Aspectos bioquímicos da infecção pelo vírus HBV

Aspectos bioquímicos da infecção
pelo vírus HBV
Edna Marisa Almeida
2º ano de Bioquímica
Gandra, Dezembro de 2007
Instituto Superior de Ciências da Saúde – Norte
Índice
Pág.
Introdução
3
Descrição geral do vírus (HBV)
4
Ciclo de vida
5
Replicação do vírus
6
Diagnóstico/sintomas
9
Tratamento
10
Vacina para a Hepatite B
11
Prevenção
12
Bibliografia
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Introdução
A patologia VHB, mais conhecida por hepatite B, não é mais do que uma
infecção viral causada pelo vírus da hepatite B. Esta hepatite já deteve uma
série de denominações, cada uma delas de acordo com o que representava o
conhecimento adquirido. O termo hepatite B surgiu em oposição a hepatite A
devido ao modo como é transmitida.
Foi em 1964 que Blumberg conseguiu identificar o antigénio de superfície
deste vírus, e denominou-o antigénio Austrália, actualmente denominado
AgHBs (Dane et al, 1970). Em 1970, Dane identificou partículas do vírus no
soro de um paciente. Seguidamente, confirmou-se a natureza viral destas
partículas, detectou-se um DNA endógeno dependente da DNA polimerase e
que esta se encontrava dentro dele. Estas descobertas permitiram a
caracterização do genoma do vírus da hepatite B (Robinson et al., 1974).
A hepatite B raramente é fatal nos dias de hoje. Os doentes em fase
aguda necessitam de um acompanhamento mais intensivo, têm sintomas como
fraqueza, febre e vómitos. Estes doentes necessitam de muito repouso até a
recuperação total, de modo a retomarem o ritmo normal no dia a dia. Se esta
cura não for total pode tornar-se perigosa e evoluir lentamente para uma forma
crónica e consequentemente para cirrose ou carcinoma hepatocelular (CHC).
Existe uma correlação entre o vírus da hepatite B e o CHC mas o mecanismo
pelo qual os hepatócitos são transformados pelo VHB continua desconhecido.
O primeiro surto de VHB foi em 1883 em que a infecção era causada
pelo uso de agulhas mal esterilizadas numa clínica. Mais tarde (1942), o maior
surto de VHB foi detectado em militares que tinham sido imunizados contra a
febre-amarela, uma vacina que continha soro humano.
Os estudos realizados até à década de 40, permitiram concluir que se
tratava de uma doença altamente infecciosa por inoculação, mas não haviam
provas científicas de que esta doença fosse transmitida por via oral.
Actualmente já se pode afirmar que este vírus se encontra presente no sangue,
saliva, leite materno, fluidos vaginais, sémen e noutros líquidos corporais.
A Hepatite B é responsável mundialmente por 2 milhões de mortos/ano,
sendo a maior incidência nos países subdesenvolvidos. Por outro lado, as
estatísticas confirmam, em todo o mundo, a existência de 200 milhões de
portadores do VHB, o que corresponde a 5% da população. Portador é o
indivíduo que apresenta os antigénios durante um período superior a 6 meses.
(Beck and Nassal, 2007).
Sabe-se hoje que é mais comum nos homens (em jovens adultos que
habitam em meios urbanos, especialmente consumidores de droga e
homossexuais) do que em mulheres. As vacinas disponíveis de prevenção
contra o VHB não são 100% fiáveis devido a todas as variantes do vírus, não
existindo cura para indivíduos infectados.
É necessário ainda muito desenvolvimento na área da investigação para
solucionar uma cura.
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Descrição geral do vírus (HBV)
O genoma deste vírus é o único por ter uma natureza compacta, por ter
grelhas de leitura sobrepostas e por ser dependente da transcriptase reversa. A
partícula infecciosa do vírus da hepatite B (partícula de Dane) é da família dos
hepadnavírus (família de vírus de DNA hepatotróficos). O seu genoma é
constituído por 3200 nucleótidos, está parcialmente em cadeia dupla, uma
longa (“negativa”) e uma curta e incompleta (cadeia “mais”). A molécula
adopta uma configuração circular devido à sobreposição das duas cadeias
complementares na região coesiva.
Uma delas é cadeia de leitura pré-S/S pode iniciar-se em 3 diferentes
codões de iniciação, produzindo 3 proteínas: pré-S1 (envolvida no
reconhecimento do VHB pelos receptores do hepatócito), pré-S2 e pequeno S
(codificando as glicoproteínas de superfície: grande, média e pequena, todas
presentes nas partículas víricas infecciosas. O core contém o genoma do vírus e
as enzimas DNA polimerase e transcriptase reversa. (Figura 1a).
