Distribuição espacial da variabilidade genética - ppgcb

RAQUEL ESTOLANO SANTOS
Distribuição espacial da variabilidade genética
intrapopulacional de Tabebuia impetiginosa e Tabebuia
serratifolia em uma Floresta Estacional Semidecidual.
Montes Claros, Minas Gerais.
2011
Raquel Estolano Santos
Distribuição espacial da variabilidade genética
intrapopulacional de Tabebuia impetiginosa e Tabebuia
serratifolia em uma Floresta Estacional Semidecidual.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Ciências Biológicas da Universidade Estadual de
Montes Claros, para obtenção de título de Mestre em
Ciências Biológicas.
Área de concentração: Biologia e Conservação.
Orientador: Prof. Dr. Marcílio Fagundes
Co-orientador (a): Profª. Drª Rosane Garcia Collevatti
Montes Claros, Minas Gerais.
2011
Raquel Estolano Santos
Distribuição espacial da variabilidade genética intrapopulacional de
Tabebuia impetiginosa e Tabebuia serratifolia em uma Floresta
Estacional Semidecidual.
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas da Universidade Estadual de Montes Claros, como requisito necessário para a
conclusão do curso de Mestrado em Ciências Biológicas, avaliada e aprovada pela banca
examinadora:
Orientador:
_____________________________________________________
Dr. Marcílio Fagundes
Examinadores: ____________________________________________________
Dr. Rodrigo Oliveira Pessoa
____________________________________________________
Dr. Afrânio Farias De Melo Júnior
Data de aprovação: 14 /03 / 2011
Montes Claros, Minas Gerais.
DEDICATÓRIA
A Deus, a minha mãe Fátima, as minha tias Lucimar, Socorro, Neta, e a minha
irmã Ruth, pelo amor, apoio e dedicação.
AGRADECIMENTOS

A minha mãe Fátima pelo amor, apoio e também auxílio financeiro durante o
curso.

A minha querida e amada irmã Ruth que sempre me apoiou e incentivou em
todas as conquistas da minha vida.

As minhas tias Lucimar, Socorro e Neta, pelo apoio e incentivo nos meus
estudos, mesmo de longe.

A Flávia e seu marido Gustavo por me acolherem em sua casa nos primeiros
meses que cheguei a Montes Claros, e também pela força durante todo o meu
mestrado.

A Dona Iraci e seu Divino por terem me acolhido em sua casa durante o
período em que cursei as disciplinas em Montes Claros.

As minhas amigas Ana Paula, Silmara e Tânia pela força e motivação ao
longo do meu curso.

A minha co-orientadora Rosane Garcia Collevatti pelo apoio e incentivo
para cursar o meu mestrado, e também por depositar em mim confiança para
realizar um projeto.

Ao meu orientador Marcílio Fagundes pelo companheirismo e incentivo ao
longo do meu mestrado.

Ao meu namorado Eduardo pelo apoio, força e compreensão nos meses em
que fiquei fora.

As Su, Fran e Karita que me acolheram em Goiânia no período em que
precisei para terminar de desenvolver o projeto na UFG.

Ao pessoal do laboratório LGBio, em especial a Su, Fran, Jac, Monique que
me acolheram e me ensinaram as metodologias que precisei.

A Marina, minha companheira de projeto, pelas dicas, companheirismo e
auxílio no meu projeto.

A Paty pelo companheirismo e auxílio no meu projeto.

Ao programa de Pós-graduação da Universidade de Montes Claros e o
pessoal da secretaria do curso, pelo apoio e compreensão no tempo que
precisei ficar fora.

Aos professores do curso de mestrado da Unimontes: Henrique, Fred,
Mario, Geraldo, pelo apoio e força ao longo do meu mestrado.

A Michele amiga que fiz no curso de mestrado da Unimontes que me ajudou
ao longo do curso.

A Larissa e Michelinha amigas que fiz em Montes Claros e que me
auxiliaram e apoiaram ao longo do meu curso.

