Óleos essenciais: Influência de métodos de secagem sobre o
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL Óleos essenciais: Influência de métodos de secagem sobre o rendimento, composição e atividades fungitóxicas TATIANI PEREIRA DE SOUZA FERREIRA 2013 Trabalho realizado junto ao Programa de Pós Graduação em Produção Vegetal da Universidade Federal do Tocantins, sob orientação do Professor Dr. Luiz Gustavo de Lima Guimarães. BANCA EXAMINADORA: ___________________________________________ Prof. Dr. Luiz Gustavo de Lima Guimarães Universidade Federal de São João Del-Rei (Orientador) ___________________________________________ Prof. Dr Gil Rodrigues dos Santos Universidade Federal do Tocantins (Co-orientador) __________________________________________ Prof. Dr. Ildon Rodrigues do Nascimento Universidade Federal do Tocantins (Avaliador) __________________________________________ Prof. Dr. Gessiel Newton Scheidt Universidade Federal do Tocantins (Avaliador) UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL Óleos essenciais: Influência de métodos de secagem sobre o rendimento, composição e atividades fungitóxicas Dissertação apresentada à Universidade Federal do Tocantins, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal, para obtenção do título de “Mestre”. GURUPI TOCANTINS - BRASIL 2013 TATIANI PEREIRADE SOUZA FERREIRA Óleos essenciais: Influência de métodos de secagem sobre o rendimento, composição e atividades fungitóxicas Dissertação apresentada à Universidade Federal do Tocantins, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal, para obtenção do título de “Mestre”. Aprovada em: __/ Dezembro de 2013 Prof. Dr. Luiz Gustavo de Lima Guimarães (Orientador) GURUPI TOCANTINS - BRASIL 2013 Ofereço A Talita Pereira de Souza Ferreira, por ter contribuído pela concretização deste trabalho, Deus vai lhe abençoar de uma maneira grandiosa, em todas as áreas da sua vida. Amém. E aos meus pais Idemar José Ferreira e Marineth Pereira de Souza, por serem tudo, so vocês são tudo para mim. E aos meus irmão e sobrinhos. DEDICO Especialmente a todas comunidades tradicionais (índios, agricultores familiares, ribeirinhos, quilombolas e outros), que contribuem muito para pesquisa com seus conhecimentos e sabedoria, adquiridos de gerações a gerações. E aos pesquisadores da área de plantas medicianais, aromáticas e condimentares. AGRADECIMENTOS Agradeço ao meu Deus, por ter me dado capacidade de vencer mais está etapa da minha vida, e perseverança para suportar momentos ruins, e sempre fortalecer as minhas mãos, e vencer vários Golias neste período. Ao Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal da Universidade Federal do Tocantins por ter me dado a oportunidade de participar do corpo discente durante os dois anos, que de forma holística e multidisciplinar possibilitou que a pesquisa fosse direcionada ao conhecimento em ‘Plantas Medicinais, aromáticas e condimentares’. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão da bolsa de estudos. Aos Professores responsáveis pelos Laboratórios e Viveiros do Campus da Universidade Federal do Tocantins, onde pude desenvolver a pesquisa, especialmente no Laboratório de Química Fitopatologia e viveiro de plantas medicinais. Também, Tallyta, Ryhára, Raiana, Rayssa e Bruno, que contribuíram bastante para o desenvolvimento do projeto e especialmente a minha irmã Talita por ter me ajudado em todas as etapas. E o orientador, Dr. Prof. Luiz Gustavo de Lima Guimarães, pelos conhecimentos passados e pelo trabalho multidisciplinar, pelo respeito e confiança e que Deus lhe abençõe ricamente na sua nova jornada. “Aprendemos que tudo na vida tem um sentido, que tudo faz parte do propósito de Deus, que no final tudo será melhor”. SUMÁRIO RESUMO .................................................................................................................. 12 ABSTRACT............................................................................................................... 13 CAPÍTULO I .............................................................................................................. 14 1 INTRODUÇÃO GERAL.......................................................................................... 15 2 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................ 16 2.1 OS ÓLEOS ESSENCIAIS .................................................................................. 16 2.1.1 Atividades fungitóxicas dos óleos essenciais ........................................... 17 2.1.2 Fatores que influenciam os teores e a composição do óleo essencial .... 19 2.1.3 Influência da secagem na composição dos óleos essenciais .................. 21 2.2 PLANTAS BIOATIVAS ....................................................................................... 23 2.2.1 Gênero Hyptis sp. .......................................................................................... 24 2.2.2 A espécie Lippia Sidoides Cham. ................................................................ 27 2.2.3 A espécie Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf. ............................................ 30 2.4 MICRORGANISMOS FITOPATOGÊNICOS DO FEIJÃO .................................. 