desenvolvimento de um protocolo de desinfecção e extração

DESENVOLVIMENTO DE UM PROTOCOLO DE DESINFECÇÃO E
EXTRAÇÃO DE MERISTEMAS APICAIS DE MANDIOCA
(Manihot esculenta) DO BANCO DE GERMOPLASMA DA UEM
Taise Bijora (PIC-UEM); Patrícia Rosin Carnelossi (Mestranda em
Agronomia, CAPES-UEM), Eliezer Rodrigues de Souto (Orientador,
[email protected]), Arildo José Braz de Oliveira (Departamento de Farmácia e
Farmacologia),
Universidade Estadual de Maringá/Centro de Ciências Agrárias
Palavras- Chave: Micropropagação de plantas, desinfecção, vírus.
Resumo
Para a limpeza de vírus de mandioca tem-se utilizado a cultura in vitro de
meristemas associado à termoterapia, com explantes livres de
contaminantes, sendo necessário a utilização de protocolos de
descontaminação eficientes. A maior dificuldade está em se obter material
limpo sem conduzi-lo à morte quando isolado. Neste trabalho testaram-se
protocolos de desinfecção utilizando concentrações e tempos de exposição
diferentes ao fungicida Tebuconazole em 6 materiais do Banco de
Germoplasma de Mandioca da UEM, com o objetivo de desenvolver um
protocolo de desinfecção para obtenção de plântulas viáveis, aptas para o
desenvolvimento in vitro.
Introdução
A mandioca (Manihot esculenta Crantz) é uma espécie propagada
vegetativamente, através de manivas. Por esta razão, apresentam
inconvenientes como a disseminação de doenças sistêmicas através das
gerações sucessivas, tal como ocorre com as causadas por vírus, podendo
acarretar a degenerescência das manivas (Costa & Kitajima, 1972). O vírus
do mosaico comum da mandioca (CsCMV), por exemplo, pode causar
perdas de produção de 10 a 20%, em manifestações severas em variedades
susceptíveis, reduzindo de 10 a 50% o teor de amido (Fukuda, 1993). Para a
limpeza de fitovírus tem-se utilizado a cultura in vitro de meristemas
associada à termoterapia. A técnica de cultura in vitro requer explantes livres
de contaminantes, sendo necessária a utilização de protocolos para a
descontaminação. A maior dificuldade tem sido a obtenção de material
descontaminado sem conduzi-lo à morte quando isolado. O objetivo deste
trabalho foi desenvolver um protocolo de desinfecção que permita obter
plântulas viáveis livres de contaminantes, e aptas para o desenvolvimento in
vitro.
Material e Métodos
Foram usados 6 materiais provenientes do Banco de Germoplasma de
Mandioca (BG) da Fazenda Experimental de Iguatemí (FEI), da Universidade
Estadual de Maringá: BG 01; BG 09; BG 119; BG 136; BG 203 e BG 101. De
cada material foram cortadas manivas de aproximadamente 20 cm de
comprimento, as quais foram vedadas nas suas extremidades com parafina.
Estas manivas foram cultivadas durante 30 dias, em câmara de termoterapia
com 16 h de luz a 40ºC e 8 h de escuro a 28ºC. Após esse período as
brotações foram retiradas e desinfectadas com as seguintes soluções:
detergente Tween por 30s, álcool etílico 50% por 1 min, Tebuconazol a 25 %
por diferentes períodos de tempo (5,0 min e 7,0 min) e diluído em diferentes
concentrações de volume/500 ml de água estéril (50µl, 100µl, 300µl, e 500
µl) e posteriormente em uma solução de hipoclorito de Cálcio 0,25% por 10
min e em seguida, foram feitas três lavagens com água estéril. Os brotos
foram cultivados em meio de cultura contendo os macros e micronutrientes
do MS (Murashige & Skoog, 1962) suplementado com 1 mg L-1 de tiamina,
100 mg L-1 de inositol, 0,02 mg L-1 de ANA (ácido naftaleno acético), 0,04
mg L-1 de BAP (benzilaminopurina), 0,05 mg L-1 de GA3 (ácido giberélico),
2% de sacarose e 7g L-1 de ágar, e pH 5,7, e mantidos sob o mesmo regime
de luz e temperatura por 30 dias. Após esse período, foram retirados os
meristemas apicais em câmara de fluxo laminar, com auxílio de pinça e
bisturi. O cultivo dos meristemas foi feito em meio MS suplementado, como
descrito, sob condições de temperatura de 24±2°C, fotoperíodo de 16 horas
e intensidade luminosa de 1.600 lux, por 30 dias (subcultivo 0). Para o
desenvolvimento dos meristemas estes foram transferidos para um meio de
cultura composto por 35% dos macros e micronutrientes do MS,
suplementado com 1 mg L-1 de tiamina, 100 mg L-1 de inositol, 0,01 mg L-1
de ANA, 0,01 mg L-1 de GA3, 2% de sacarose e 7 g L-1 de ágar, e de pH 5,7
(subcultivo 1), nas mesmas condições de cultura acima descritas.