Aos colegas do curso de mestrado em Ciências Biológicas da Unimontes pelo
companheirismo ao longo do curso.
LISTA DE FIGURAS
Figura 01
Parque Ecológico Altamiro de Moura Pacheco (PEAMP) no mapa
delimitado pela linha preta .................................................................... 12
Figura 02
Indivíduo de Tabebuia impetiginosa (A); frutos e sementes (B);
madeira (C); flores e folhas em destaque (D) ...................................... 14
Figura 03
Indivíduo de Tabebuia serratifolia (A); frutos e sementes (B); madeira
(C); flores e folhas em destaque (D) ...................................................... 15
Figura 04
Relação da área de coleta demonstrando os 5 transectos contendo 8
parcelas cada um. ................................................................................... 16
Figura 05
Mapa da distribuição espacial dos indivíduos de Tabebuia amostradas
no Parque Estadual Altamiro de Moura Pacheco-GO........................... 17
Figura 06
Gel de poliacrilamida 6 % corado com nitrato de prata contendo
amostras de PCR do primer Tau 21 em 18 indivíduos de T.
impetiginosa. Ladder 10 pb ...............................................................
27
Figura 07
Distribuição das freqüências alélicas para os seis locos polimórficos
utilizados nos indivíduos de T. impetiginosa. O eixo das ordenadas
indica as freqüências alélicas e o eixo das abscissas indica os alelos
encontrados para cada loco................................................................... 29
Figura 08
Distribuição das freqüências alélicas para os seis locos polimórficos
utilizados nos indivíduos de T. serratifolia.O eixo das ordenadas
indica as freqüência alélicas e o eixo das abscissas indica os alelos
encontrados para cada loco.................................................................... 31
Figura 09
Distribuição dos pares de indivíduos da população de T. impetiginosa
e Tabebuia serratifolia........................................................................... 33
Figura 10
Relação entre o o parentesco ( Fij ± SE) e os pares de distância entre
todos os indivíduos da população de T.impetiginosa............................. 34
Figura 11
Relação entre o o parentesco ( Fij ± SE) e os pares de distância entre
todos os indivíduos da população de T.serratifolia ............................... 34
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 Descrição dos locos microssatélites desenvolvidos para Tabebuia
Aurea por Braga et al.(2007) .............................................................
18
Tabela 02 Sistema de coloração do gel de acrilamida, apresentados por Creste
et al., (2001) ..........................................................................................
21
Tabela 03 Classes de distância usadas nas análises da estrutura genética espacial
para as duas espécies de Tabebuia, determinada pelo programa
SPAGeDi 1.3 a partir da distância em metros entre pares de
indivíduos...............................................................................................
24
Tabela 04 Descrição dos seis locos microssatélites desenvolvidos para Tabebuia
aurea por Braga et al.(2007), transferidos para T. impetiginosa e T. 26
serratifolia..............................................................................................
Tabela 05 Caracterização dos seis locos microssatélites observados em
Tabebuia impetiginosa quanto ao número de alelos por loco (A),
número
de
indivíduos
analisados
para
cada
loco
(N);
heterozigosidade esperada sob equilíbrio de Hardy-Weinberg (Nei
1978) (He); heterozigosidade observada (Ho) e coeficiente de
endogamia (f).........................................................................................
28
Tabela 06 Desequilíbrio de ligação entre os pares de locos para T. impetiginosa.
O valor limite de significância após correção de Bonferroni é
0.003333................................................................................................. 28
Tabela 07 Caracterização dos seis locos microssatélites observados em
Tabebuia serratifolia quanto ao número de alelos por loco (A),
número de indivíduos analisados para cada loco(N); heterozigosidade
esperada sob equilíbrio de Hardy-Weinberg (Nei 1978) (He);
heterozigosidade observada (Ho) e coeficiente de endogamia
30
(f)............................................................................................................
Tabela 08 Desequilíbrio de ligação entre os pares de locos para T. serratifolia.
O valor limite de significância após correção de Bonferroni é
0.003333................................................................................................. 30
Tabela 09
Diversidade genética nas populações de T. impetiginosa e T.
serratifolia. N - Número de indivíduo analisados por loco; A- número
de alelos por loco (média); He – Heterozigosidade esperada sob
equilíbrio de Hardy-Weinberg (Nei 1978);Ho–
Heterozigosidade
observada; Fis - Coeficiente de endogamia; realizado com programa
FSTAT baseado em 10000 permutações com nível de significância
32
p< 0,05...................................................................................................
Tabela 10 Estrutura genética espacial (SGS) e vizinhança genética para as duas
espécies de Tabebuia. N- número de indivíduos amostrados; Ddensidade (indivíduo por ha); F1- intra-grupo Fij ; b- inclinação da
regressão para relação logarítmica do parentesco; Sp- parâmetro que
mede a força da estrutura genética espacial ; Nb- vizinhança
genética;R- índice de agregação............................................................
34
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
%
Porcentagem
°C
Grau Celsius
μg
Micrograma
μl
Micro litro
μM
MicroMolar
λ
dNTP
Desoxirribonucleotídeo
Trifosfato
SSR
Seqüências simples
repetidas
BSA
Albumina de soro
Bovina
Lambda
ng
Nanôgrama
M
Molar
mg
Miligrama
mM
MiliMolar
NaCl
Cloreto de sódio
PCR
Reação em cadeia
polimerase
Taq
Thermus aquaticus
EDTA
Ácido Etileno
pH
Potencial Hidrogeniônico
CTAB
Cetil Trimetil-amonio
brometo
DNA
Desoxirribonucléico
Ho
Tris-Cl
Tris HCl
pb
Pares de base
Heterozigosidade
observada
He
Heterozigosidade
esperada
A
Número de alelos por
loco
diamino
tetraacético
Ácido
Fis
coeficiente de endogamia
RESUMO
Distribuição espacial da variabilidade genética intrapopulacional de Tabebuia
impetiginosa e Tabebuia serratifolia em uma Floresta Estacional Semidecidual.
ESTOLANO-SANTOS, Raquel. Ms. Ciências Biológicas. Universidade Estadual de
Montes Claros. Fevereiro, 2011. Orientador: Dr. Marcílio Fagundes. Co-orientador (a):
Dr. (a). Rosane Garcia Collevatti.
No Cerrado, a família Bignoniaceae é amplamente representada pelos gêneros
Tabebuia, Tecoma e Jacaranda. Embora o gênero Tabebuia, conhecido popularmente
como ipê, possua ampla distribuição e alto valor econômico, as espécies mais estudadas
do gênero são as da floresta amazônica, sendo poucos ainda os estudos sobre genética
desse gênero nas Florestas Estacionais do Cerrado. Tabebuia impetiginosa e Tabebuia
serratifolia são espécies utilizadas de forma não sustentável e comercial em diversas
áreas, como nas indústrias farmacêuticas e principalmente, madeireiras. A fragmentação
e destruição de habitats têm levado a diminuição das populações e extinção
local das mesmas. A estrutura genética espacial está diretamente relacionada à história
de vida da planta, e pode ser afetada tanto por processos ecológicos quanto por
processos demográficos e genéticos. Este trabalho visa o estudo da estrutura genética
espacial de duas espécies de Tabebuia, com o objetivo de dar subsídio para sua
conservação e manejo. No Parque Estadual Altamiro de Moura Pacheco-PEAMP,
remanescente de Floresta Estacional Semidecidual, sul de Goiás, foram mapeados e
amostrados 31 indivíduos de T. impetiginosa e de 62 indivíduos de T. serratifolia.
Todos os indivíduos foram genotipados utilizando seis locos microssatélites. T.
impetiginosa apresentou uma média de 11,3 alelos por loco com variação de 6 (TAU
21) a 16 (TAU 28) alelos. Já T. serratifolia apresentou uma média de 4.3 alelos por loco
variando de 2 (TAU 21 e TAU 31) a 8 alelos (TAU 15). T. impetiginosa apresentou
maior diversidade genética (He = 0, 804) que T. serratifolia (He = 0, 473). O coeficiente
de endogamia (f) foi significativo para as duas espécies (p > 0, 00833) e todos os locos
estão em equilíbrio de ligação (p > 0, 003333). Ambas as espécies apresentaram
autocorrelação espacial significativa (b = -0, 0036, p < 0, 001). Entretanto, o parentesco
diminui fortemente e foram significativas somente até 20 metros para ambas as
espécies. Assim, a estrutura genética espacial é significativa, porém fraca (Sp = 0,036
para T. impetiginosa e 0,032 para T. serratifolia). A vizinhança genética, estimada pela
estrutura genética espacial, foi ligeiramente maior para T. serratifolia que para
(Nb=29,92) T. impetiginosa (Nb=27,35). Nossos resultados mostram que, apesar das
espécies estudadas serem dispersas pelo vento, esta dispersão está limitada a pequenas
distâncias originando uma população cada vez mais aparentada.
ABSTRACT
Spatial distribution of genetic variability for Tabebuia impetiginosa and Tabebuia
serratifolia in a Semideciduous Forest.
ESTOLANO-SANTOS, Raquel. Ms. Ciências Biológicas. Universidade Estadual de
Montes Claros. Fevereiro, 2011. Orientador: Dr. Marcílio Fagundes. Co-orientador (a):
Dr. Rosane Garcia Collevatti.
In the Cerrado, the Bignoniaceae family is widely represented by the genus Tabebuia,
Tecoma and Jacaranda. Although the genus Tabebuia, popularly known as Ipê, has
wide distribution and high economic value, the most studied species of the genus are
those of the Amazon rainforest, yet little research on the genetics of this genus in the
Cerrado Seasonal Forests. Tabebuia serratifolia and Tabebuia impetiginosa species are
used unsustainably and trade in several areas, as in the pharmaceutical and mainly
timber. The fragmentation and habitat destruction have caused the decline of
populations and local extinction of them. The spatial genetic structure is directly related
to the life history of the plant, and can be affected both by processes of ecological and
demographic processes and genetic factors. This work aims to study the spatial genetic
structure of two species of Tabebuia, aiming to give support to their conservation and
management. State Park Altamiro de Moura Pacheco-PEAMP reminiscent of
semideciduous forest, southern Goiás were mapped and sampled 31 individuals of T.
impetiginosa and 62 individuals of T. serratifolia. All individuals were genotyped using
six microsatellite loci. T. impetiginosa averaged 11.3 alleles per locus ranging from 6
(TAU 21), 16 (TAU 28) alleles. Since T. serratifolia showed an average of 4.3 alleles
per locus ranged from 2 (TAU TAU 21 and 31) to 8 alleles (TAU 15). T. impetiginosa
showed higher genetic diversity (He = 0, 804) that T. serratifolia (He = 0, 473). The
inbreeding coefficient (f) was significant for either species (p > 0.00833) and all loci are
in linkage equilibrium (p <0.003333). Both species showed significant spatial
autocorrelation (b = -0, 0036, p <0, 001). However, the relationship was significant
decreases strongly and only 20 meters for both species. Thus, the spatial genetic
structure is significant but weak (Sp = 0.036 and T. impetiginosa 0.032 for T.
serratifolia). The genetic neighborhood, estimated by the spatial genetic structure was
slightly larger than that for T. serratifolia (Nb = 29.92) T. impetiginosa (Nb = 27.35).
Our results show that, despite the species being dispersed by wind, this dispersal is
limited to short distances, producing a population increasingly relative.
SUMÁRIO
RESUMO............................................................................................................................. 1
ABSTRACT......................................................................................................................... 2
SUMÁRIO........................................................................................................................... 4
1. INTRODUÇÃO............................................................................................................... 5
1.1. Estrutura Genética Espacial (SGS) e suas implicações nas populações de plantas ..... 5
1.2. Efeitos da fenologia da floração na estrutura genética de plantas................................7
1.3. Uso de marcadores microssatélites em estudos genéticos.............................................. 8
1.4. Gênero Tabebuia .......................................................................................................... 11
2. MATERIAL E MÉTODOS ..........................................................................................12
2.1. Caracterização da Área de estudo ...............................................................................12
2.2. Espécies de estudo: T. impetiginosa e T. serratifolia................................................. 13
2.3. Experimento de campo ............................................................................................... 16
2.4. Extração e quantificação do DNA .............................................................................. 17
2.5. Transferibilidade dos primers de Tabebuia aurea para Tabebuia impetiginosa e
Tabebuia serratifolia. ........................................................................................................ 18
