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Bacteriologia - Prof. Cláudio
12/03/2015
Bases do diagnóstico bacteriológico
Prof. Cláudio Galuppo Diniz
Diagnóstico clínico
• Sinais (mensuráveis) e sintomas (subjetivos)
• Origem
• Etiologia
• Natureza
Diagnóstico laboratorial
• Identificação agentes envolvidos em patologias
• Suporte para o diagnóstico/tratamento clínico
• Investigação epidemiológica
• Investigação científica
1º Semestre de 2015
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Bacteriologia - Prof. Cláudio
12/03/2015
Microbiota indígena
Monomicrobiana
ORIGEM
ETIOLOGIA
Microbiota exógena
Polimicrobiana
Infecciosa
NATUREZA
Não-infecciosa
A utilidade do resultado liberado pelo laboratório de
microbiologia depende da qualidade da amostra recebida para
investigação.
A investigação baseia-se na construção de um estudo extremamente
cuidadoso para a identificação correta de determinada espécie ou linhagem
bacteriana.
Linhagem microbiana:
- Grupo de indivíduos, que de acordo com um sistema de identificação são
indistinguíveis e podem ser diferenciados de outros grupos/indivíduos de uma
mesma espécie em uma população.
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A comunicação entre o clínico e o microbiologista deve ser rápida e confiável.
Amostras clínicas
Amostras de origem
ambiental
Coleta de espécimes
Sinais e
sintomas
Secreções
Fluidos ou líquidos
corporais
Diagnóstico
clínico
presuntivo
Matéria orgânica (fezes)
Biópsia de tecidos
Espécimes
especiais
DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
Microscopia
Sorologia
Cultivo
Biologia
Molecular
• Aglutinação
• Fixação do
complemento
Provas
bioquímicas
Hibridização
Amplificação
Ac. nucléicos
• ELISA
Diagnóstico definitivo
Antibiograma
Tratamento
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DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DIRETO
Pesquisa da presença de agentes causais de processos infecciosos em espécimes clínicos.
Em termos gerais o diagnóstico direto pode ser feito de quatro formas diferentes:
• Cultivo de microrganismos em meio de cultura específicos;
• Visualização direta do patógeno por técnicas de microscopia;
• Detecção de antígenos específicos do patógeno. Estes métodos requerem a utilização de técnicas
imunológicas ou de biologia molecular;
• Detecção de seqüências de ácidos nucléicos do patógeno pela utilização de sondas ou amplificação
gênica;
A visualização e o cultivo são, em geral, as técnicas mais utilizadas para se realizar diagnóstico
microbiológico.
• São técnicas mais simples;
• Requerem menor infraestrutura;
• Tem menor custo.
O diagnóstico microbiológico por cultivo dos microrganismos permite a recuperação do agente etiológico e
sua utilização futura para estudos científicos
• Epidemiológicos;
• Susceptibilidade a drogas.
Alguns microrganismos não podem ser visualizados ao microscópio óptico e outros não
crescem em meios de cultivo.
Neste caso, devemos nos ater aos métodos moleculares de diagnóstico ou às técnicas de diagnóstico
indireto.
• As técnicas moleculares oferecem uma capacidade de discriminação muito maior além de seus
resultados representarem dados mais precisos, apesar da necessidade de técnicos especializados.
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A detecção de antígenos e de ácidos nucléicos não permite recuperar células microbianas.
• Estas técnicas são mais eficientes na pesquisa de agentes não cultiváveis ou em concentrações muito
baixas nos espécimes clínicos.
Outra vantagem destas técnicas é sua rapidez.
• Apresentam um tempo de resposta muito menor do que as técnicas de cultivo porque não dependem
do crescimento in vitro do patógeno.
DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO INDIRETO
É possível diagnosticar uma infecção estudando-se o sistema imunológico do paciente pela pesquisa de
anticorpos formados pela resposta imune específica.
• A pesquisa de anticorpos dirigidos a antígenos específicos de um dado microrganismo possibilita o
diagnóstico de infecções crônicas ou agudas.
Toda informação proveniente do serviço de microbiologia depende da qualidade do espécime.