33 2.4.1 Rhizoctonia solani ......................................................................................... 34 2.4.2 Sclerotium rolfsii ........................................................................................... 35 2.5 BIOCONTROLE ................................................................................................. 36 3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 37 CAPITULO II ............................................................................................................. 52 Óleo essencial de Hyptis glomerata Mart. Ex Schrank: Influência de métodos de secagem sobre o rendimento e a composição química e atividades fungitóxicas. ... 52 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 52 2 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 53 2.1. OBTENÇÃO DO MATERIAL VEGETAL E EXTRAÇÃO DOS ÓLEOS ESSENCIAIS. ........................................................................................................... 55 2.2 SECAGEM ......................................................................................................... 55 2.3 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE UMIDADE ....................................................... 55 2.4 EXTRAÇÃO DOS ÓLEOS ESSENCIAIS ........................................................... 56 2.5 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS............................... 56 2.6 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E ANÁLISE ESTATÍSTICA ....................... 57 2.7 OBTENÇÃO DOS ISOLADOS ........................................................................... 57 2.8 ATIVIDADE FUNGITÓXICA DO ÓLEO ESSEÊNCIAL DE Hyptis glomerata..... 58 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 59 3.1 Hyptis glomerata ................................................................................................ 59 3.2 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DAS FOLHAS DE Hyptis glomerata SUBMETIDAS À DIFERENTES MÉTODOS DE SECAGEM. . 61 3.3 ATIVIDADE FUNGITOXIDADE DO ÓLEO ESSENCIAL DE Hyptis glomerata ... 64 4 CONCLUSÃO ....................................................................................................... 67 5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 67 CAPÍTULO III ............................................................................................................ 73 ATIVIDADE FUNGITÓXICA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DE Lippia sidoides Cham. E DE Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf. NO CONTROLE DA PODRIDÃO DO COLO DO FEIJOEIRO COMUM. ......................................................................................... 73 1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 74 2 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 76 2.1 OBTENÇÃO DO MATERIAL VEGETAL E EXTRAÇÃO DOS ÓLEOS ESSENCIAIS. ............................................................................................................ 76 2.2 ISOLAMENTO DOS FUNGOS UTILIZADOS NOS BIOENSAIOS ..................... 76 2.3 ATIVIDADE BIOLÓGICA IN VIVO PARA INIBIÇÃO DOS MICÉLIOS ............... 77 2.4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL................................................................... 78 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 79 3.1 AÇÃO FUNGITÁSTICA ....................................................................................... 79 4 CONCLUSÃO ....................................................................................................... 85 5 REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA .......................................................................... 86 ANEXO A .................................................................................................................. 89 Lista de Figuras Figura 1: Aspecto geral de uma planta da espécie Hyptis glomerata Mart. Ex Schrank no município de Gurupi - Tocantins............................................................. 25 Figura 2: Aspecto Geral de um arbusto de Lippia sidoides, no município de Gurupi Tocantins ................................................................................................................... 27 Figura 3: Estruturas químicas do timol (A) e do cravcrol (B) .................................... 28 Figura 4: Aspecto Geral de uma touceira de Cymbopogon citratus (D. C.) Stapf, no município de Gurupi - Tocantins................................................................................ 31 Figura 5: Estruturas químicas do neral (A) e do geranial (B). ................................... 32 Figura 6: Efeito das concentrações do óleo essencial C. citratus e seu constituinte majoritário citral em relação a severidade da podridão do colo, causada por Sclerotium rolfsii em caule de plantas de feijoeiro comum. ...................................... 80 Figura 7 - Efeito das concentrações do óleo essencial de Lippia sidoides - MG e seu constituinte majoritário Carvacrol em relação à severidade da doença causada pelo fungo Sclerotium rolfsii em caule de plantas de feijoeiro comum .............................. 