2.6. Genotipagem por meio de eletroforese em Gel de poliacrilamida 6% ..................... 20
3. ANÁLISES ESTATÍSTICAS........................................................................................23
3.1. Determinação da Diversidade Genética ..................................................................... 23
3.2. Determinação da Estrutura Genética Espacial e dispersão das sementes .................. 24
4. RESULTADOS...............................................................................................................26
4.1. Transferibilidade de primers SSR de Tabebuia aurea para Tabebuia impetiginosa e
Tabebuia serratifolia ......................................................................................................... 26
4.2. Caracterização dos locos microssatélites ................................................................... 27
4.2.1 Tabebuia impetiginosa.................................................................................... 27
4.2.2 Tabebuia serratifolia ...................................................................................... 30
4.3. Determinação da Diversidade Genética ..................................................................... 32
3
4.4. Estrutura genética espacial e Dispersão de sementes................................................. 32
5. DISCUSSÃO...................................................................................................................35
5.1. Sucesso na transferência dos Marcadores Microssatélites ......................................... 35
5.2. Diversidade Genética ................................................................................................. 35
5.3. Estrutura genética espacial e Dispersão de sementes ................................................. 37
6. CONCLUSÃO................................................................................................................42
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................................43
4
1. INTRODUÇÃO
1.1. Estrutura Genética Espacial (SGS) e Fluxo Gênico em Espécies Arbóreas
A caracterização da estrutura populacional na abordagem genética e evolutiva
procura quantificar a variabilidade morfológica e quantitativa existente entre os indivíduos,
como o comportamento reprodutivo, os padrões de fluxo gênico e as diferentes estratégias
adaptativas aos ambientes locais (Martins, 1987).
A estrutura genética espacial nada mais é do que a distribuição não aleatória dos
genótipos dentro de uma população (Vekemans e Hardy 2004). A estruturação genética
pode ocorrer dentro de grupos locais de plantas ou na progênie de indivíduos. A migração,
as mutações, a seleção natural e a deriva genética que operam no contexto histórico de
cada espécie de planta são as principais forças que determinam a estruturação espacial
(Loveless & Hamrick, 1984). Em uma escala ecológica, a limitação de pólen e sementes, o
isolamento de pequenas manchas, a mortalidade diferencial e a seleção por microhabitats
são os fatores determinantes da distribuição genética espacial de populações de plantas
(Epperson, 1993).
A estruturação espacial de genótipos ou isolamento por distância dentro de
populações e subseqüente endogamia biparental pode ocorrer mesmo que haja limites de
dispersão de sementes moderados (Epperson & Chung, 2001). Um exemplo é a ocorrência
de endogamia que não depende apenas das características genéticas do indivíduo, mas,
também, da configuração espacial dos seus aparentados. A estrutura genética espacial e a
taxa de cruzamento são, portanto, os principais fatores controlando o sistema de
reprodução, os níveis de endogamia e mesmo a dinâmica da variação genética dentro de
populações de plantas (Epperson & Chung, 2001).
O fluxo gênico entre as populações determina o grau de diferenciação genética entre
elas. O fluxo gênico em plantas é caracterizado pela movimentação dos grãos de pólen e
sementes entre e dentro de populações. Se o fluxo gênico se restringe provavelmente
ocorrerá variação na população em conseqüência da seleção natural local ou deriva
genética. Por outro lado, o fluxo gênico em longas distâncias promove a homogeneidade
genética entre populações da mesma espécie (Slatkin, 1985; Ellstrand, 1992).
5
Nas populações de plantas os genótipos são arranjados de forma aleatória e estão
estruturados no espaço e no tempo. A estrutura espacial é determinada pelo modo de
reprodução, dispersão de pólen e semente de cada espécie, que geralmente possuem
limitações físicas. Por outro lado, a estrutura genética temporal refere-se à divisão das
gerações. Assim os mecanismos de dispersão podem modelar a composição e a
estruturação genética das populações de plantas (Hamrick, 1982).
O fluxo gênico em plantas possui dois estágios: o haplóide representado pela
dispersão do pólen, e o diplóide que é a dispersão das sementes. A grande maioria das
espécies arbóreas é polinizada por animais, principalmente por insetos, morcegos e beijaflores. Os mecanismos de dispersão de cada espécie também influenciam na estruturação
genética das populações (Bawa et al., 1985).
A dispersão de sementes nos ambientes tropicais é realizada na sua grande maioria
por animais (zoocoria)(Ohsawa et al., 1993). Dispersores de sementes de uma espécie
precisam, portanto, ser suficientes e eficientes para a manutenção dessa espécie,
conseguindo dispersar o mais longe possível as sementes da árvore mãe. Caso isso não
ocorra as sementes serão dispersas na vizinhança das árvores mães, originando assim à
estrutura genética espacial, onde indivíduos próximos tendem a ser mais semelhantes
(geneticamente) entre si do que indivíduos espacialmente distantes (Wright, 1943).
Muitos estudos de simulação demonstram que, quando o fluxo de pólen e sementes
é restrito em uma população, a homozigose se desenvolve mais rapidamente devido a
endogamia e deriva gênica (Wright, 1943; Sokal & Wartenberg, 1983). Wright (1943)
descreveu o modelo de isolamento por distância, sugerindo que o fluxo gênico restrito
geograficamente dentro de uma população local gera a estruturação genética. Assim,
quanto maior for à distância do fluxo gênico, maior será o tamanho da vizinhança, menor
será a taxa de deriva genética e, portanto menor será a diferenciação genética entre a
vizinhança.
Modelos teóricos de isolamento por distância mostram que indivíduos
espacialmente próximos são mais correlacionados entre si do que os indivíduos mais
distantes, e que a estimativa da coancestria decline gradualmente entre pares de indivíduos
localizados espacialmente próximos para os de longas distâncias geográficas (Loiselle et
al., 1995). Esse declive corresponde a regressões lineares que podem ser utilizadas para
6
estimar a distância de dispersão utilizando a densidade populacional e a distância média ao
quadrado da movimentação dos genes.
1.2. Efeitos da fenologia da floração na estrutura genética de plantas
Variações no número de flores e no tempo de florescimento são freqüentemente
observadas entre plantas de uma mesma população (Pors & Werner, 1989; Dieringer,
1991; Washitani et al., 1991; Okayama et al., 2003). Estas variações podem afetar o fluxo
de pólen e a estruturação genética das populações. Por exemplo, a floração em massa de
plantas próximas aumenta a troca de pólen entre plantas vizinhas e, conseqüentemente, a
média de polinização a longa distância cai. Este fato está associado ao movimento
antecipado do polinizador entre plantas vizinhas, conseqüentemente o fluxo de pólen a
longa distância diminui, gerando um impacto sobre a estrutura espacial de populações de
plantas (Schmitt, 1983). Assim, efeito da fenologia floral (tempo de floração e número de
flores), na distância do fluxo de pólen pode ter conseqüências bastante significativas na
estrutura genética espacial (Schmitt, 1983; Loveless & Hamrick, 1984).
Estudos têm demonstrado que a densidade floral pode afetar fortemente a distância
do fluxo de pólen (Levin & Kerster, 1969). Padrões de dispersão de genes podem ser
sensivelmente diferentes em populações que apresentam distribuição contínua e alta
densidade em relação aquelas que formam colônias com maior ou menor grau de
isolamento (Martins, 1987).
Segundo Futuyma (1992), se existir limitações físicas entre os indivíduos de uma
população de forma a limitar o cruzamento entre todos os indivíduos (cruzamentos
aleatórios), haverá maior probabilidade de cruzamentos entre indivíduos próximos, o que
gera a redução de heterozigotos e formação de grupos, estruturando a população. Portanto,
o sistema de cruzamento é fundamental dentro da composição das populações, pois
determina a taxa de auto-fecundação, cruzamentos correlacionados, padrão de distribuição
de indivíduos parentes e fluxo gênico de uma determinada espécie (Hamrick, 1982).
Diversos estudos têm detectado estrutura genética espacial dentro de populações de
espécies arbóreas tropicais (Sebbenn et al., 1998; Chung et al., 1999; Chung & Epperson,
2000; Giudice-Neto & Kageyama, 2000; Dutech et al., 2002; Moreira et al.,2009). Por isso
7
se faz necessário o estudo de mais espécies para entender como estas populações estão
respondendo as diferenciadas condições e quais são suas adaptações para tal. Pouco se sabe
sobre a estrutura genética dos Ipês, grande parte dos estudos é voltada para testes de
germinação para utilização dessas espécies em reflorestamento e arborização (Stockman et
al., 2007; Sarzi et al., 2008). Uma das ferramentas utilizadas para quantificar estes fatores
é o uso dos marcadores moleculares no estudo da genética de populações, que possibilita
avaliar a diversidade genética dentro e entre populações.
1.3. Uso de Marcadores Microssatélites em Estudos Genéticos
Marcadores moleculares são, todo e qualquer fenótipo molecular proveniente de um
gene expresso, ou de um segmento específico de DNA, que podem corresponder a regiões
expressas ou não. Os marcadores moleculares demonstram as diferenças entre dois ou mais
indivíduos na seqüência de seus nucleotídeos ao longo da fita de DNA (Ferreira &
Grattapaglia, 1995). Os marcadores moleculares microssatélites são utilizados em
trabalhos de determinação de paternidade, estimativas de diversidade, fluxo gênico, taxa de
cruzamento, parentesco, na construção de mapas genéticos e também na quantificação dos
efeitos gerados pela fragmentação dos habitats que servem como subsídios para a
conservação das espécies (Collevatti et al., 2001a; 2001b; Gaiotto et al., 2003; Zucchi et
al., 2003; Lemes et al., 2007).
O uso de marcadores moleculares iniciou-se na década de 60 através da introdução
da técnica de eletroforese em isoenzimas. O número de marcadores moleculares então foi
ampliado, e a aplicabilidade dessa técnica passou a incluir potencialmente o estudo em
todas as espécies de plantas. Posteriormente, na década de 70, o desenvolvimento do
processo chamado de PCR (Polymerase chain reaction) que é a amplificação de DNA em
cadeia utilizando a enzima DNA polimerase, possibilitou a descrição de outras classes de
marcadores moleculares (Ferreira & Grattapaglia, 1995).
Através dos avanços da biologia molecular, hoje existem diversas técnicas que
permitem a detecção da variabilidade genética através do acesso direto de uma seqüência
de DNA destacando-se: RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), RAPD
(Random
Amplified
Polymorphic
DNA),
AFLP
(Amplified
Fragment
Length
8
Polymorphism), SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions); STS (Sequence
Tagged Sites) e microssatélites (Ferreira & Grattapaglia, 1995).
No final da década de 80, três grupos de cientistas isolaram e descreveram os
microssatélites ou SSRs (Simple Sequence Repeats) como marcadores que consistem de
seqüências curtas contendo de um a seis nucleotídeos repetidos em tandem (lado a lado),
cujo nível de polimorfismo produzido é devido à variação no número de unidades de
repetição em um determinado loco (Litt & Luty, 1989; Weber & May, 1989; Tautz, 1989).
Todos os organismos até hoje já analisados apresentaram microssatélites,
principalmente no interior de regiões não codificantes do genoma (Hancock, 1999). Os
microssatélites já foram observados em humanos (Litt & Luty, 1989), Drosophila (Diptera:
Drosoplhilidae) (Tautz, 1989), e plantas como, por exemplo, Eucalyptus grandis (Brondani
et al., 1998).
As unidades de repetição dos marcadores microssatélites são geralmente mono-, di, tri- ou tetranucleotídeos. De acordo com Oliveira et al.,(2006), os marcadores
microssatélites são classificados segundo o tipo de seqüência repetida que podem ser
perfeitos (a seqüência repetida não é interrompida por nenhuma base nitrogenada),
imperfeitos (apresentam outras seqüências além daquelas repetidas em tandem) e os
compostos (quando ocorre à repetição de mais um tipo de motivo).
Marcadores microssatélites são de natureza co-dominante, possuem alto
polimorfismo genético, riqueza de alelos por locos, alta heterozigosidade. Cada loco
microssatélite pode ser amplificado por PCR e analisados de uma só vez em sistemas semiautomatizados ou automatizados. Estas características são na sua grande maioria desejadas
em um marcador molecular (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
O alto nível de polimorfismo encontrado em seus locos (Weber &May, 1989;
Tautz, 1989) faz dos microssatélites um dos marcadores moleculares mais utilizados em
diversos tipos de estudos populacionais (Brown et al., 1996). Isto porque o seu
