ocorrência, severidade e interação de vírus em plantas
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI MESTRADO EM PRODUÇÃO VEGETAL OCORRÊNCIA, SEVERIDADE E INTERAÇÃO DE VÍRUS EM PLANTAS DANINHAS ASSOCIADAS À CULTURA DA MELANCIA MARIELLE PERES EVANGELISTA 2012 UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI MESTRADO EM PRODUÇÃO VEGETAL MARIELLE PERES EVANGELISTA Engenheira Agrônoma OCORRÊNCIA, SEVERIDADE E INTERAÇÃO DE VÍRUS EM PLANTAS DANINHAS ASSOCIADAS À CULTURA DA MELANCIA Dissertação apresentada à Universidade Federal do Tocantins como parte das exigências do curso de Mestrado em Produção Vegetal, para obtenção do título de “Mestre”. Orientador: Profº Dr. Raimundo Wagner de Sousa Aguiar GURUPI TOCANTINS Dissertação de Mestrado realizada junto ao Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal da Universidade Federal do Tocantins sob orientação do professor e pesquisador Dr. Raimundo Wagner de Sousa Aguiar. Apoio financeiro da CAPES. Aprovado por: _________________________________________________ Dr. Raimundo Wagner de Souza Aguiar (Orientador) Universidade Federal do Tocantins (UFT) ____________________________________________________ Dr. Manoel Mota dos Santos Universidade Federal do Tocantins (UFT) ____________________________________________________ Dr. Helio Bandeira Barros Universidade Federal do Tocantins (UFT) ____________________________________________________ Dr. Marcelo Rodrigues dos Reis Universidade Federal de Viçosa (UFV) ____________________________________________________ Dr. Fernanda de Sousa Bernardes Universidade Federal do Tocantins (UFT) GURUPI FEVEREIRO DE 2012 “Ouço e esqueço Vejo e recordo Faço e compreendo” Confúcio (551-479 a.C.) À minha princesinha Ana Gabrielle. Aos meus pais, Bonifacio e Clecy. Às minhas irmãs Mariane e Maraiza. À minha sobrinha Laurinha. Pelo amor, carinho e por serem meu porto seguro sempre que precisei. DEDICO. AGRADEÇO... A Deus, Pai celeste, que me deu a vida, me guia por caminhos retilíneos e me mostra que acima da falsidade dos desencantos e mesquinhez o mundo ainda é bonito. Aos meus pais Bonifacio Pereira Evangelista e Clecy Peres Evangelista, pelo incentivo, compreensão e seu amor incondicional, pelas orações a mim dedicadas, pelas noites de sono perdidas ao encontro de formulas eficientes de colaboração; pelo ensinamento e valores transmitidos durante toda a minha vida; À minha filha Ana Gabrielle por suportar os momentos de ausência, para que esse sonho se tornasse realidade; Às minhas irmãs Mariane e Maraiza, pelo carinho e pelo apoio nas horas necessárias; À minha avó Maria Peres pelo carinho de sempre e orações; Ao Programa de Pós Graduação da Universidade Federal do Tocantins pela oportunidade de realização deste trabalho e estrutura oferecida para realização das pesquisas; À CAPES, pela concessão da bolsa de estudos; Ao Profº Dr. Raimundo Wagner Aguiar, pela orientação, paciência, ensinamentos e “puxões de orelha”. Esses requisitos foram essenciais para o desenvolvimento do presente trabalho. Aos funcionários Douglas e Suetônio e todos os estagiários do laboratório de Entomologia pelo apoio na realização dos experimentos; Às minhas amigas Maíra, Ana Paula, Aline Torquato, Thaynã e Ariadila pelos momentos de companheirismo, ajuda, paciência e descontração; A mim mesma pelo esforço, dedicação e força de vontade durante esses dois anos de trabalho. A todos aqueles que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho. ÍNDICE GERAL RESUMO................................................................................................................. ABSTRACT............................................................................................................. INTRODUÇÃO GERAL........................................................................................ 01 CAPITULO I - REVISÃO BIBLIOGRAFICA.................................................. 1. Aspectos Gerais da Cultura da Melancia..................................................... 2. Principais vírus de ocorrência no Brasil....................................................... 2.1 Aspectos Gerais do Gênero Potyvirus.................................................... 2.2 Aspectos Gerais do Gênero Cucumovirus.............................................. 2.3 Aspectos gerais do gênero Tospovirus................................................... 3. Plantas Hospedeiras..................................................................................... 4. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS......................................................... 03 03 04 04 09 10 12 14 CAPITULO II - PROSPECÇÃO DE PLANTAS DANINHAS HOSPEDEIRAS DE VÍRUS ASSOCIADA À CULTURA DE 23 MELANCIA............................................................................................................ RESUMO................................................................................................................. 23 ABSTRACT............................................................................................................. 24 1. INTRODUÇÃO.......................................................................................... 25 2. MATERIAL E METODOS.......................................................................... 26 2.1 Levantamento das plantas daninhas hospedeiras de vírus........... 26 2.2 Identificação sorológica dos isolados.......................................... 26 2.3 Testes em plantas indicadoras..................................................... 27 2.4 Avaliações sintomatológicas....................................................... 27 2.5 Analise estatística........................................................................ 28 3. 4. 5. 6. RESULTADOS............................................................................................ DISCUSSÃO................................................................................................ CONCLUSÃO.............................................................................................. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS........................................................ 28 36 39 40 CAPITULO III - EFEITO DE PERIODOS DE INFECÇÃO E SUSCEPTIBILIDADE DE MELANCIA A VÍRUS............................................ 44 RESUMO............................................................................................... 44 ABSTRACT........................................................................................... 45 1. INTRODUÇÃO............................................................................................ 46 2. MATERIAL E METODOS.......................................................................... 47 2.1 Estirpes de vírus............................................................................. 47 2.2 Plantio e variedade de Melancia..................................................... 47 2.3 Inoculação dos vírus....................................................................... 2.4 Identificação sorológica................................................................. 48 48 3. 4. 5. 6. 2.5 Delineamento Experimental........................................................... 2.5.1 Avaliação da clorofila total..................................................... 48 49 2.5.2 Características físicas.............................................................. 49 2.5.3 Características físico-químicas................................................. 49 2.6 Análise estatística.............................................................................. 50 RESULTADOS............................................................................................ DISCUSSÃO................................................................................................ CONCLUSÃO.............................................................................................. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................ 50 57 60 61 ÍNDICE DE TABELAS CAPÍTULO I – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................... 01 CAPÍTULO II - PROSPECÇÃO DE PLANTAS DANINHAS HOSPEDEIRAS DE VÍRUS ASSOCIADA À CULTURA DE MELANCIA............................................................................................................ 23 TABELA 1: Plantas daninhas hospedeiras coletadas em lavouras comerciais de melancia no estado do Tocantins, e números de reações positivas por plantas, pelo teste de Dot-ELISA, com antissoro específico para os vírus PRSV-W, CMV, WMV, ZYMV e ZLCV na safra de melancia 2010/10 e 2011/11..................................................................................................................... 30 TABELA 2: Plantas daninhas hospedeiras coletadas em lavouras comerciais de melancia por município no estado do Tocantins, e números de amostras por região do total de amostras obtidas na safra de melancia 2010/10 e 2011/11...................................................................................................................... 31 TABELA 3: Plantas teste apresentando sintomatologia para os vírus PRSV-W, CMV, ZYMV e WMV e detecção por Dot-ELISA................................................ 35 CAPÍTULO III - EFEITO DE PERIODOS DE INFECÇÃO E SUSCEPTIBILIDADE DE MELANCIA A VÍRUS............................................ 44 TABELA 1: Confirmação de infecção dos vírus PRSV-W, CMV, ZYMV e WMV em ensaios de Dot-ELISA............................................................................ 50 TABELA 2: Avaliação da biomassa e do teor de clorofila total produzidas por plantas infectadas com PRSV-W, CMV, ZYMV e WMV em função de três período de inoculação.............................................................................................. 52 TABELA 3: Avaliação das características dos frutos produzidos por plantas infectadas com PRSV-W, CMV, ZYMV e WMV em função do período de três 54 períodos de inoculação............................................................................................ ÍNDICE DE FIGURAS CAPÍTULO I – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................. 01 FIGURA 1: Esquema do genoma dos potyvirus. Barra azul representa as 10 proteínas funcionais resultantes do processo de clivagem da poliproteína. A barra vermelha representa a região PIPO recentemente descoberta................................... 05 FIGURA 2: Micrografia de luz mostrando a cabeça do pulgão e uma folha. A pulgão projeta estilete vindo da proboscite. B - penetração intracelular através do mesofilo da folha. C - Entrada do vírus nos feixes vasculares.................................. 06 FIGURA 3: Modelo de possível interação entre HC-Pro, o estilete do pulgão e a proteína do Potyvirus. A: Modelo mostrando associação entre duas moléculas de HC-Pro. Note que uma molécula de HC-Pro esta ligada a um “receptor” sobre o estilete, enquanto a segunda é ligada a subunidade da capa protéica. B: Modelo mostrando que um dímero é necessário para se ligar ao “receptor” do estilete. Ambas as moléculas de HC-Pro estão ligadas a proteínas de subunidades de revestimento............................................................................................................... 07 FIGURA 4: Esquema representativo da direção e da taxa de translocação de um vírus em uma planta................................................................................................... 10 FIGURA 5: Organização do genoma de Tospovirus. As linhas representam a única fita de RNA (-) e as caixas regiões codificadas com os produtos finais identificados e as setas indicam o C-terminal........................................................... 11 CAPÍTULO II - PROSPECÇÃO DE PLANTAS DANINHAS HOSPEDEIRAS DE VÍRUS ASSOCIADA À CULTURA DE MELANCIA............................................................................................................ 23 FIGURA 1: Exemplo da reação sorológica por Dot-ELISA para PRSV-W, WMV, CMV, ZYMV e ZLCV, controle negativo (verde), controle positivo (roxo) e amostra de planta daninha apresentando roxeamento para todos os vírus analisados................................................................................................................... 