Existem também partículas subvirais mais pequenas (filamentosas e
esféricas) encontradas no soro de indivíduos infectados, e são constituídas
apenas por antigénios se superfície. Sendo assim, não contêm o genoma viral,
logo não são focos infecciosos para o organismo (Figura 1b). Numa fase de
infecção aguda pode ser encontrado elevado número dessas partículas. Por
estarem presentes nestas partículas antigénios que o vírus também possui, não
se torna vantajoso para o vírus uma vez que elevados níveis destes antigénios
de superfície induzem uma resposta imunitária. Apesar disso pensa-se também
que esses níveis elevados de partículas pode fazer com que partículas do vírus
passem para a corrente sanguínea sem serem detectadas pelos anticorpos.
Este vírus é considerado bastante estável.
a)
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b)
Figura 1: a) Estrutura geral do vírus da Hepatite B [adaptado de  2002 James A.
Perkins]; b) Partículas esféricas e filamentosas que o vírus possui e que se encontram no
soro de um indivíduo infectado. Pormenor da localização da camada de HBe. [Murray et. al.,
2005].
Ciclo de vida
O vírus da hepatite B, tal como todos os vírus, tem que primeiramente
infectar uma célula capaz de suportar a sua replicação (Figura 2). Embora as
células do fígado sejam as mais efectivas para a replicação do VHB, existem
outros locais, extra-hepáticos, que também conseguem suportar a replicação,
mas a um nível mais baixo.
Após o vírus contactar com o hepatócito, liga-se a ele pela glicoproteína de
superfície pré-S1 e um receptor do hepatócito. Assim, o vírus “ataca” a
membrana das células do fígado e a partícula “core” vai entrar para o interior
dessas células. Aqui, a partícula “core” vai libertar o seu conteúdo de DNA e de
DNA polimerase no núcleo das células do fígado. Dentro do núcleo da célula, o
DNA do vírus vai conduzir à produção de RNA mensageiro, proteínas de
superfície (HBs), proteína core (HBc), DNA polimerase, proteína HBe, outras
proteínas desconhecidas e enzimas pelas células do fígado.
A DNA polimerase vai induzir as células do fígado a produzir cópias do vírus da
hepatite B. Estas cópias do vírus vão ser libertadas da membrana das células do
fígado para a circulação sanguínea e daqui podem infectar outras células do
fígado, onde se vão replicar. Contudo, ao longo da replicação, podem ocorrer
erros originando cadeias diferentes ou cadeias mutantes da hepatite B.
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Figura 2: Ciclo de vida do HBV.[www.labmed.pt]
O RNAm por um lado é traduzido em proteínas (p. ex. HBsAg) e por outro lado é
empacotado numa nucleocápside. No citoplasma, o RNA da nucleocápside vai servir de
molde para a síntese da cadeia menos (-) e da cadeia mais (+) do DNA.
Replicação do vírus
A entrada do vírus no hepatócito (principal célula do fígado) envolve
receptores específicos do vírus (o receptor da região pré-S1, aminoácidos 21-47
mas o receptor celular do hepatócito ainda não é conhecido.
