Produção de Estoques de Vírus, Vírus Semente e Vírus de

PRODUÇÃO DE ESTOQUES DE VÍRUS, VÍRUS SEMENTE E VÍRUS DE
TRABALHO.
01- Preparo de estoques de vírus
Objetivos:
• Armazenar amostras de vírus no laboratório;
• Preservar amostras de vírus.
Material:
• Fluxo laminar
• Álcool 70%
• Amostra de vírus
• Pipetadores
• Ponteiras estéreis
• Microtubos
• Etiquetas
• Desprezador com hipoclorito de sódio (10%)
• Freezer -70 oC ou botijão de nitrogênio líquido
Procedimento:
• Congelar o vírus quando o ECP estiver evidente em 90 a 100 % da
garrafa (amostras de vírus não citopáticos são geralmente incubadas por
3 a 5 dias e então congeladas).
Importante!!!! ANTES do descongelamento, anotar os dados constantes
na etiqueta de identificação do vírus.
• Descongelar o vírus rapidamente, em água corrente ou no banho-Maria.
Em alguns casos o descongelamento/descongelamento pode ser
repetido três vezes;
*Isto não é recomendado para vírus envelopados, pois sucessivos
congelamentos/descongelamentos podem levar à redução de
infectividade.
• Antes de abrir o tubo com vírus, mergulhá-lo em álcool 70 oGL para
diminuir a contaminação por fora do frasco.
• Centrifugar o meio contendo vírus por 5 minutos a 1500 x g para
sedimentar os restos celulares.
• Aliquotar (ou seja, separar em volumes menores) de aproximadamente
300 ml, em tubos de congelamento.
• IDENTIFICAR cada alíquota com o nome da amostra, número da
passagem e tipo de célula, data e nome de quem produziu o estoque>
P. ex.:
EVI 123------------------------Nome da amostra
3 MDBK-----------------------Terceira passagem em células MDBK
11/04/2005-------------------Data
Helena-------------------------Nome de quem trabalhou com a amostra
OBS: É importante armazenar a amostra em diferentes locais (p.ex.
freezer -70 oC e no Nitrogênio líquido; preferencialmente, em mais de
um laboratório), para que se houver alguma pane a amostra de vírus
não seja perdida completamente.
2. Produção de vírus semente (para estoque de vírus)
• Primeiramente, preparar etiquetas e colar nas ampolas a
identificação do vírus (nome, origem, número de passagens em
qual tipo de célula, data, operador).
Ex.: BoHV-1 Cooper (CPFA); 12 MDBK 1 TT; 12/03/2007; Roehe
• Semear (infectar uma garrafa de célula), com um volume
usualmente ente 300 a 500 microlitros de uma semente original
do vírus que se deseja preparar.
• Adsorver por uma a duas horas, trocar o meio, incubar, coletar
quando o efeito citopático estiver cerca de 100 %; aliquotar e
armazenar a -70 oC (vide procedimento para isolamento viral).
• Descongelar uma das ampolas e titular – se o título estiver
razoável, preservar (mínimo 10 a 20 ampolas).
• Estocar em N2 líquido ou a -70 oC.
•
3. Produção de vírus de trabalho :
• O vírus trabalho terá uma passagem a mais do que o vírus
semente. Sempre que quisermos fazer vírus para a produção de
antígenos (para testes de ELISA ou outros procedimentos),
devemos usar uma ampola de vírus trabalho; assim evitamos
seguir fazendo inúmeras passagens com o vírus original, evitando
que o mesmo se altere por um número muito grande de
passagens in vitro.
• A partir de uma ampola de vírus semente – semear, coletar e
armazenar (- 70°) (mínimo de 20 a 50 ampolas). O pro cedimento
é o mesmo que para o preparo de semente. Titular o vírus
trabalho como acima.
• Quando for preparar qualquer outro antígeno com este vírus, usar
uma ampola de vírus trabalho.
Revisado por PMR em 12/03/2007