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ISSN 1413-3555
Rev. bras. fisioter. Vol. 9, No. 2 (2005), 235-241
©Revista Brasileira de Fisioterapia
ANÁLISE MORFOMÉTRICA DOS TECIDOS MUSCULAR E CONJUNTIVO
APÓS DESNERVAÇÃO E ESTIMULAÇÃO ELÉTRICA DE BAIXA FREQÜÊNCIA
Fernandes, K. C. B. G., 1 Polacow, M. L. 0., 1 Guirro,R. R. 1., 1 Campos, G. E. R., 2
Somazz, M. C., 2 •3 Pinto, V.'F}Fuentes, C. B. 3 e Teodori, R. M. 1
Programa de Pós-Graduação em Fisioterapia- UNIMEP, Piracicaba, SP, Brasil
1
2
lnstituto de Biologia- UNICAMP, Campinas, SP, Brasil
'Curso de Fisioterapia- UNIMEP, Piracicaba, SP, Brasil
Correspondência para: Rosana Macher Teodori, UNIMEP, Rodovia do Açúcar,
km 156, CEP 13400-911, Piracicaba, SP, e-mail: [email protected]
Recebido: 20/8/2004- Aceito: 28/6/2005
RESUMO
Introdução: A estimulação elétrica muscular tem sido empregada após lesão nervosa periférica com o objetivo de minimizar a atrofia
e a fraqueza muscular. Experimentos têm demonstrado que há plasticidade nas fibras musculares, sendo o músculo capaz de sofrer
adaptações ante fatores como a desnervação e a estimulação elétrica. Objetivo: Analisar a influência da estimulação elétrica sobre
o perfil morfométrico do músculo sóleo de ratos desnervado por esmagamento do nervo isquiático. Método: Foram utilizados 18 ratos
Wistar (196,86 g ± 33,67) divididos em 3 grupos (n = 6): desnervado +estimulação elétrica (DEE); desnervado (D); e controle (C).
Vinte e quatro horas após o esmagamento do nervo iniciou-se a estimulação elétrica muscular no grupo DEE (i = 5 mA, Fase = 3
ms, f= 1O Hz) por 30 minutos, durante 20 dias consecutivos. O músculo sóleo foi retirado para análise morfométrica. Resultados:
A área média de secção transversa das fibras musculares do grupo C foi de 1.035 J.Lm 2 ± 210, no grupo D foi de 375 Jlm 2 ± 65 e no
grupo DEE, de 600 J.!m 2 ± 126 (p::; 0,05). A densidade de área do tecido conjuntivo foi significativamente menor (p ::; 0,05) no grupo
DEE (16,61% ± 3,68) em relação ao D (34,49% ± 4,32), sendo que ambos os grupos apresentaram valores maiores que o grupo C
(9,55% ± 2,62). A densidade de área das fibras do músculo sóleo foi significativamente maior (p::; 0,05) no grupo DEE (83,37% ±
3,68) quando comparada ao grupo D (65,49% ± 4,32). A estimulação elétrica de baixa freqüência minimizou a atrofia das fibras
musculares e a proliferação de tecido conjuntivo no músculo desnervado.
Palavras-chave: Fisioterapia, estimulação elétrica, baixa freqüência, desnervação muscular, plasticidade muscular, morfometria.
ABSTRACT
Morphometric analysis of muscle and conjunctive tissue after denervation and
low-frequency electrical stimulation
Background: Electrical stimulation of muscles has been used after peripheral nerve injury for minimizing atrophy and muscle weakness.