polimorfismo está associado à alta taxa de mutação encontrado nas regiões microssatélites,
que variam de 10-2 a 10-6 eventos por loco e por geração, comparado a regiões codificantes
do genoma, que apresentam taxas de mutação entre 10-9 a 10-10 (Goldstein & Schlotterer,
1999).
9
Essas mutações são causadas por alterações no número das unidades de repetição, e
a maioria delas resulta na modificação em seu número de cópias (Eisen, 1999). Dois
mecanismos podem explicar essas modificações: o primeiro é o crossing-over desigual
onde a presença das unidades repetidas em tandem aumenta a probabilidade da ocorrência
do alinhamento desigual entre as cromátides dos cromossomos homólogos durante a
recombinação, o que gera modificações no tamanho das seqüências dos microssatélites
(Harding et al., 1992). O segundo mecanismo é do slippage da DNA polimerase, e é o
mais aceito hoje em dia. Ele se dá através do avanço ou recuo da DNA polimerase durante
a replicação o que resulta no aumento ou diminuição das unidades repetitivas (Tachida &
Lizuka, 1992).
A vantagem de se usar os marcadores microssatélites se dá pelo fato de requerer
pouca quantidade de DNA e podem ser obtidos entre pesquisadores ou centro de pesquisa,
pois cada loco é definido por um par de seqüências de primers (Powell et al., 1996).
Podem ser utilizados em espécies taxonomicamente relacionadas devido sua a alta
homologia encontrada nas regiões flanqueadoras, pois são conservadas entre as espécies
(Moore et al., 1991).
A desvantagem do uso dos marcadores microssatélites está relacionado ao
desenvolvimento de primers específicos, que requerem muito trabalho e tempo, além do
custo ser bastante alto (Rafalski et al., 1996). Embora existam essas desvantagens muitos
pesquisadores vêm desenvolvendo marcadores microssatélites para várias espécies tanto de
plantas tais como, Manihot esculenta (Chavariaga et al., 1998), Populus tremuloides
(Dayanandan et al. 1998), Caryocar brasiliense (Collevatti et al., 1999), Fragaria vesca L
(James et al. 2003), Passiflora edulis f. flavicarpa (Oliveira et al. 2005) Anacardium
occidentale (Croxford et al. 2006), Tabebuia aurea (Braga et al. 2007), entre outros, como
também para animais, Myrmecophaga tridactyla (Garcia et al. 2005), Inia geoffrensis
(Gravena et al., 2007) entre outros.
10
1.4- Gênero Tabebuia
As espécies do gênero Tabebuia recebem vulgarmente o nome de Ipê. Os Ipês são
caracterizados por possuírem floração sazonal, que são classificadas em dois tipos:
cornucópia e “big bang”. A primeira é quando ocorre uma produção maciça de flores
durante 3 a 10 semanas e a segunda é quando ocorre uma floração explosiva durante
apenas alguns dias (Gentry, 1974). São espécies arbóreas utilizadas de forma não
sustentável devido seu valor econômico e comercial em diversas áreas, como nas indústrias
farmacêuticas, madeireira e no reflorestamento de áreas degradadas (Santos et al., 2005).
Embora o gênero Tabebuia possua ampla distribuição e alto valor econômico, as
espécies mais estudadas do gênero são típicas da floresta amazônica, especialmente
estudos voltados para distribuição, polinização e fenologia (eg. Gentry, 1974, 1990). Os
estudos envolvendo aspectos genéticos são poucos encontrados ainda na literatura, ainda
mais envolvendo marcadores microssatélites. Braga et al. (2007), desenvolveu 21 locis
microssatélites para o gênero Tabebuia que possibilitará estudos mais aprofundados sobre
a genética de populações dessas espécies. Estudos com espécies de Ipês em áreas de
cerrado ainda são raros.
Assim são necessários mais estudos sobre a diversidade genética, fluxo gênico,
sistemas de cruzamento e evolução das espécies que ocorrem no cerrado. Esses estudos
servem de referencial teórico para a implementação correta do manejo e conservação de
áreas florestais remanescentes (Seoane et al., 2000; Kageyama, 1987), o que auxilia no
acúmulo de dados que apontam quais direções devem ser tomadas para minimizar o
impacto ambiental provocado nestes ecossistemas que são cada vez mais perturbados
(Kageyama, 1987). Este trabalho teve como objetivo avaliar o padrão espacial da
variabilidade genética de T. serratifolia e T. impetiginosa, por meio do uso de marcadores
microssatélites utilizando técnicas de autocorrelação espacial.
11
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Caracterização da Área de estudo
O presente estudo foi realizado no Parque Ecológico Altamiro de Moura Pacheco
(PEAMP) (Figura 01), em uma área de floresta estacional semi-decídua próxima à Trilha
do Tamanduá (“16°31, 902‟-16°32‟11” S e 49°08, 366‟-49°08‟18” W), PEAMP, Goiás. O
PEAMP é uma unidade de conservação de proteção integral que está situado a 22 km de
Goiânia as margens da BR-060/156, integram áreas dos municípios de Goiânia,
Goianápolis, Teresópolis e Nerópolis. Abrange uma área de 4.123 há e possuiu uma
altitude que varia de 740 a 920 m (Semarh, 2009).
Figura 01 - Parque Ecológico Altamiro de Moura Pacheco (PEAMP) no mapa delimitado pela linha
preta.
Fonte: Sistema Estadual de Estatística e de Informações Geográficas de Goiás – SIEG –
www.sieg.go.gov.br
12
A vegetação predominante do PEAMP é a floresta estacional semidecidual, além da
existência de matas de galeria e pequenas manchas de cerrado sensu stricto e cerradão, com
características de zona de transição cerrado/floresta estacional, sendo a família
Bignoniaceae, família das espécies em estudo, a segunda mais representativa no PEAMP
(Haidar et al., 2005).
A vegetação do PEAMP apresenta grande variedade de espécies de alto valor
econômico como a aroeira, jatobá, cedro, jequitibá, além de outras espécies como ipês,
barriguda, guatambu, angico, que há algumas décadas atrás, recobriam a maior parte da
região central do Estado, estabelecendo ligação com a Floresta Atlântica através do Rio
Paranaíba (Semarh, 2009). Contudo, essa vegetação se encontra em diferentes condições de
perturbação, uma vez que antes da criação do Parque a área foi utilizada como fazenda,
havendo muitos pastos abandonados, clareiras para a extração de madeira e antigos roçados
intercalados com trechos mais preservados (SEMARH, 2009).
2.2 Espécies de estudo: T. impetiginosa e T. serratifolia
Tabebuia impetiginosa (Figura 02) é uma árvore decídua durante o inverno,
heliófita, característica das florestas semidecíduas e pluviais. Ocorre tanto em florestas
primárias densa, como em formações abertas e secundárias podendo atingir 12 metros de
altura (20 a 30 metros no interior de florestas) (Lorenzi, 2002). Apresenta flores em forma
de trombetas, sua a floração inicia-se nos meses de maio a agosto. Possui folhas compostas
e palmadas, com 5 folíolos que caem durante a floração. Produz frutos em forma de vagens
de 25 cm que se abre liberando as sementes aladas que são amplamente dispersas, porém
de forma descontínua em toda sua área de distribuição. Sua polinização é realizada por
abelhas, mais especificamente as espécies Partamona Cupira, Trigonoma spinipes
(Lorenzi, 1992).
13
B
A
C
D
Figura 02 - Indivíduo adulto de Tabebuia impetinosa (A); frutos e sementes (B); madeira
(C); flores e folhas em destaque (D).
Fonte: Árvores Brasileiras. (Lorenzi, 2002)
No Brasil ocorre do Piauí e Ceará até Minas Gerais, Goiás e São Paulo, tanto na
mata pluvial atlântica como na floresta semidecídua (Lorenzi, 2002). Em Minas Gerais
passa das matas para os pastos como árvores solitárias e ocasionalmente ocorre no cerrado
e na caatinga (Rizzini, 1978).
Tabebuia serratifolia (Figura 03) é encontrada em quase todo o território nacional
(Lorenzi, 1992). Segundo Carvalho (1994), ocorre na Bolívia, Colômbia, Equador, Guiana,
Guiana Francesa, Peru, Suriname, Trinidad & Tobago, Venezuela e no Brasil. No Brasil é
bastante freqüente na região Amazônica ocorrendo desde o Ceará até São Paulo na floresta
pluvial atlântica; na região sul da Bahia e no norte do Espírito Santo é um pouco mais
freqüente do que no resto da costa (Lorenzi, 2002).
14
B
A
C
D
Figura 03 - Indivíduo adulto de Tabebuia serratifolia (A); frutos e sementes (B); madeira
(C); flores e folhas em destaque (D).
Fonte: Árvores Brasileiras. (Lorenzi, 2002)
É uma árvore do tipo caducifólia, sua folhagem é renovada anualmente; as folhas
caem no inverno e aparecem logo após a floração que ocorre no período de julho a
outubro. É uma planta decídua, heliófita, característica da floresta pluvial densa, sendo
também largamente dispersa nas formações secundárias, como capoeiras e capoeirões;
porém, tanto na floresta como na capoeira, prefere solos bem drenados situados nas
encostas (Lorenzi, 1992).
Possui flores hermafroditas que são dispostas em inflorescências nas pontas dos
ramos. As folhas são opostas, digitadas e 5-folioladas. Os frutos são vagens coriáceas,
deiscentes que amadurecem no período de outubro a dezembro, produzindo grande
quantidade de sementes leves e aladas, que são dispersas rapidamente pelo vento
geralmente de forma uniforme e sempre muito esparso (Lorenzi, 1992).
As flores atraem abelhas e pássaros, principalmente beija-flores, sendo que os
principais polinizadores são as abelhas (Carvalho, 2003). Os eventos reprodutivos são
observados em árvores com oito anos de idade e 8-10m de altura, em áreas abertas, e em
árvores com 10-15m de altura, na floresta (Lorenzi, 1992).
15
2.3 Experimento de campo
A coleta foi realizada em uma área bastante íngreme, onde foram traçados cinco
transectos perpendiculares a trilha do Tamanduá. Cada transecto possuindo oito parcelas de
aproximadamente 20X20 m cada, o que equivalente a um total de 3.200 m² por transecto
(Figura 04).
Figura 04 - Relação da área de coleta demonstrando os 5 transectos contendo 8
parcelas cada um.
Todos os indivíduos de Tabebuia impetiginosa (25 adultos e 6 juvenis) e T.
serratifolia (26 adultos e 36 juvenis) encontrados dentro das parcelas foram coletados,
anotados e georreferenciados através de um aparelho de GPS (Sistema de Posicionamento
Global) (Figura 05).
16
Figura 05 – Mapa da distribuição espacial dos indivíduos de Tabebuia amostradas no
Parque Estadual Altamiro de Moura Pacheco-GO.
As folhas das árvores maiores foram coletadas com auxilio de podão e quando não
possível o alcance das mesmas foi retirado um pedaço do câmbio dos troncos. A retirada
do câmbio foi realizada por meio de um instrumento de metal cilíndrico com diâmetro de 1
cm. As folhas coletadas ou câmbio foram armazenados em saquinhos plásticos contendo a
identificação de cada árvore, e conservados em sílica gel até o armazenamento dos mesmos
no laboratório em freezer vertical à - 20º C.
Através das informações genéticas e geográficas (coordenadas geográficas) de cada
planta foi possível estimar o índice de agregação (R) intrapopulacional das duas espécies
de Tabebuia. Esse índice de agregação é estimado para diferentes classes de distância
geográfica, e permite a inferência do padrão de distribuição espacial das árvores em cada
população. Os valores de R indicam: <1, distribuição agregada; 1, distribuição aleatória; e
>1, associam-se à distribuição regular (Degen, 2000; Degen et al., 2001a; Hardesty et al.,
2005). Os valores do índice de agregação foram estimados pelo programa SPAGeDi 1.3
(Hardy & Vekemans, 2009).
2.4 Extração e quantificação do DNA
O DNA das folhas ou câmbio de T. serratifolia e T.impetiginosa foram extraídos de
acordo com o protocolo de extração de DNA adaptado de Doyle & Doyle (1987). As
17
amostras de DNA foram quantificadas em gel de agarose 1% (0,30 g de agarose e 30 ml de
TBE 1X) utilizando λ 20, 60 e 100 ng/ml como marcador. Posteriormente as amostras
foram diluídas para obtenção de DNA em concentração final de 3 ng/ml e volume final de
100 µl.
2.5 Transferibilidade dos primers de Tabebuia aurea para Tabebuia impetiginosa
e Tabebuia serratifolia
Para testar a transferibilidade dos primers desenvolvidos por Braga et al., (2007),
foram escolhidos ao acaso quatro indivíduos de T. impetiginosa e T.serratifolia. Estes
indivíduos foram submetidos à amplificação via PCR contendo 15 µl de volume final
utilizando 21 pares de primers microssatélites (Tabela 01). Para amplificação por meio de
PCR para cada reação foi utilizado, 1 unidade de Taq DNA polymerase (Phoneutria, MG)
0,9 µM e cada primer (forward e reverse), 1 X tampão (10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM
KCl, 1,5 mM MgCl²) 250 µM de dNTP, 0,25 mg de BSA e 9,0 ng de DNA.
Todos os primers foram inicialmente testados com temperatura de hibridação igual
à 56º C baseadas nas temperaturas utilizadas em T. aurea, para a qual os primers foram
desenvolvidos. Os primers que não amplificaram ou apresentaram alta freqüência de
bandas inespecíficas foram testados com temperaturas de hibridação variando de 50º C à
58º C até que se encontrasse a temperatura ideal para cada primer. Os produtos de PCR
primeiramente foram observados em gel de agarose 3% (0,90 g de agarose e 30 ml de TBE
1X), para detectar se houve amplificação ou não para as temperaturas testadas.
Tabela 01 - Descrição dos locos microssatélites desenvolvidos para Tabebuia aurea por
Braga et al.(2007).
Loco SSR
Repetição do motivo
Tau 07
(AG)25
Seqüência do primer
(5’-3’)
F: CCATAAGCTGCATCAACACA
R: ATCCTAAGATCGGTACTCCA
Tau 08
(TC)6(CC)
F: TCACAAACTAGAGCGACTGA
(TC)27
R: TGCCAATATGTTGACATTGA
18
Tau 09
(AG)25
F: TTCCATAAGCTGCATCAACA
R: ATCCTAAGATCGGTACTCCA
Tau 10
(AG)34
F: ATTCCAATTGACTAAGTCCA
R: CCTCACACGGATATGTCGCA
Tau12
(TC)8(TA) (TG)29
F: CATCATCAAGGTCAAGATCA
R: CATTCTAGTCTTCCATAAGT