28 FIGURA 2: Identificação dos vírus PRSV-W, WMV, CMV, ZYMV e ZLCV em plantas daninhas e plantas de melancia coletada em lavouras comerciais dos municípios de Lagoa da Confusão, Formoso do Araguaia do estado Tocantins. Sendo A: % de plantas daninhas reação positiva para PRSV-W, WMV, CMV, ZYMV e ZLCV e B: % de plantas de melancia coletadas com reação positiva para os vírus PRSV-W, WMV, CMV, ZYMV e ZLCV........................................... 32 FIGURA 3: Sintomas e efeitos citopatológicos causados por inóculos dos vírus PRSV-W, WMV, CMV, ZYMV e ZLCV. A: Tabaco samsun com mosaico. B: Luffa acutangula com bolhosidade, mosaico e deformação foliar. C: Lagenaria vulgaris com mosaico, deformação foliar e bolhosidade e D: Physalis Angulata com mosaico e bolhosidade. E: Nicandra physaloides. F: Physalis angulata....... 34 CAPÍTULO III - EFEITO DE PERIODOS DE INFECÇÃO E SUSCEPTIBILIDADE DE MELANCIA A VÍRUS............................................. 44 FIGURA 1: Escala de notas atribuida aos frutos de melancia infectados com PRSV-W, CMV, WMV e ZYMV para A: Coloração de polpa e B: Formato de fruto.......................................................................................................................... 55 FIGURA 2: Característica dos sintomas e frutos de planta melancia infectada com PRSV-w, ZYMV, CMV e WMV em três períodos de inoculação. Sendo A, B e C: Sintomas de PRSV-w com inoculações realizadas 5 DAE; D, E e F: Sintomas de ZYMV com inoculações realizadas 5 DAE; G, H e I: Sintomas de CMV inoculadas 5 DAE; J, K e L: Sintomas de WMV inoculados com 5 DAE... 56 RESUMO A produção de melancia Citrullus lanatus é influenciada negativamente pelas ocorrências de vírus. As plantas daninhas associadas à cultura pode funcionar como reservatório constante de inóculo dos vírus, dessa forma pode ocorrer infecção nos primeiros dias após emergência das plântulas. Desta forma, objetivou-se neste trabalho identificar as possíveis plantas daninhas hospedeiras de PRSV-W, CMV, ZYMV, WMV e ZLCV e análise da severidade em diferentes períodos de inoculação em plantas de melancia. As plantas daninhas foram coletadas e identificadas e os vírus por meio do teste de Dot- ELISA. Entre as plantas analisadas observou-se Amaranthus spinosus, Nicandra physaloides, Physalis angulata e Heliotropium indicum tiveram reação positiva para todos os vírus estudados. Sendo o ZYMV predominante em amostras das plantas de A. spinosus, N. physaloides e P. angulata com 23%, 13%,8% e 8%,85%, respectivamente. Teste com inóculos obtidos das plantas daninhas, em plantas indicadoras, desenvolveram sintomas característicos dos vírus analisados. Desse modo, as plantas daninhas apresentam grande potencial como fonte de inóculo de vírus para plantas de melancia. Ao mesmo tempo observou-se a severidade dos vírus PRSV-W, CMV, ZYMV e WMV em diferentes períodos de inoculação (5, 12 e 19 dias após emergência). Todos os vírus influenciaram drasticamente na redução do teor clorofila total. Enquanto, as características de fruto como pH e firmeza da polpa dos frutos pouco foi influenciado pelas infecções virais. De uma maneira geral, os vírus influenciaram negativamente no peso dos frutos, independentemente do período de inoculação. Conclui-se que infecções virais com PRSV-W, CMV, ZYMV e WMV são severas ao desenvolvimento das plantas e na qualidade dos frutos de melancia infectadas, independentemente da fase de inoculação das estirpes virais. ABSTRACT The production of watermelon Citrullus lanatus is influenced negatively by the virus occurrences. Weeds associated with culture can function as constant reservoir of inoculum of virus, so infection can occur in the first days after seedling emergence. Thus, this study aimed to identify potential weed hosts of PRSV-W, CMV, ZYMV, WMV and ZLCV analysis of severity and at different periods of inoculation on watermelon plants. The weeds were collected and identified and viruses through the Dot-ELISA. Among the plants examined was observed Amaranthus spinosus, Nicandra physaloides, Physalis angulata and Heliotropium indicumhad positive reaction for all viruses studied. As the ZYMV predominant in samples from plants of A. spinosus, N. physaloides and P. angulata 23%, 13%, 8% and 8%, 85%, respectively. Test inocula obtained with weed host plants, developed symptoms characteristic of viruses analyzed. Thus, the weeds have great potential as a source of virus inoculum for watermelon plants. At the same time observed the severity of PRSV-W virus, CMV, ZYMV and WMV in different periods of inoculation (5, 12 and 19 days after emergence). All viruses influenced drastically reducing the total chlorophyll content. While fruit characteristics such as pH and firmness of fruit was little influenced by viral infections. In general, the viruses were negatively influenced by the weight of the fruit regardless of inoculation period. We conclude that viral infections with PRSVW, CMV, ZYMV and WMV are severe for plant development and fruit quality of watermelon infected, regardless of the stage of inoculation of virus strains. 1 INTRODUÇÃO GERAL O consumo de frutas e hortaliças tem crescido de forma bastante significativa nos últimos anos, necessitando de acréscimo na produção para sustentar o mercado consumidor. O aumento da produção está associado aos sistemas de cultivos de frutas, exigindo tecnologias mais apropriadas de cultivo. Atualmente o mercado de hortaliças em cadeia nacional tem como destaque a produção de melancia, onde vários estados brasileiros que vem se firmando como produtores, principalmente pelas características nutricionais e grande aceitação pelo mercado consumidor. A melancia [Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. & Nakai] é a espécie de cucurbitáceas mais cultivadas em diversos pais do mundo, com significativa produção de 99,1 milhões de toneladas de frutos e produtividade média de 26,4 t/ha. A China, Turquia, Irã e Brasil são os países de maiores produções mundiais (FAO, 2010). No Brasil, o cultivo da melancia é praticado em vários estados brasileiros, com destaque para os Estados do Rio Grande do Sul, São Paulo, Bahia, Rio Grande do Norte e Tocantins, que contribuem juntos com cerca de 60% da produção nacional (AGRIANUAL, 2007). Um dos fatores limitantes para produção de melancia esta associado doenças viróticas que ocasionam severas perdas na produção de frutos, e influenciam negativamente no desenvolvimento da planta. Dentre os diferentes gêneros de vírus que infectam essas espécies cultivadas, se destacam as espécies do gênero Potyvirus por serem considerados fatores limitantes nas principais regiões produtoras do Brasil. De acordo com as condições ambientais e os cuidados dispensados a cultura, as viroses podem causar perdas de 100% da produção. (LIMA et al., 2002; OLIVEIRA, 2000; RAMOS, 2002). Entre os tipos de vírus predominantes nas regiões produtora de melancia no Brasil tem como destaque vírus da mancha anelar do mamoeiro (Papaya ringspot virus, PRSV); vírus do mosaico da melancia (Watermelon mosaic virus, WMV), vírus do mosaico amarelo da abobrinha-de-moita (Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV); família Bromoviridae, gênero Cucumovirus vírus do mosaico do pepino (Cucumber mosaic virus, CMV), e Família Bunyaviridae, gênero Tospovirus: Zucchini lethal chlorosis vírus – ZLCV (OLIVEIRA, 2000; OLIVEIRA et al., 2002; MOURA et al., 1 2001; LIMA et al., 2002; RAMOS, 2002). As plantas infectadas podem apresentar mosaico, redução do limbo foliar, deformação nas folhas e frutos, podendo os sintomas variarem conforme o hospedeiro infectado, assim como com a ocorrência de infecções mistas (RAMOS et al., 2003). Além de plantas cultivadas, muitas espécies de plantas daninhas têm sido relatadas como hospedeiras de vírus. Ali et al. (2010), que realizou estudos relacionados ao movimento sistêmico de CMV em diversas espécies invasoras e estudos realizados por Adkins et al. (2008) que identificou a espécie invasora Momordica charantia como hospedeira do potyvirus SqVYV. Em razão da frequente ocorrência natural de infecção viral em plantios de melancia e a importância que a disseminação dos vírus representa para as regiões produtoras do estado do Tocantins, a presente pesquisa tem como objetivo identificar vírus em plantas hospedeiras por Dot-ELISA e investigar a sua transmissão para outras espécies de hospedeiras alternativas. Assim como, avaliar em campo, em três períodos de inoculação viral, o processo de infecção viral e suas implicações em alterações fisiológicas tanto na planta como nos frutos de melancia. 2 REVISÃO BIBLIOGRAFICA 1. Aspectos Gerais da Cultura da Melancia A melancia (Citrullus lanatus) é a espécie mais importante economicamente dentro da família das Cucurbitáceas que inclui duas subfamílias, cerca de 16 gêneros e 750 espécies (JEFFREY, 1990). É originária das regiões secas da África tropical, tendo um centro de diversificação secundário no Sul da Ásia. Segundo Guner & Wehner (2008), a melancia cultivada C. lanatus variedade lanatus deriva provavelmente da variedade C. lanatus var. citroides existente na África Central. A domesticação ocorreu na África Central onde é cultivada há mais de 5000 anos e foi introduzida no Brasil por volta de 1551 a 1557 durante o tráfico de escravos. Estudos realizados por Romão (1995), afirmam que a melancia foi introduzida no Brasil em dois momentos, o primeiro através dos escravos no século XVII que eram trazidos da África para trabalhar durante o ciclo econômico da cana-de-açúcar (Saccharum spp.), onde traziam suas próprias sementes e cultivavam em hortas. O segundo momento foi relatado por Costa e Pinto (1977) sendo a introdução da melancia no Brasil marcada pela utilização de cultivares melhoradas vindas dos EUA e do Japão no estado de São Paulo. As características nutricionais da melancia estão associadas à produção de grande variedade antioxidante em dietas como os carotenóides (licopeno e β caroteno), fenóis, vitaminas (A, B, C e E) e aminoácidos específicos (citrulina e arginina) (PERKINS VEAZIE et al., 2007), que exercem um papel protetor na redução de riscos de certos tipos de câncer, doenças cardiovasculares e relacionadas com a idade de patologias degenerativas (RICE -EVANS et al., 1996.; GIOVANNUCCI, 1999; RAO, 2006). Os benefícios para a saúde bem como o seu baixo valor calórico, torna uma fruta muito atraente (GUNER & WEHNER, 2008). As cultivares existentes no Brasil são de origem americana e japonesa, destacandose Charleston Gray, Crimson Sweet, Sugar Baby, Jubilee, Fairfax, Flórida Gigante, Omaru Yamato, além de alguns híbridos que estão no mercado como Crimson Glory, Emperor, Eureka, Rubi AG-8 e Safira AG-124. Também têm sido disponibilizados alguns híbridos de melancia sem sementes, dos quais o mais comum é o Tiffany. No Brasil, cultivares do tipo Crimson Sweet tem sido plantada em praticamente todas as regiões que cultivam melancia no país (CARVALHO, 1999). 3 A horticultura tocantinense é representativa na economia do Estado, gerando milhares de emprego e renda. Com um clima tropical e estações bem definidas, o que permite produzir muitos tipos de frutas. De acordo com a Diretoria de Fruticultura, da SEAGRO, a melancia tocantinense está conquistando outros estados e países do Mercosul. Em 2008, o Estado do Tocantins teve uma área plantada em torno de 2.400 ha, com uma produção de aproximadamente 65.400 toneladas, resultando em um rendimento de 27.674 kg/ha (IBGE, 2008). Com solos de boa fertilidade, clima favorável e água suficiente para todo o ciclo da cultura, a planta começa a produzir com cerca de 75 dias após o plantio (SANTOS et al., 2001). Na região sul do Estado, destacam-se os municípios de Formoso do Araguaia e -1 Lagoa da Confusão, com produtividade média de 30 t.ha (SANTOS et al., 2005) onde o cultivo é feito principalmente em solo de várzea. Nestas regiões existem grandes reservatórios de água acumulada durante os meses de outubro a abril, e a planta encontra as condições ideais para o seu desenvolvimento, tanto em termos de fertilidade do solo como também no clima quente e boa luminosidade durante toda a safra da cultura. Tornando assim o fruto mais doce e com poucas anomalias fisiológicas, conferindo assim um bom valor comercial. 