Dentro do hepatócito, o genoma do VHB encontra-se numa forma
relaxada ou RC-DNA (figura 3). Este DNA é circular mas não é fechado
covalentemente e tem cerca de 3,2 Kb de comprimento. Depois é enviado para
dentro do núcleo, onde é reparado e se completa a síntese da cadeia positiva
(incompleta) do DNA. O genoma vírico é, assim, convertido numa cadeia
circular fechada de DNA com ligações covalentes (cccDNA) pela DNA
polimerase vírica. (Beck and Nassal, 2007). A partir da cadeia de cccDNA, são
transcritos (pela RNA polimerase) vários genomas e subgemonas de RNA. Estes
RNA pré-genómicos (pgRNA), são selectivamente encapsulados, enviados para
o citoplasma e seguidamente convertido na cadeia negativa do DNA pela
transcriptase reversa. Durante a acção desta, forma-se primeiramente um
intermediário de RNA de cerca de 3,4 Kb ficando no interior do chamado vírus
imaturo. Este RNA constitui o molde para a síntese da cadeia (–) do DNA. À
medida que esta transforma RNA em DNA, vai também degradando o RNA
através da actividade da RNAse H que também possui. Mas a degradação do
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RNA não é completa e o oligoribonucleótido terminal (que inclui a sequência
repetida DR1) é emparelhado com a região DR2 perto do terminal 5’ da mesma
cadeia menos (-), onde actua como iniciador da síntese da cadeia mais (+). A
síntese da cadeia positiva é então iniciada e as partículas do core, contendo
DNA vírico, são então envolvidas por AgHBs e secretadas para fora do
hepatócito ou transportadas para o núcleo, onde se completa a síntese da
cadeia positiva e se forma novamente o cccDNA. Há assim, 2 fontes de cccDNA:
as novas partículas víricas que entram no hepatócito e a relocalização para o
núcleo do DNA do VHB sintetizado de novo no citoplasma do hepatócito
Figura 3: Ciclo de replicação do vírus da hepatite B. (1) RC-DNA é tansportado para o
núclei e reparado em cccDNA. (2) Transcrição de cccDNA pela RNA polimerase e produção de,
entre outros transcritos, pgRNA. (3) Este é encapsulado juntamente com a proteína P e é
inversamente transcrito dentro dessa cápsula. A síntese da cadeia (+) do DNA é feita através
da cadeia (-) do DNA, o que faz com que se gerem novos RC-DNA. Novos ciclos vão conduzir à
amplificação do cccDNA; em alternativa, o RC-DNA contendo a nucleocápsula vai ser envolvido
e libertado pela membrana plasmática [Beck and Nassal, 2007].
No genoma do vírus há 4 cadeias de leitura aberta (ORF, open reading
frames) na cadeia positiva do genoma do vírus (Figura 4):
Gene pré-S/S: O gene pré-S/S codifica as proteínas do invólucro do
vírus (AgHBs) que é detectado no soro de pacientes
infectados.
Gene pré-C/C: Codifica uma proteína solúvel (AgHBe), a proteína do
invólucro extreno. A proteína da nucleocápside
(AgHBc), o “core”, que possui o DNA viral. O core é
composto por DNA (que se duplica dentro dos
núcleos das células infectadas) e DNA polimerase.
Gene P: Codifica a DNA polimerase/transcriptase reversa.
Gene X: Codifica uma proteína de significado pouco claro.
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O gene core ou C possui 2 codões de iniciação, a região pré-core e a
região core, sendo possível a tradução a partir de um ou outro. Assim, é
traduzido o AgHBe (a partir do pré-core) e quando a trandução se inicia na
região do core é sintetizada uma proteína estrutural da nucleocápside, o AgHBc
(que protege o DNA vírico da degradação por nucleases exógenas).
A cadeia de polimerase, que compreende cerca de 75% da extensão do
genoma, produz uma proteína multifuncional que inclui: uma proteína terminal,
uma região spacer ou de ligação, uma região da DNA polimerase/transcriptase
reversa e uma região correspondente à ribonuclease H. Assim, a polimerase
vírica funciona quer como uma transcriptase reversa (para a síntese da cadeia
negativa do DNA a partir RNA genómico) quer como uma DNA polimerase
endógena. A polimerase do vírus apresenta semelhanças com enzimas de
transcrição reversa de retrovírus, como o VIH (vírus da imunodeficiência
humana), que foram exploradas para o desenvolvimento de fármacos, como a
lamivudina, que inibem a actividade destas enzimas.
A proteína X é um potente transactivador, parecendo ter uma função
essencial na replicação e na hepatocarcinogénese.
Algumas sequências reguladoras da transcrição foram mapeadas
(promotores, enhancers). Algumas interacções específicas entre estas
sequências e factores de transcrição derivados da célula hepática (que podem
também contribuir para o hepatotropismo do vírus) começam agora a ser
esclarecidas.
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Figura 4: Organização do genoma do vírus. O RC-DNA está parcialmente em duas cadeias,
é circular e é indicado por linhas pretas grossas, com o P ligado covalentemente à extremidade
5' do DNA (-)e o primer do RNA (linha em zigzag) à extremidade 5’ do DNA (+). A parte
tracejada simboliza os comprimentos heterogéneos da cadeia positiva. DR1 e DR2 são zonas
directamente repetidas. O círculo exterior simboliza o pgRNA terminal redundante com a cauda
poli-A ligada à extremidade 3'. As posições relativas a ORF para o núcleo (c), P, o preS/S, e o X
são mostradas no interior da figura. Tp, domínio terminal da proteína P [Beck and Nassal,
2007].