Severa! experiments have shown that muscle fibers present plasticity, such that muscles can undergo adaptations through factors
like denervation and electrical stimulation. Objective: This work intended to analyze the influence of an electrical stimulation protocol
on the morphometric profile of rat soleus muscle denervated by sciatic nerve crushing. Method: Eighteen Wistar rats (196.86g ±
33.67) were distributed into 3 groups (n = 6): denervated + electrically stimulated (DEE); denervated (D) and control (C). Electrical
stimulation of the muscle (i = 5 mA; phase = 3 ms; f= 1O Hz) began 24 hours after nerve crushing, and was done for 30 minutes/
day for 20 consecutive days (DEE group). The soleus muscle was removed for morphometric analysis. Results: The cross-sectional
area of the muscle fibers in the C group was 1035 J.Lm 2 ± 210; in D, 375 J.Lm 2 ± 65; and in DEE, 600 J.Lm 2 ± 126 (p::; 0.05). The
area density of conjunctive tissue was lower (p ::; 0.05) in DEE (16.61% ± 3.68) than in D (34.49% ± 4.32) while both these groups
presented greater values than in C (9.55% ± 2.62). The area density of the soleus muscle fiber was greater in DEE (83.37% ± 3.68)
than in D (65.49% ± 4.32) (p::; 0.05). Conclusion: Low-frequency electrical stimulation minimized the muscle fiber atrophy and
conjunctive tissue proliferation in denervated muscle.
Key words: physical therapy, electrical stimulation, low-frequency, muscle denervation, muscle plasticity, morphometry.
236
Fernandes, K. C. B. G. et ai.
INTRODUÇÃO
As limitações provocadas por lesões nervosas periféricas
são freqüentes na prática clínica, sendo os objetivos da
reabilitação nesses casos a prevenção da atrofia muscular,
a manutenção das amplitudes de movimento articular e a
recuperação da motricidade e da sensibilidade das áreas
afetadas pela lesão. A recuperação funcional depende da
regeneração neural, porém, esse processo é lento, o que
determina a inatividade do músculo por um tempo
considerável e, conseqüentemente, o estabelecimento da
atrofia muscular. 1·2.:1
As alterações morfológicas após desnervação envolvem
diminuição da massa muscular4•5 ·6 e da área de secção
transversa das fibras, 6 •7•8•9 aumento do tecido conjuntivo ao
redor da fibra muscular, 10• 11 • 12 · 13 .1 4 entre outras. A fraqueza
muscular após desnervação é decorrente da perda de ação
trófica do neurônio motor sobre o músculo, sendo agravada
pela atrofia das fibras musculares e/ou pela proliferação de
tecido conjuntivo. 12 O acúmulo de tecido conjuntivo
intersticial dificulta a troca de substâncias entre o leito vascular
e as fibras musculares. Esse tecido pode afetar a extensão
do crescimento axonal durante a reinervação, quando as fibras
colágenas atuam como barreira fisiológica ao crescimento
axonal, e dificultar a difusão de fatores de crescimento
nervoso liberados após desnervação. 15
Em músculos desnervados, especialmente nos casos
de lesão nervosa, em que a recuperação neural e o
restabelecimento das condições funcionais do músculo são
possíveis, a estimulação elétrica tem sido empregada com
objetivo de minimizar a atrofia progressiva e a fraqueza
muscular. 6 • 16• 17
Outro efeito já conhecido da estimulação elétrica é a
elevação da captação de glicose pelo músculo por meio da
atividade contrátil, que promove a translocação de GLUT4,
um transportador de glicose responsável pela homeostasia
glicêmica da fibra muscular, melhorando a captação de
glicose. 17 Silva et a/. 17 observaram elevação no conteúdo
de glicogênio no músculo sóleo desnervado de ratos tratados
com estimulação elétrica, sugerindo que essa terapia seja
eficiente para a recuperação das condições metabólicas do
músculo e conseqüente preservação de suas condições
tróficas.
Diversos pesquisadores 18 · 19 ·2021 têm investigado os efeitos
da estimulação elétrica crônica de baixa freqüência em
músculos desnervados de animais, observando transição das
cadeias pesadas de miosina, 18 conversão parcial de fibras
,
Ios d e contraçao
- rap1
, ·d a 20 · 21 e
rápidas para lentas em museu
redução da atrofia muscular. 22
A estimulação elétrica crônica de baixa freqüência utiliza
eletrodos implantados no músculo, liberando pulsos de baixa
freqüência, cujas durações variam de 8 a 24 horas 19 •23 · 24
diariamente. Esse procedimento pode ser viável em animais,
Rev. bras. fisioter.
mas na prática clínica apresenta limitações, não sendo possível
manter um período tão prolongado de estimulação.