O diagnóstico incorreto pode ter conseqüências diretas no curso do tratamento adequado aos pacientes.
Colheita incorreta, escassez, contaminação ou transporte deficiente - pode resultar em falhas na
recuperação de patógenos predominantes ou responsáveis pelo processo infeccioso.
OBSERVAÇÕES IMPORTANTES PARA O DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO:
• Preparo do paciente
• Seleção de sítio anatômico e natureza do espécime clínico
• Momento da coleta
• Amostragem do espécime – número e quantidade
• Técnica de coleta: punção, swab, eliminação espontânea, aspirados, fragmentos de biópsia, etc
• Natureza do equipo de coleta e controle de população microbiana
• Armazenamento e transporte do material coletado
• Antibioticoterapia
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Procedimentos adequados de coleta devem ser adotados para evitar o isolamento de um
"falso" agente etiológico, resultando numa orientação terapêutica inadequada
Colher antes da antibioticoterapia, sempre que possível;
Instruir claramente o paciente sobre o procedimento;
Observar a anti-sepsia na coleta de todos os materiais clínicos;
Colher do local onde o microrganismo suspeito tenha maior probabilidade de ser isolado;
Considerar o estágio da doença na escolha do material. Patógenos entéricos, causadores
de diarréia, estão presentes em maior quantidade e são mais facilmente isolados durante a
fase aguda ou diarréica do processo infeccioso intestinal.
Quantidade adequada de material deve ser coletada para permitir uma completa análise
microbiológica;
O pedido do exame deve conter dados como idade, doença de base e indicação do uso de
antibióticos.
CRITÉRIOS PARA AVALIAÇÃO DE SISTEMAS DE INVESTIGAÇÃO
Aplicabilidade: possibilidade de resultado positivo, nulo ou
indistinguível entre diferentes amostras
Reprodutibilidade: fatores técnicos e biológicos.
Poder discriminatório: capacidade de discriminação entre as
linhagens.
Facilidade de execução: infra-estrutura pessoal e material.
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As técnicas clássicas de identificação microbiana são baseadas na presença ou
ausência de determinantes fisiológicos como peculiaridades metabólicas ou
estruturais.
Biotipagem (isolamento e identificação);
Susceptibilidade a drogas antimicrobianas;
Sorologia;
Fagotipagem;
Tipagem por bacteriocinas;
Perfil eletroforérico de proteínas celulares e Immunoblotting;
Eletroforese multi-enzimática (MLEE – multilocus enzime electrophoresis)
Pesquisa de Reações de Hipersensibilidade Tardia
As técnicas clássicas de identificação microbiana são baseadas na presença ou
ausência de determinantes fisiológicos como peculiaridades metabólicas ou
estruturais.
Biotipagem (isolamento e identificação);
Susceptibilidade a drogas antimicrobianas;
Sorologia;
Fagotipagem;
Tipagem por bacteriocinas;
Perfil eletroforérico de proteínas celulares e Immunoblotting;
Eletroforese multi-enzimática (MLEE – multilocus enzime electrophoresis)
Pesquisa de Reações de Hipersensibilidade Tardia
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BIOTIPAGEM
Também utilizado para taxonomia bacteriana – manual e automatizada.
Princípio: o perfil de atividades metabólicas expressado por uma dada amostra
bacteriana que inclui características como:
Morfologia colonial e celular;
Reações bioquímicas
Tolerância ambiental (meios seletivos, atmosfera, pH, temperatura, salinidade)
Desvantagens: mutações ou mesmo condição fisiológica sob diferentes condições de
estresse podem trazer resultados errôneos de tipagem e identificação.
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SUSCEPTIBILIDADE A DROGAS ANTIMICROBIANAS
- Muito utilizado nos centros de saúde para monitoramento dos níveis de resistência.
- Alteração nos padrões susceptibilidade a drogas antimicrobianas pode ser indicativo da
ocorrência de novas linhagens na comunidade e seu isolamento de vários pacientes pode
ser considerado como primeiro indicativo de um surto.
Princípio:
Avaliação do perfil de susceptibilidade a drogas clinicamente importantes.