2. Principais vírus de ocorrência no Brasil 2.1 Aspectos Gerais do Gênero Potyvirus O gênero Potyvirus, que inclui os vírus transmitidos por afídeos e que possuem somente um componente genômico, é o mais numeroso, com mais de 100 espécies classificadas. Potyviridae engloba espécies de grande importância agrícola, como o Potato vírus Y (PVY), infectado tomate e batata; o Soybean mosaic vírus (SMV), infectando soja; Sugarcane mosaic vírus (SCMV), infectando milho e cana de açúcar e Bean common mosaic vírus (BCMV) infectando feijão (FAUQUET et al., 2005). Alguns dos critérios taxonômicos para classificação de espécies dentro do gênero Potyvirus incluem a identidade de sequência de aminoácidos da capa protéica inferiores a 80%, identidade da seqüência de nucleotídeos menor que 85% para a seqüência completa do genoma viral, possuir diferentes sítios de clivagem na poliproteina, a gama de hospedeiros e o modo de transmissão (BERGER et al., 2005). 4 As partículas virais são alongadas flexuosas com comprimento de 680-900 nm e com 11-13 nm de espessura. O virion é composto por uma molécula de RNA de fita simples, senso positivo, com aproximadamente 9,7 kb de tamanho. Este RNA genômico e envolto por um capsídeo formado por 2.200 cópias de um polipeptídeo de massa molecular em torno de 34 kDa (BERGER et al., 2005). Todos os membros da família apresentam uma proteína de origem viral (VPg) covalentemente ligada na extremidade 5’ e uma cauda poli (A) na extremidade 3’ (FAUQUET et al, 2005; SHUKLA et al., 1994) (Figura 1). A descoberta de uma pequena ORF (open reading frame) dentro do cistron P3 da poliproteina, com tradução em fase de leitura diferente, foi evidenciada por Chung et al. (2008) em Turnip mosaic vírus (TuMV). Esta ORF denominada PIPO (Pretty Interesting Potyviridae ORF), tem características bioinformática de codificação conservada ao longo de toda família Potyviridae (CHUNG et al., 2008). Chung et al. (2008), Wei et al. (2010) e Wen & Hajimorad (2010) vêm estudando assuntos envolvendo mutações nesta ORF com o intuito de avaliar a relevância de expressão protéica PIPO para o estabelecimento e sobrevivência do vírus na hospedeira, bem como, avaliar sua função dentro da célula vegetal. FIGURA 1: Esquema do genoma dos potyvirus. Barra azul representa as 10 proteínas funcionais resultantes do processo de clivagem da poliproteína. A barra vermelha representa a região PIPO recentemente descoberta. A disseminação desses vírus no campo é realizada com muita eficiência por mais de 38 espécies de afídeos em 19 gêneros, sendo seus principais vetores Myzus persicae, Aulacorthum solani, Aphis craccivora e Macrosiphum euphorbiae. A transmissão é altamente eficiente por serem insetos polífagos e também por atribuir delicada penetração na célula vegetal onde a transmissão ocorre de maneira não 5 persistente, ou seja, o vírus não se multiplica no inseto vetor e não é transmitido para sua progênie (COSTA & PINTO 2002; HULL, 2009). A transmissão ocorre no momento da “picada de prova” feita pelo inseto vetor na planta hospedeira, onde a inserção do estilete na camada epidérmica durante alguns segundos (Figura 2). FIGURA 2: Micrografia de luz mostrando a cabeça do pulgão e uma folha. A - pulgão projeta estilete vindo da proboscite. B - penetração intracelular através do mesofilo da folha. C - Entrada do vírus nos feixes vasculares. (HARRIS, 2001). Segundo Matthews (1991), a transmissão de espécies de potyvirus por afídeos é dependente da proteína capsidial e de uma proteína não estrutural, denominada de componente auxiliar (“helper component protease” – Hc-Pro), que é codificada pelo genoma viral e produzida somente nas células das plantas infectadas. A proteína HCPro pode ser esquematicamente dividida em três regiões funcionais, a região N-terminal essencial no processo de transmissão, a região C terminal responsável pela atividade proteolítica e a região central apontada como importante para a replicação através do motivo funcional IGN (PLISSON et al., 2003) e por apresentar ainda uma atividade de ligação não específica com ácidos nucléicos, preferencialmente RNA fita simples (MAIA et al., 1996). Estudos preliminares demonstraram que a HC-Pro atua na interação vírus-vetor como fator assistente de transmissão, indispensável durante a disseminação do vírus pelo afídeo (Figura 3)(PIRONE, 1981). 6 FIGURA 3: Modelo de possível interação entre HC-Pro, o estilete do pulgão e a proteína do Potyvirus. A: Modelo mostrando associação entre duas moléculas de HCPro. Note que uma molécula de HC-Pro esta ligada a um “receptor” sobre o estilete, enquanto a segunda é ligada a subunidade da capa protéica. B: Modelo mostrando que um dímero é necessário para se ligar ao “receptor” do estilete. Ambas as moléculas de HC-Pro estão ligadas a proteínas de subunidades de revestimento. (HULL, 2009). Entre os vírus do gênero potyvirus de maior ocorrência em lavouras comerciais de melancia o Papaya ringspot virus – Strain w (PRSV-W) (LIMA et al., 1996), Zucchini yellow mosaic vírus (ZYMV) (LIMA et al., 1996), Watermelon mosaic virus – (WMV) (SÁ & KITAJIMA, 1991). O PRSV-W é amplamente distribuído nas regiões produtoras de cucurbitáceas no País (REZENDE & PACHECO, 1998) (MOURA et al., 2001; RAMOS et al., 2003). Em levantamentos realizados nas principais regiões produtoras de cucurbitáceas da região nordeste, dados mostram que o vírus PRSV-W teve maior ocorrência (SILVEIRA et al., 2009). PRSV-W teve predominância em plantas de melancia em levantamento realizado por Moura et al. (2001) no estado do Maranhão, representando no total de 60% das amostras analisadas. Segundo Purciful et al. 1996, PRSV-W possui ocorrência comum em cultura de melancia são transmitidos por inoculação mecânica, mas não por via sementes. Alem disso, possui uma grande variedade de hospedeiros com sintomas sistêmicos quando inoculadas: C. lanatus, C. melo, C. metuliferus, C. sativus, Luffa acutangula, Macroptilium lathyroides L., Psiguria triphylla, todas da família cucurbitácea (PURCIFUL et al., 1996, NAKANO et al., 2007). Os sintomas apresentado por PRSV7 W vão de mosaico e necrose em folhas e deformação dos frutos (GUNER et al. 2002). Os danos na produção são variáveis, podendo atingir 100% quando a espécie cultivada é bastante sensível e a infecção ocorre no início do desenvolvimento (REZENDE, 1996). Outro vírus de extrema importância e o ZYMV pode ser encontrado principalmente nas espécies de cucurbitáceas, incluindo espécies cultivadas e há relatos de infecção de algumas outras espécies de dicotiledôneas. Possui ampla gama de hospedeiras dentre elas duas espécies de Chenopodiaceae, chenopodium amaranticolor Willd e C. quinoa Willd, que quando inoculadas reagem com sintomas locais nas folhas, sendo boas indicadoras de ZYMV (DESBIEZ & LECOQ, 1997). Ao infectar plantas de melancia apresentam sintomas de distorção e mosaico amarelo em folhas, nanismo no crescimento e manchas de frutas com tamanho reduzido (LING et al., 2009). ZYMV e PRSV-W infectam plantas de melancia com frequência, sozinhos ou em infecção mistas, e são disperso pelos insetos vetores sendo na maioria pulgões em condições de campo, causando perda de rendimento de até 50% (MA et al., 2005; XU et al., 2004). O vírus WMV possui ampla gama de hospedeiras, infectando cerca de 178 espécies de plantas dentro de 27 famílias, incluindo cucurbitáceas e algumas espécies de leguminosas, malváceas, quenopodiáceas e ornamentais (SHUKLA et al., 1994). Plantas infectadas exibem sintomas de mosqueado, mosaico, bolhosidades e deformações do limbo foliar. A qualidade e a quantidade de produção dos frutos podem ser reduzidas (OLIVEIRA et al., 2000). Apesar dos vírus da família potyviridae serem transmitidos de maneira nãopersistente através da “picada de prova”, o controle destas doenças através do uso de produtos químicos para o controle do inseto vetor é praticamente inviável, embora seja essa a principal estratégia de controle para doenças causadas por vírus usada na região Sul do estado do Tocantins. Porém, pouco se sabe o comportamento epidemiológico destas doenças em campo, o que dificulta a adoção de medidas duradouras, eficientes e viáveis de manejo de tais viroses (SILVEIRA et al., 2009). 8 2.2 Aspectos Gerais do Gênero Cucumovirus Segundo Fauquet (2005), o CMV é classificado taxonomicamente como espécie da família Bromoviridae, gênero Cucumovirus. É um vírus cujas partículas são isométricas, com diâmetro de 29 nm. O genoma viral é constituído por três moléculas de RNA de fita simples senso positivo encapsidadas separadamente (FRANCKI et al., 1979). Os três genomas de RNA são divididos em: RNAs 1 e 2 que codificam proteína envolvida na replicação viral (HAYES & BUCK, 1990) e RNA 3 que codifica duas proteínas, a proteína capsidial (CP) e uma proteína associada a movimentação celula-acelula. No Brasil, os primeiros relatos de CMV foram descritos por Silberschmidt & Nóbrega em (1941) no Estado de São Paulo, onde plantios de bananeiras apresentavam sintomas de mosaico, necrose e morte. Posteriormente, outros autores relataram a presença deste vírus tanto em bananeira como em pomares de maracujá (ARAUJO et al., 2001; COLARICCIO et al., 1996; EIRAS et al., 2001). As plantas de cucurbitáceas afetadas pelo CMV apresentam folhas com sintomas de mosqueado, retorcidas, enrugadas e de tamanho reduzido. Os frutos têm seu tamanho reduzido e apresentam-se com deformações, mosqueados e verrugas (KIMATI et al., 1997). O CMV é transmitido por mais de 75 espécies de afídeos, como A. gossypii e M. persicae. Vírus do mosaico do pepino pode ser adquirido e transmitido a um novo hospedeiro dentro de segundos, pois seu modo de transmissão é classificado como nãopersistente, porque o vírus não persiste no corpo do vetor (WATSON, 1939) e a transmissão por afídeo depende somente da proteína capsidial. Estirpes de CMV podem apresentar diferentes taxas de transmissão por afídeos (GERA et al., 1979; PALUKAITIS et al., 1992). Possui uma ampla gama de hospedeiros sendo capaz de infectar mais de 800 espécies vegetais (PALUKAITIS et al., 1992). Segundo Nelson et al. (2004), o movimento sistêmico de vírus de plantas inclui movimento célula a célula a partir de células inicialmente infectadas para as células vizinhas e movimento a longa distancia para outros tecidos da planta. O movimento célula a célula é conseguido através dos plasmodesmos, membranas intercelulares plasmáticas alinhadas em canais da parede celular que conectam o citoplasma de células vizinhas e fornecem passagens para a comunicação entre as células simplásticas da planta (Figura 4). 9 FIGURA 4: Esquema representativo da direção e da taxa de translocação de um vírus em uma planta. 2.3 Aspectos gerais do gênero Tospovirus A clorose letal das cucurbitáceas causadas pelo vírus Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV), pertencente à família Bunyaviridae ao gênero Tospovirus, tem contribuindo significativamente para as perdas na produção de abobrinha de moita, principal planta hospedeira do vírus (YUKI et al., 2000). No Brasil, este tospovirus foi primeiramente isolado de Cucurbita pepo em 1994, em lavoura desta cultura no Estado de São Paulo (NAGATA et al., 1998) e a incidência desta virose pode alcançar altos valores (GIAMPAN, 2002). As partículas deste vírus são esféricas, de diâmetro entre 80 e 110 nm e o genoma constitui-se de três segmentos de RNA (L, M e S) semelhantes aos do TSWV (Figura 5), constatadas no interior do retículo endoplasmático no citoplasma, onde também foram observadas massas amorfas densas (viroplasma) (REZENDE et al., 1996). Trabalhos realizados por Nakahara et al. (1999) mostram que a transmissão de ZLCV é feita principalmente pelos tripes Frankliniella zucchini de forma circulativa – propagativa. 