Tau 13
(TC)22(ACTCCC)
F: CATCATCAAGGTCAAGATCA
R: CATTCTAGTCTTCCATAAGT
(TC)4(AC)11
Tau 14
(CT)3(TCC)
(CT)20
Tau15
(AG)32
Tau 16
(CT)33(CA)11
Tau17
(GA)7(GC) (GA)3(GC)5
F: GGTAACGGATTGCTGGTTGT
R: CATTGCGAATGGCCTATGGT
F: TTTGAGGGGTTGAAGCATTT
R: CATTGTGGTCCCTCTCAACA
F: GCTTGTAGCAACGTTAGGTTT
R:TGTGCATTGTGACTACCAGCTA
F: TGGCCGTGTTGATGTTTATG
R: TGCCTCACGCTCTATGTGTC
(GA)21(GGGAGG)
Tau 18
(GT)10(GA)35
Tau 19
(GA)33
F: TGAATCGGATTAATCGTGGA
R: GTGCATTGTGACTACCAGCTA
F: AGGGCAAGCTTTTCCAGTTT
R: TTCCTCACACGGATATGTCG
Tau 20
(GA)42
F:GTCTATGTTTGTGTGTGTCTCTCA
R: TTCATGGTGGGAAGTTAGGG
Tau21
(GA)
Tau 22
(CT)18(CCCTCTCGTCA)
F: CTTTTGGGGGTCTTTGGAAT
R:TGAAAGAGACAGAGACAAAGATACA
F: TATCTCTCCGCCGTACACCT
R: CCAATCGAAGAGCCCATTTA
(GT)3
Tau 23
(CT)28
F: GCATCTTTGCACCTCTCCTC
R:CAAGCACAACAAGTAAATAGATCAG
Tau 24
(GA)33
F: TGTAAACTACTCCTCCAAGCATC
R: GTGTGATTAGGTGAGTTTTCTAAGG
Tau 27
(CT)24(CA)8(CC)(CA)7
F: GGTAAATCATCTTCCGCTTCC
R: ACTGCAGAATCGCCTTTTGT
Tau28
(CT)33
F: TCAGCCACTACACAACCAAAG
R: GGGAAGCAATGGAGTCAAAA
Tau 30
(TC)23
F: TAGTTTAAGGGTGCCGTTGG
R: CGAACATAAAGAGGCAACCA
Tau31
(CT)28(CA)10
(CTT) (GT)5
F: TCGTGCAGCTTTTGAGTCTG
R: CTGCAAAACACAAAGCGAAA
19
As amplificações foram realizadas em termociclador Applied Biosystem 9600
thermal controller (Apllied Biosystem, Foster City, CA) sobre as seguintes condições:
95º C 5‟ (1 ciclo)
94ºC 1‟
50º à 52ºC 1‟
(temperatura de hibridação de cada par de primer)
Desnaturação
}
35 ciclos
72º C 1‟
72º 10‟
Extensão final
2.6 Genotipagem por meio de eletroforese em Gel de poliacrilamida 6%
Para a confirmação da amplificação dos locos, os produtos de PCR foram
analisados em géis desnaturantes de poliacrilamida 6% corados com prata (Bassam et al.,
1991) e o tamanho dos fragmentos foram determinados por comparação com um DNA de
tamanho conhecido 10 pb DNA ladder standard (Invitrogen, MD).
Após a confirmação das temperaturas de cada primer, foram genotipados todos os
indivíduos da população das duas espécies utilizando gel de poliacrilamida 6 % corado em
prata. O gel de poliacrilamida desnaturante 6% (1000 ml) continha: 14,4 g de uréia, 10,0
mL solução de acrilamida/bis-acrilamida (29:1), 3,0 mL de TBE (10X 108,0 g de Tris;
53,0 g de ácido bórico; 40,0 mL de solução de EDTA pH 8,0; completar o volume para 1
litro de H2O), 22,5 μL de TEMED, 450 μL de solução de persulfato de potássio e água
destilada).
Os géis desnaturantes polimerizados foram montados em cuba de eletroforese
vertical, modelo Sequi-Gen da marca BioRad, contendo tampão TBE (1X – 100 ml
Tampão TBE (10X); 900 ml H2O) em ambos os pólos (porção superior e inferior). Esta
cuba foi conectada a uma fonte de eletroforese Amershan Pharmacia Biotech (EPS 1001),
20
ajustada à corrente elétrica de 90 Watts, por um tempo médio de três horas e meia,
necessária para uma boa separação dos fragmentos amplificados.
Antes da aplicação das amostras (produtos de PCR) para a separação eletroforética,
estas foram submetidas às condições de desnaturação em um tratamento prévio com
formamida: foram colocados 6 μL de tampão de amostra (900 μL de bromofenol, 900 μL
xilenocianol, 900 μL TBE (10X), 4,5 ml de Ficol 30 % diluído em água destilada, 1,8 mL
de EDTA 0,5 M pH 8,0, 3,6 g de sacarose); na proporção de 3:1 (com formamida) em tubo
eppendorf, junto com 5 μL do produto amplificado. Estes tubos foram aquecidos a 94 º C
por 5 minutos e subseqüentemente colocados em banho de gelo (tratamento desnaturante),
seguindo-se à aplicação no gel.
Para a visualização dos alelos (produtos da amplificação), os géis foram submetidos
ao passos descritos no sistema de coloração apresentados por Creste et al., (2001) (Tabela
02).
Tabela 02 – Sistema de coloração do gel de acrilamida, apresentados por Creste et al.
(2001).
Procedimento
Solução
Tempo Nº reutilização
1. Fixação
Etanol 10%, ácido acético 1%
10‟
3
2. Lavagem
Água destilada deionizada
1‟
-
3. Pré-tratamento
Ácido Nítrico 1,5%
3‟
4
4. Lavagem
Água destilada deionizada
1‟
-
5. Impregnação
0,2% Ag NO3
20‟
3
6. Lavagem
Água destilada deionizada
30‟‟
-
7. Lavagem
Água destilada deionizada
30‟‟
-
8. Revelação1, 2
15g/500 mL Na2CO3, 0,27 mL formaldeído¹
4-7‟
-
9. Bloqueio
Ácido acético
5‟
5
10. Lavagem
Água destilada deionizada
1‟
-
¹-Acrescentar na solução de revelação na hora de utilizar.
²-Durante a revelação colocar aproximadamente metade da solução (resfriada a 12°C) e
manter sob lenta agitação até a solução ficar escura e adicionar então o restante da solução.
21
Após a revelação e secagem das placas, os géis foram digitalizados para o
arquivamento das informações para futuras consultas. Após a digitalização, estas foram
colocadas sobre a luz branca para a análise do produto amplificado e genotipagem de todos
os indivíduos, utilizando-se como padrão de peso molecular o marcador 10bp (Invitrogen
TM
), que apresenta uma faixa de fragmentos de tamanhos que varia entre 10pb e 330pb, em
intervalos de 10 pb.
22
3. ANÁLISES ESTATÍSTICAS
3.1 Caracterização da diversidade genética
Os locos foram caracterizados quanto à heterozigosidade observada e esperada e
testados quanto à aderência ao Equilíbrio de Hardy e Weinberg (NEI, 1978) e equilíbrio de
ligação, utilizando o programa FSTATS 2.9.3.2 (GOUDET, 2002), de acordo com os
seguintes parâmetros: (He) heterozigosidade média esperada em equilíbrio de HardyWeinberg, (Ho) heterozigosidade observada, (A) Número médio de alelo por loco e (Fis)
coeficiente de endogamia de cada loco.
O desequilíbrio de ligação, que representa a associação não aleatória entre alelos de
diferentes locos em uma população, também foi estimado. Dessa forma, o teste de
desequilíbrio de ligação foi realizado entre todos pares de locos para todos os indivíduos
(adultos e juvenis) com base em uma estatística G de razões de logaritmos de máximaverossimilhança. A significância estatística foi calculada com base em 1000 permutações,
usando uma correção seqüencial de Bonferroni (95%, α=0,05) através do programa FSTAT
2.9.3.2 (Goudet, 2002).
Para verificar a diversidade genética das populações de T.impetiginosa e T.
serratifolia, foram estimados os seguintes parâmetros com o auxílio do programa FSTATS
2.9.3.2 (Goudet, 2002): heterozigosidade média esperada em equilíbrio de HardyWeinberg (He), heterozigosidade observada (Ho). Assim como o índice de fixação Fis
(coeficiente de endocruzamento intra-populacional a nível populacional), que mede a
redução de heterozigosidade de um indivíduo com relação a sua sub-população. Esses
testes foram baseados em 10000 randomizações, com o nível de significância de p ≤ 0,05
corrigidas pelo teste de Bonferroni (Goudet et al., 1996), para testar a se os valores de Ho,
He e Fis são iguais para as duas espécies.
23
3.2 Determinação da Estrutura Genética Espacial e dispersão das sementes
O coeficiente de parentesco, também chamado de coeficiente de coancestria é
baseado na probabilidade de se identificar alelos de dois genes homólogos em uma
amostragem. Um método utilizado para o estudo da estrutura genética espacial é a
estimativa do coeficiente de coancestria por classe de distância (Loiselle et al., 1995), que
faz inferência à identidade por descendência dos alelos.
O parentesco (coancestria) foi estimado utilizando o estimador de Nason FIJ, que
calcula o FIJ entre todos os pares de indivíduos (Loiselle et al., 1995).
Para testar a hipótese de que T. serratifolia e T. impetiginosa apresentam
estruturação genética espacial foi realizada uma análise de autocorrelação espacial. Este
método verifica a estrutura de parentesco (FIJ) com a dispersão de sementes, onde são
calculados os valores médios do coeficiente de parentesco para cada intervalo de distância
(Tabela 03), e realizado uma regressão linear dos valores com a distância geográfica, ou
seu logaritmo. Todos os cálculos individuais são feitos para cada loco e uma média
ponderada multiloco é calculada (Wright 1943; Rousset, 1997). Utilizou-se um intervalo
de confiança de 95% de probabilidade do coeficiente médio de coancestria para cada classe
de distância com base no erro padrão (EP) da média das estimativas, obtido por
reamostragem jackknifed entre locos. O coeficiente de coancestria e o erro padrão foram
estimadas usando o programa SPAGeDi 1.3 (Hardy & Vekemans, 2009). Testes de 10.000
permutações foram realizados para verificar a significância do parentesco de cada classe de
distância e da regressão.
Tabela 03 - Classes de distância usadas nas análises da estrutura genética espacial para as duas espécies de
Tabebuia, determinada pelo programa SPAGeDi 1.3 a partir da distância em metros entre pares de indivíduos.
Classes de Distância (m)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
Espécies
T.impetiginosa
20
40
60
80
90
100
120
150
160
170
200
240
280
300
400
550
T. serratifolia
1
5
10
15
20
25
35
45
65
100
190
195
200
215
225
310
24
550
A intensidade da estrutura genética espacial também foi mensurada através da
estatística Sp de acordo com Vekemans & Hardy ( 2004) através da seguinte equação:
onde, F1 é o coeficiente de parentesco entre os indivíduos da primeira classe de
distância (o FIJ intra-grupo), e
é a inclinação da regressão baseado no logaritmo da
distância espacial.
As estimativas indiretas de dispersão das sementes foram calculadas com base na
vizinhança genética (Nb), através da seguinte fórmula:
Onde,
distância e
é o coeficiente de parentesco médio entre indivíduos da primeira classe de
é a inclinação da regressão baseado no logaritmo da distância espacial
(Hardy & Vekemans, 2002).
25
4. RESULTADOS
4.1 Transferibilidade de primers SSR de Tabebuia aurea para Tabebuia
impetiginosa e Tabebuia serratifolia
Os testes de transferibilidade dos primers desenvolvidos para T. aurea para T.
impetiginosa e T. serratifolia foram bem sucedidos. Assim, dentre os 21 pares de primers
testados, seis foram selecionados para genotipagem de todos os indivíduos de T.
impetiginosa e T. serratifolia por apresentarem produtos de PCR com amplificações sem
bandas inespecíficas. Todos os seis primers apresentaram número de pares de base
(amplitude dos alelos) dentro dos intervalos observados em T. aurea. As temperaturas de
hibridação dos primers das duas espécies T.impetiginosa e T. serratifolia variaram entre
50º e 52º C (Tabela 04).
Tabela 04 - Descrição dos seis locos microssatélites desenvolvidos para Tabebuia aurea
por Braga et al.,(2007), transferidos para T. impetiginosa e T. serratifolia.
Loco SSR Repetição do motivo
Tamanho do Fragmento
Ta (º C)
e amplitude dos alelos (pb)
Tau12
Tau15
Tau17
Tau21
Tau28
Tau31
(TC)8(TA) (TG)29
(AG)32
(GA)7(GC) (GA)3(GC)5
(GA)21(GGGAGG)
(GA)26
(CT)33
(CT)28(CA)10
(CTT) (GT)5
180 (146-212) *
132-184
132-146
151(104-166) *
125-161
125-141
222 (148-240) *
104-228
124-228
238 (198-290) *
184-228
184-186
186 (140-190) *
134-180
154-176
265 (210-270)*
233-270
232-250
52º
50º
50º
52º
52º
52º
*- Intervalo entre o tamanho mínimo e máximo do alelo em pares de bases (pb) observado para T.
aurea, T. impetiginosa (em negrito) e T. serratifolia (em itálico); Ta - temperatura de hibridação
dos primers em T. impetiginosa e T. serratifolia.
26
Todos os primers testados foram polimórficos para as duas espécies, apresentando
assim mais de um alelo por loco (Figura 06).
Figura 06 - Gel de poliacrilamida 6 % corado com nitrato de prata contendo amostras de
PCR do primer Tau 21 em 18 indivíduos de T. impetiginosa. Ladder 10 pb.
4.2 Caracterização dos locos microssatélites
4.2.1 Tabebuia impetiginosa
O número de alelos por loco para T. impetiginosa variou de 6 (TAU 21) a 16 (TAU
28) apresentando uma média de 11,3 alelos por loco (Tabela 05). A distribuição das
freqüências alélicas variou bastante entre os locos, porém a maioria dos alelos apresentou
uma freqüência menor que 0,3. Os locos que apresentaram alelos com freqüência maior
que 0,3 foram TAU 17 e TAU 21, sendo que TAU 21 apresentou o alelo de maior
freqüência (0,68) (Figura 07).
A heterozigosidade média observada foi igual a 0, 466, no qual o loco TAU 21
apresentou a maior heterozigosidade observada (0.76) e o TAU 15 a menor (0.29). A
heterozigosidade média esperada foi igual a 0.804 (Tabela 05).
O loco TAU 12 apresentou a maior heterozigosidade esperada equivalente a 0, 918
e o loco TAU 21 a menor com 0, 532. A heterozigosidade observada foi menor que a
esperada para todos os locos, com exceção do loco TAU 21, resultando em valores
positivos e significativos de f (Tabela 05). Todos os locos estão em equilíbrio de ligação (p
> 0, 003333) (Tabela 06).
27
Tabela 05 - Caracterização dos seis locos microssatélites observados em Tabebuia
impetiginosa quanto ao número de alelos por loco (A), número de indivíduos analisados
para cada loco(N); heterozigosidade esperada sob equilíbrio de Hardy-Weinberg (Nei
1978) (He); heterozigosidade observada (Ho) e coeficiente de endogamia (f) (significativo
para todos os locos seguidos de p > 0.00833).
Locos
Tau12
Tau15
Tau17
Tau21
Tau28
Tau31
Média
N
28
27
30
30
26
26
A
12
12
11
6
16
11
11.3
Ho
0.46
0.29
0.3
0.76
0.57
0.42
0.466
He
0.918
0.840
0.782
0.532
0.915
0.842
0.804
f
0.416
0.163
0.105
0.561
0.538
0.315
0.343
Tabela 06 – Desequilíbrio de ligação entre os pares de locos para T. impetiginosa. O valor
limite de significância após correção de Bonferroni é 0.003333.
Pares de Locos
Tau12 X Tau15
Tau12 X Tau17
Tau12 X Tau21
Tau12 X Tau28
Tau12 X Tau31
Tau15 X Tau17
Tau15 X Tau21
Tau15 X Tau28
Tau15 X Tau31
Tau17 X Tau21
Tau17 X Tau28
Tau17 X Tau31
Tau21 X Tau28
Tau21 X Tau31
Tau28 X Tau31
Valores de p
0.00333
0.00667