Diagnóstico/sintomas
É possível ser-se infectado com o vírus da hepatite B e não apresentar
quaisquer sintomas de doença. Quando ocorre um ataque agudo pela hepatite
provoca mau estar, cansaço e perda de apetite, algo semelhante a uma gripe.
Por vezes, observa-se uma coloração amarelada nos olhos. Quando é mais
grave provoca insuficiência hepática fulminante e fatal, dependendo da
resposta do indivíduo.
O diagnóstico da infecção é obtido com base na serologia. Virtualmente,
todos os indivíduos infectados com VHB, irão possuir antigénios (HBsAg),
detectáveis no soro. Mas se não apresentar estes antigénios não quer dizer que
não possa possuir a doença. Na infecção aguda os antigénios são detectáveis
no soro algumas semanas após a infecção, coincidindo com o aparecimento dos
sintomas da doença e, também podem ser detectados pela elevada taxa de
replicação viral observada neste tipo de infecções. Apenas a presença isolada
de anti-HBc pode fazer o diagnóstico 100% fiável. Os indivíduos que
desenvolvem uma resposta imunitária contra o VHB desenvolvem anticorpos
contra os antigénios da hepatite B (HBsAg). Tais anticorpos são também
produzidos através da vacinação.
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E doença ocorre em três fases:
Fase prondrómica: iInicia-se subitamente - anorexia, mau estar
náuseas vómitos, febre e intolerância ao tabaco; aparecem
erupções urticariformes e artalgias – infecção do vírus. Esta fase
caracteriza-se por altos níveis de AgHBs, o AgHBe e de carga viral e
por níveis normais de aminotransferases;
Fase ictérica: aApós 5 a 10 dias, a urina fica escura e detecta-se
icterícia – o paciente sente-se melhor apesar da icterícia. Esta fase
caracteriza-se por níveis mais baixos de carga viral, aumento das
aminotransferases e existe AgHBe no soro;
Fase de recuperação: é nesta fase que se detecta o pico da icterícia
uma a duas semanas depois. Após isso há regressão lenta do vírus.
Esta fase é caracterizada pela passagem de portador crónico para o
estado de portador inactivo de AgHBs, baixos níveis de carga viral e
aminotransferases normais.
Em achados laboratoriais detectaram-se elevados níveis de aminotransferases
(antes do pico da fase ictérica e diminui lentamente na fase de recuperação), o
aspartato (AST) e a alanina (ALT) que é a mais elevada. Na fase ictérica, ao
serem detectados pigmentos biliares na urina é importante aconselhamento
médico pois pode ser feito um diagnóstico precoce. A fosfatase alcalna aumenta
moderadamente. Os leucócitos são inferiores ao normal e ao fazer um
esfregaço podem encontrar-se leucócitos atípicos. Na fase pondrómica os níveis
de AST são mais elevados que os níveis de ALT, o que faz com que não se
possa fazer um diagnóstico fiável. A biopsia hepática não é normalmente feita
mas é necessária quando existem dúvidas. [Manual Merk, 1995]
Tratamento
Nas últimas décadas houve um progresso muito importante no
tratamento do VBH. Actualmente há cinco drogas aprovadas para este
tratamento: interferão alfa, lamivudina, adenovir, entecavir e telbivudina.
(Ferreira and Borges, 2007). Os quatro últimos são análogos de
nucleosídeos/nucleotídeos utilizados por via oral e que inibem a transcriptase
reversa.
Os interferões foram os primeiros a serem utilizados para o tratamento
destas infecções podendo levar a uma resposta sustentada (perda do DNA do
vírus e do AgHBe) até um terço dos casos tratados. Especificamente, este é
uma citocina que actua por dois mecanismos. Por um lado, inibe a síntese de
DNA viral e por outro, por uma acção imunomolduladora que se expressa com o
aumento dos antigénios de histocompatibilidade da classe I da membrana dos
hepatócitos e através da estimulação da actividade dos linfócitos T auxiliares e
natural killer.
A lamivudina, foi, mais tarde, o primeiro análogo nucleosídeo utilizado, e
actua especificamente em pacientes com AgHBe positivo. Ao fim de um ano de
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tratamento, resulta uma melhora histológica (52% dos casos), queda do DNA
sérico (em 44% dos casos) soro-conversão AgHBe anti-HBe (17% dos casos).