10 FIGURA 5: Organização do genoma de Tospovirus. As linhas representam a única fita de RNA (-) e as caixas regiões codificadas com os produtos finais identificados e as setas indicam o C-terminal. Adaptado de Hull (2009). Como todos os vírus deste gênero, a aquisição do vírus pelo tripes vetor se dá apenas pelas ninfas, enquanto a transmissão é realizada por adultos e ninfas em estádio final de desenvolvimento (NAGATA & PETERS, 2001). Os estádios de pré-pupa e pupa não se alimentam e conseqüentemente não adquirem e não transmitem o vírus (NAGATA & PETERS, 2001). Segundo Persley et al. (2006), tripes podem ativamente se alimentarem de plantas infectadas por vírus em ambos os estágios de larvas e adultos, mas apenas nos primeiros estágios larvais podem adquirir o vírus e, posteriormente, larvas e adultos poderão transmitir o vírus após um período de latência. Insetos adultos de tripes podem adquirir tospovirus, mas não transmiti-los. Isso se deve, principalmente por causa da multiplicação insuficiente no intestino médio e a falta de movimento para as glândulas salivares. Esses são pré-requisitos para a transmissão de tospovirus. Alem disso, tospovirus não são transmitidos transovarianamente (WIJKAMP et al., 1996). Assim, cada nova geração de tripes vetores deve adquirir o vírus quando larvas, sendo que há associação distinta entre espécies de tripes e sua capacidade de transmitir específicos tospovirus (JONES & SHARMAN, 2005) Resende et al. (1996) estudou , sob ambiente protegido, o ciclo de hospedeiras do ZLCV e verificou infecção apenas em algumas espécies das famílias Amaranthaceae, Cucurbitaceae, e Solanaceae. No caso dessa ultima família, dentre as espécies inoculadas, o ZLCV infectou sistematicamente Datura stramonium, Capsicum annum e C. chinense PI 159236. Bezerra et al. (1999) também estudaram o ciclo de hospedeiras de ZLCV e verificou que, além de causar sintomas sistêmicos em cucurbitáceas, o vírus causou sintomas locais em G. globosa, Nicotiana benthamiana e N. occidentalis. Gomphrena globosa e N. benthamiana, também foram invadidas sistematicamente. 11 3. Plantas Daninhas Hospedeiras Conforme relatado por Hull (2009), o termo hospedeira é definido “um organismo em que um determinado vírus pode replicar”. Isto é, uma espécie de planta na qual o vírus pode replicar causando uma célula infectada é considerada hospedeira. Em termos práticos, também se define que hospedeira local é usada para espécie de vírus que se restringe a folha inoculada e que hospedeira sistêmica é usada para uma espécie de vírus que se propaga a partir da folha inoculada para outras partes da planta, mas não necessariamente para toda ela. Plantas hospedeiras constituem na principal forma de sobrevivência dos vírus; alem desta, vetores e sementes também proporcionam a perpetuação das partículas virais na natureza, várias espécies cultivadas, daninhas e silvestres podem abrigar diversos vírus fitopatogênicos, funcionando como reservatórios de patógenos atuando, portanto como fonte de inóculo (BERGAMIN FILHO et al., 1995). Enquanto que, plantas daninhas têm como características crescer em locais inóspitos, apresentar hábito agressivo, dispersão de sementes principalmente pelo vento, alta capacidade reprodutiva, resistência a controle químico e grandes populações ocupando extensas áreas; o que as tornam grandes fontes potenciais de inóculo de fitopatógenos para plantações de espécies comerciais, desempenhando papel fundamental na epidemiologia das doenças causadas por vírus como hospedeiras primárias e secundárias (DUFFUS, 1971). Diversas espécies de plantas daninhas pertencentes às famílias Asteraceae, Amaranthaceae, Chenopodiaceae, Commelinaceae, Solanaceae, Fabaceae, Plantaginaceae, Malvaceae, Tropaeolaceae já foram descritas como hospedeiras naturais de vírus pertencentes aos gêneros Alfamovirus, Badnavirus, Begomovirus, Carmovirus, Closterovirus, Comovirus, Ilarvirus, Luteovirus, Potexvirus, Potyvirus, Rhabdovirus, Sequivirus, Sobemovirus, Tobamovirus, Tospovirus e Tymovirus. Assim, é importante ressaltar que dos vírus já identificados no mundo, cerca de 15% foram descritos em espécies pertencentes à flora daninha (BRUNT et al., 1997). Merecendo destaque para os membros do gênero Potyvirus por representarem 20% do total dos vírus de plantas já descritos, o que torna este gênero um dos mais importantes devido ao grande número de espécies descritas, tanto em plantas cultivadas como na vegetação espontânea (ZERBINI JUNIOR & ZAMBOLIM, 1999). 12 Mayo, (2005) registrou 196 espécies de Potyvirus, sendo 91 destas consideradas definitivas, caracterizando-o definitivamente, do ponto de vista econômico, como o mais importante gênero de vírus de plantas. Muitos vírus dessa família têm gama de hospedeiras restrita, tanto natural quanto experimental, freqüentemente confinado a poucas espécies vegetais pertencentes à mesma família botânica, mesmo gênero ou gêneros relacionados (BRUNT et al., 1997). Desta forma, torna-se de grande importância a identificação de plantas hospedeiras de vírus que constituem fonte potencial do vírus para melancia, para melhor entendimento da transmissão de vírus entre plantas de vegetação espontânea e plantas cultivadas, visto que a atividade dos insetos vetores em campo é mais intensa, podendo o vírus chegar mais cedo nos novos plantios. 13 4. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ADKINS S.; WEBB S.E.; KOUSIK, C.S.; Squash vein yellowing virus Detection Using Nested Polymerase Chain Reaction Demonstrates that the Cucurbit Weed Momordica charantia Is a Reservoir Host. Plant Disease v. 92, p. 1119-1123.2008. AGRIANUAL, Anuário da agricultura brasileira. FNP Consultoria & Agroinformativos. São Paulo. p. 544, 2007. ALI, A.; ROOSSINCK, M.J. Genetic bottlenecks during systemic movement of Cucumber mosaic virus vary in different host plants. Virology v. 404, p. 279–283. 2010. ARAUJO, J.; EIRAS, M. COLARICCIO, A; CHAVES, A.L.R.; HARAKAVA, R.; BRAUN, M.R.; CHAGAS, C.M. 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Revisão Anual de Patologia de Plantas, v. 7, p. 1-66, 1999. 22 CAPÍTULO II – PROSPECÇÃO DE PLANTAS DANINHAS HOSPEDEIRAS DE VÍRUS ASSOCIADA À CULTURA DE MELANCIA RESUMO Com o objetivou de identificação de plantas daninhas hospedeiras de vírus em lavouras comerciais de melancia no estado do Tocantins foram coletadas 337 amostras de plantas daninhas. A identificação dos vírus foi realizada pelo método sorológico de Dot-ELISA a partir de anticorpos policlonais específicos para PRSV-W, ZYMV, CMV, WMV e ZLCV. Segundo os resultados obtidos, dentre as 21 espécies de plantas avaliadas, somente Amaranthus spinosus, Nicandra physaloides, Physalis angulata e Heliotropium indicum apresentaram reação positiva para os vírus em estudo A. spinosus teve reação positiva em 23% das amostras para ZYMV. N. physaloides e P. angulata, tiveram reações positivas para PRSV-W, WMV e ZYMV; PRSV-W, CMV, WMV, ZYMV e ZLCV respectivamente. Em amostras de P. angulata e N. physaloides, ZYMV foi predominante com 13,8% e 8,8%, seguidos por PRSV-W com 7,6% e 6,6%, respectivamente. H. indicum teve reação positiva para CMV, ZYMV e ZLCV. O teste de gama de hospedeiro mostrou que Tabaco rustica foi infectada com PRSV-W (80%), ZYMV (60%) e WMV (40%). Em levantamento da gama de hospedeiros, Luffa acutangula, Langenaria vulgaris, Citrullus lanatus e Cucurbita pepo tiveram 100% de infecção para os vírus analisados. P. angulata teve infecção para PRSV-W e ZYMV. A partir dos resultados verifica-se que a identificação de plantas hospedeiras em lavouras de melancia é de extrema importância para os estudos epidemiológicos. A caracterização das espécies de vírus predominantes nesta vegetação espontânea e a posterior análise das interações vírus-hospedeiro e vetores levará ao manejo correto de plantas daninhas e ao controle de viroses. Palavras chaves: Citrullus lanatus, Dot-ELISA, virose. 23 ABSTRACT With the aim of identifying weed hosts of the virus in commercial fields of watermelon in the state of Tocantins were collected 337 samples of weed. The identification of virus was performed by serological ELISA-Dot from polyclonal antibodies specific for PRSV-W, ZYMV, CMV, and WMV ZLCV. According to the results obtained among the 21 plant species tested, only Amaranthus spinosus, Nicandra physaloides, Physalis angulata and Heliotropium indicum showed a positive reaction to the virus in study A. spinosus had a positive reaction in 23% of samples for ZYMV. N. physaloides and P. angulata, had positive reactions to PRSV-W, WMV and ZYMV, PRSV-W, CMV, WMV, ZYMV and ZLCV respectively. In strains of P. angulata and N. physaloides, ZYMV was predominant with 13.8% and 8.8%, followed by PRSV-W with 7.6% and 6.6% respectively. H. indicum had positive reaction to CMV, ZYMV and ZLCV. The test showed that host range were infected with Tobacco rustica PRSV-W (80%), ZYMV (60%) and WMV (40%). In a survey of host range, Luffa acutangula, Langenaria vulgaris, Citrullus lanatus and Cucurbita pepo had 100% infection for the virus analyzed. P. angulata had infection to PRSV-W and ZYMV. From the results it appears that the identification of host plants in crops of watermelon is extremely important for epidemiological studies. The characterization of this virus species predominant natural vegetation and the subsequent analysis of virushost interactions and vector will lead to the correct management of weeds and controlling the virus. Keywords: Citrullus lanatus, Dot-ELISA, virose. 24 1. INTRODUÇÃO A cultura da melancia (Citrullus lanatus) é a quinta hortaliça em área de cultivo, dentre as cucurbitáceas de importância econômica no Brasil. A cultura é cultivada em todo o território nacional, tendo os estados do Rio Grande do Sul (28,5%), Bahia (12%), Goiás (9,8%), São Paulo (7,6%), Tocantins (6,9%), Rio Grande do Norte (4,8%) e Pernambuco (4,5%) como maiores produtores de frutos (IBGE, 2008). A produção de melancia tem sido influenciada diretamente por doenças ocasionadas por vírus que causam sérios danos à cultura. Dentre os vírus capazes de infectar plantas de melancia no Brasil, a família Potyviridae apresenta maior importância (HALFELD-VIEIRA et al., 2004). Esta família é composta por: Papaya ringspot virus – strain W (PRSV-W) (LIMA et al., 1996), Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) (LIMA et al., 1996), e Watermelon mosaic virus – (WMV) (SÁ & KITAJIMA, 1991). Sendo a transmissão dessas viroses se dá de maneira não persistente, o que caracteriza a alta interação do vírus com o hospedeiro (VEGA et al. 1995).Também, com relevante importância, destaca-se a família Tospoviridae com a espécie: Zucchini lethal chlorotics virus (ZLCV) com transmissão de forma persistente circulativa realizada por adultos e ninfas de tripes em estádio final de desenvolvimento (NAGATA & PETERS, 2001) e família Bromoviridae: Cucumber mosaic virus (CMV) (CUPERTINO et al., 1988). Doenças ocasionadas por vírus em melancia resultam em frutos de baixa qualidade (FILGUEIRA, 2003; KUROZAWA et al., 2005). Plantas de cucurbitáceas infectadas por vírus podem ter variações na expressão dos sintomas conforme o tipo de vírus e a ocorrência de infecções mistas (Ramos et al., 2003). Além disso, 15% dos vírus predominantes em áreas cultivadas estão associados à flora daninha presente nos cultivos (CHAVES et al., 2003). De acordo com Costa (1998), a planta daninha constitui-se fonte constante de inóculo de vírus e o processo de disseminação do vírus está associado aos insetos. Santos et al. (2004), Assunção et al. (2006 ) e Arnaud et al. (2007) relataram que diversas plantas daninhas existentes em áreas de cultivos de tomate são hospedeiras de vírus, servindo como fonte de inóculo de vírus para posterior disseminação de viroses no campo. A identificação de plantas daninhas hospedeiras de vírus associadas a lavouras comerciais de melancia é de extrema importância para compreender a epidemiologia e a identificação das espécies de vírus predominantes nas regiões produtoras. Além disso, 25 possibilita o estudo da interação vírus-hospedeiro na busca pela redução da incidência de viroses em plantios de melancia devido ao manejo correto de plantas daninhas. No Estado do Tocantins, não há registros de levantamento de plantas hospedeiras de vírus. Desta forma, objetivou-se neste trabalho identificar as possíveis plantas daninhas hospedeiras de vírus WMV, CMV, ZYMV, PRSV-W e ZLCV em lavouras comerciais de melancia de quatro regiões do estado do Tocantins. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Levantamento das plantas daninhas hospedeiras de vírus O levantamento de plantas daninhas hospedeiras, possivelmente associadas aos vírus PRSV-W, CMV, WMV, ZYMV e ZLCV presentes em lavouras de melancia foi realizado nos municípios de Formoso do Araguaia, Lagoa da Confusão, Figueirópolis e Gurupi no estado do Tocantins. As amostragens foram realizadas durante dois anos consecutivos (2010 e 2011) o cultivo comercial de melancia, o qual ocorre nos meses de julho a setembro. Foram coletadas 337 plantas daninhas na cultura da melancia de diferentes espécies e que apresentavam sintomas de vírus tais como: mosaico, deformação foliar e bolhosidade. Destas, foram coletadas 15 amostras foliares localizadas no ápice da planta e acondicionadas em sacos papel e mantidos em caixas térmicas sob baixa temperatura para preservação do material. Posteriormente, realizou-se o teste sorológico em laboratório visando a identificação dos vírus. 2.2 Identificação sorológica dos isolados A identificação foi realizada por teste sorológico tipo Dot-ELISA com antissoro policlonal específico para os vírus WMV, CMV, ZYMV, PRSV-W e ZLCV. As amostras foliares das plantas daninhas foram maceradas e preparadas de acordo com os procedimentos realizados por Banttari & Goodwin (1985) na proporção de 1g de folha para 1000μL de tampão ½ PBS (NaH2PO4H2O 0,08 M; K2HPO4 0,02 M; NaCl 1,40 M; KCl 0,02 M e pH 7,4). Posteriormente, uma alíquota de 4μL do macerado foi distribuída sobre uma membrana de nitrocelulose contendo os controles positivos e negativos. Em seguida, a 26 membrana foi submetida à secagem por 30 minutos em temperatura ambiente. O bloqueio da membrana foi realizado pela adição de uma solução de ½ PBS acrescido de 3% de leite em pó (fonte proteica) e, posteriormente, agitação da mesma por 3 h a 60 rpm. Ao término, a membrana foi colocada separadamente em meio antissoro específico para cada um dos vírus analisados CMV, PRSV-W, WMV-2, ZYMV e ZLCV. O conjugado geral “Goat anti-rabbit IgG Alkaline Phosphatase Conjugate” (SIGMA®) foi diluído na proporção de 1:30.000μl de ½ PBS. Para revelação foi utilizado o kit de BCIP/NBT “5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/Nitro blue tetrazolium” (SIGMA FAST™) de acordo com o protocolo do fabricante. Com observação do roxeamento das amostras positivas. 2.3 Testes em plantas daninhas Para o estudo de gama de hospedeiros, as amostras iniciais obtidas das plantas daninhas que tiveram reação positiva foram inoculadas em plantas da espécie Amaranthus viridis L., Chenopodium quinoa Willd. e Chenopodium murale L., Nicotiana benthamiana, Tabaco rustica L. e Tabaco samson L., Luffa acutangula M. Roem., Lagenaria vulgaris L., Citrullus lanatus Thunb. e Cucurbita pepo L. Todas as inoculações foram realizadas por meio de fricção mecânica da suspensão do inóculo contra a superfície foliar. A primeira inoculação ocorreu após o surgimento de duas folhas definitivas e uma segunda inoculação foi realizada após três dias da primeira. A suspensão contendo a fonte de inóculo do vírus foi obtida por meio do extrato foliar macerado em tampão de fosfato de potássio (K2HPO4) a 0,01 M, pH 7,0 e 0,1% de sulfito de sódio (Na2SO3). A superfície adaxial da folha foi polvilhada com abrasivo carborundum 400 mesh. Após a aplicação de uma alíquota de 1 mL da suspensão de inóculo sobre a folha, fez-se a fricção mecânica e o excesso de abrasivo foi retirado por meio de lavagem. Para cada inoculação foi deixada uma planta teste (sem inoculação) e cinco plantas de cada espécie receberam o inóculo viral inicial. Posteriormente, foram realizados a análise dos sintomas e o teste sorológico. 2.4 Avaliações sintomatológicas As reações sintomatológicas das plantas indicadoras foram avaliadas aos 7, 14, 21 e 28 dias após a segunda inoculação . Para avaliação a intensidade dos sintomas sistêmicos adotaram-se os seguintes critérios: lesão local clorótica (LLC); mosaico (M); 27 deformação foliar (DF); bolhosidade (B); mosaico severo (MS); sem sintomas (S/S), conforme a metodologia descrita por Chung et al. (2007). As plantas com ou sem sintomas foram submetidas ao teste sorológico (Dot-ELISA) com antissoro específico para cada um dos vírus PRSV-W, CMV, WMV e ZYMV para confirmação dos resultados positivos. 2.5 Analise estatística Os dados foram analisados estatisticamente usando o programa Sigmaplot 11 (Systat software, 2008). 3. RESULTADOS Dentre as 337 amostras de plantas daninhas analisadas, as quais compõem as seguintes famílias: 21 Amaranthaceae, 35 Euphorbiaceae, 128 Solanaceae, 26 Cucurbitaceae, 16 Fabaceae, 10 Boraginaceae, 41 Malvaceae, 60 Asteraceae (Tabela 1). As amostras foram coletadas dos municípios de Formoso do Araguaia (125), Figueiropolis (37), Lagoa da Confusão (109) e Gurupi (66) (Tabela 2). A identificação de PRSV-W, CMV, WMV, ZYMV e ZLCV a partir das viroses nas plantas daninhas foi realizada utilizando antissoro policlonal específico para os cinco vírus. Conforme os resultados evidenciaram, os antissoros foram altamente específicos na identificação dos cinco vírus (Figura 1). FIGURA 1: Exemplo da reação sorológica por Dot-ELISA para PRSV-W, WMV, CMV, ZYMV e ZLCV, controle negativo (verde), controle positivo (roxo) e amostra de planta daninha apresentando roxeamento para todos os vírus analisados. 28 Observou-se que apenas as plantas daninhas pertencentes às famílias Amaranthaceae, Solanaceae e Boraginaceae tiveram reações positivas para PRSV-W, CMV, WMV, ZYMV e ZLCV. A espécie Amaranthus spinosus mostrou reação positiva para ZYMV, ao passo que Amaranthus viridis não apresentou nenhuma reação positiva (Tabela 1). O vírus ZYMV esteve presente em 13,8% e 8,8% das amostras de P. angulata e N. physaloides, seguidos por PRSV-W com 7,6% e 6,6%, respectivamente (Tabela 1). Enquanto, CMV, WMV e ZLCV foram menos presente em P. angulata com 1,5%, 1,5% e 3% do total de amostras, respectivamente. N. physaloides teve reação positiva somente para WMV (4,4%) das amostras obtidas (Tabela 1). Em Heliotropium indicum foram identificadas CMV (20%), ZYMV (30%) e ZLCV (10%), não apresentando reação positiva para PRSV-w (Tabela 1), representando um total de 3% do total de plantas coletadas (Tabela 1). Conforme os resultados obtidos, o número amostras positivas para PRSV-W, CMV, WMV, ZYMV e ZLCV variaram em função da espécie de planta daninha e por região das lavouras comerciais. As regiões apresentaram diferença quanto ao número de espécie da família Malvaceae, sendo a S. rhombifolia predominante nas regiões de Formoso do Araguaia e Lagoa da Confusão (Tabela 2). Nos municípios de Formoso do Araguaia e Lagoa da Confusão houve predominância de duas espécies de plantas daninhas da família Solanaceae como N. physaloides e P. angulata que representaram mais de 90% das amostras (Tabela 2). As demais espécies de plantas daninhas estavam amplamente distribuídas nas regiões de cultivos de melancia (Tabela 2). O maior número de amostras de plantas daninhas foram obtidas nas regiões de Formoso do Araguaia e Lagoa da Confusão por essas regiões apresentarem maiores áreas cultiváveis de melancia (Tabela 2). 29 TABELA 1: Plantas daninhas hospedeiras coletadas em lavouras comerciais de melancia no estado do Tocantins, e números de reações positivas por plantas, pelo teste de Dot-ELISA, com antissoro específico para os vírus PRSV-W, CMV, WMV, ZYMV e ZLCV na safra de melancia 2010/10 e 2011/11 Família Espécie Nome vulgar Amaranthaceae Amaranthus spinosus Amaranthus viridis Euphorbia heterophylla Chamaesyce hirta Datura stramonium Nicandra physaloides Physalis angulata Solanum sisymbrifolium Momordica charantia Caruru de espinho Bredo Leiteiro Erva de Santa Luzia Trombeteira Quintilho Camapú Juá Melãozinho de São Caetano Fedegoso Pega-pega Crista de galo Guaxima Malva- preta Malva- lacenta Mata- pasto Picão-branco Euphorbiaceae Solanaceae Cucurbitaceae Fabaceae Boraginaceae Malvaceae Asteraceae Senna obtusifolia Desmodium tortuosum Heliotropium indicum Sida urens Sidastrum micranthum Sida santaremnensis Sida rhombifolia Galinsoga quadriradiata Pluchea sagittalis Praxelis pauciflorum Siegesbeckia orientalis Emilia fosbergii Numero de amostras positivas por teste Dot-ELISA/ Total de plantas coletadas PRSV-W CMV WMV ZYMV ZLCV 00/13 00/13 00/13 03/13 00/13 00/08 00/08 00/08 00/08 00/08 00/20 00/20 00/20 00/20 00/20 00/15 00/15 00/15 00/15 00/15 00/05 00/05 00/05 00/05 00/05 03/45 00/45 02/45 04/45 00/45 05/65 01/65 01/65 09/65 02/65 00/13 00/13 00/13 00/13 00/13 00/26 00/26 00/26 00/26 00/26 Madrecravo Couvinha Botão- de- ouro Falsa-serralha 30 00/12 00/04 00/10 00/08 00/12 00/05 00/16 00/14 00/12 00/04 02/10 00/08 00/12 00/05 00/16 00/14 00/12 00/04 00/10 00/08 00/12 00/05 00/16 00/14 00/12 00/04 03/10 00/08 00/12 00/05 00/16 00/14 00/12 00/04 01/10 00/08 00/12 00/05 00/16 00/14 00/06 00/18 00/06 00/16 00/06 00/18 00/06 00/16 00/06 00/18 00/06 00/16 00/06 00/18 00/06 00/16 00/06 00/18 00/06 00/16 TABELA 2: Plantas daninhas hospedeiras coletadas em lavouras comerciais de melancia por município no estado do Tocantins, e números de amostras por região do total de amostras obtidas na safra de melancia 2010/10 e 2011/11 Família Amaranthaceae Euphorbiaceae Solanaceae Cucurbitaceae Fabaceae Boraginaceae Malvaceae Asteraceae TOTAL Espécies Amaranthus spinosus Amaranthus viridis Euphorbia heterophylla Chamaesyce hirta Datura stramonium Nicandra physaloides Physalis angulata Solanum sisymbrifolium Momordica charantia Senna obtusifolia Desmodium tortuosum Heliotropium indicum Sida urens Sidastrum micranthum Sida santaremnensis Sida rhombifolia Galinsoga quadeiradiata Pluchea sagittalis Praxelis pauciflorum Siegesbeckia orientalis Emilia fosbergii Formoso do Araguaia 00/13 03/09 07/20 08/15 02/05 28/45 32/65 04/13 12/26 00/12 02/04 04/10 00/08 00/12 02/05 09/16 04/14 02/06 04/18 02/06 07/16 134 Lagoa da Confusão 04/13 00/09 09/20 03/15 01/05 17/45 30/65 06/13 09/26 04/12 00/04 02/10 03/08 05/12 01/05 04/16 03/14 01/06 05/18 00/06 00/16 109 31 Gurupi Figueiropolis 09/13 04/09 04/20 00/15 02/05 00/45 03/45 01/13 03/26 07/12 01/04 00/10 04/08 01/12 02/05 01/16 02/14 03/06 06/18 03/06 05/16 66 00/13 02/09 00/20 04/15 00/05 00/45 00/45 02/13 03/26 01/12 01/04 04/10 01/08 06/12 00/05 02/16 05/14 00/06 03/18 01/06 02/16 37 A análise da incidência de vírus em plantas de melancia nas áreas de coleta das plantas daninhas também foi realizada e em cada região foram coletadas amostras nas seguintes proporções Lagoa da Confusão (115), Formoso do Araguaia (104), Gurupi (51) e Figueiropolis (30) (Figura 2) sendo observada a presença dos cinco vírus em estudo (Figura 2 B). O PRSV-W e ZYMV foram mais predominante nas amostras de Formoso do Araguaia, CMV e WMV em amostras de Gurupi e Lagoa da Confusão, e ZLCV foi mais predominante em amostras da Lagoa da Confusão (Figura 2B). Enquanto, predominância dos vírus em plantas daninhas teve diferença por região (Figura 2A). Conforme foi observado as plantas daninhas de Formoso do Araguaia foram positivas para todos os tipos de vírus avaliados (Figura 2A). PRSV-w foi identificado nas amostras de Formoso, Gurupi e Lagoa, CMV ZYMV e ZLCV em Formoso e Lagoa da Confusão e WMV teve distribuição em todas as regiões analisadas (Figura 2A). FIGURA 2: Identificação dos vírus PRSV-W, WMV, CMV, ZYMV e ZLCV em plantas daninhas e plantas de melancia coletada em lavouras comerciais dos municípios de Lagoa da Confusão, Formoso do Araguaia, Gurupi e Figueiropolis no estado Tocantins. Barras verticais mostrando em A: % de plantas daninhas reação positiva para PRSV-W, WMV, CMV, ZYMV e ZLCV e B: % de plantas de melancia coletadas com reação positiva para os vírus PRSV-W, WMV, CMV, ZYMV e ZLCV. 32 Os sintomas foram reproduzidos sobre as folhas que receberam o inóculo mecanicamente nas planta teste prontamente infectados pelos inóculos iniciais de vírus, resultando em uma variedade de sintomas (Figura-3). Algumas plantas reagiram com sintomas que variaram entre clorose e manchas, tais como Tabaco samsum (Figura 3A), ou com necrose de nervuras, manchas necróticas, bolhosidade, mosaico e deformação foliar, como observado em Luffa acutangula (Figura 3B), com mosaico, deformação foliar e bolhosidade em Lagenaria vulgaris (Figura 3C). Os sintomas relativos à infecção também produzidam graves manchas necróticas como foi o caso Physalis angulata e Nicandra physaloides (Figuras-3D e E). Portanto, os sintomas apresentados nas plantas hospedeiras deste vírus ficou restrito a algumas plantas solanáceas. A severidade dos inóculos iniciais de PRSV-W, CMV, ZYMV, WMV e ZLCV foi notável, uma vez que consistentemente infectou solanáceas, como Tabaco rustica, T. samsun, Physalis Angulata, Luffa acutangula, Lagenaria vulgaris, Citrullus lanatus e Cucurbita pepo (Tabela-4). A diversidade e a gravidade dos sintomas causados por estes vírus foram diferenciadas e sendo capaz de identificar o vírus quanto a infecção apresentada na planta hospedeira. 