0.29000
0.00333
0.35333
0.00333
0.14333
0.00333
0.01000
0.56333
0.00333
0.02667
0.02333
0.78667
0.00333
28
Figura 07 - Distribuição das freqüências alélicas para os seis locos polimórficos utilizados
nos indivíduos de T. impetiginosa. O eixo das ordenadas indica as freqüências alélicas e o
eixo das abscissas indica os alelos encontrados para cada loco.
29
4.2.2 Tabebuia serratifolia
O número de alelos por loco para T. serratifolia variou de 2 (TAU 21) a 9 (TAU
15) com média de 5,5 alelos por loco (Tabela 07). A distribuição das freqüências alélicas
variou bastante entre os locos, porém a maioria dos alelos apresentou uma freqüência
menor que 0,3. Os locos que apresentaram alelos de maior freqüência foram TAU 15 e
TAU 21, onde TAU 21 foi o que apresentou o alelo de maior freqüência (0,9) (Figura 08).
A heterozigosidade média observada foi igual a 0, 286, no qual o loco TAU 15
apresentou a maior heterozigosidade observada (0.631) e o TAU 21 a menor (0.016). A
heterozigosidade média esperada foi igual a 0.473. O loco TAU 12 apresentou a maior
heterozigosidade esperada equivalente a 0.682 e o loco TAU 21 a menor com 0.143. A
heterozigosidade observada foi menor que a esperada para todos os locos, com exceção do
loco TAU 15, resultando em valores positivos e significativos de f (Tabela 07). Todos os
locos estão em equilíbrio de ligação (p > 0, 003333) (Tabela 08).
Tabela 07 - Caracterização dos seis locos microssatélites observados em Tabebuia
serratifolia quanto ao número de alelos por loco (A), número de indivíduos analisados para
cada loco(N); heterozigosidade esperada sob equilíbrio de Hardy-Weinberg (Nei 1978)
(He); heterozigosidade observada (Ho) e coeficiente de endogamia (f) (significativo para
todos os locos seguidos de p > 0.00833).
Locos
Tau12
Tau15
Tau17
Tau21
Tau28
Tau31
Média
N
45
57
62
59
45
44
A
6
9
7
2
6
3
5.5
Ho
0.333
0.631
0.338
0.016
0.330
0.068
0.286
He
0.682
0.448
0.489
0.143
0.659
0.420
0.473
f
0.772
0.570
0.406
0.882
0.089
- 0.238
0.375
Tabela 08 – Desequilíbrio de ligação entre os pares de locos para T. serratifolia. O valor
limite de significância após correção de Bonferroni é 0.003333.
Pares de Locos
Tau12 X Tau15
Tau12 X Tau17
Tau12 X Tau21
Tau12 X Tau28
Tau12 X Tau31
Tau15 X Tau17
Valores de p
0.00333
0.00667
NA
0.07000
0.00333
0.00333
30
Tau15 X Tau21
Tau15 X Tau28
Tau15 X Tau31
Tau17 X Tau21
Tau17 X Tau28
Tau17 X Tau31
Tau21 X Tau28
Tau21 X Tau31
Tau28 X Tau31
0.00333
0.34000
0.01333
0.00667
0.04667
0.00333
0.00333
0.00333
0.57667
Figura 08 - Distribuição das freqüências alélicas para os seis locos polimórficos utilizados
nos indivíduos de T. serratifolia. O eixo das ordenadas indica as freqüências alélicas e o
eixo das abscissas indica os alelos encontrados para cada loco.
31
4.3 Caracterização da Diversidade genética
O teste de permutação para comparação das duas espécies revelou que os valores de
heterozigosidade observada (p = 0,00020) diferiram dos valores de heterozigosidade
esperada (p = 0,00160) resultando em um coeficiente de endogamia Fis (p =0,81120) igual
estatisticamente entre as duas espécies.
O número médio de alelos por loco foi menor em T.serratifolia (5,5) do que em T.
impetiginosa (11,3). A heterozigosidade média observada nas duas espécies foi menor que
a esperada, gerando valores de Fis positivos e significativos para a população das duas
espécies (Tabela 09).
Tabela 09- Diversidade genética nas populações de Tabebuia impetiginosa e T.
serratifolia. N - Número de indivíduo analisados por loco; A - número de alelos por loco
(média); He – Heterozigosidade esperada sob equilíbrio de Hardy-Weinberg (Nei 1978);
Ho - Heterozigosidade observada; Fis - Coeficiente de endogamia; realizado com
programa FSTAT baseado em 10000 permutações com nível de significância p< 0,05.
População
N
A
Ho
He
Fis
T.impetiginosa
27,8
11,3
0, 529
0, 642
0, 176
T.serratifolia
52
5,5
0, 296
0, 344
0, 139
4.4 Estrutura genética espacial e Dispersão de sementes
A distribuição espacial dos indivíduos nas duas espécies diferiu bastante. Em T.
impetiginosa a distância entre as árvores variou de 20 a 550 metros, apresentando uma
média de 29 m, onde a maioria dos indivíduos (70 %) apresentou uma distância de até 325
metros (Figura 09 A). Já T. serratifolia apresentou uma distância média entre as árvores de
114 m variando de 1 a 550 metros de distância. A maioria dos indivíduos (70 %)
apresentou uma distância de até 136,2 metros (Figura 09 B).
32
A
B
Figura 09 - Distribuição dos pares de indivíduos da população de T. impetiginosa e
Tabebuia serratifolia.
Os valores do índice de agregação calculados com o auxílio do programa SPAGeDi
1.3 (Hardy & Vekemans, 2009), foram respectivamente de 0.0603 e 0.0178para T.
impetiginosa e T. serratifolia (Tabela 10). Todos os valores são menores do que 1, o que
indica que as espécies exibem um padrão espacial dos indivíduos de forma agregada.
A análise de autocorrelação espacial foi significativa para ambas as espécies
demonstrando que o parentesco é relacionado com o logaritmo da distância (R2 = 0.06030,
b = - 0,036 P < 0, 001). Em T. impetiginosa o parentesco diminuiu fortemente após a
primeira classe de distância, e foi significativo até 20 metros (Figura 10). Assim a estrutura
genética espacial é significativa, porém fraca com baixo nível de Sp = 0,036. A vizinhança
genética, estimada a partir da estrutura genética espacial, foi de Nb=27,35 m (Tabela 10).
Em T. serratifolia o parentesco diminuiu fortemente após a quinta classe de
distância, e foi significativo até 20 metros (Figura 11). Assim a estrutura genética espacial
é significativa, porém fraca com baixo nível de Sp = 0,033. A vizinhança genética,
estimada a partir da estrutura genética espacial, foi de Nb=29,92 m (Tabela 10).
33
Tabela 10 – Estrutura genética espacial (SGS) e vizinhança genética para as duas espécies
de Tabebuia. N- número de indivíduos amostrados; D- densidade (indivíduo por ha); F1intra-grupo Fij; b- inclinação da regressão para relação logarítmica do parentesco; Spparâmetro que mede a força da estrutura genética espacial ; Nb- vizinhança genética; Ríndice de agregação.
Espécie
N D (Ind/ha)
F1
b
Sp
Nb
R
T. impetiginosa
31
0,71
0,13 ±-0,087
- 0,036
0,036
27,35
0.0603
T. serratifolia
62
3,57
0,338 ±-0,099
-0,032
0,033
29,92
0.0178
Figura 10 - Relação entre o o parentesco ( Fij ± SE) e os pares de distância entre todos os
indivíduos da população de T.impetiginosa.
Figura 11 - Relação entre o o parentesco ( Fij ± SE) e os pares de distância entre todos os
indivíduos da população de T.serratifolia.
34
5. DISCUSSÃO
5.1 Sucesso na transferência dos Marcadores Microssatélites
De modo geral, o sucesso na transferibilidade (amplificação heteróloga) de
seqüências de DNA via PCR está relacionada inversamente com a distância evolutiva entre
duas espécies (Zucchi et al., 2003). Assim a porcentagem de locos transferidos para as
duas espécies deste estudo se deu principalmente pelo fato de se tratar de uma amplificação
entre espécies do mesmo gênero, bastante aparentadas evolutivamente. Visto que o
desenvolvimento de marcadores microssatélites possui um alto custo e é bastante
demorado, a transferibilidade dos locos microssatélites entre espécies do mesmo gênero ou
até mesmo entre famílias foi fundamental no presente estudo.
O uso desses iniciadores heterólogos vem crescendo cada vez mais em estudos com
espécies arbóreas tropicais (Ciampi et al., 2000; Zucchi et al., 2003; Feres et al.,2009).
Diversos trabalhos já demonstraram o sucesso da transferibilidade de primers
microssatélites em plantas entre espécies do mesmo gênero como por exemplo: Tabebuia
roseo-alba (Feres et al.,2009), Tabebuia aurea (Braga et. al, 2006) .
5.2 Diversidade Genética
O número médio de alelos por loco encontrado em Tabebuia impetiginosa (11,3)
foi próximo ao encontrado em outros estudos realizados com Bignoniaceas tais como:
Jacaranda copaia (13,3) (Jones et al., 2005), T. aurea (18,8) (Braga et. al, 2006),
Tabebuia roseo-alba (14,9) (Feres et al.,2009). Em Tabebuia serratifolia este número foi
menor (5,5), porém também próximo a valores já descritos na literatura. Em estudos
realizados com isoenzimas em Tabebuia cassinoides o número médio de alelos por loco foi
de 2,6 (Cavallari-Neto, 2004), sendo este bem menor do que o encontrado no presente
estudo para T. serratifolia. Demonstrando que o uso dos marcadores microssatélites é mais
viável do que outros marcadores, pois eles apresentam uma grande quantidade de alelos
por loco, mesmo que este número pareça baixo.
35
Se comparado com outros trabalhos realizados com primers transferidos, como por
exemplo, em Tabebuia roseo-alba (He= 0, 852) (Feres et al.,2009), a Heterozigosidade
média esperada tanto em T. impetiginosa (0.804), quanto T. Serratifolia (0.473) foram
satisfatórias. De modo que, T.impetiginosa apresentou valor bem próximo ao encontrado
por Braga et al. (2007) em T. aurea (0,890). Por outro lado, T.serratifolia apresentou valor
menor que o encontrado por Braga et al. (2007), porém valores menores de He já foram
encontrados para espécies do mesmo gênero como de 0.439 para Tabebuia ochracea por
Moreira et al.(2009) e Eugenia dysenterica (He = 0.44, Zucchi et al., 2002) demonstrando
que a He nas espécies transferidas geralmente são menores do que as obtidas nas espécies
para os quais os primers foram desenvolvidos.
A heterozigosidade observada foi menor que a heterozigosidade esperada para as
duas espécies, o que significa que existe um excesso de homozigotos na população em
relação ao esperado pelas proporções do EHW. Como os indivíduos estudados pertencem à
mesma população, o alto valor de f (Ti= 0.343; Ts= 0.375) indica uma alta taxa de
cruzamentos aparentados entre os indivíduos dessa população das duas espécies, o que é de
grande importância visto que este tipo de acasalamento determina a estrutura dessa
população.
Todos os locos das duas espécies estudadas estão em equilíbrio de ligação (p > 0,
003333) (Tabela 06 e 08). Isso indica que os alelos dos diferentes locos não estão
associados, assim todos os locos apresentam uma herança mendeliana simples e segregam
independentemente.
As espécies estudadas não diferiram quanto ao coeficiente de endogamia, onde
ambas apresentaram Fis positivo e significativo. Os valores de Fis negativos ou próximos
de zero indicam que há variabilidade genética na população devido à maior número de
heterozigotos, enquanto que valores distantes de zero indicam maiores níveis de
homozigose (Nei, 1978).
Este resultado, aliados aos valores de Fis encontrados em todos os locos das duas
populações, indica que o acasalamento entre indivíduos aparentados ocorre com certa
freqüência. Cruzamentos entre indivíduos parentes em populações naturais têm sido
relatados em diversos estudos do sistema de reprodução de espécies arbóreas tropicais
(Seoane et al., 2005), sugerindo que a estruturação genética intra-populacional possa ser
um padrão comum das espécies arbóreas tropicais.Como por exemplo em Caryocar
36
brasiliense ( Collevatti et al., 2010) e Tabebuia roseo-alba (Feres et al., 2009).
Contudo os valores encontrados de Fis para as duas espécies não foram tão altos
(Ti= 0, 176; Ts=0, 139), apresentando um He (mede a diversidade genética) alto e
significativo, levando em consideração o número de alelos encontrados na população.
Isso nos indica que a população tanto de T. impetiginosa quanto T. serratifolia possuem
alta variabilidade genética dentro de suas populações.
Estas estimativas da diversidade genética das duas espécies são relevantes para a
conservação in situ de Tabebuia, visto que quanto maior e positiva for à diversidade
genética das espécies maior a ocorrência de novas recombinações genotípicas e maior o
potencial evolutivo de cada espécie (Reed & Frankham, 2003).
5.3 Estrutura genética espacial e Dispersão de sementes
Os resultados obtidos no presente estudo revelam que as duas espécies de Tabebuia
possuem uma estruturação genética espacial significativa, porém fraca. Este resultado
demonstra que apesar das espécies de Tabebuia serem dispersas pelo vento, esta dispersão
está limitada a pequenas distâncias originando uma população cada vez mais aparentada.
Em estudos realizados em outras espécies arbóreas também foram encontrados níveis
baixos de estruturação genética como, por exemplo, para Caryocar brasiliense (ver
Collevatti et al., 2010) e Dipteryx alata (Soares et al.,2008).
Na literatura é descrito que espécies de plantas dispersas pelo vento são menos
suscetíveis a perturbações das paisagens (Ghazoul, 2005), onde a dispersão pelo vento
pode ser facilitada pela fragmentação. Assim árvores com pequenas sementes dispersas
pelo vento são favorecidas em relação às árvores que possuem dispersão realizada por
animais e que possuem frutos grandes (Fore et al., 1992 ; Cordeiro & Howe, 2003). No
entanto as espécies do presente estudo estão situadas em uma área de preservação
ambiental e ainda assim demonstraram uma estruturação genética espacial positiva e uma
distribuição agregada dos seus genótipos, concluindo que mesmo espécies que possuam
dispersão de sementes pelo vento são suscetíveis a uma distribuição não aleatória dos seus
genótipos.
37
Como o fluxo gênico em plantas é caracterizado pela movimentação dos grãos de
pólen e sementes entre e dentro de populações, visto que plantas com dispersão
anemocórica são mais favorecidas, o fato dessas duas espécies de Tabeuia apresentarem