A estimulação fásica difere da crônica em relação ao
tempo de aplicação do estímulo e por utilizar eletrodo de
superfície, o que, na prática clínica, torna viável a aplicação
desse recurso com o objetivo de manter as melhores condições
possíveis do músculo desnervado.
Apesar de ocorrer de forma lenta, 25 a atrofia muscular
em humanos pode definir limitações funcionais permanentes,
mesmo após reinervação. Essa disfunção preocupa a equipe
multiprofissional envolvida no processo de reabilitação. Estudos
com animais desenvolvidos paralelamente a estudos clínicos
favorecem a compreensão dos efeitos da estimulação elétrica
no músculo esquelético desnervado, fornecendo fundamentação
científica para o estudo dessa forma de intervenção
fisioterapêutica, que visa à recuperação funcional.
Este trabalho teve por objetivo analisar a influência
de um protocolo de estimulação elétrica sobre o perfil
morfométrico do músculo sóleo de ratos submetidos a
desnervação por esmagamento do nervo isquiático.
MATERIAL E MÉTODOS
Animais de Experimentação
Dezoito ratos Wistar (196,86 g ± 33,67) foram divididos em 3 grupos (n = 6): controle (C), desnervado +
estimulação elétrica (DEE) e desnervado (D). Os animais
foram fornecidos pelo biotério central da instituição e
acondicionados em gaiolas plásticas, à temperatura
ambiente, com livre acesso à ração e à água e submetidos
a ciclo claro/escuro de 12 horas. O experimento foi realizado
de acordo com as normas internacionais de ética na
experimentação animal. 26
Procedimento Experimental
Após anestesia intramuscular com cloridrato de cetamina
(50 mg/ml) e cloridrato de xilazina (2 g/1 00 ml), na proporção
de 1:1 (0,3 ml/1 00 g de peso corporal), o nervo isquiático
esquerdo foi exposto e submetido a 4 pinçamentos
consecutivos (20 segundos cada)Y A estimulação elétrica
do grupo DEE teve início 24 horas após a cirurgia (30 minutos
durante 20 dias consecutivos). Após anestesia, 2 eletrodos
percutâneos com 1 cm 2 de área, untados com gel
eletrocondutor, foram posicionados: um na região inguinal
e o outro sobre o músculo sóleo. A corrente elétrica foi gerada
no equipamento Dualpex 961-QUARK, com forma de pulso
quadráticas bifásicas simétricas, fase de 3 ms e intensidade
de 5 mA, por envolver músculo desnervado e por ser essa
a intensidade de estímulo que permitiu uma contração
vigorosa do músculo sóleo, caracterizada pelo movimento
de flexão plantar. A freqüência foi de I OHz. Esses parâmetros
foram estabelecidos em função de a cronaxia ser maior no
músculo que no nervo e pela característica fenotípica do sóleo
..
..
237
Estimulação Elétrica em Músculo Desnervado
Yol. 9 No. 2, 2005
ser de contração lenta. Para evitar acomodação do músculo
ao estímulo e garantir o mesmo nível de estimulação em todos
os animais, foi acrescido 1 mA a cada 5 minutos, totalizando
1O mA ao final dos 30 minutos de estimulação.
Após o período experimental, o músculo sóleo dos
animais dos três grupos foi retirado, seccionado transversalmente no terço médio de seu ventre, posicionado em bloco
de madeira com tragacanth gum e congelado em isopentano
resfriado em nitrogênio líquido a -159°C. Os músculos foram
seccionados em micrótomo criostato HM 505E-MICRON,
com 12 J..Lm de espessura, corados em Hematoxilina por 15
minutos e Eosina por 3 minutos. As áreas de secção
transversa, de aproximadamente 400 fibras do músculo sóleo
de cada animal, foram mensuradas utilizando o sistema de
análise de imagem Image Pró-Pius 4.0- Media Cybemetics.
