
2006; Silva et al. 2006), DNA mitocondrial (Vences et al. 2005; Funk et al. 2007) e microssatélites
(Martínes & París 2005; Conte et al. 2011). Moresco et al. (2013) recentemente fizeram o uso
pioneiro do marcador ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) em anuros neotropicais, obtendo ótimos
resultados, e mostrando ser este extremamente útil e eficiente no diagnóstico da diversidade
genética de populações de anfíbios. No entanto, embora na literatura se verifique que o marcador
molecular ISSR produza excelentes resultados e tenha baixo custo em relação aos demais
marcadores, este apresenta estudos escassos de diversidade e estrutura genética de populações em
anfíbios (Zhou et al. 2011).
O presente estudo teve como objetivo analisar a diversidade genética intra e
interpopulacional de L. latrans em lagoas naturais nos Campos Gerais da Mata Atlântica por meio
do uso de marcadores moleculares ISSR, relacionando estes resultados a aspectos ecológicos.
Materiais e métodos
As coletas foram realizadas em 4 lagoas naturais e permanentes do Bioma Mata Atlântica,
no ecossistema de Campos Gerais, estando 3 lagoas no município de São Lourenço do Oeste, Santa
Catarina (26º21’50‖ S; 52º56’43‖ O) (Figura 1) e uma em Francisco Beltrão (Ao lado da
Universidade Paranaense, 26º07’90’’ S; 53º05’06’’ O), Paraná. As lagoas analisadas estão dispostas
da seguinte forma: lagoas 1 e 2 distantes 500m, lagoas 2 e 3 distantes 1.000m, lagoas 1 e 3 distantes
1.500m, e lagoa 4 (Francisco Beltrão) distante cerca de 37 km das lagoas de São Lourenço do
Oeste. As coletas foram realizadas nos períodos de setembro/2011 a abril de 2013. Foram coletados
no total 36 indivíduos, sendo 9 indivíduos de cada lagoa (Licença temporária conforme SISBIO
31060-1), e sacrificados por submersão corporal completa em etanol 20% (Comitê de Ética na
Experimentação Animal a Aulas Práticas - CEEAAP/Unioeste - Protocolo nº 66/10). Foi retirado
tecido hepático dos indivíduos e fixado em etanol 100% para posterior extração de DNA. A
extração de DNA foi realizada com o GenElute™ Mammalian Genomic Miniprep Kit (SigmaAldrich, Buchs, SG, Switzerland), seguindo recomendações do fabricante. A quantificação do DNA
14
genômico foi realizada em gel de agarose 1%, utilizando a comparação com o peso molecular do
marcador Low DNA Mass Ladder (Invitrogen Life Technologies Corporation, Grand Island,
NewYork, USA). Após a quantificação, o DNA foi diluído a uma concentração final de 10 ng/μl.
Para a amplificação dos fragmentos ISSR foram utilizados os primers (GGAC)3A,
(GGAC)3C, (GGAC)3T e (ACA)5G. As condições de amplificação do DNA através de PCR foram
as recomendadas por Fernandes-Matioli et al. (2000) com modificações. A mistura de reação de
amplificação consistiu em Tris-KCl, 2 mM de MgCl2, 0,92 mMprimer, dNTP mM 0,38, 1 Taq
U/reação da DNA polimerase, e DNA (10 ng) e água suficiente para perfazer um volume de 13 μl.
As condições de amplificação do DNA, via PCR, ocorreram em termociclador programado para 4
ciclos de 45s a 94 °C, 1 min a 51 °C e 1 min a 72 °C, seguido por 29 ciclos de 45 s a 94° C, 1 min a
48 °C e 1 min a 72 °C. Após o último ciclo de amplificação, a mistura de reação foi arrefecida e
mantido a 4 °C. Controles negativos sem DNA foram incluído em cada conjunto de amplificações.
Depois da amplificação, amostras que consistiam 7 μl da mistura de reação de PCR foram
submetidas a eletroforese em 1,4% gel de agarose e coradas com brometo de etídio (0,2 μg/ml). Em
seguida o material foi visualizado e fotografado em um transiluminador de luz UV, com sistema de