uma estrutura genética espacial positiva pode estar relacionada com a sua dispersão via
pólen. A taxa de cruzamento em plantas hermafroditas, como em Tabebuia, vai depender
de fatores tais como: presença e intensidade de mecanismos de auto-incompatibilidade;
comportamento forrageiro dos polinizadores (abelhas) entre e dentro de árvores, que por
sua vez são influenciados pela densidade de florescimento das árvores na população e;
aborto seletivo de frutos e sementes de autofecundação (Murawski & Hamrick, 1991).
Portanto o fluxo de pólen é um dos fatores mais importantes que influenciam a estrutura
genética de espécies arbóreas (Dick et al., 2003),sendo que, nas populações naturais o
fluxo gênico intenso pode efetivamente contrapor os efeitos da deriva genética ou seleção
direcional (Burczyk et al., 2004).
Em um estudo sobre o fluxo de pólen realizado em T. roseo-alba (Feres, 2009),
revelou uma tendência no aumento de autofecundação em árvores isoladas, e os resultados
de correlação de paternidade mostraram que existe uma maior probabilidade de sementes
compartilharem o mesmo parental dentro de um mesmo fruto que entre frutos de uma
mesma árvore. As causas desses cruzamentos correlacionados podem ser atribuídas ao
comportamento dos polinizadores visitando de forma sistemática árvores próximas,
poliandria ou depósito de múltiplos grãos de pólen de um simples polinizador e pequeno
número de vizinhos próximos (Sun & Ritland, 1998) ou fenologia das árvores.
Possivelmente vários destes fatores tenham contribuído para a alta taxa de cruzamento
biparental observadas em T. roseo-alba (Feres, 2009).
No presente estudo ambas as espécies apresentaram auto-correlação espacial
significativa, indicando uma relação significativa entre o parentesco e o logaritmo da
distância. Onde, o parentesco diminui fortemente e foi significativo somente até 20 metros
para T. impetiginosa e para T. serratifolia. O que indica que até essa distância o parentesco
entre os indivíduos das duas espécies dentro dessa população estão diretamente
relacionados com a distância física entre os indivíduos da mesma. A troca do fluxo gênico
então é maior entre árvores mais próximas corroborando a idéia de que os polinizadores
permanecem em pequenas manchas de grupos de árvores mais próximas. Que podem ser
confirmadas através da análise da vizinhança genética, estimada a partir da estrutura
38
genética espacial, que também foi pequena para as duas espécies T. serratifolia (Nb=29,92)
e T. impetiginosa (Nb=27,35), se levado em consideração o tamanho amostral e a distância
física entre todos os indivíduos.
O fluxo gênico via semente pode ser o responsável por dois terços do tamanho da
vizinhança genética, sendo assim o conhecimento de sua extensão também é essencial para
estimar o tamanho reprodutivo de populações de espécies arbóreas tropicais (Hamilton,
1999).
A correlação entre parentesco e a distância é também observada através da
estimativa do coeficiente de coancestria, onde foi observada uma distribuição agregada dos
genótipos para as duas espécies de Tabebuia, indicando agrupamentos de indivíduos
aparentados. Estudos realizados em Caryocar brasiliense também demonstraram uma
distribuição agregada dos genótipos e revelou que tal distribuição pode promover um
elevado tempo de residência de polinizadores em uma árvore individual e dentro de um
número restrito de plantas mais próximas causando um elevado percentual de
autopolinização e conseqüentemente um aumento da probabilidade de parentesco dentro
das progênies (Collevatti et al ., 2010).
Como a síndrome de floração em Tabebuia se dá de forma rápida e ao mesmo
tempo os polinizadores que são pequenos (abelhas), podem percorrer um percurso pequeno
de uma árvore para outra, tornam essa polinização mais restrita a pequenas distâncias como
demonstrado em nossos estudos. Isso acarreta em poucas gerações eventos de
acasalamentos entre indivíduos aparentados, o que gera uma diminuição na diversidade
genética dessas populações e futuramente em deriva gênica levando a uma possível
extinção local dessas espécies.
Como a densidade também influencia na estrutura genética das populações, nossos
resultados confirmam o modelo de isolamento por distância descrito por Wright (1943),
que já dizia que o tamanho da vizinhança e o número de indivíduos dentro dela são
determinados pela extensão do fluxo gênico e pela densidade da população local. Quanto
maior for à distância do fluxo gênico, maior será o tamanho da vizinhança, menor será a
taxa de deriva genética e, portanto menor será a diferenciação genética entre a vizinhança.
A população de T. impetiginosa como de T. serratifolia amostrados para o presente
estudo foram baixas devido sua baixa densidade no próprio Parque. No levantamento
realizado pela Semarh em 2007, baseado em uma amostra de 14.000m² (1,4 ha) a
39
densidade para a comunidade amostrada foi de 1.097,86 árvores por ha e a dominância
19,96 m²/há, porém demonstraram uma baixa densidade para as duas espécies de Tabebuia
onde a Densidade Absoluta (n/ha) para T. impetiginosa foi de 0,71 e para T. serratifolia foi
de 3,57 árvores por ha.
As espécies de Tabebuia do presente estudo além de possuírem uma baixa
densidade no PEAMP-GO, também se encontram na lista de espécies ameaçadas embora
verificasse que, de um modo geral, as formações de florestas estacionais estão ameaçadas
em todo o Brasil Central devido a sua substituição por cultivos agrícolas, pela pecuária e
naquelas sobre afloramentos calcáreos ou basálticos, pela mineração para a produção de
calcáreo, cimento ou brita (Felfili, 2003). Dentre as espécies encontradas no Parque
destacam-se algumas espécies que estão ameaçadas pela erosão genética que suas
populações têm sofrido devido à super exploração de madeira: Cedrella fissilis (Cedro),
Cordia tricotoma (Louro preto), que estão em perigo na região de modo que sua madeira já
não está mais disponível em escala, no mercado. Tabebuia serratifolia (Ipê amarelo),
Astronium fraxinifolium e Myracruodruon urundeuva estão, também, sob intensa ameaça
apesar de ainda haver madeira no mercado (Semarh, 2009).
O PEAMP não se vê fora dessa realidade isto devido à alteração histórica da região
e da presença das áreas urbanas nas proximidades dos Parques. Esta se encontra em
diferentes condições de perturbação, uma vez que antes da criação do Parque a área foi
utilizada como fazenda, havendo muitos pastos abandonados, clareiras para extração de
madeira, antigos roçados intercalados com trechos mais preservados. Isto se traduz em um
isolamento muito grande e em problemas de dispersão para as espécies da flora que
dependem da zoocoria para propagar suas sementes.
Nossos resultados sugerem que as espécies do presente estudo podem ser afetadas
pela fragmentação e pela perturbação dos seus hábitats naturais devido às características do
histórico de vida dessas plantas, levando a significativa estrutura genética espacial.
Portanto, são necessários estudos complementares sobre estas duas espécies dessa
população em relação ao fluxo gênico via pólen para corroborar os resultados aqui obtidos.
Portanto o conhecimento do modo como a variabilidade genética está estruturada
no espaço, aliado a outras características da espécie podem fornecer subsídios para
programas de conservação de germoplasma, auxiliando na definição de unidades
evolutivamente estáveis (UEE) ou unidades de manejo (UM) (Eizirik, 1996). Para as
40
espécies que apresentam potencial de utilização econômico, estas informações também
podem ser utilizadas em programas de domesticação As análises realizadas sugerem que
processos estocásticos, tais como o modelo de isolamento-por-distância ou “steppingstone”, são mais adequados para explicar o padrão espacial de divergência genética nas
duas espécies de Ipê na população do PEAMP no Estado de Goiás. Além disso, a
existência de um padrão espacial na variação genética é importante para a compreensão de
como ocorre à dinâmica dos alelos entre as sub-populações dessa espécie. Essa informação
pode ser utilizada para otimizar a amostragem da variabilidade genética para sua
subseqüente utilização.
41
6. CONCLUSÃO
1. A estrutura genética espacial intra-populacional indica que as duas espécies de
Tabebuia analisadas apresentam estruturação em parentesco e formam grupos de
vizinhança, em diferentes escalas geográficas.
2. Há correlação entre parentesco e a distância física dos indivíduos gerando assim
uma distribuição agregada dos genótipos para as duas espécies de Tabebuia, indicando
agrupamentos de indivíduos aparentados.
42
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BASSAM, B. J.; CAETANO-ANOLLES, G.; GRESSHOFF, P. M. Fast and sensitive
silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry, 196: 8083. 1991.
BRAVO, J.P.; HOSHINO, A.A.; ANGELICI, C.M.L.C.D. 2006. Transferability and use of
microsatellite markers for the genetic analysis of the germplasm of some arachis
section species of the genus Arachis. Genetics and Molecular Biology, 29 (3): 516524. 2006.
BAWA, K.S.; PERRY, D.R.; BEACH, J.H. Reproductive biology of tropical lowland rain
forest trees. I. Sexual systems and incompatibility mechanisms. American journal
of botany, v. 72, p. 331-45, 1985.
BRAGA, ALINE. C.; ALESSANDRA M. M. REIS, LÉLIA T. LEOI, RINALDO W.
PEREIRA and ROSANE G. COLLEVATTI. Development and characterization of
microsatellite markers for the tropical tree species Tabebuia aurea (Bignoniaceae).
Molecular Ecology Notes (2007).
BRONDANI, R. P. V.; BRONDANI, C.; TARCHINI, R.; GRATTAPAGLIA, D.
Development, characterization and mapping of microsatellite markers in
Eucalyptus grandis and E. urophylla. Theoretical and Applied Genetics, 97: 816827. 1998.
BROWN, S.M.; HOPKINS, M.S.; MITCHELL, S.E.; SENIOR, M.L.; WANG, T.Y.;
DUNCAN, R.R.; GONZALEZ-CANDELAS, F.; KRESOVICH, S. 1996. Multiple
methods for the identification of polymorphic simple sequence repeats (SSRs) in
sorghum [Sorghum bicolor (L.) [Moench]. Theoretical and Applied Genetics,
93:190.
BURCZYK, J.; LEWANDOWSKI, A.; CHALUPKA, W. Local pollen dispersal and
distant gene flow in Norway spruce (Picea abies (L.) Karst.). Forest Ecology and
Management, 197, 39-48, 2004.
43
CARVALHO, P. E. R. Espécies florestais brasileiras: recomendações silviculturais,
potencialidades e uso da madeira. Paraná: EMBRAPA, 1994. 640 p.
CARVALHO, P. E. R. Espécies arbóreas brasileiras. Colombo: Embrapa Florestas, 2003.
v.1
CAVALLARI-NETO, M. Efeito do manejo na diversidade genética de populações naturais
de Tabebuia cassinoides LAM (DC), por marcadores isoenzimáticos. 2004. 67 p.
Dissertação (Mestrado) – Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”Universidade de São Paulo, Piracicaba.
CHAVARIAGA,A.P.MAYA,M.M;BONIERBALE,M.W;KRESOVICH,S;FREGENE,M.S
;TOHME,J;KOCHERT,G. Microsatellites in Cassava (Manihot esculenta Crantz):
discovery, inheritance and variability. Theor Appl Genet (1998) 97: 493-501.
CHUNG, M. G.; CHUNG, J. M.; EPPERSON, B. K. Spatial structure of allozyme
polymorphisms whithin populations of Rhus trichocarpa (Anacardiaceae). Silvae
Genetica, Frankfurt, v. 48, p. 223-227, 1999.
CHUNG, M. G.; EPPERSON, B. K. Spatial structure ofallozyme polymorphisms in a
populations of Eurya japonica (Theaceae). Silvae Genetica, Frankfurt, v. 49, p. 1-4,
2000.
CIAMP, A.Y.; BRONDANI, R.P.V.; GRATTAPAGLIA, D. Desenvolvimento de
marcadores microssatelites para Copaifera langsdorffii (Copaiba)–LeguminosaeCaesalpinioideae e otimizacao de sistemas fluorescentes de genotipagem multiloco.
Boletim de Pesquisa Embrapa, v.16, p.1-40, 2000.
COLLEVATTI, R.G.; BRONDANI, R.V.P.; GRATTAPAGLIA,D . Development and
characterization of microsatellite markers for genetic analysis of a Brazilian
endangered tree species Caryocar brasiliense. Heredity 1999.83, 748-756.
COLLEVATTI, R.G.; GRATTAPAGLIA, D.; HAY, J.D. 2001a. High resolution
microsatellite based analysis of mating system allows the detection of significant
biparental inbreeding in populations of Caryocar brasiliense, an endangered
tropical tree species. Heredity, 86:60-67.
44
COLLEVATTI, R.G.; GRATTAPAGLIA, D.; HAY, J.D. 2001b. Population genetic
structure of the endangered tropical tree species Caryocar brasiliense, based on
variability at microsatellite loci. Molecular Ecology, 10:349-356.
COLLEVATTI, R. G.; LIMA, JS; SOARES, T. N.; TELLES, M. P. C. Spatial Genetic
Structure and Life history traits in Cerrado tree species: inferences for conservation.
Natureza & Conservação, v. 8, p. 1-5, 2010.
CORDEIRO, N.J.; HOWE, H.F. 2003. Forest fragmentation severs mutualism between
seed dispersers and an endemic African tree. Proceedings of the National Academy
of Sciences, 100:1452-1456.
CRESTE, C.; TULMANN NETO, A.; FIGUEIRA, A. Detection of single sequence repeat
polymorphisms in denaturing polyacrylamide sequencing gels by silver staining.
Plant Molecular Biology Report, v. 19, p. 299-306, 2001.
CROXFORD A. E., ROBSON M; WILKINSON, M. J Characterization and PCR
multiplexing of polymorphic microsatellite loci in cashew (Anacardium occidentale
L.) and their cross-species utilization. Molecular Ecology Notes (2006) 6, 249–251.
DAYANANDAN, S; RAJORA, O. P; BAWA K. S. Isolation and characterization of
microsatellites in trembling aspen (Populus tremuloides). Theor Appl Genet (1998)
96: 950-956.
DICK, C.W; ETECHELECU, G.; AUSTERLITZ, F. 2003. Pollen dispersal of tropical
trees
(Dinizia excelsa: Fabaceae) by native insects and African honeybees in pristine and
