Vacinas - Página Virologia Animal

Vacinas
Clássicas e de Nova geração
O que é vacina DNA?
Vacinas tradicionais

Variolização - 1796
Mais de 200
anos
 Edward Jenner (1749 - 1823) “pai da
imunologia”


14 de maio de 1796: inoculou em uma criança
de 8 anos de idade material retirado de uma
vesícula de varíola. Em contato com o vírus da
varíola e não contraiu a doença. Variolização
Vírus vaccínia  Vacina
Histórico vacinas
Vacinas virais
Vacinas bacterianas
1878:
1885:
1935:
1955:
1962:
1964:
1970:
1981:
1897:
1923:
1926:
1927:
1927:
varíola
raiva
febre amarela
poliomielite injetável
poliomielite oral
sarampo
rubéola
hepatite B (DNAr)
peste bubônica
difteria
coqueluche
tuberculose –BCG
tétano
Tradicionais:
“vacinas de primeira geração”

Vivas vivas: vírus ou bactérias com
virulência atenuada

Mortas ou inativadas: patógenos mortos
por processos químicos
Vacinas vivas “primeira geração”

Processo empírico


Espécies avirulentas
Condições atípicas ao agente patogênico


Hospedeiro ou células não usuais
Variante

Isolada e caracterizada
Atenuação: não caracterizada geneticamente
 Problemas



Controle de qualidade em grande escala
Reversão
Avaliação de vacinas vivas clássicas
Caracterização
 Segurança
 Imunogenicidade
 Eficácia
 Dispersão vacinal
 Estabilidade genética

Avaliação de vacinas vivas clássicas
Vacinas clássicas licenciadas
 Grande impacto a saúde pública
 Vaccinia:




transmitido por contato (lesões),
Imuno comprometidos
Poliovírus atenuado:



Excretado em fezes,
Transmitido por contato,
Gestantes (fetos)
Atualmente: maiores restrições
Agencias regulatórias:
 Potencial de recombinação genética
 Potencial de persistência no meio ambiente
ou cadeia alimentar
 Transmissão a indivíduos imuno comprometidos

Vacinas vivas:







Alguns requisitos especiais
Dispersão da cepa vacinal
Virulência: atenuação
Reversão da virulência
Interferência
Propriedades biológicas da cepa vacinal
Potencial de recombinação
Livre de agentes estranhos a vacina
Vacinas vivas:

Dispersão: Segurança e Proteção




Dispersão da cepa vacinal
Dispersão do vírus vacinal entre os animais não
vacinados da mesma espécie ou animais de outras
espécies (não alvo).
Vírus vacinal secretado no leite, ovos, secreções
oral/nasal ou excretado em fezes ou urina, etc.
Ex:transmissão acidental: Cinomose e Parvovirose
Proteção: “reter virulência”


Exemplo: Vírus da doença de Newcastle
Aves pré-vacinadas, reforço com cepa menos
atenuada “booster”
Vacinas vivas: Atenuação

Vírus atenuado para uma espécie pode
reter virulência para outra espécie:
Vacina contra a cinomose: segura para
cães. Risco para minks, ferrets, panda.
 Raiva: Street Alabama Dufferin (SAD):
atenuada para várias espécies, patogênica
para gatos

Vacinas vivas: Reversão da virulência
Estabilidade genética
 População mista de vírus:



Variantes com potencial para reversão
Mutações
Cepa vacinal  cepa virulenta
 Vírus da hepatite de patos (DHV)

Uma ou algumas passagens em patos
 Contato com aves vacinadas

Vacinas vivas:

Interferência: vacinas multivalentes


Propriedades biológicas




Vacina: Bronquite Infecciosa Aviária (H120) e
doença de Newcastle
Retrovírus - integração no genoma
Herpesvírus - latência
Pestivírus – BVDV - superinfecção
Potencial de recombinação

Vírus com RNA segmentado


Co-infecção com dois sorotipos do vírus da língua azul
Contaminação com outros vírus
Vacinas vivas: vantagens
Custo/Benefício
 Capaz de infectar o hospedeiro
 Imita a infecção natural
 Reposta Imune mais efetiva:



Imune reposta: humoral e celular
Menor quantidade de vacinações
Algumas vacinas vivas de animais

Bovino:


Ovinos/ caprinos:


Doença de Aujeszky, Peste Suína Clássica
Aves:


Língua azul, Pox ovino ou caprino
Suínos:


Diarréia bovina a vírus, Rinotraqueíte infecciosa.
Bronquite infecciosa aviária, Doença infecciosa da bursa,
Newcastle, Marek, Pox aviário
Cães:

Cinomose, adenovírus, parvovírus, parainfluenza.
Vacinas de nova
geração
Vivas
Inativadas
Fundamentos

Avanços no conhecimento


Identificação e caracterização




imunologia e da biologia molecular
Grande número de agentes infecciosos
Proteínas de interesse imunológico
Seleção de proteínas negligenciáveis
Expressão gênica em diferentes vetores.


