Método de determinação do teor G+C

TEÓRICA 10
DOCENTES:
Prof. Helena Galvão
(responsável – componente teórico)
Prof. Margarida Reis
(componente prático)
TAXONOMIA BACTERIANA – Conceitos e Definições
 Conceito de espécie bacteriana é complexo. Para organismos multicelulares com



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reprodução sexuada a definição é “uma população de indivíduos que é livre de se
inter-cruzar aleatóriamente”.
Mas como a maioria de microrganismos reproduz-se apenas assexuadamente, é
necessário estabelecer outra definição.
Definição de espécie bacteriana: conjunto de estirpes que exibem um grau
elevado de semelhança fenótipica e que se distinguem de outras estirpes em
relação a muitos caracteres independentes.
Para aplicar este conceito de espécie foi necessário desenvolver uma análise
numérica ou taxonomia numérica, que foi desenvolvida no século XIX por
Adanson e que calcula coeficientes de semelhança entre microrganismos.
Mais tarde esta taxonomia foi aplicada a caracteres genotípicos, nomeadamente o
sequenciamento de bases do 16S ARNr e de outros oligonucleótidos.
Taxonomia Numérica
Determinação de coeficientes de
semelhança
Quantos géneros
e espécies estão
determinados ?
Dendrograma representando relações entre 10
estirpes bacterianas. Linhas tracejadas indicam
possíveis níveis para determinar géneros (65%)
e espécies (85%).
Caracterização genótipica – Teor G+C do ADN, hibridação &
sequenciamento de bases de oligonucleótidos
 Composição de bases do ADN : Adenina – Timina com dupla ligação H
Guanina – Citosina com tripla ligação H
 Proporção molar G+C = Teor GC (%)
G+C+A+T
Comparação de espectros
de variação no teor GC
entre grupos de
organismos.
N.B. Eubactérias e
arquiobactérias exibem
maior espectro de variação
na composição do ADN ou
heterogeneidade genética,
vertebrados têm maior
homogeneidade.
Método de determinação do teor G+C
Temperatura de fusão (Tm) do ADN (setas):
ponto onde 50% de ligações H quebradas
Relação linear entre Tm e
teor G+C. N.B. Quanto mais
rico em G & C fôr o ADN,
mais termodinâmicamente
estável é, devido a triplas
ligações entre G & C.
Relação linear entre densidade
do ADN (determinada por
ultra-centrifugação) e teor G+C.
N.B. Diferença maior entre 2
espécies Gram (+) do que entre
a galinha e o homem (?!).
Variação natural do teor G+C no mesmo género entre familías
Teor G+C varia em espécies
do género Pseudomonas de
62 a 70 %, o que constitui
intervalo de variação
relativamente grande.
Teor G+C varia em géneros
diferentes de famílias de
bactérias deslizantes e de
cocos Gram (+) bastante (30
– 40%), demonstrando
heterogeneidade genética
existente nestes grupos
taxonómicos.
HIBRIDAÇÃO ADN –ADN & ADN-ARNr
ADN extraído de 2 estirpes diferentes de Pseudomonas aeruginosa é aquecido até
desnaturação completa do ADN (desemparalhamento de filamentos); depois extractos são
arrefecido e misturados para promover re-associação de filamentos. N.B. A quantidade de
filamentos pares híbridos formada é proporcional à homologia no sequenciamento de bases.
N.B. Autohibridação como
medida de
referência.
Hibridação ADNADN com valores
inferiores a ADNARNr porque
sequência de
bases mais
conservada no
ARNr (função
activa)
Sequenciamento do 16S ARNr
Coeficentes de semelhança Sj:
< entre grupos de organismos
(domínios de Woese)
> no mesmo domínio
N.B. Sequenciamento de oligonucleótidos (16S
ARNr, 5S ARNr, ARNt) mais rápido; fragmentos
são digeridos com endonucleasee específica,
separados e sequenciados num sequenciador
automático. Análise de homologia nas
sequências alignadas de 6 nucleótidos por
computador para calcular coeficientes
desemelhança.
Dendrograma do grupo Gram (+) obtido por homologias no 16S ARNr
Sub-grupo dos
Actinomicetos
com teor G+C
elevado
N.B. Género Clostridium
aparece em agrupamentos
diferentes com coeficientes Sj
baixos (< 0.4) demonstrando
hetero-geneidade genética
elevada
Sub-grupo com
teor G+C baixo
Sequenciamento do 16S ARNr e novos métodos de identificação
 “Fingerprinting”: método mais rápido de sequenciamento usando
transcriptase inversa viral que produz sequências de ADN
complementares ao ARNr. Desta forma, sequências completas do 16S
ARNr já foram obtidas para centenas de bactérias (< 500) elaborando
catálogos genéticos.
 Sondas moleculares: segmentos curtos (14 a 40 bases) complementares
ao ADN ou ARN são produzidos com endonucleases restritivas, são
associadas a etiquetas fluorescentes/luminescentes ou radioactivas por
reações químicas. Estas sondas depois ligam-se a sequências específicas
do ácido nucleico alvo para identicação rápida (ex: bactérias patogénicas
ou tóxicas em populações mistas de microrganismos).
 Métodos imunológicos usando anticorpos fluorescentes foram aplicados
para enumerar espécies bacterianas (ex: bactérias nitrificantes) em
amostras de água do mar.
Filogenia procariótica usando sondas moleculares
Sondas moleculares
identificam grupos
hierarquicos diferentes
(domínios Archaea &
Eubactéria; grupo Gram (+);
sub-grupo com teor G+C
alto; sub-grupo Cytophaga Flavobacterium &
Bacteroides; sub-divisões de
proteobactérias)