33 FIGURA 3: Sintomas e efeitos citopatológicos causados por inóculos dos vírus PRSV-W, WMV, CMV e ZYMV. A: Tabaco samsun com sintomas de PRSV-W. B: Luffa acutangula com sintomas de ZYMV. C: Lagenaria vulgaris com sintomas de WMV D: Physalis angulata com sintomas de PRSV-W. E: Nicandra physaloides com sintomas de ZYMV. F: Physalis angulata com sintomas de ZYMV. 34 TABELA 3: Plantas teste apresentando sintomatologia para os vírus PRSV-W, CMV, ZYMV e WMV e detecção por Dot-ELISA Planta testada PRSV-W CMV ZYMV WMV Sintomas* ELISA** Sintomas* ELISA** Sintomas* ELISA** Sintomas* ELISA** Amaranthaceae Amaranthus viridis S/S - S/S - S/S - S/S - Chenopodiaceae Chenopodium quinoa Chenopodium murale S/S S/S - S/S S/S - S/S S/S - S/S S/S - Solanaceae Nicotiana benthamiana Tabaco rustica Tabaco samsun Physalis Angulata Nicandra physaloides S/S B M M M + + + + S/S S/S S/S S/S S/S - S/S B S/S M, B M, DF + + + S/S B M S/S S/S + + - DF, MS, B LLC, M + DF, MS, B MS, B + Cucurbitaceae Luffa acutangula DF, MS, + DF, MS, + B B Lagenaria vulgaris + + DF, MS, + DF, MS, + B B Citrullus lanatus DF, MS, + DF, M, B + DF, MS, + DF, M, B + B, B Cucurbita pepo DF, MS + DF, M, B + DF, MS + M + *SINTOMAS: LLC, lesão local clorótica; M, mosaico; DF, deformação foliar; B, bolhosidade; MS, mosaico severo; S/S, sem sintomas. **ELISA: +, amostras positivas; -, amostras negativas. 35 3. DISCUSSÃO Os resultados dos testes sorológicos indicaram que somente 10,6% das amostras de plantas daninhas estavam infectadas com pelo menos um dos vírus estudados. Amostras de P.angulata teve 5,3% desse total, caracterizando a planta com potencial de inóculo para PRSV-W, CMV, ZYMV, WMV e ZLCV. Sendo mais abundante em Lagoa da Confusão e Formoso do Araguaia. N. physaloides teve reações para PRSV-w, WMV e ZYMV sugerindo que esta planta é uma fonte potencial de inóculos de vírus. Bukovinszki et al. (2007) realizaram estudos com a espécie Physalis floridana infectados com diferentes estirpes da espécie de potyvirus PVY onde foi observado sintomas sistêmicos de mosaico e distorções foliares. Trabalhos conduzidos por Trenado et al. (2007) identificaram Physalis ixocarpa e P. peruviana como hospedeiras de Tomato chlorosis virus (ToCV) dentro de cultivos de tomate em Portugal. Conforme observado, estudos biológicos têm sido utilizados para o entendimento da especificidade do vírus às diferentes espécies de plantas hospedeiras nos mecanismos relacionados à infecção (replicação e movimento) (MATTHEWS, 1992). Estes resultados indicam a ampla disseminação de PRSV-W, CMV, WMV, ZYMV e ZLCV os quais podem estar diretamente associados à população de plantas daninhas associadas ao sistema de cultivo. De acordo com estudos relacionados ao CMV em solanáceas há reações distintas entre as plantas hospedeiras analisadas, diferenciando quanto ao movimento do vírus na planta e a virulência dos isolados obtidos (CARRÈRE et al., 1999). Diferentes plantas daninhas têm sido associadas como mantedoras de inóculos de vírus junto a áreas de cultivos, de forma que cada espécie de vírus tem sido associada à especificidade da planta hospedeira. Conforme os resultados de Srinivasulu et al., (2010), Lagenaria vulgaris foi identificada como fonte de inóculo dos vírus do gênero Potyvírus em experimentos conduzidos por). Trabalho desenvolvido por Takami et al., (2006) demonstra que Momordica charantia é hospedeira de CMV. De acordo com resultados obtidos neste trabalho, as populações das plantas hospedeiras estudadas diferenciam em função da região que foram amostradas, o mesmo foi observado para os vírus analisados. De acordo com Santos et al., (2004), as plantas daninhas coletadas em culturas de tomateiros na região Nordeste do Brasil houve predominância de 36 begomovírus nas amostras de solanáceas, sendo assim uma fonte de inóculo permanente para o vírus concomitante com a cultura. O levantamento do número de viroses em plantas de melancia cultivadas próximas às plantas daninhas com sintomas de viroses não confirmou a associação entre os mesmos vírus encontrados nas plantas daninhas. O que resulta em dizer que a dispersão dos vírus nas lavouras não está totalmente dependente das plantas hospedeiras, mesmo como fonte potencial de inóculo viral. Porém, em trabalho desenvolvido por Silva et al., (2010), há uma interação positiva na dispersão de begomovírus em cultivos de tomate pelos inseto vetor Bemisia tabaci após aquisição junto a plantas hospedeiras. Os sintomas nas plantas indicadoras apresentados pelos inóculos obtidos de plantas daninhas foram altamente influenciados pelo tipo de vírus, com lesão local clorótica, mosaico, deformação foliar; bolhosidade e mosaico severo, como observado em plantas de T. samsun e P. angulata. Enquanto, os sintomas de deformação foliar, lesão local clorótica e mosaico severo foram observados em todas as plantas da família cucurbitácea. Trabalho realizado por Silveira et al. (2009) com levantamento de vírus em espécies de cucurbitáceas, identificaram dentro de plantios de melancia, plantas hospedeiras da família cucurbitáceas infectadas por vírus. Chaves et al., (2007) analisaram a vegetação espontânea em lavouras de alface e verificaram a predominância dos sintomas de mosaico e necroses em plantas de Sonchus asper (L.) Hill. Plantas submetidas à inoculação mecânica com PRSV-W, CMV, WMV e ZYMV apresentaram diferenças nos números de plantas positivas, diferenciando entre as plantas na obtenção dos inóculos virais. Sendo a sintomatologia apresentada nas plantas esta tem possibilitando a identificação dos vírus. No entanto, Daniels & Campbell (1992) e Eiras et al. (2001) relatam que CMV é um vírus bastante dinâmico e que pode infectar centenas de espécies de plantas, com desenvolvimento de sintomas distintos para cada planta hospedeira testada, ensaios biológicos com Vigna unguiculata e Nicotiana glutinosa foi possível diferenciar espécies e estirpes de cucumovírus. A permanência dos vírus em vegetações espontâneas favorece a manutenção dos inóculos virais nas áreas de cultivos de melancia nas principais regiões produtoras do estado do Tocantins. De modo que, a ausência de cultivares de melancias resistentes a PRSV-W, CMV, WMV, ZYMV e ZLCV, assim como medidas de controle pouco 37 efetivas e considerando a complexidade de controle das plantas daninhas e insetos vetores nos sistemas de cultivos, é possível afirmar que os prejuízos causados pelos vírus PRSV-W, CMV, WMV, ZYMV e ZLCV poderão ser minimizados pela adoção de um manejo integrado de pragas (MIP), associado ao manejo integrado de plantas daninhas (MIDP), com aplicação de medidas de controle bem definidas tanto para o inseto vetor quanto para plantas invasoras. Ainda que seja considerada difícil, a prática para a erradicação das espécies daninhas, principalmente na cultura da melancia, deve ser recomendada visando à redução da incidência das viroses nas lavouras de melancia, uma vez que as invasoras podem ser fontes contínuas de inóculos virais para a cultura. Conforme demonstrado por Ambrozevícius et al. (2002), Assunção et al. (2006) e Arnaud et al. (2007), em plantas hospedeiras de vírus em diferentes áreas cultivadas. 38 4. CONCLUSÃO As espécies A. spinosus, N. physaloides, P angulata e H. indicum são fonte de inóculo de vírus em cultivos de melancia; As espécies Luffa acutangula, Lagenaria vulgaris e Cucurbita pepo são boas indicadoras dos vírus PRSV-W, ZYMV, CMV, WMV e ZLVC com sintomatologia semelhante as encontradas em plantas de melancia. 39 5. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS AMBROZEVICIUS, L.P.; CALEGÁRIO, R.F.; FONTES, E.P.B.; CARVALHO, M.G.; ZERBINI, F.M. Diversidade genética de begomovírus infetando o tomateiro e plantas daninhas no Sudeste do Brasil. Fitopatologia Brasileira 27: 372-377. 2002. ARNAUD, L.S.E.P.; SANTOS, C.D.G.; LIMA, J.A.A; FEITOSA, F.A.A. Predominância de Begomovírus em Tomateiros na Região Produtora da Ibiapaba, Ceará, e sua Detecção Natural em Plantas Daninhas. Fitopatologia Brasileira 32. 2007. ASSUNÇÃO, I.P.; LISTIK. A.F.; BARROS, M.C.S.; AMORIM, E.P.R.; SILVA, S.J.C.; IZAEL, O. 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Diante deste aspecto, objetivou-se neste trabalho avaliar a severidade de PRSV-W, CMV, ZYMV e WMV em função de três períodos de inoculação. Os resultados obtidos demonstraram que todos os vírus foram capazes de reduzir a biomassa das plantas infectadas, sendo que o processo de infecção foi influenciado pelo período de inoculação. Entre as variáveis analisadas verificou-se que os vírus influenciaram no peso dos frutos, sólidos solúveis (ºBrix) e na coloração da polpa. Esta influência foi mais significativa no quinto dia após inoculação dos vírus PRSV-W e WMV. O vírus CMV teve forte redução do ºBrix dos frutos. Com relação à coloração da polpa observou-se que o vírus PRSV-W no período de inoculação de 5 DAE obteve notas mais baixo, caracterizando frutos com cor de polpa branca. Portanto, observa-se no geral, que os vírus PRSV-W, WMV, CMV e ZYMV influenciaram diretamente no desenvolvimento e na qualidade dos frutos de melancia. Desta forma, a ocorrência de viroses em plantas de melancia é um fator determinante para a redução na qualidade dos frutos, influenciando diretamente na sua qualidade. Palavra chave: Severidade, Citrullus lanatus, inoculação. 44 ABSTRACT In the state of Tocantins, the culture of watermelon [Citrullus lanatus (Thunb) Matsum & Nakai] is the main fruit grown in the area continues. Despite the expansion of the crop, its production has been affected by the occurrence of viruses. Given this aspect, this study aimed to assess the severity of PRSV-W, CMV, ZYMV and WMV in terms of three periods of inoculation. The results showed that all viruses were capable of reducing the biomass of the infected plants, and the infection process was influenced by the time of inoculation. Among the variables was verified that the virus influence on the weight of fruit soluble solids (° Brix) and on pulp. This influence was more significant on the fifth day after inoculation of virus PRSV-W and WMV. The CMV virus was strongly reduced ° Brix of the fruit. With respect to the flesh color was observed that the virus-W in PRSV inoculation period of 5 DAE notes lower characterized fruit pulp white in color. Therefore, there is in general viruses PRSV-W, WMV, ZYMV and CMV directly influenced the development and fruit quality of watermelon. Thus, the occurrence of viruses in watermelon plants is a determining factor for the reduction in fruit quality, directly affecting its quality. Keywords: Severity, Citrullus lanatus, inoculation. 