Infelizmente, a incidência de resistência do vírus àlamivudina aumenta com a
duração do tratamento, sendo 14% no primeiro ano e 70% no 5º ano de uso.
O adenofir, é um análogo nucleotídeo da adenosina monofosfato. O
adenofir dipivoxil é o medicamento oral do adenofir e no organismo é
convertido em difosfato, um metabolito que interage com a DNA polimerase do
vírus. Tem aproximadamente os mesmos resultados que a lamivudina mas com
mais tempo de tratamento.
O entecavir, é o mais potente inibidor da DNA polimerase; no organismo
é fosforilado em trifosfato pelas cinases celulares e tem percentagens mais
eficazes que a lamivudina.
Por último, a tetbivudina, um análogo de nucleosídeo, apresenta uma
actividade potente, selectiva e específica sobre os hepadnavírus, bloqueando
rapidamente a replicação viral. Comparanto esta com a lamivudina, os dados
obtidos na 48ª semana de terapia já se mostravam conclusivos, mostrando
valores normais da doença hepática compensada.
Co-infectados HIV/HBV representam um grupo de doentes de difícil
manuseio e que hoje podem beneficiar de combinações de drogas no esquema
anti-retroviral potente que devem actuar em ambas as viroses.
Nenhuma medicação consegue erradicar de maneira eficaz o VHB dos
hepatócitos. Nenhum antiviral consegue a curto prazo diminuir os níveis de
cccDNA dos hepatócitos de forma eficaz, e seriam necessários muitos anos de
tratamento com análogos de nucleosidos/nucleotidos, por exemplo, para se
conseguir erradicar estes mini círculos dos núcleos das células hepáticas.
Mais actualmente, pensa-se que os efeitos
combinados são mais eficazes do que em separado.
dos
medicamentos
Vacina para a Hepatite B
A vacina da hepatite B é altamente efectiva: 85-96% dos vacinados
desenvolvem anticorpos, o que é quase sempre uma boa protecção. Uma
resposta imune diminuída pode, contudo, ser observada em pacientes que
fazem hemodiálise e por indivíduos imunocomprometidos. Por este motivo, a
dose deve ser duplicada nestes paciente. Uma pequena proporção de indivíduos
vacinados não respondem adequadamente à vacinação e é importante,
subsequentemente, monotorizar sorologicamente os títulos de anticorpos,
especialmente em pessoal médico e outros que estejam profissionalmente
expostos a um alto risco de infecção.
A vacina antigamente era derivada do plasma mas actualmente foi
substituída por vacinas elaborada por engenharia genética pois desse modo é
possível produzir uma maior quantidade. Deste modo, reduzem-se os efeitos
colaterais e são muito mais seguras.
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A quando a administração da vacina contra o VHB, há uma produção de
uma resposta imunitária anti-HBs quase universal em receptores normais e há
reduções dramáticas (cerca de 90%) na incidência da doença.
Apenas há vacinação após exposição em latentes recém-nascidos.
A vacina é ineficaz para eliminar a infecção do organismo.
A vacina é normalmente bem tolerada, estando as reacções mais
comuns limitadas ao local da injecção – calor, edema e enduração. Contudo,
cefaleias, sintomas do tracto respiratório superior, anorexia, náusea, vómitos,
dores abdominais, diarreia, febre e mialgias, foram referidos algumas vezes.
(Manual Merk, 1995).
Prevenção
O objectivo da prevenção da hepatite B é diminuir a incidência da
doença e assim minorar as graves consequências que a evolução crónica pode
acarretar. Algumas medidas gerais de prevenção são importantes:
- Informação e aconselhamento dos doentes (não partilhar objectos
pessoais eventualmente contaminados – lâminas, escovas dentárias,
tesouras, roupas interiores, usar barreiras protectoras nas relações
sexuais,...);
- Usar luvas no manuseamento de sangue e outros produtos
orgânicos;
- Vacinação
O VHB pode ser transmitido por via parental, caracteristicamente por
transfusão de sangue ou derivados de contaminados. Houve uma grande
redução da infecção pós-transcricional pelo VHB mas a transmissão através de
agulhas compartilhadas por usuários de drogas continua a ser um problema.
Risco para pacientes em diálise renal ou em unidades oncológicas assim como
para a equipa hospitalar que trabalha em contacto com sangue(Manual
Merk,1995).
O reservatório mundial de VHB para portadores crónicos é menos de
0,5% na América e na Europa e mais de 10% no Extremo Oriente (Fainboim et
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