Resultados e Discussão
O número de brotos contaminados por microorganismos e o número de
brotos viáveis para a retirada dos meristemas apicais foram avaliados. As
diluições do fungicida Tebuconazole a 25% usadas neste trabalho para a
desinfecção de brotos de mandioca, com imersão na solução por 5 minutos,
resultou em grandes variações no desenvolvimento dos brotos, bem como
na redução da contaminação por fungos. Nos brotos desinfetados com
solução de Tebuconazole 25% na diluição de 50µL /500 mL por 5 minutos,
houve 100% de contaminação por fungos. Na concentração de
500µL/500mL os brotos apresentaram coloração marrom, indicativo da
ocorrência de fitotoxidez, considerados, assim, inaptos ao desenvolvimento
de plantas (dados não mostrados na tabela). Na tabela 1, são apresentados
os resultados obtidos com as concentrações de 100µL e 300µL/500mL por 5
minutos, demonstrando as variações na resposta aos tratamentos.
Tabela 1: Avaliação do comportamento de 6 materiais do BG de Mandioca
da UEM, submetidos à desinfecção com Tebuconazole, a diferentes
concentrações e tempo de exposição.
BG
Concentração de Tebuconazole
Mandioca
(Manihot
esculenta)
BG 119
BG 101
BG 203
BG 136
BG09
BG01
Totais
(100µL/500 mL)/ 5min
o
o
(300µL/500 mL)/ 5min
o
o
o
o
N Total
Brotos
N Brotos
contaminados
N Brotos
viáveis
N Total
Brotos
N Brotos
contaminados
N Brotos
viáveis
25
19
20
18
20
22
124
22
18
18
17
20
16
111
3
0
1
1
0
4
9
17
15
10
9
5
6
62
8
5
8
4
3
2
30
3
0
1
2
2
3
11
Como persistiu alta contaminação por fungos, usou-se como alternativa o
aumento do tempo de exposição dos brotos para 7 minutos, mantendo-se a
diluição de Tebuconazole a 25% em 300 µL/500 mL.
Tabela 2: Avaliação do comportamento de 6 materiais do Banco de
Germoplasma de Mandioca da UEM, ao tratamento com Tebuconazole, na
concentração de 300µL/500 mL/7min.
Desinfecção com Tebuconazole
BG Mandioca (Manihot
esculenta)
(300µL/500 mL)/ 7min
o
BG 119
BG 101
BG 203
BG 136
BG09
BG01
Totais
o
o
N Total Brotos
N Brotos contaminados
N Brotos viáveis
20
33
24
11
8
7
103
4
4
1
2
1
0
12
4
2
10
1
7
7
40
Os brotos viáveis obtidos após a desinfecção foram transferidos para meio
de cultivo MS, onde se desenvolveram por 30 dias. Após esse período, os
meristemas apicais dos brotos sadios foram extraídos e transferidos para
novo meio MS (subcultivo 0) por mais 30 dias. Uma vez estabelecidos os
meristemas no subcultivo 0, estes foram transferidos para um novo meio
MS, o subcultivo 1. Os dados apresentados na tabela 3 nos mostram que
para todos os BGs testados houve redução no número de meristemas
viáveis após as transferências para os diferentes meios de cultivo.
Tabela 3: Número de meristemas totais e viáveis (subcultivo 0 e 1) extraídos
de brotos de mandioca de 6 materiais do BG de Mandioca da UEM.
o
o
o
BG – Mandioca
(Manihot esculenta)
N Meristemas Totais
N Meristemas
Viáveis
( subcultivo 0)
N Meristemas Viáveis
(subcultivo 1)
BG 119
BG 101
BG 203
BG 136
BG09
BG01
Total
4
2
10
9
7
7
40
3
3
6
9
4
4
29
0
1
4
7
3
2
17
Conclusões
Mesmo utilizando diferentes concentrações do fungicida com variados
tempos de exposição, a contaminação dos explantes por fungos ainda
manteve-se alta, resultando em um baixo número de brotos viáveis. Novas
concentrações do fungicida a diferentes tempos de exposição dos brotos
estão em fase de testes, buscando-se o melhor protocolo para a
micropropagação das variedades de mandioca visando à limpeza
somaclonal de vírus.
Referências
Costa, A.S. & Kitajima, E. W. Studies on virus and mycoplasma diseases of
cassava plant in Brazil. In IDRC/IITA. CASSAVA MOSAIC WORKSHOP,
Ibadan, Nigeria. Proceedings. 1972, pp.18-36.
Fukuda, C. Doenças da mandioca. In: EMBRAPA. Centro Nacional de
Mandioca e Fruticultura (Cruz das Almas, BA), Instruções práticas para o
cultivo de mandioca. Cruz das Almas,1993, pp.53-56.
Murashige, T. & Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bioassays
with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 1962 15:473-497.