captura de imagem Quantum ST4 v16.04 e câmera digital 1.4 megapixels através do software
Quantum-capt.
Os fragmentos foram lidos como presença (1) e ausência (0) de bandas para a obtenção de
uma matriz binária. A matriz de distância genética entre pares foi obtida pelo índice de similaridade
de Jaccard, para construir o dendrograma Neighbor-Joining, utilizou-se o programa FreeTree e
Mega 6.0. As principais coordenadas de dispersão (scatter plot) foram obtidas utilizando os
programas DistPCoA e Statistica 7.1. A diferenciação genética foi examinada através da aplicação
do teste de Mantel, com 10.000 permutações para a matriz de similaridade Jaccard utilizando o
programa Mantel-Struct 1.0. A análise da variância molecular (AMOVA), heterozigosidade
esperada (He) e o índice de diferenciação genética (FST) foram obtidos pelo programa Arlequim
3.5.1.2. Por meio de AMOVA, a variação genética foi separada em dois níveis: por lagoa
(intrapopulacional) e entre lagoas (interpopulacional).
Resultados
Foram encontrados 91 loci, sendo 58 polimórficos (64%) para a subpopulação da lagoa 1,
52 loci polimórficos (57%) na lagoa 2 e 43 loci polimórficos (47%) na lagoa 3, com variação
intrapopulacional de 68,35% e variação interpopulacional 31,65%. Os fragmentos amplificados
15
estavam entre 1430 e 160 para o primer (GGAC)3A, 1200 e 230 para o primer (GGAC)3C, 1650 e
210 para o primer (GGAC)3T e 2250 e 290 para o primer (ACA)5G (Figura 2).
A análise do dendograma (Figura 3) revelou 3 agrupamentos, sendo um oriundo da lagoa
3, outro da lagoa 4, e outro formado pelas lagoas 1 e 2. O gráfico de dispersão das principais
coordenadas construídas com os dois principais vetores próprios (0,260 e 0,100 de variação,
respectivamente), também obtida com o índice de similaridade de Jaccard, vem corroborar o
dendograma Neighbor-Joining indicando também 3 principais agrupamentos (Figura 4).
A diferenciação genética entre as subpopulações obtida pelo teste de Mantel exibiu valores
moderados (0,25 > FST ≥ 0,05) entre as 3 subpopulações (lagoas) de São Lourenço do Oeste, e alta
diferenciação (FST > 0,25) entre as subpopulações de São Lourenço do Oeste e de Francisco Beltrão
(Tabela 1). A dissimilaridade genética intrapopulacional foi quase a mesma para todas as lagoas,
fixando valores de 0,444 na Lagoa 1, 0,415 na Lagoa 2, 0,379 na Lagoa 3 e 0,394 na lagoa 4. A
heterozigosidade esperada (He) se demonstrou baixa e foi quase a mesma para todas as
subpopulações, sendo de 0,2484 ± 0,2144 na Lagoa 1, 0,2423 ± 0,2341 na Lagoa 2, 0,2045 ±
0,2340 na Lagoa 3 e na 0,1892 ± 0,2192 lagoa 4.
Discussão
A heterozigosidade esperada se mostrou similar e baixa para todas as subpopulações
analisadas no presente estudo (0,1892≤ He ≤ 0,2485), indicando portanto alto grau de endogamia
nas 4 subpopulações, mesmo estas estando a curtas (500, 1.000 e 1.500m), resultados oriundos do
perfil filopátrico da espécie. Neste contexto, alguns anfíbios muitas vezes apresentam forte
fidelidade ao seu habitat, que culmina em baixa habilidade dispersiva, reduzindo o fluxo gênico
entre populações (Burns et al. 2004; Funk et al. 2005; Silva 2006). Seppä e Laurila (1999)
identificaram que Rana temporaria também se caracteriza como um anfíbio de perfil filopátrico e
baixa dispersão, fatores estes que contribuem para redução da sua variabilidade genética
culminando em endogamia e o isolamento de suas populações (Ficetola & Di Bernardi 2004,
Johansson et al. 2007). Já Conte et al. (2009), utilizando microssatélites analisaram 160 indivíduos