45 1. INTRODUÇÃO A melancia [Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. & Nakai], é uma das cucurbitáceas mais importantes cultivadas no mundo. A produção mundial de melancia em 2008 atingiu 99,1 milhões de toneladas, com a produtividade média de 26,4 t/ha (FAO, 2010). A área plantada no Brasil, em 2008 superou os 98 mil hectares, com produção total de mais de dois milhões de toneladas de frutos e com produtividade media de 21 t/ha (IBGE, 2010). Os problemas fitossanitários relacionados aos vírus são os que causam maior prejuízo em plantios de melancia. Foram identificados mais de 10 vírus infectando cucurbitáceas no Brasil (Moura et al., 2001), sendo os mais predominantes pertencentes às seguintes famílias e gêneros: família Comoviridae, gênero Comovirus: vírus do mosaico da abóbora (Squash mosaic virus, SqMV) (Lima & Amaral, 1985); família Bromoviridae, gênero Cucumovirus: vírus do mosaico do pepino (Cucumber mosaic virus, CMV) (Cupertino et al., 1988); família Potyviridae, gênero Potyvirus: vírus da mancha anelar do mamoeiro (Papaya ringspot virus, PRSV) (Lima et al., 1996), vírus do mosaico da melancia (Watermelon mosaic virus-2, WMV-2) (Sá & Kitajima, 1991); vírus do mosaico amarelo da abobrinha de moita (Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV) (Lima et al., 1996), infectam as plantas de forma sistêmica, sendo a resistência genética a maneira mais segura e eficiente para o controle desses patógenos. A severidade dos sintomas apresentados é ocasionada principalmente por várias alterações bioquímicas, fisiológicas e morfológicas, através da ativação e/ou bloqueio de determinadas atividades celulares nas plantas infectadas. Como exemplo, Fujita (1996) relatou que sintomas de clorose podem refletir na biossíntese de clorofila. A diversidade de sintomas e severidade pode ser observada, geralmente, associada a alterações citológicas na estrutura e função dos cloroplastos (Arias et al., 2003; Sampol et al., 2003; Bertamini et al., 2004; Gonçalves et al., 2005; Domiciano et al., 2009). De modo geral, as infecções virais são capazes de induzir desordens na célula vegetal, que incluem alterações na fotossíntese, na respiração, nas atividades enzimáticas, no transporte de fotoassimilados e no balanço hormonal (Sampol et al., 2003). Em decorrência disto, este processo infeccioso resultará em queda de produtividade e da qualidade da produção (Auger et al., 1992; Domiciano et al., 2009; Cretazzo et al., 2010). 46 Muitos estudos mostram que infecções virais que causam sintomas de mosaico nas folhas, podem levar ao acúmulo de carboidrato e alterar a capacidade fotossintética (Goodman et al., 1986; Tecsi et al., 1994; Balachandran et al., 1997; Sindelarova et al., 1999), afetar o movimento de fotoassimilados (Aaziz et al., 2001) e alterar o transporte de elétrons em várias vias metabólicas (Balachandran et al., 1997). Objetivou-se com este trabalho avaliar as alterações fisiológicas em folhas e frutos ocasionadas pelos vírus PRSV-W, CMV, ZYMV e WMV em melancia tipo ‘Crimson sweet’ sob condições de campo, correlacionando as alterações com diferentes fases de inoculação viral. Para um melhor entendimento da maneira pela qual um fitopatógeno pode alterar a fisiologia da planta hospedeira e a qualidade do fruto. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Estirpes de vírus Foram utilizadas estirpes dos vírus de PRSV-W, WMV, CMV e ZYMV. A manutenção das estirpes foi realizada por inoculação mecânica na fase de duas folhas cotiledonares de melancia com fricção direta nas folhas. Todas as plantas foram obtidas a partir de semeadura em bandeja de germinação e posteriormente transplantadas para vasos de 5 litros até desenvolvimento dos sintomas. 2.2 Plantio e variedade de Melancia Foi utilizada a variedade de melancia ‘Crimsom sweet’ proveniente da empresa Sakata Seed Sudamerica Ltda. Para o plantio das sementes no campo foram realizados o preparo de solo de modo convencional com uma aração seguida de uma gradagem em uma área de 50 x 30 m totalizando 1500 m2. As covas foram preparadas de acordo com o recomendado para a cultura de melancia com um total de 250 covas. Foram semeadas quatro sementes de melancia por cova com espaçamento de 2 m entre linhas e 1,5 m entre covas, com 10 repetições para cada tratamento (PRSV-W, WMV, CMV e ZYMV) e por três períodos de inoculação (5, 12 e 19 dias após a emergência das plantas-DAE). Durante experimento, as plantas foram manejadas de acordo com as técnicas culturais recomendadas para a cultura. 47 2.3 Inoculação dos vírus A inoculação foi realizada diretamente nas plantas em campo de acordo com a metodologia utilizada por Nascimento et al. (2011) com adição do tampão de fosfato de potássio (K2HPO4) 0,01 M pH 7,0 e 0,1% de sulfito de sódio (Na2SO3), por fricção da suspensão viral sobre as folhas cotiledonares, previamente polvilhadas com o abrasivo Carbureto de silício (carborundum) 400 mesh. Posteriormente, retirou-se via lavagem com água o excesso de abrasivo. Para cada tratamento foram realizadas três inoculações seguidas com intervalo de um dia. 2.4 Identificação sorológica Folhas sintomáticas de cada tratamento foram coletadas aos 45 DAE e levadas para laboratório para identificação viral pelo teste sorológico de Dot-ELISA ou DIBA, com anti-soros específicos para os vírus WMV, CMV, ZYMV e PRSV-W. As amostras foram maceradas e preparadas de acordo com os procedimentos realizados por Banttari & Goodwin (1985) na proporção de 1g de folha para 1000μL de tampão ½ PBS (NaH2PO4H2O 0.08M; K2HPO4 0.02M; NaCl 1.40M; KCl 0.02M; pH 7.4). Posteriormente, foram pipetados 4μL da solução e distribuídos em membrana de nitrocelulose, contendo os controles positivos e negativos. Em seguida, a membrana ficou a temperatura ambiente por 30 minutos para secar. O bloqueio foi realizado com uma solução de ½ PBS acrescido de 3% de leite em pó, deixando a membrana em agitação por 3 horas a 60 RPM. As membranas foram colocadas em meio contendo antisoros policlonais específicos para CMV, PRSV-W, WMV e ZYMV. 2.5 Delineamento Experimental O delineamento utilizado foi de blocos inteiramente casualizados, em arranjo fatorial (4x3+1), com 10 repetições. Cada tratamento correspondia a um tipo de vírus (PRSV-W, CMV, ZYMV e WMV), totalizando quatro tratamentos à exceção da testemunha (plantas sem inoculação dos vírus), e três períodos de inoculação (5, 12 e 19 DAE). Para cada tratamento foram realizadas avaliações quanto a biomassa das plantas, a produção de clorofila e as características físicas e fisioquímicas dos frutos, como segue: 48 2.5.1 Avaliação da clorofila total Utilizando o clorofilômetro portátil (Clorofilog-1030) foram realizadas quatro leituras para a determinação do teor de clorofila durante intervalos de 7 dias. A primeira avaliação foi feita 40 DAE, com a leitura de duas folhas localizadas no ápice da rama da planta infectada e previamente marcada. Todas as folhas analisadas possuíam sintomas dos vírus e estas foram analisadas quanto ao teor de clorofila. Para isto, foram realizadas 15 leituras para a determinação da média correspondente a cada tratamento/vírus (PRSV-W, WMV, CMV e ZYMV) e, também, para cada período de inoculação (5, 12 e 19 DAE), totalizando 1.000 amostras de folhas. 2.5.2 Características físicas A massa do fruto (kg) foi obtida após a colheita dos frutos jovens e tardios pela leitura direta em balança semi-analítica. O formato do fruto foi obtido conforme o índice proveniente da divisão do diâmetro transversal pelo diâmetro longitudinal, atribuindo notas em que os valores menores que 0,5 são considerados frutos longos, entre 0,5 a 0,79 ovais e 0,80 a 1,00 frutos esféricos, conforme Silva et al., (2006). A coloração da polpa foi determinada utilizando o colorímetro Minolta, modelo CR 400, no modo CIE L*a*b* A coloração da polpa, também, foi determinada pela utilização da escala de notas desenvolvida por Silva et al. (2006), sendo: 1 - polpa vermelha; 2 - polpa rosa intenso; 3 - polpa rosa médio; 4 - polpa rosa claro; e 5 - polpa branca. 2.5.3 Características físico-químicas Foram determinando as características físico-química como, pH (potencial hidrogeniônico) foi determinado com auxílio de potenciômetro, aferido com tampões de pH 4 e 7, conforme AOAC (1992). O valor de sólidos solúveis (SS) foi determinado por refratometria, utilizando suco filtrado da polpa, a qual foi amostrada em partes representativas do fruto, de acordo com a metodologia recomendada pela AOAC (1992) expressos em ºBrix. 49 2.6 Análise estatística Os dados das características ou variáveis analisadas foram submetidas à análise de variância (ANOVA) pelo teste F e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade utilizando o programa estatístico Sisvar 4.6 (Ferreira, 2001). 3. RESULTADOS A infecção viral de cada período de inoculação foi confirmada por Dot-ELISA com antisoro específico para PRSV-W, WMV, CMV e ZYMV (Tabela-1). Conforme os resultados, observa-se que o período de inoculação influenciou na produção da biomassa das plantas infectadas, com diferença (p<0,05) no peso fresco da planta (PFP) (Tabela-2). As plantas infectadas pelo PRSV-W e CMV não apresentaram diferenças significativas (p>0,05), ao contrário foi observado para ZYMV e WMV valores significativos na redução de PFP. O peso de matéria verde das folhas (PMVF) e o peso da matéria seca das folhas (PMSF) das plantas infectadas não apresentaram diferenças significativas (p>0,05), tanto entre os períodos de inoculação quanto aos vírus. De forma geral, observa-se que todas as plantas infectadas reduziram o peso quando comparadas às plantas não infectadas pelos vírus (Tabela 2). TABELA 1: Confirmação das plantas de melancia infectadas pelos vírus PRSV-W, CMV, ZYMV e WMV em três períodos de inoculação, em teste de Dot-ELISA. Vírus Controle Controle + - 5 DAE 12 DAE 19 DAE PRSV-W CMV ZYMV WMV A análise da clorofila total das plantas infectadas com PRSV, CMV e ZYMV não houve diferenças significativas (p>0,05). No entanto, observou-se uma redução no teor da clorofila total na planta infectada com o inóculo do vírus WMV quando inoculado no período de 19 DAE para os demais períodos de inoculação 5 e 12 DAE não houve diferenças significativas (P>0,05) (Tabela 2). Comparativamente entre os vírus CMV, ZYMV e WMV houve diferenças significativas (p<0,05) no teor de clorofila total 50 (Tabela 2). O contrário foi observado em plantas inoculadas com PRSV-W aos 19 DAE, pois este tratamento obteve maior teor de clorofila total, quando comparado aos períodos iniciais. 51 TABELA 2: Avaliação da biomassa e do teor de clorofila total produzidas por plantas infectadas com PRSV-W, CMV, ZYMV e WMV em função de três períodos de inoculação (5, 12 e 19 dias após a inoculação). Vírus Inoculação PFP (Kg) PMVF (Kg)* PMSF (Kg)* CLOT 5 DAE 1,675 aB 0,043aA 0,010 Aa 33,753aC PRSV-W 12 DAE 1,231 aB 0,157 aA 0,020 aA 39,073aB 19 DAE 1,588 aB 0,105aA 0,032 aA 43,653aB 5 DAE 0,878 bC 0,060 aA 0,048 aA 40,380aA CMV 12 DAE 0,528 bC 0,165 aA 0,025 aA 30,333aB 19 DAE 0,667 bC 0,137 aA 0,030 aA 31,840aB 5 DAE 0,596 bC 0,046 aA 0,052 aA 37,013 aA ZYMV 12 DAE 0,928 aB 0,141 aA 0,014 aA 36,106aA 19 DAE 0,763 aC 0,143 aA 0,034 aA 35,326aA 5 DAE 0,542 bC 0,040 aA 0,036 aA 37,120aA WMV 12 DAE 0,500 bC 0,100 aA 0,017 aA 32,033abA 19 DAE 1,060 aBC 0,111 aA 0,022aA 26,660bB TEST 2,617 aA 0,395aA 0,043aA 45,576aA Letras minúsculas iguais não diferem significativamente entre os períodos de inoculação (5, 12 e 19 DAE) pelo teste Tukey a 5% de probabilidade. Letras maiúsculas iguais não diferem significativamente entre os vírus PRSV-W, CMV, ZYMV e WMV pelo teste Tukey a 5% probabilidade. PFP: Peso fresco de planta; PMVF: peso de massa verde foliar; PMSF: peso de massa seca foliar; CLOT: clorofila total. 