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SUSCEPTIBILIDADE A DROGAS ANTIMICROBIANAS
Desvantagens:
A ausência da pressão seletiva dos antimicrobianos pode resultar em perda dos
marcadores de resistência;
Os mecanismos de recombinação genética bacteriana permitem a troca de
marcadores de resistência em diferentes circunstâncias, o que dificulta a determinação
de marcadores epidemiológicos.
Resistência cruzada a diferentes drogas antimicrobianas leva a uma identificação
equivocada dos marcadores epidemiológicos.
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SOROLOGIA
- Este método tem sido largamente utilizado na identificação microbiana, sendo uma das
ferramentas clássicas para os estudos epidemiológicos.
Princípio: baseados na observação de que microrganismos de mesma espécie podem
expressar diferentes determinantes antigênicos na superfície. Variadas estruturas da
superfície apresentam propriedades antigênicas, como:
Lipopolissacarídeo (LPS);
Polissacarídeo capsular;
Proteínas de membrana;
Organelas extracelulares (flagelos e fímbrias)
A determinação isolada de anticorpos específicos oferece pouca informação porque qualquer contato
com antígenos vai desencadear sua produção.
Para se estabelecer um diagnóstico sorológico confiável é necessário comparar-se a quantidade de
anticorpos em períodos distintos do processo infeccioso
Como outros métodos, a sorologia está sujeita a erros
• Em alguns casos a presença de anticorpos circulantes indica que certa pessoa esteve em contato com um
agente infeccioso e não, necessariamente, apresenta uma doença.
• Janela imunológica - causa freqüente de falsos negativos: período compreendido entre o contato com o
agente infeccioso, seu reconhecimento pelo sistema imunológico e a produção de anticorpos específicos.
• Reações cruzadas podem ser a causa de falsos positivos.
- Estruturas antigênicas semelhantes podem favorecer o reconhecimento inespecífico de antígenos.
• Imunossupressão pode induzir uma queda ou inibição da resposta imune específica impedindo a detecção
de anticorpos mesmo durante uma doença infecciosa.
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SOROLOGIA
-Várias são as técnicas disponíveis para os ensaios sorológicos, como:
Reações antígeno-anticorpo;
Soroaglutinação;
Aglutinação de partículas;
Neutralização
Marcação enzimática;
Fluorescência;
Aplicação de anticorpos monoclonais, etc
.
Desvantagens:
- Técnicas sorológicas exigem um grande controle de qualidade nos reagentes desde sua
pureza e as soluções preparadas.
- Considerando-se células bacterianas, estas técnicas podem apresentar um baixo poder
discriminatório devido à diversidade de determinantes antigênicos em uma mesma
população bacteriana.
Aplicabilidade de técnicas moleculares no
diagnóstico microbiológico
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Técnicas de diagnóstico molecular, geralmente caras, não devem ser usadas
no lugar de técnicas convencionais que são reconhecidamente rápidas,
sensíveis, reprodutíveis e que possuem um alta relação custo benefício.
• A decisão por um diagnóstico molecular deve levar em consideração
principalmente o impacto da nova técnica na prática clínica e a economia de
gastos associados à intervenção e para o paciente.
• A detecção rápida de bactérias multirresistente pode resultar em um
isolamento mais rápido do paciente, terapia mais apropriada e diminuição da
infecciosidade do paciente.
Contenção do
espalhamento da
infecção
+
diminuição do
tempo de
morbidade do
paciente
=
custo-benefício da
utilização de técnicas
moleculares para
diagnóstico
• Apesar de toda rapidez e sensibilidade, o diagnóstico molecular não pode
substituir os métodos culturais e sorológicos convencionais em todos os
momentos.
• Os resultados do diagnóstico molecular e dos métodos culturais e sorológicos
têm significado diferente.
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A detecção ou amplificação de ácidos nucléicos
determinam se existe DNA ou RNA de um organismo
particular em uma amostra biológica
• Não revela dados sobre a viabilidade do organismo
• Não diz se um microrganismo está envolvido em um processo
infeccioso
• Permite avaliar a clonalidade dos diferentes organismos e
permite avaliação de surtos e geração de conhecimento
epidemiológico
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