A análise da densidade relativa de área dos tecidos
conjuntivo e muscular foi realizada de acordo com Mathieu
et a/. 28 Foram delimitadas aleatoriamente três áreas em cada
corte em aumento de 400 x, sendo computados os pontos
de intersecção de retas que incidiram sobre os tecidos
conjuntivos e muscular. Esses dados permitiram conhecer
a densidade relativa da área(%) do tecido conjuntivo e das
fibras do músculo sóleo.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Utilizou-se a análise de variância (ANOVA- teste F)
seguida do teste de Tukey-HSD. Os dados foram processados
no sistema SPSS versão 7.1. Em todos os cálculos foi
estabelecido 5% como nível de significância.
RESULTADOS
Área de Secção Transversa das Fibras Musculares
No grupo controle (C), a área média de secção transversa
das fibras do músculo sóleo foi de 1.035 f.1m 2 ± 21 O, enquanto
no grupo desnervado (D) foi de 375 f.1m 2 ± 65 e no grupo
desnervado + estimulação elétrica (DEE), de 600 f.1m 2 ± 126.
Observou-se atrofia nos dois grupos desnervados (p :S 0,05),
porém, menos expressiva no grupo DEE (Figura 1).
Densidade de Área do Tecido Conjuntivo e das
Fibras Musculares
A média da densidade relativa de área do tecido conjuntivo
no músculo sóleo dos animais do grupo C foi de 9,55% ± 2,62,
enquanto no grupo D foi de 34,49% ± 4,32 e no grupo DEE,
de 16,61% ± 3,68. Os grupos D e DEE apresentaram valores
maiores que o controle, sendo o valor do grupo DEE menor que
do grupo D (p :S 0,05). A média da densidade relativa de área
das fibras do músculo sóleo no grupo C foi de 90,43% ± 2,62;
no grupo D, de 65,49% ± 4,32 e no grupo DEE, de 83,37% ±
3,68. A diferença entre os grupos D e DEE foi estatisticamente
significativa (p :S 0,05) (Figura 2).
A Figura 3 mostra a distribuição do tecido conjuntivo
nos diferentes grupos experimentais, bem como sinais de
atrofia muscular decorrentes da desnervação.
1400
1200
~
E
2 1000
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Grupos
Figura 1. Área média de secção transversa (!1m 2 ) do músculo sóleo. Grupos controle (C), desnervado (D) e desnervado + estimulação elétrica
(DEE) (n = 6). (*) Difere significativamente (p ~ 0,05) do controle (C) e (#) difere significativamente (p ~ 0,05) do grupo DEE.
238
Fernandes, K. C. B. G. et ai.
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100
Rev. bras. fisioter.
Tecido conjuntivo
Fibras musculares
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30
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o
c
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DEE
Grupos
Figura 2. Média da densidade de área(%) de tecido conjuntivo e fibras musculares. Grupos controle (C), desnervado (D) e desnervado +estimulação
elétrica (DEE) (n = 6). (*) Difere significativamente (p::; 0,05) do controle (C). (#) Difere significativamente (p::; 0,05) do grupo DEE.
DISCUSSÃO
O tipo de lesão nervosa periférica é fator determinante
do tempo de instalação dos eventos degenerativos e
regenerativos no nervo. Em lesões por esmagamento há
preservação dos envoltórios do nervo e o processo de
regeneração e reinervação das fibras musculares é mais efetivo
,
,
apos
esmagamento que apos
secçao
nervosa. IS·
Lunn et al. 29 acreditam que, com o esmagamento, tanto
a microcirculação local como o perineuro permanecem
relativamente íntegros. Eles consideram que após a secção,
em razão do arranjo longitudinal dos vasos no nervo, boa
parte do segmento distai esteja desprovida de irrigação arterial.
Por outro lado, após esmagamento, provavelmente parte da
rede vascular perineural permaneça íntegra, favorecendo o
processo de reparação.