de subpopulações de Physalaemus cuvieri de diversas regiões do Brasil e encontraram valores de
He bem maiores (0,30 ≤ He ≤ 0,85), indicando excesso de heterozigosidade esperada e definindo a
população global de seu estudo como panmítica.
Os resultados da análise genética do dendograma e gráfico de dispersão demonstraram
agrupamentos isolados e bem definidos das subpopulações das lagoas 3 e 4, e misto entre as lagoas
16
1 e 2, e também indicaram moderada diferenciação genética (0,054 ≤ FST ≤ 0,218) entre as 3 lagoas
de São Lourenço do Oeste, e alta diferenciação (FST > 0,403) entre as 3 subpopulações de São
Lourenço do Oeste em relação à Francisco Beltrão. Em estudo com RAPD entre populações de L.
latrans distantes 38 Km no estado de São Paulo, também verificou-se alta diferenciação genética
(FST = 0,53) (Arruda & Versute 2008). Moresco et al. (2013), com o marcador ISSR em populações
distantes 35 Km de P. cuvieri, que se caracteriza como uma espécie de pequeno porte, obteve
resultado similar (FST = 0,072) ao encontrado no presente trabalho em distâncias bem menores (500,
1.000 e 1.500m). Neste contexto, verifica-se que distância geográfica não deve ser compreendida
como a variável de maior influência no fluxo gênico e, consequentemente na diferenciação genética
de populações de anfíbios. Contudo, um anfíbio de pequeno porte como P. cuvieri com
diferenciação genética interpopulacional menor que L. latrans em distâncias semelhantes, acaba
tendo menor diferenciação entre suas populações devido a estratégias ecológicas diferentes.
Kuhn (2014), em estudo utilizando o marcador ISSR em populações de Scinax granulatus
de uma mesma lagoa, mas de diferentes lados e diferentes bromélias, encontrou baixa diversidade
genética (FST < 0,05) entre as populações dos diferentes lados, mas verificou o isolamento de uma
população em uma das bromélias. O autor sugere que estratégias reprodutivas e o desenvolvimento
da prole na bromélia até a fase adulta foram os responsáveis pela diferenciação genética dos
indivíduos naquela bromélia, uma vez que era composta por uma fêmea adulta e 4 juvenis.
O comportamento ecológico voltado ao deslocamento em anfíbios acaba sendo um fator
preponderante para a diferenciação genética de suas populações. Mesquita e Wirderhercker (2003)
em estudo sobre deslocamento de anfíbios, verificaram uma variação de deslocamento médio em L.
latrans entre zero e 30m. Embora esta espécie seja de grande porte, ela se mostra filopátrica e fiel
principalmente ao sítio de vocalização, informações estas que corroboram para a redução de fluxo
gênico, alta endogamia intrapopulacional e alta diferenciação genética interpopulacional mesmo em
curtas distâncias. Estas tendências podem ser acentuadas quando somadas as características de
reprodução mencionadas por Oliveira (2011), que descreve L. latrans com intenso cuidado a prole,
cujo comportamento favorece o aumento da sobrevivência e fixação de alelos em suas populações,
resultando em baixa heterozigosidade. Seus ovos são depositados em ninhos de espumas
preferencialmente em lagoas permanentes (Crump 1996) e são agraciados com cuidados parentais
(defesa, direcionamento da prole e construção de canaletas) (Rodrigues, 2008). Heyer (1969)
complementa que, além de cuidados com a prole, esta espécie também apresenta girinos em grupos,
outro comportamento que remete uma herança genética comum em suas populações, indicando
também uma conservação dos alelos, o que diminui a heterozigosidade de suas populações.