Amplificação
Carreadores
Fundamentos

Primeiramente: identificação e isolamento de
proteínas antigênicas


que induzem resposta imune similar ao agente íntegro.
Em segundo lugar: identificação das proteínas
negligenciáveis:
 não imunogênicas,
 não atuem na replicação,
 não relacionadas com a virulência.
 Proteínas que possam ser eliminadas.
Fundamentos

Aplicando a engenharia genética:

Genes que codificam as proteínas de interesse


Genes de outras proteínas podem ser eliminados


selecionados, clonados e expressos usando vetores
diferentes.
deleção seletiva.
Variação desse sistema : produção química de
proteínas.
Vacinas de nova geração
Subunidade Proteínas Sintéticas
Deleção
Recombinante
DNA
Vacinas vivas e inativadas

Inativadas


Vacinas de
subunidades:



Vírus da febre aftosa;
vírus da peste suína
clássica; Parvovírus
porcino (experimental)
Proteínas sintéticas:

vírus da febre aftosa
Vivas
Deletadas:

Vírus da doença de
Aujeszky, vírus da
rinotraqueíte infecciosa
bovina
 Recombinantes:


experimentais
Vacinas de DNA:

somente experimentais
Vacinas de nova geração: vivas
Tecnologia do DNA recombinante
 Conhecimento

mecanismos de patogenicidade
 baixa virulência


Risco de reversão


Quantificado e minimizado
Maior nível de segurança
Vacinas Deletadas
Herpesvírus de animais
Vacinas vivas deletadas

Deletadas: eliminação de genes

Vírus da rinotraqueíte infecciosa de bovino IBR


Herpesvirus bovino 1- BoHV1
Vírus da Doença de Aujeszky – VDA ou
Pseudoraiva de suínos - PRV

Herpesvirus suídeo 1 – SuHV1
Herpesvirus
Herpesvirus: codificam cerca 70 a 100 proteínas.
Pelo menos 8 glicoproteínas: B, C, D, E, G, H, I, K, L
Vacina deletada de IBR
Vacina Marcada: deleção do genes que
codificam glicoproteínas (g)
 gE-viva, gE-morta, gG-morta, gC-viva,
 Somente a vacina gE-negativa é
comercializada: “Difivac”
 Importante na campanha de erradicação
 Diferenciação de anticorpos

Diferenciação: Detecção anticorpos
específicos contra gE
Vírus vacinal
B
Vírus de campo
H
C
H
I
D
I
Anticorpos: B, C, D, G, H, I
Negativo: não infectado com IBR
B
E
C
D
Anticorpos: B,C,D,E,G,H, I
Positivo: infectado com IBR
Vacinas marcadas: gE-negativa
Veículo: cepa Za dissolvida em água destilada
 Aplicação: via intranasal ou intramuscular.
 Segurança:







Ensaios de atenuação
Eficácia
Dispersão
Reversão da virulência
Recombinação
Latência
Vacinas: PRV

Vacina viva atenuada convencional


Atenuação:


Cepa Bartha
Mutações induzidas por múltiplas passagens
células
Mutações pontuais


genes gC, gE e gI
genes envolvidos na montagem do capsídeo
Vacina PRV Marcada
Cepa 783
 Uma deleção na região “unique short” (US)



incluindo todo gene que codifica a glicoproteína E
Um pequena deleção na “unique long” (UL)

Inativa o gene da enzima timidina-quinase (TK)
Cepa PRV deficiente em virulência:
 Avirulência
 Distinção sorológica
 Incluiu PRV como vetor vacinal

Vacinas
recombinantes
Carreadas em vetores virais
“vetoriadas”
Vetores virais: vacinas e terapia gênica
Transformação de vírus em vetores
 Sem potencial patogênico
 Capacidade de incluir genes de outros
vírus ou organismos
 Vírus

Fácil de manipulação
 Eficiência na transferência
 Níveis de expressão reproduzível

Características dos vetores virais
Segurança
 Eficácia
 Natureza da resposta imune
 Desenho molecular
 Aplicabilidade

Vetores mais usados

Vírus:





Poxvírus
Adenovírus
Poliovírus
Retrovírus
Herpesvírus

Bactérias:


Salmonela
BCG
Vetores: Poxvírus
Vaccinia e Avipox (Canary pox e Fowlpox)
 Biologia bem definida e ampla faixa de
hospedeiros


Avipox: infecções abortivas em células de
mamíferos (1a. Fase do ciclo): ideal para
patógenos de mamíferos
Fácil de manipular
 Capaz de acomodar inserções de grandes
quantidade de DNA (>20kb) em seqüências
não-essenciais

Poxvirus como vetores
 Altamente atenuado (Imunogenicidade e
fenótipo)Vaccinia - cepa Copenhagen
 NYVAC:
Ampla
faixa de hospedeiros