fragmented Amazonian rainforest. Molecular Ecology, 12:753-64.
DIERINGER, G. 1991. Variation in individual flowering time and reproductive success of
Agalinis strictifolia (Scrophulariaceae). American Journal of Botany 78: 497–503.
DOYLE, J.J.;DOYLE,J.L.Isolation of plant DNA from fresh tissue. 1987, Focus12, 13-15.
DUTECH, C. et al. Evidence of low gene flow in a neotropical clustered tree species in
two rainforest stands of French Guiana. Molecular Ecology, Edinburgh, v. 11, p.
725-738, 2002.
ELLSTRAND, N. C. 1992. Gene flow among seed plant populations. New Forests 6, 241–
256.
45
EISEN, J. A Mechanistic basis for microsatellite instability. In: Goldstein DB, Schlötterer
C (eds) Microsatellites – evolution and applications. p.34-48. Oxford University
Press, Oxford, UK, 1999.
EIZIRIK, E. 1996. Ecologia molecular, genética da conservação e o conceito de unidades
evolutivamente significativas. Brazilian Journal of Genetics 19:23-29.
EPPERSON, B.K. Recent advances in correlation studies of spatial patterns of genetic
variations. Evolutionary Biology 27.1993.
EPPERSON,B; CHUNG, M. G. Spatial genetic structure of allozyme polymorphisms
within populations of Pinus strobus (Pinaceae). American Journal of Botany,
Oklahoma, v. 88, n. 6, p. 1006-1010, 2001.
FELFILI, J.M. Fragmentos de florestas estacionais do Brasil Central: diagnóstico e
proposta de corredores ecológicos. In: COSTA, R.B. da (Org.). Fragmentação
florestal e alternativas de desenvolvimento rural na Região Centro Oeste. Campo
Grande: Universidade Católica Dom Bosco, 2003. p. 138160.
FERES, J. M. Diversidade genética, sistema reprodutivo e fluxo de pólen em duas
populações de Tabebuia roseo-alba (Ridl.) Sand.: Implicações para a conservação /
Dissertação de mestrado – Ribeirão Preto, 2009.
FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D. 1998.Introdução ao uso de marcadores RAPD
e RFLP em análise genética.3ºed. Brasília: EMBRAPA-CENARGEN.
FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares
em análise genética. Brasília: EMBRAPA-CENARGEN. 1995. 220p.
FRANKHAM, R.; BALLOU, J.D.; BRISCOE, D.A. Conservation Genetics. Cambridge
University Press: Cambridge UK, 2002. 617p.
FORE SA et al., 1992. Genetic structure after forest fragmentation: a landscape ecology
perspective on Acer saccharum. Canadian Journal of Botany, 70: 1659-1668.
FUTUYMA, D.J. Biologia evolutiva. 2.ed. Ribeirão Preto: SBG/CNPq, 1992. 646p.
GAIOTTO, F.A.; GRATTAPAGLIA, D.; VENCOVSKY,R.2003. Genetic Structure,
Mating System, and Long-Distance Gene Flow in Heart of Palm (Euterpe edulis
Mart.). Journal of Heredity, 5: 399-406.
46
GARCIA J. E., VILAS BOAS L. A., LEMOS M. V. F., DE MACEDO LEMOS E. G.,
CONTEL E. P. B.Identification of Microsatellite DNA Markers for the Giant
Anteater Myrmecophaga tridactyla. Journal of Heredity Advance Access published
July 1, 2005.
GENTRY, A. H. 1974. Flowring phenology and diversity in tropical Bignoniaceae.
Biotropica, 6 (1):64-68.
GENTRY, A.H. 1990. Evolutionary patterns in Neotropical Bignoniaceae. Memoirs of the
New York Botanical Garden 55:118-129.
GHAZOUL, J. Pollen and seed dispersal among dispersed plants. Biology Reviews, 80,
413–443. 2005.
GIUDICE-NETO, J. D.; KAGEYAMA, P. Y. Estrutura genética espacial em populações
naturais de Machaerium villosum Vog. (Leguminosae) na região de Moji-Guaçu,
SP, Brasil. Rev. Bras. De Bot., São Paulo, v. 23, p. 207-215, 2000.
GOUDET, J, RAYMOND M, DE MEEDS T, ROUSSET F. 1996. Testing differentiation in
diploid populations. Genetics, 144: 1933-1940.
GOUDET, J. Fstat. (Version 2.9.3.2.): a computer program to calculate F-statistics. J.
Heredity, 86: 485-486, 2002.
GOLDSTEIN, D.G.; SCHOLOTTERER, C. (eds). 1999 Microsatellites: Evolution and
Applications. Oxford University Press. New York.
GRAVENA, W. Isolamento e caracterização de marcadores microssatélites para análise de
parentesco
no
boto-vermelho
(Inia
geoffrensis).
Dissertação
(Mestrado)
Universidade Federal do Amazonas- UFAM. Manaus.2007.
HAIDAR, R.F.; FELFILI, J.M.; PINTO, J.R.R. & FAGG, C.W. Fitossociologia de
vegetação arbórea em fragmentos de Floresta Estacional, no Parque Altamiro de
Moura Pacheco, Goiás. B. Herb. Ezechias Paulo Heringer, v.15, p.19. 2005.
HANCOCK, J. Microsatellites and other simple sequences: genomic context and
mutational mechanism. In Microsatellites: Evolution and Applications.Edited by.
D.GOLDSTEINS&CHRISTIAN SCHOTTERER.Oxford University Press, New
York. 1999.
47
HAMRICK, J.L. Plant population genetics and evolution. American Journal of Botany,
Columbus, v. 69, n. 10, p. 1685- 1693, 1982.
HARDING, R.M.; BOYCE, A.J.; CLEGG, J.B. The evolution of tandemly repetitive
DNA: recombination rules. Genetics, v.131, p.847-859, 1992.
HARDY, O.; VEKEMANS, X. SPAGeDI 1.3: a program for spatial pattern analysis of
genetic diversity. Disponível em: <www.ulb.ac.be/sciences/ecovol/software>.
Acesso em: 1 junho. 2009.
JAMES, C. M; WILSON F; HADONOU A . M; TOBUTT K. R. Isolation and
characterization of polymorphic microsatellites in diploid strawberry (Fragaria
vesca L.) for mapping, diversity studies and clone identification. Molecular
Ecology Notes (2003) 3, 171–173.
JENNERSTEN, O. Pollination in Dianthus deltoides (Caryophyllaceae): effects of habitat
fragmentation on visitation and seed set. Conserv. Biol. 2: 359-366 1988.
JONES, F.A.; CHEN, J.; WENG, G.J.; HUBBELL, S.P. A genetic evaluation of seed
dispersal in the Neotropical tree, Jacaranda copaia (Bignoniaceae). American
Naturalist, 166, 543–555, 2005.
KAGEYAMA, P.Y. Conservação “in situ” de recursos genéticos de plantas. IPEF,
Piracicaba, n.35, p.7-37, 1987.
KAGEYAMA, P.Y; GANDARA, F.P. Conseqüências genéticas da fragmentação sobre
populações de espécies arbóreas. Serie Técnica IPEF, v. 12, n. 32, p. 65-70, dez.
1998.
LEMES, M.R.; GRATTAPAGLIA, D.; GROGAN, J.; PROCTOR, J.; GRIBEL, R.
Flexible mating system in a logged population of Swietenia macrophylla King
(Meliaceae): implications for the management of a threatened neotropical tree
species. Plant Ecology, v.192, p.169-179, 2007.
LEVIN, D. A., AND H. W. KERSTER. 1969. The dependence of bee-mediated pollen and
gene dispersal upon plant density. Evolution 23: 560–571.
LITT, M. & LUTY, J.A. 1989. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro
amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene.
American Journal of Human Genetics, 44: 397-401.
48
LOISELLE, B. A. et al. Spatial genetic structure of a tropical understory shrub, Psychotria
officinalis (Rubiaceae). American Journal of Botany, Oklahoma, v. 82, p. 14201425, 1995.
LORENZI, H. Árvores brasileiras: manual de identificação e cultivo de plantas arbóreas
nativas do Brasil. São Paulo. Nova Odessa: Plantarum, 1992.
LORENZI, H. Árvores brasileiras: manual de identificação e cultivo de plantas arbóreas
nativas do Brasil. v.1.4º.ed. Nova Odessa,São Paulo: Plantarum, 2002.66-70p.
LOVELESS, M.D & HAMRICK,J.L.Ecological determinants of genetic estruture in plnat
populations.Rev.Ecol.Syst. is: 65-95.1984.
MARTINS,P.S. Estrutura populacional,fluxo gênico e conservação “in situ” IPEF, n.35,
p.71-78, abr.1987.
MOORE,S.S.;SARGEANT,L.L.;KING,T.J.;MATTICK,J.S.;GEORGES,M.;HETZEL.G.J.
The conservation of dinucleotide microsatellitesamong mammalian genomes allows
the use of heterologous PCR primer pairs in closely related species. Genomic.
1991.
MOREIRA, P.A; FERNANDES, G. W. ; COLLEVATTI, R. G. Fragmentation and spatial
genetic structure in Tabebuia ochracea (Bignoniaceae) a seasonally dry Neotropical
tree. Forest Ecology and Management, v. 258, p. 2690-2695, 2009
MURAWSKI, D.A.; HAMRICK, J.L. The effect of the density of flowering individuals on
the mating systems of nine tropical tree species. Heredity 67:167-174, 1991.
NEI, M. 1978. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small
number of individual. Genetics 89: 583-590.
OHSAWA, R., N. FURUYA, AND Y. UKAI. 1993. Effect of spatially restricted pollen
flow on spatial genetic structure of an animal-pollinated allogamous plant
population. Heredity 71: 64–73.
OKAYAMA, Y., M. NAGAI, AND I. WASHITANI. 2003. Testing the „assortative
mating‟ hypothesis on a variation maintenance mechanism for flowering time
within a forest-floor population of Primula sieboldii. Plant Species Biology 18:1–
11.
49
OLIVEIRA, E; J. PÁDUA, J; G. ZUCCHI, M. I; CAMARGO, L . E ;A FUNGARO M. H.
P; VIEIRA M. L. C. Development and characterization of microsatellite markers
from the yellow passion fruit ( Passiflora edulisf. flavicarpa) Molecular Ecology
Notes (2005);5, 331–333.
OLIVEIRA, A. F; PÁDUA, J. G; ZUCCHI, M. I.; VENCOVSKY, R.; VIEIRA, M. L. C.
Origin, evolution and genome distribuition of microsatellites. Genetics and
Molecular Biology 29: 294 - 307, 2006.
PORS, B., AND P. A. WERNER. 1989. Individual flowering time in a goldenrod
(Solidago canadensis): field experiment shows genotype more important than
environment. American Journal of Botany 76: 1681–1688.
POWELL, W., MACHARAY, G.C., PROVAN, J. 1996. Polymorphism revealed by
simple sequence repeats. Trends in Plant Science, 7: 215-222.
RAFALSKI, J. A.; MORGANTE, M.; POWELL, W.; VOGEL, J. M.; TINGEY, S. V.
1996. Generating and using DNA markers in plants. In: Birren, B. and Lai, E. (eds)
Analysis of Non-mammalian Genomes - A Pratical Guide. Academic Press, New
York. p. 75-134.
REED, D.H.; FRANKHAM, R. Correlation between fitness and genetic diversity.
Conservation Biology, v.17, p.230-237, 2003.
RODRIGUES, L.A & ARAÚJO,G.M.Levantamento florístico de uma mata decídua em
Uberlândia-MG, Brasil.Acta Botânica Brasilica 11(2):229-236.1997.
RIZZINI, C.T. Árvores e madeiras úteis do Brasil. editora Edgard blucher ltda. São
Paulo.1978.
ROUSSET F, 1997. Genetic differentiation and estimation of gene flow from F-statistics
under isolation by distance. Genetics, 145: 1219-1228.
SANTOS, D. L.; SUGAHARA, V. Y.; TAKAKI, M. Efeitos da luz e da temperatura na
germinação de Tabebuia serratifolia (Vahl.) Nich., Tabebuia chrysotricha (Mart.
Ex Dc.) Standl. e Tabebuia roseo-alba (Ridl.) Sand. – Bignoniaceae. Ciência
Florestal, v.15, n.1, p. 87-92, 2005.
50
SARZI, I; BÔAS, R L.V; SILVA, M.R. Desenvolvimento de mudas de Tabebuia
chrysotricha em função de substrato e de solução de fertirrigação.Cerne, Lavras, v.
14p. 153-162, 2008.
SCARIOT, A. & SEVILHA, A. C. 2000. Diversidade, estrutura e manejo de florestas
deciduais e as estratégias para a conservação. pp. 183-188. In: T. B. Cavalcanti &
B. M. T. Walter. Tópicos Atuais em Botânica, Brasília, DF
SCHMITT, J. 1983. Density-dependent pollinator foraging, flowering phenology, and
temporal pollen dispersal patterns in Linanthus bicolor. Evolution 37: 1247–1257.
SEBBENN, A.M.; KAGEYAMA, P.Y.; VENCOVSKY, R. Variabilidade genética,
sistema de reprodução e estrutura genética espacial em Genipa americana L.
através de marcadores isoenzimáticos. Scientia forestalis, Piracicaba, v.53, p.15-30,
1998.
SEMARH. Secretaria Estadual de Meio Ambiente e de Recursos Hídricos do Estado de
Goiás.Disponível
em
http://www.semarh.goias.gov.br/arquivos_main/peamp/PEAMP_flora_final.pdf em
10 de maio de 2009.
SEOANE, C.E.S.; SEBBENN, A.M.; KAGEYAMA, P.Y. Efeitos da fragmentação
florestal em populações de Esenbeckia leiocarpa Engl. Scientia Forestalis, Piracicaba, n. 57, p. 123-139, 2000.
SLATKIN, M.1985.Gene flow in natural populations. Annual review of Ecology and
Systematics 16:393-430.
SOKAL, R.R. and WARTENBERG, D. (1983). A test of spatial autocorrelation using an
isolation-by-distance model. Genetics 105: 219-237.
STOCKMAN,A.L;BRANCALION,P.R.S;NOVEMBRE,A.D.L.C;CHAMMA,H.M.C.P.
Sementes de Ipê-branco (Tabebuia roseo-alba (Ridl.) Sand. (BIGNONIACEAE):
Temperatura e substrato para teste de germinação. Revista Brasileira de Sementes,
vol. 29, nº 3, p. 121-125, 2007.
SUN, M.; RITLAND, K. Mating system of yellow starthistle (Centaurea solstitialis), a
successful colonizer in North America. Heredity 80: 225-232, 1998.
51
SOARES, T. N.; CHAVES, Lázaro José; TELLES, Mariana Pires de Campos; RESENDE,
Lucileide Vilela; DINIZ FILHO, José Alexandre Felizola. Landscape conservation
genetics of Dipteryx alata (baru tree: Fabaceae) from Cerrado region of central
Brazil. Genetica (The Hague), v. 132, p. 9-19, 2008.
TAUTZ, D. 1989. Hypervariability of simple sequences as a general source for
polymorphic DNA markers. Nucleic Acids Research. 17: 6463-71.
TACHIDA H.; LIZUKA, M. 1992. Persistence of repeated sequences that evolve by
replication slippage. Genetics, 131: 471-478.
VEKEMANS, X.; HARDY, O.J. New insights from fine-scale spatial genetic structure
analyses in plant population. Molecular Ecology, v.13, p.921‑935, 2004.
WASHITANI, I., H. NAMAI, AND R. OHSAWA. 1991. Species biology of Primul
sieboldii for the conservation of its lowland-habitat population. I. Inter-clonal
variations in the flowering phenology, pollen load and female fertility components.
Plant Species Biology 6: 27–37.
WEBER, J. L.; MAY, P.E. 1989. Abundant class of human DNA polymorphisms which
can be typed using the polymerase chain reaction. American Jornal of Human
Genetics, 44, 388-96.
WRIGHT, S. 1978. Evolution and the genetics of populations. Variability within and
among natural populations. Chicago: University of Chicago Press, 4, 423p.
WRIGHT, S.1943.Isolation by distance.Genetics.28:114-138.
ZUCCHI, M.I.; BRONDANI, R.P.V.; PINHEIRO J.B.; CHAVES L.J.; COELHO A.S.G.;
VENCOVSKY, R. Genetic structure and gene flow in Eugenia dysenterica DC in
the Brazilian Cerrado utilizing SSR markers. Genet. Mol. Biol. 26:449-457, 2003.
52