17
Portanto, os resultados aqui obtidos indicam que características comportamentais de L.
latrans refletem em alta influência na estruturação genética populacional, relacionados aos fatores
ecológicos reprodutivos da espécie, tais como a fidelidade aos sítios de vocalização e cuidados parentais que
favorecem a sobrevivência da prole, e levando ao baixo fluxo gênico e alta endogamia.
Agradecimentos
Os autores são gratos ao Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade
(ICMBio) pela autorização da captura de espécimes. Os autores agradecem a Unioeste pelo suporte
técnico. Este estudo foi financiado pela Fundação Araucária (Fundação Araucária de Apoio ao
Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Estado do Paraná), CAPES (Coordenadoria de
Aperfeiçoamento de Ensino Superior) e CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico
e Tecnológico).
Referências
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22
Figura 1: Locais de coleta de Leptodactylus latrans em Francisco Beltrão (PR) e São Lourenço do
Oeste (SC).
23
a
b
c
d
Figura 2: Géis de agarose com os resultados do marcador ISSR em Leptodactylus latrans para os 4
primers: (a) primer (GGAC)3A; (b) primer (GGAC)3C; (c) primer (GGAC)3T e (d) primer
(ACA)5G.
24
Figura 3: Dendograma Neighbor-Joining construído a partir da análise de ISSR em Leptodactylus
latrans baseado no índice de similaridade de Jaccard com 10.000 permutações.
25
Figura 4: Gráfico de dispersão construído a partir da análise de ISSR em Leptodactylus latrans
com as principais coordenadas baseadas no índice de similaridade de Jaccard.
26
Tabela 1: Comparação entre pares de populações de Leptodactylus latrans baseada em análise de ISSR
Pares de
Distância
FST
p
r
Z
Z10.000
Dissimilaridade
populações
geográfica
comparadas
(Km)
Lagoa 1 x
0.5
0.054
0.0321
0.159
36.304
35.593
0.448
1.5
0.218
0.0001
0.504
40.460
37.093
0.499
36.8
0.403
0.0002
0.863
50.111
42.514
0.619
1.0
0.135
0.0001
0.300
36.272
34.337
0.448
36.9
0.424
0.0001
0.885
49.901
41.840
0.616
37.0
0.499
0.0002
0.902
52.682
42.606
0.650
genética
Lagoa 2
Lagoa 1 x
Lagoa 3
Lagoa 1 x
Lagoa 4
Lagoa 2 x
Lagoa 3
Lagoa 2 x
Lagoa 4
Lagoa 3 x
Lagoa 4
Distância aproximada em quilômetros (Km), índice de diferenciação genética interpopulacional (FST), nível de significância para a dissimilaridade genética (p),
correlação entre duas matrizes (r), robustez relacionada aos dados originais (Z), e depois de 10.000 permutações (Z10 000), dissimilaridade genética utilizando o
Coeficiente Jaccard.
27
Anexo I
Instructions for Authors: Population Ecology
GENERAL
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language without the consent of the copyright owners, that the rights of third parties will not be
violated, and that the publisher will not be held legally responsible should there be any claims for
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the Editor-in-Chief)‖ that no part of the manuscript has been published or considered for publication
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publication. Comments could also contain a brief introduction of the manuscript (NOT an abstract)
and reason(s) for submitting it to Population Ecology.
Authors wishing to include figures or text passages that have already been published
elsewhere are required to obtain permission from the copyright owners and to include evidence that
such permission has been granted when submitting their papers. Any material received without such
evidence will be assumed to originate from the authors.