52 Com relação a análise do pH e firmeza da polpa dos frutos obtidos das plantas infectadas, estes não apresentaram diferenças (p>0,05), para os vírus e entre os períodos de inoculação. No entanto, observa-se que o pH dos frutos obtidos variou de 4.77 a 5.08 (Tabela 3). Com relação ao peso dos frutos houve diferenças (p>0,05) entre os períodos de inoculação (Tabela 3). A redução do peso dos frutos das plantas infectadas com PRSV-W e WMV foi mais expressiva no período de 5 DAE. Todavia, em plantas infectadas com ZYMV e CMV, a redução foi maior aos 12 DAE, reduzindo drasticamente o peso dos frutos em mais de 100%. Aos 19 DAE, não houve diferenças (p>0,05) no peso dos frutos das plantas infectas com vírus PRSV-W, WMV, ZYMV e CMV (Tabela 3). As médias dos valores do ºBrix variaram de 3,67 a 7,0º Brix, os quais estão bem abaixo dos valores comerciais que variam entre 11 a 13º Brix. Estes valores indicam polpas com baixo teor de açúcar. Houve diferenças (p>0,05) tanto entre épocas como entre vírus, exceto para ZYMV que não diferiu quando comparado aos valores referentes às épocas de inoculação. Para o vírus PRSV-W, os menores teores de açúcares foram encontrados quando este foi inoculado com 5 DAE da planta. Já o CMV quando comparado aos demais vírus apresentou a menor média. Entre as análises observou-se que somente na faixa de leitura L houve diferenças P<(0,05) entre os vírus e o período de inoculação, sendo mais expressiva para o período de 12 DAE, em relação às plantas infectadas com PRSV-W e WMV aos 5 DAE (Tabela 3). Os mesmos resultados foram encontrados na coloração de polpa determinada por escala de nota, onde o vírus PRSV-W obteve as maiores notas com 5 DAE (polpa branca), seguido por ZYMV apresentando notas próximas a 5 quando infectados com 5 DAE e 12 DAE (Figura-1A). Desta forma observa-se que a coloração tipo L dos frutos é altamente influenciada pela infecção dos vírus PRSV-W, WMV, CMV e ZYMV. Entre os resultados do espectro de coloração, o componente “a” obteve diferença significativa ente os períodos de inoculação. No entanto, quanto a análise entre os vírus não houve diferença (P>0,05), conforme os resultados obtidos neste espectro de coloração, o que indica que os vírus não influenciaram diretamente no componente “a”. Quanto ao espectro de coloração do componente “b” não houve diferenças significativas tanto para os períodos de inoculação quanto para os vírus analisados. 53 TABELA 3: Avaliação das características dos frutos produzidos por plantas infectadas com PRSV-W, CMV, ZYMV e WMV em função dos três períodos de inoculação. Vírus Inoculação 5 DAE PRSV-W 12 DAE 19 DAE 5 DAE CMV 12 DAE 19 DAE 5 DAE ZYMV 12 DAE 19 DAE 5 DAE WMV 12 DAE 19 DAE TEST Letras minúsculas PF (Kg) pH* S/S ºBrix Firmeza* CP-colorímetro L a 1,701bB 4,82aA 4,59cBC 10,48aA 27,85abAB 1,66bcA 2,516bB 4,95aA 6,00abABC 8,59aA 25,44bB 5,09aA 2,055bB 4,82aA 5,13bcBC 11,04aA 28,63abAB 3,39abA 2,678bB 4,80aA 4,67bcBC 9,55aA 28,48abAB 1,81aA 0,872cB 4,82aA 3,67cC 9,35aA 27,77abAB 1,78aA 2,251bB 4,88aA 5,11bBC 11,26aA 26,94bAB 3,45aA 0,860bB 4,88aA 4,20bBC 11,77aA 27,60aAB 1,72aA 0,922bB 4,86aA 4,60bBC 8,10aA 27,13aAB 4,17aA 1,609bB 4,88aA 4,00bBC 10,51aA 30,50aAB 2,19aA 1,635bB 4,83aA 5,17bBC 8,04aA 25,16bB 2,93aA 1,935bB 5,08aA 6,00abABC 6,46aA 26,43abAB 2,13abA 3,100abAB 4,77aA 4,50bBC 9,48aA 29,05abAB 1,46abA 4,940aA 4,90aA 7,00aA 8,93aA 30,56aA 1,17aA iguais na coluna não diferem significativamente entre os períodos de inoculação (5, 12 e 19 DAE) b* 5,17aA 9,42aA 6,26aA 7,19aA 5,67aA 5,47Aa 5,89aA 5,24aA 8,66aA 5,17aA 6,06aA 6,36aA 6,07aA pelo teste Tukey a 5% de probabilidade. Letras maiúsculas iguais na coluna não diferem significativamente entre os vírus PRSV-W, CMV, ZYMV e WMV pelo teste Tukey a 5% probabilidade. PF: peso do fruto; pH; S/S ºBrix: Sólidos solúveis em ºBrix; CP-colorímetro: Cor da polpa medida por colorimetria; 54 Com relação ao formato do fruto não houve uma alteração drástica, as médias das notas variaram de 0.70 a 0.80 (Figura-1B) demonstrando pouca influência da infecção dos vírus no formato dos frutos. De acordo com os resultados apresentados, a alteração mais acentuada entre os vírus foi para WMV aos 19 dias após a inoculação, o diferenciando dos demais outros vírus. De maneira geral, entre o período de inoculação houve uma variação no formato do fruto e seu tamanho, o qual se destacou como um fator importante em plantas infectadas com esse vírus. FIGURA 1: Escala de notas atribuidas aos frutos de melancia infectados com PRSV-W, CMV, WMV e ZYMV para A: Coloração de polpa sendo nota 1 - polpa vermelha; 2 polpa rosa intenso; 3 - polpa rosa médio; 4 - polpa rosa claro; e 5 - polpa branca. B: Formato de fruto com notas <0.5 foram considerados frutos longos, entre 0,5 a 0,79 ovais e entre 0.80 a 1.00 frutos esféricos. Os sintomas foram reproduzidos sobre as folhas e frutos em plantas infectadas com PRSV-W, WMV, CMV e ZYMV, o que resultou em uma variedade de sintomas e alterações na coloração do fruto (Figura-2). Em PRSV-W foram observados sintomas foliares de bolhosidade, mosaico e deformação foliar, assim como frutos apresentando manchas necróticas e polpa de coloração branca (Figura-2 A, B e C). Plantas inoculadas com ZYMV apresentaram sintomas foliares de mosaico, bolhosidade e distorções foliares ocasionando frutos com sintomas visíveis de bolhosidade e amarelecimento na casca e polpa branca (Figura-2 D, E e F). Em plantas inoculadas com CMV as folhas 55 apresentaram sintomas de mosaico e frutos com leve mosaico e polpa rosa-clara (Figura-2 G, H e I). Já em WMV, foram observados sintomas foliares de mosaico, bolhosidade e deformações nas folhas e frutos que apresentaram sintomas visíveis de bolhosidade com polpa branca (Figura-2 J, K e L). FIGURA 2: Característica dos sintomas e frutos de planta melancia infectadas com PRSV-W, ZYMV, CMV e WMV em três períodos de inoculação. Sendo A, B e C: Sintomas de PRSV-W com inoculações realizadas 5 DAE. D, E e F: Sintomas de ZYMV com inoculações realizadas 5 DAE; G, H e I: Sintomas de CMV inoculadas 5 DAE; J, K e L: Sintomas de WMV inoculados com 5 DAE. 56 4. DISCUSSÃO Os vírus PRSV-W, CMV, ZYMV e WMV são comumente encontrados infectando plantas de cucurbitáceas, ocasionado sérios prejuízos à produção e alterando as características organolépticas dos frutos. De acordo com a severidade dos sintomas apresentados pelos vírus, estes podem variar em função da estirpe de vírus, da espécie de planta e do tipo de infecção mista. Desta forma, a severidade observada isoladamente em plantas infectadas por PRSV-W, CMV, ZYMV e WMV apresentaram diferenças quanto a massa fresca e a massa seca das plantas. Estes resultados comprovam que as infecções virais influenciam diretamente na produção da biomassa das plantas, reduzindo drasticamente o desenvolvimento e a produção das mesmas. Resultados semelhantes foram encontrados quando avaliaram o peso de massa seca de plantas infectadas com os vírus PRSV-W e ZYMV em (Cucurbita pepo cv. Caserta), com intervalos de inoculação de 12 DAE e 22 DAE, onde não houve diferença entre eles (Pereira et al. 2007). Os resultados obtidos evidenciam como o período de inoculação/infecção do vírus na planta pode influenciar no desenvolvimento desta e, consequentemente, na sua produção de frutos com qualidade. Desse modo, temos subsídios para concluir que durante o processo de infecção os vírus podem possuir diferenças quanto aos mecanismos de infecção em consequência à resposta da planta hospedeira. Estes mecanismos podem ser menos severos em infecções mais tardias ou em fases iniciais como observado para CMV e WMV que tiveram diferenças significativas quando inoculados com 19 DAE. As severidades observadas entre os vírus podem estar associadas à capacidade destes em translocar na planta e/ou na resistência desta ao vírus. De acordo com Pereira et al. (2007), o vírus ZYMV apresentou maior severidade quando inoculado na fase inicial de desenvolvimento da planta de abobrinha de moita, reduzindo drasticamente o desenvolvimento destas. A redução do teor de clorofila total (CLOT) não foi significativa para o vírus PRSV-W quando comparadas as épocas de inoculação avaliadas, sugerindo que plantas de melancia quando infectadas em diferentes épocas de plantio não influenciam no teor de clorofila total e possivelmente, na produção de fotoassimilados. No entanto, CMV influenciou no teor da clorofila total das plantas infectadas, conforme foi observado em relação ao teor de clorofila 5 DAE que foi semelhante aos 19 DAE, reduzindo o teor de 57 clorofila, o que pode estar relacionado com a maior agressividade de CMV na planta, limitando o desenvolvimento desta. Desse modo, as baixas taxas fotossintéticas das plantas infectadas pelos vírus podem estar associadas à capacidade dos vírus em interferir diretamente na produção de proteínas celulares, essenciais para o correto desenvolvimento da planta (Sampol, 2003). Conforme os resultados de Naidu et al. (1984), plantas de amendoim (Arachis hypogaea L.) infectadas pelo vírus Peanut green mosaic virus (PGMV) tiveram baixas taxas fotossintéticas, as quais seriam resultantes da redução dos níveis de clorofila, especificamente da clorofila a. Estudos conduzidos por Auger et al. (1992), mencionam que a infecção ocasionada por vírus pode ser um dos fatores que contribuem para a redução do potencial fotossintético em plantas de uva. Outros fatores também são relatados como a menor área foliar das plantas infectadas quando comparadas às plantas sadias, no final do ciclo vegetativo e, também, no aumento da concentração de antocianinas (avermelhamento) comumente verificado em folhas assintomáticas de determinadas plantas hospedeiras, (Brar et al., 2008). Plantas de melancia infectadas com PRSV-W e ZYMV apresentaram frutos abaixo do peso comercial que variaram entre 8 a 10 Kg. O peso final do fruto foi diretamente afetado pelo período 5 DAE de inoculação tanto para PRSV-W e ZYMV o qual reduziu o desenvolvimento das plantas, que apresentavam alta severidade de infecção . Plantas infectadas com CMV apresentaram menor peso dos frutos obtidos aos 12 DAE também relacionado ao subdesenvolvimento das plantas. A relação de severidade entre os vírus e as plantas de melancia pode estar associada com movimento sistêmico destes agentes infecciosos. Este período de inoculação pode ter favorecido ou não a translocação dos vírus, influenciando na sintomatologia dos mesmos. O movimento do vírus pelo floema da planta ocorre pela interação entre este e o número de vasos condutores do floema, sendo que a planta que possui maior número de vasos condutores permite maior translocação das partículas virais, aumentando drasticamente a infecção célula a célula. Logicamente, as diferenças nas estruturas dos plasmodesmas e a frequência destes entre os diferentes tipos de células são fatores consideráveis durante à infecção dos vírus. (Heinlein, 2002; Turgeon et al., 2001; Ali et al., 2010). A alta incidência, predominância e a redução da produção ocasionada pelos vírus PRSV-W, CMV, ZYMV e WMV em plantas, juntamente à dificuldade de controle 58 desses vírus por resistência genética, práticas culturais e controle químico dos insetos vetores, torna imperativo os estudos sobre a fase de desenvolvimento da planta de melancia, que melhor resiste a infecção por estes vírus. Assim, este estudo pode gerar respostas que predigam o melhor momento para se evitar a entrada de vírus junto às lavouras comerciais. Momento este que poderá influenciar diretamente na produção e qualidade dos frutos, influindo também nos custos da cultura. Desse modo, os resultados aqui apresentados servirão de suporte para o manejo integrado de doenças, demonstrando que para os vírus analisados a melhor tática a ser utilizada é a erradicação dos mesmos nos sistemas de cultivo, quando se visa obter uma produção de qualidade. 59 5. CONCLUSÃO Conclui-se que infecções virais com PRSV-W, CMV, ZYMV e WMV são severas ao desenvolvimento das plantas e na qualidade dos frutos de melancia infectadas, independentemente da fase de inoculação 60 das estirpes virais. 6. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS AAZIZ, R.; DINAT, S.; EPEL, B. Plasmodesmata and plant cytoskeleton. Trends Plant Science 6: 326-330. 2001. ALI, A.; ROOSSINCK, M.J. Genetic bottlenecks during systemic movement of Cucumber mosaic virus vary in different host plants. Virology 404: 279–283. 2010. ALVARENGA, M.A.R.; RESENDE, G.M. Cultura da melancia. Lavras: Editora UFLA, 132 p. (UFLA, Textos Acadêmicos, 19). 2002. ARIAS, M.C.; LENARDON, S.; TALEISNIK, E. 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