DNA
completamente
seqüenciado
 ALVAC:
Canary
pox genes relevantes
 Alterações
genéticas:
precisamente
deletados
 expressando
glicoproteína
do vírus de raiva
 Conhecimento
das funções genéticas
 muito eficaz
 Kanapox da
(França)
 Controle
virulência
 DeleçãoFowlpox
do ORF impede a reversão viral
TROVAC:
Vacinas recombinantes
para aves

Tropismo
celular
 Newcastle
 Faixa de hospedeiro alvo
 Influenza

Ciclo replicativo de Poxvirus
Vaccínia Vetor vacinal:
preparação do vetor de recombinação
Promotor do
vaccínia
Gene heterólogo
Sítio de restrição
ATG
Vetor de
Inserção
TAA
Clivagem
Ligação
Ori C
Marcador
antibiótico
Vetor de
Recombinação
Ori C
Marcador
antibiótico
Vaccinia vetor vacinal:
vírus recombinante
Vírus Vaccínia
Vetor de
Recombinação
transfecção
Infecção
Ori C
Células
Marcador
antibiótico
Recombinação Homóloga nas
células infectadas
Vírus
recombinante
Vacinas DNA
Clonagem
Aplicação
Objetivo

Fornecer ao organismo hospedeiro a
informação genética necessária para
que ele fabrique o antígeno com todas
as suas características importantes para
geração de uma resposta imune.
Vacinas DNA
Inoculação direta do DNA
 Construída em Plasmídeos
 Contém o gene que codifica a proteína
antigênica
 O gene será processado e expresso no
interior da célula
 Utilizando a maquinaria celular

Clonagem do antígeno em plasmídeo
“É o isolamento e propagação de moléculas
idênticas de DNA em um organismo”.
 Clonagem do gene que codifica o antígeno


seqüência de DNA da proteína antigênica
duas etapas:
 1) ligação da molécula de DNA de interesse
no plasmídeo
 2) transformação de uma célula hospedeira
com o vetor de clonagem e replicação.

Plasmídeos
Vetores de clonagem: plasmídeos







Moléculas de dsDNA circulares e extracromossômicas.
Tamanho: 1 a 200kb
São capazes de replicação autônoma.
Codificam genes de resistência a
drogas/genes de transferência
Multiplicam-se em bactérias.
Limitação: tamanho máximo do inserto ~ 10kb
Seleção por antibióticos e/ou substratos cromógenos
Esquema geral de um plasmídeo
Clonagem
Vacinas DNA: plasmídeo






Origem de replicação
Gene de seleção
Sítio múltiplo de clonagem
Um promotor – geralmente um promotor viral
Após a clonagem: produção de plasmídios em
larga escala (transformação - E. coli)
Produção de DNA suficiente para a vacinação
Expressão em mamíferos
Composição dos Plasmídeos:
 Origem de replicação do plasmídeo: ColE1 (E.

coli).

Região promotora e acentuadora: forte

citomegalovírus humano (CMV)
Um íntron quimérico
 Um sinal de poliadenilação
 Sítios únicos de clonagem


Facilitar a expressão das seqüências clonadas.
Administração da vacina

Intramuscular mais utilizada


Mais barata e mais simples
Inconvenientes:


Requer maior quantidade de plasmídeo
Presença de nucleases: degradação do DNA
Intranasal ou oral
 Intradémica: bombardeamento de micropartículas de ouro

cobertas pelo material genético - Biobalística
Aplicação
Penetração

Fatores limitantes
Tamanho da molécula de DNA
 Carga superficial

Maiores doses para indução de resposta
 Liberação efetiva do DNA na célula alvo


Uma em cada 1000 moléculas de
plasmídeo atinge o núcleo.
Penetração do material genético

Células
Musculares: Miócitos
 Mononucleares: Macrófagos
 Células dendríticas:CAA

Células Dendríticas: APC
Endocitose do plasmídeo
 Plasmídeo: penetra no núcleo



Não deve ser incorporado ao genoma da célula.
Maquinaria celular
Transcrição do DNA inoculado
 Tradução do RNA mensageiro
 Síntese do antígeno protéico

Vacina DNA:
estímulo ao desenvolvimento
Não construídas vetores virais
 O hospedeiro pode produzir o antígeno para
induzir resposta imune.





Redução dos efeitos colaterais causados pela
inoculação do agente patogênico
Simula uma infecção natural
Ampla resposta imune
Produção e controle de qualidade


Mais fácil e mais barato,
São termoestáveis: fácil o transporte e aplicação.
Vacina DNA: Riscos potenciais
Integração
do
plasmídeo
genoma hospedeiro
 Em células somáticas pode levar a
 Mutagênese por inserção:

Ativação de protoncogenes
 Inativação genes supressores de tumor.

ao
Vacina DNA: Riscos potenciais

Expressão do gene inserido:

expressão for em níveis basais ou níveis
constitutivos de antígenos
Indução a Imuno-tolerância
 Indução a Auto-imunidade

Vacinas experimentais
Tuberculose
 Febre Aftosa
 Influenza aviária
 Vacina contra diversas doenças

Malária, D. Chagas, Fibrose cística,
 HIV, Herpes, etc.
 Cânceres