82 Figura 8 - Efeito das concentrações do óleo essencial Lippia sidoides - CE e seu constituinte majoritário Timol em relação à severidade da podridão do colo, causada pelo fungo Sclerotium rolfsii em plantas de feijoeiro comum. ................................... 83 Lista de Tabelas Tabela 1: Valores médios dos rendimentos dos óleos essenciais das folhas de Hyptis glomerata no município de Gurupi - Tocantins submetidas a diferentes métodos de secagem, expressos em p/p BLU (base livre de umidade). ................... 60 Tabela 2: Constituintes químicos dos óleos essenciais das folhas frescas e secas de Hyptis glomerata coletados no município de Gurupi – Tocantins e os seus respectivos teores expressos em porcentagem ........................................................ 61 Tabela 3: Atividade fungitóxica do óleo essencial de Hyptis glomerata expressa em relação a inibição do crescimento micelial de Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii. ...................................................................................................................... 64 Tabela 4: Critérios de notas para avaliar a severidade . ........................................... 78 Tabela 5: Análise de variância com aplicação do teste F para os valores observados de rendimentos do óleo essencial das folhas do pau-da-vitória submetidas a diferentes métodos de secagem. .............................................................................. 89 Tabela 6: Análise de variância com aplicação do teste F para o efeito do óleo essencial de Hyptis glomerata sobre a inibição do crescimento micelial de Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii. ...................................................................... 89 12 RESUMO FERREIRA, Tatiani Pereira de Souza. Óleos Essenciais: influência de métodos de secagem sobre o rendimento, composição e atividades fungitóxicas. 2013. 89 p. Dissertação (Mestrado em Produção Vegetal) – Universidade Federal do Tocantins, Tocantins, TO. O presente trabalho buscou analisar a aplicação dos óleos essenciais de três plantas medicinais bioativas, como fungicidas alternativos na cultura do Phaseolus vulgaris (feijão comum). Foram analisados a eficiência dos óleos essenciais de Lippia sidoides, quimiotipos timol e carvacrol, do óleo essencial de Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf., que possui como constituinte majoritário o citral (mistura iomérica de geranial e neral), bem como de seus constituintes puros, por meio de ensaios in vivo.Este trabalho também teve como objetivo avaliar a influência de alguns métodos de secagem sobre o rendimento e a composição do óleo essencial das folhas de Hyptis glomerata (pau-da-vitória), bem como determinar o potencial fungitóxico do óleo essencial desta espécie, por meio de ensaios in vitro, sobre a inibição do crescimento micelial dos fitopatógenos Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii. Os óleos essenciais foram extraídos por hidrodestilação, utilizando-se o aparelho de Clevenger modificado, para realização das atividades “in vivo”, os ensaios foram dispostos de forma inteiramente casualizada, em esquema fatorial de (8 compostos x 5 doses) e 4 repetições. Em relação ao óleo essencial de H. glomerata, seu rendimento foi observado nas folhas frescas e folhas secas, sendo utilizado quatro métodos de secagem. Os mesmos foram caracterizados por CG-EM e a atividade fungitóxica avaliada por meio de ensaios in vitro, com os tratamentos arranjados em esquema fatorial de 2 x 5 com 3 repetições,sendo constituídos pelas combinações de dois fungos fitopatogênicos e cinco concentrações do óleo essencial. A avaliação do rendimento perante os métodos de secagem, foi realizado em delineamento inteiramente casualizado, com 3 repetições. Os óleos essenciais de L. sidoides, C. citratus e seus constituintes majoritários, não foram eficazes no controle do progresso dos sintomas causados em plantas de P. vulgares frente a contaminação com S. rolfsii. Em relação aos teores do óleo essencial de H. glomerata, as folhas sobmetidas à secagem na sombra apresentaram o maior rendimento. O método de secagem influenciou na composição do óleo essencial H. glomerata, que apresentou o sesquiterpeno oxigenado, óxido de cariofileno, como constituinte majoritário. O óleo essencial desta espécie apresentou efeito fungitóxico, sendo capaz de causar a inibição do crescimento micelial de R. solani e S. rolfsii, em até 74,40 e 47,34%, respectivamente. As folhas de H. glomerata apresentam teores de óleo essencial, semelhantes aos apresentados por plantas aromáticas, sendo o mesmo influenciado pelo processo de secagem, bem como a sua composição química. Palavras chave: Pau-da-vitória, fungitoxicidade, feijão comum. plantas medicinais, atividade biológica, 13 ABSTRACT FERREIRA, Tatiani Pereira de Souza. Essential Oils. Influence of Dryng Methods on the Yield, Composition and Fungitoxic Activities. 2013. 