Editorial office

Dr. Kazunori Sato, Chief Editor

Faculty of Engineering, Shizuoka University

3-5-1 Johoku, Naka-ku, Hamamatsu 432-8561, Japan

Enquiries to the Editorial Office:

e-mail: popecol+fsc.hokudai.ac.jp

(replace "+" with "@" to use this e-mail address)
ONLINE MANUSCRIPT SUBMISSION
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28
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PREPARATION OF MANUSCRIPTS
Manuscripts must be in English. The text should be double-spaced with 3-cm margins on
A4-size pages. Number lines and pages consecutively throughout the manuscript and arrange them
in the following order: title page, abstract, key words, text, acknowledgments, references, tables,
figure legends.

Title page:
The title page must include the title, along with the names and affiliations of all authors.
Also give the full name, address, and e-mail address of the author who is to receive and
approve page proofs. Other authors may also have their e-mail addresses included if they
wish.The title page must also include information about the structure of the manuscript: the
number of text pages, the number of figure(s)/table(s), and any other notes.

Abstract and key words:

An abstract should be no longer than 250 words, and should concisely summarize the contents
and main conclusions of the article. A list of up to 6 key words must immediately follow the
abstract. Key words should not include words used in the article title.

Text:

Authors should consult recent issues for details of style and presentation. Scientific names and
mathematical parameters should be in italics. The complete scientific names (genus, species,
and authority) should be cited for every organism on first appearance in the text: the
authority can be omitted in the case of an organism from a cited paper.

References:

References should be cited in the text by the author and year. The reference list at the end of
the paper should include only works cited in the text and should be arranged alphabetically
by the name of the first author. Citations of "unpublished results" or papers "in preparation"
should be included in the text but not in the reference list.
References should be cited as follows: journal papers—names and initials of all authors,
year in parentheses, full title, journal as abbreviated in accordance with international
practice, volume number, first and last page numbers; books—names and initials of all
29
authors, year, chapter title, names of all editors, full title, edition, publisher, place of
publication.
Responsibility for the accuracy of bibliographic data rests entirely with the author.

Tables:
Each tables must be on separate page with short, informative titles. Tables should be
numbered consecutively with Arabic numerals. Double-space all parts of each table.

Figures:
The figures should match the size of either the column width (8.4 cm) or the printing area
(17.4 × 23.4 cm). Figure parts should be identified by lowercase roman letters (a, b, etc.). If
illustrations are supplied with uppercase labeling, lowercase letters will still be used in the
figure legends and citations. Figure legends should be placed at the end of the text.
For production, the publisher requires figure files to be prepared following the Technical
Instructions for Manuscripts and Illustrations in Electronic Form, published in most issues. Color
figures will always be published in color in the online version. In print, however, they will appear in
color only if the author agrees to make a contribution (JPY 152 000 per article) to printing costs.
Otherwise, the figures will be printed in black and white.
Please note that, in such cases, it is authors’ responsibility to prepare figures to be
illustrative enough to convey the necessary information even after they are converted into black and
white. Units of measurements The International System of Units (SI) should be used.
ELECTRONIC SUPPLEMENTARY MATERIAL
Electronic Supplementary Material (ESM) for a paper will be published in the electronic
edition of this journal provided the material is:

submitted in electronic form together with the manuscript.

Accepted after peer review:
ESM may consist of:

Information that cannot be printed: animations, video clips, sound recordings (use
QuickTime, .avi, .mpeg, animated GIFs, or any other common file format).


Information that is more convenient in electronic form: sequences, spectral data, etc.
Legends must be brief, self-sufficient explanations of the ESM. ESM is to be numbered and
referred to as S1, S2, etc.

After acceptance for publication, ESM will be published as received from the author in the
online version only. Reference will be given in the printed version.
30
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separate e-mail for ordering offprints and printing of figures in color.
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Open Choice
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Publisher exclusive publication and dissemination rights). This will ensure the widest
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
Online First:
31
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first publication citable with the DOI. After release of the printed version, the paper can also
be cited by issue and page numbers.

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Ecology.