Gorio et af.3° estudaram a reinervação do músculo
extensor longo dos dedos em ratos após lesão por
esmagamento do nervo isquiático, e citam que passados I O
dias do esmagamento não se evidenciou nenhum axônio no
músculo e após 15 dias, 25% das fibras musculares foram
inervadas por mais que um axônio (poliinervação) e o número
de terminações poliinervadas aumentou com o tempo,
alcançando o máximo entre 21 e 25 dias, quando ocorreu
a recuperação da atividade mecânica do músculo, o que
fundamenta os protocolos de lesão e intervenção neste estudo.
Considerando que nos primeiros I O dias após o
·
- esta' ausen t e no museu
'
esmagamento a mervaçao
I o·' 0 e q u e
o estímulo aplicado neste estudo, 24 horas após o esmaga-
mento, provocou contração evidente pelo movimento de
flexão plantar, admite-se que a eletroestimulação atuou nas
fibras musculares desnervadas. Polacow et al., 14 utilizando
a mesma metodologia de eletroestimulação, observaram
aumento da concentração de glicogênio no músculo sóleo
desnervado, demonstrando que o estímulo elétrico atingiu
esse músculo.
Nos grupos desnervados, os resultados apontam diminuição das áreas de secção transversa do músculo sóleo,
determinando presença de atrofia muscular. A atrofia foi mais
intensa nos animais do grupo D, nos quais a área média de
secção transversa das fibras reduziu 63,77% em relação à média
do grupo C, enquanto no grupo DEE, a redução foi de 42,03%.
As medidas das áreas demonstram que a atividade
contrátil induzida pela estimulação elétrica reduziu
significativamente a atrofia, corroborando com os resultados
de Silva et al., 17 que observaram, após desnervação total do
nervo isquiático em ratos, diminuição no conteúdo de
glicogênio no músculo sóleo (52,9%) e que a estimulação
elétrica propiciou aumento na concentração de glicogênio nesse
músculo (87,5%). Esses autores discutem que o
restabelecimento das reservas de glicogênio melhora o padrão
energético das fibras, contribuindo para impedir o
desenvolvimento da atrofia. Nemeth 31 sugere que a estimulação
elétrica de músculos desnervados poderia prevenir a perda
de enzimas oxidativas e a conseqüente atrofia pós-desnervação.
Assim, o restabelecimento parcial da homeostasia de músculos
desnervados pode favorecer a integridade estrutural e funcional
das células musculares, minimizando a atrofia.
Yol. 9 No. 2, 2005
Estimulação Elétrica em Músculo Desnervado
239
..
Figura 3. Análise do tecido conjuntivo: fotomicrografia do músculo sóleo de ratos dos grupos controle (C), desnervado (D) e desnervado +
estimulação elétrica (DEE). Observar a quantidade de tecido conjuntivo (__..)e o tamanho das fibras musculares (*).Coloração: HE. Aumento:
400 X.
240
Fernandes, K. C. B. G. et al.
Eberstein & Eberstein 32 referem que a atividade
muscular é fator fundamental na regulação das propriedades
fisiológicas e bioquímicas das fibras musculares e que a
estimulação elétrica muscular pode ser um recurso clínico
importante para o tratamento de músculos desnervados,
podendo manter as propriedades dos músculos próximas ao
normal ou recuperá-las. Apontam também que os parâmetros
adequados de estimulação são fatores crítico para o sucesso
da intervenção, sendo os melhores resultados obtidos quando
o padrão de estimulação se assemelha ao padrão de disparo
do neurônio motor normal.
Assim, músculos de contração lenta desnervados
necessitam de estímulo contínuo de baixa freqüência,
conforme utilizado neste estudo. Em estudos com
eletroestimulação muscular devem ser considerados: tipo
de corrente, posicionamento dos eletrodos, nível de contração,
período de estimulação e intervalo de análise. Diante de lesão
nervosa, outros parâmetros devem ser considerados, como
o período entre a lesão e o início do tratamento e a duração
do processo de reinervação. Essas variáveis dificultam a
comparação entre resultados de diferentes pesquisas. Nesse
contexto, ressalta-se que no presente estudo foram provocadas
18.000 contrações/dia, sendo que a freqüência de I O Hz
produziu contrações musculares não-tetânicas. Dow et al. 33
investigaram a influência do número de contrações diárias
na manutenção da força e massa do músculo EDL desnervado
de ratos e observaram que a força não foi mantida com menos
de 200 ou mais de 800 contrações diárias e que a massa
muscular não foi mantida com menos de 50 contrações diárias.
Os resultados sugerem que protocolos adequados de
estimulação elétrica muscular aplicados por períodos
prolongados após desnervação podem minimizar problemas
clínicos associados à atrofia. Entretanto, os autores utilizaram
estimulação elétrica muscular tetânica crônica (24 h/dia),
com diferentes intervalos de repouso, e consideram que o
protocolo deve variar em função da composição das fibras
ou da arquitetura dos diferentes tipos de músculos, bem como
no mesmo músculo em diferentes espécies.
A desnervação também causa alterações no tecido
conjuntivo. Segundo Salonen et al., 10 a lesão do nervo
isquiático provoca aumento do turnover de colágeno nos
ligamentos, tendões e ossos do membro posterior de ratos,
ou seja, a lesão nervosa é seguida de alterações fibróticas
no músculo esquelético, envolvendo especialmente o
endomísio e o perimísio. Eles observaram que a desnervação
causou atrofia no músculo gastrocnêmio, seguida de aumento
de colágeno tipo I e III no endomísio e no perimísio, tendo
sido mais pronunciado o aumento do colágeno tipo I no
perimísio. Como o colágeno tipo I é considerado mais "rígido"
e se organiza em feixes e o colágeno tipo III tende a formar
uma rede reticular frouxa, o aumento mais expressivo do
colágeno tipo I poderia levar à perda da elasticidade,
prejudicando a função muscular em caso de reinervação.
Rev. bras. fisioter.
Considerando que a atrofia pós-desnervação é acompanhada de aumento do tecido conjuntivo (fibrose), 10•14 que pode
interferir na funcionalidade do músculo após reinervação, 15
analisou-se a densidade de área do tecido conjuntivo, que foi
significativamente menor no grupo eletroestimulado em relação
àquele que não sofreu eletroestimulação. Os resultados da
densidade de área das fibras musculares demonstram que
houve atrofia nos dois grupos desnervados, porém, foi
significativamente menor no grupo DEE, o que caracteriza
que a eletroestimulação aplicada atingiu o músculo sóleo
e influenciou seu trofismo. Polacow et al. 14 também utilizaram
ratos Wistar, porém, submetidos à secção total do nervo
isquiático. Um grupo de animais recebeu tratamento com
estimulação elétrica fásica de baixa freqüência ( 1O Hz; T
= 3 ms; 20 min./dia) sobre o músculo gastrocnêmio, durante
15 dias consecutivos. Na análise da média da densidade de
área das fibras do músculo sóleo, o grupo-controle teve 73,46
f.Lm ± 2,72, o grupo desnervado, 39,60 )lm ± 1,57 e o grupo
desnervado/estimulação elétrica, 44,73 f.!m ± 3,79. Essas
diferenças foram estatisticamente significativas e mostram
que, apesar de nos dois grupos desnervados a média de
densidade de área ter diminuído, o grupo submetido à
estimulação elétrica apresentou diminuição menos expressiva.
Nesse mesmo trabalho, um grupo de animais não foi
desnervado e recebeu estimulação elétrica. A densidade de
área nesse grupo foi de 75,86 j.!m ± 1,85, demonstrando que
a estimulação elétrica em músculo normal não promoveu
alterações.
Segundo Carter et al., 15 as alterações morfológicas
observadas nas fibras musculares após desnervação e
reinervação afetam o nível de recuperação da função. Assim,
minimizar a atrofia e a proliferação de tecido conjuntivo é
motivo de preocupação durante o processo de reabilitação,
propondo-se a utilização da estimulação elétrica.
Neste estudo, a estimulação elétrica fásica de baixa
freqüência do músculo sóleo desnervado de ratos Wistar
demonstrou ser efetiva, pois minimizou a atrofia muscular
e a proliferação de tecido conjuntivo. Esses resultados podem
refletir em condições musculares mais favoráveis à
recuperação funcional após reinervação.
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