89 p. Dissertation (Master's degree in Vegetable Production) - Federal University of the Tocantins, Tocantins, TO. This study aimed to analyze the application of essential oils from three bioactive medicinal plants, as alternative fungicides in the culture of Phaseolus vulgaris (common bean). The efficienty of essential oils of Lippia sidoides, Carvacrol, Thymol chemotypes and of Cymbopogon citratus (DC) Stapf., that has citral (mixture of iomerica geranial and neral), as main constituent, as well as its pure constituents, were analyzed by testing in vivo. This paper was also carried out to evaluate the influence of some drying methods on yield and composition of essential oil, from the leaves of Hyptis glomerata (“pau-da-vitória”), as well as to determine the potential of fungitoxic essential oil of this specie, by means of essays in vivo, on the inhibition of mycelial growth of phytopathogenic Sclerotium rolfsii and Rhizoctonia solani. The essential oils were extracted by hydrodistillation, using a modified Clevenger apparatus for performing activities “in vivo”. Trials were arranged in completely random factorial scheme (compounds 8 x 5 doses) and 4 replications. Regarding the essential oil H. glomerata, its yield was observed in the fresh and dried leaves, using four drying methods. These ones were characterized by GC-MS and fungitoxic activity was assessed by in vitro tests, with treatments arranged in a factorial scheme 2 x 5, with 3 replications, and constituted by combitanations of two pathogenic fungi and five concentrations of essential oil. The performace evaluation through drying methods, was conducted in a completely randomized design, with 3 replications. The essential oils of L. sidoides, C. citratus and its major constituents, were not effective in controlling the progress of the symptoms caused in plants of P. vulgaris, against contamination with S. rolfsii. Concerning the content of the essential oil of H. glomerata, that showed oxygenated sesquiterpene, caryophyllene oxide as major constituent. The essential oil of this species showed antifungal effect, being able to cause inhibition of mycelial growth of R. solani and S. rolfsii, up to 74,40% and 47,34%, respectively. The leaves of H. glomerata have essential oil levels, similar to those provided by aromatic plants, being influenced by drying process, as well as its chemical composition. Keywords: “Pau-da-vitória”, medicinal plants, biological activity, fungitoxicity, common bean. 14 CAPÍTULO I 15 1 INTRODUÇÃO GERAL Os produtos da biodiversidade brasileira, são muito abundantes por todo o país, os chamados produtos não madeireiros, são muito explorados, porém preocupa-se pela maneira predatória que são retirados da natureza. Dentre estes produtos encontram-se as plantas medicinais, tendo em vista com a retomada dos valores naturais e os conhecimentos etnobotânicos vêm sendo valorizados no meio científico. As plantas medicinais, possuem metabólicos secundários, que servem para a proteção da planta pela perda de água, defesa contra predadores, microrganismos e atração a insetos e pássaros para a reprodução. Dentre os metabólicos secundários se destaca os óleos essenciais, utilizados a milhares de anos, no embalsamento de cadáveres em cerimônias religiosas e para fins terapêuticos. Os óleos essenciais são constituídos por misturas de substâncias voláteis, sendo importantes para as industrias farmacêutica, cosmética e alimentícia. Estes metabólitos, também possuem propriedades que podem atuar contra microrganismos patogênicos, na medicina e agropecuária. Porém, há poucos estudos sobre os mesmos na agropecuária, que utiliza-se de tratamentos convencionais com os defensivos químicos, que vem causando impactos sobre os inimigos naturais e promovendo resistência dos insetos e dos microrganismos. Atualmente, estão sendo buscados produtos alternativos que podem ser utilizados no manejo de doenças. Estes por sua vez apresentam como vantagens não poluir o meio ambiente, incluindo a não poluição do lençol freático e a não agressão ao homem, animais, plantas e microorganismos úteis. As espécies Hyptis glomerata, Lippia sidoides Cham. e Cymbopogon citratus (D. C) Stapf. possuem uma grande importância econômica por possuírem óleos essenciais, tanto para uso cosmético, como condimentar, aromático e/ou medicinal, possuindo compostos que podem ser utilizados como defensivos naturais ou associado aos mesmos, tendo em vista suas propriedades ecologicamente saudáveis, uma vez que os mesmos são constituidos por compostos praticamente atóxicos. No Tocantins, o clima é favorável para o aumento da área de cultivo do feijão (Phaseolus vulgaris L.) o qual ainda não é tradicionalmente cultivado. Conforme os 16 dados da CONAB no Estado do Tocantins na safra 2009/2010 e safra 2010/2011 a produtividade média de grão foi de 1.051kg ha-1 e 2.139 kg ha-1, respectivamente, superando a média nacional de 945 kg ha-1 (OLIVEIRA et al., 2012). Apesar da produtividade do feijoeiro no Tocantins ser economicamente favorável, o feijoeiro pode ser infectado por vários patógenos habitantes do solo de importância epidemiológica que dentre os agentes causais encontra-se a mela e podridão radicular do feijoeiro comum causadas pelo fungo Rhizoctonia solani e a podridão do colo do feijoeiro comum causada pelo fungo Sclerotium rolfsii. O presente trabalho teve como objetivos avaliar o rendimento e a composição química do óleo essencial das folhas de Hyptis glomerata Mart. Ex Schrank submetidas a diferentes condições de secagem e a atividade fungitóxica do mesmo sobre a inibição do crescimento micelial dos fitopatógenos Sclerotium rolfsii e Rhizoctonia solani. E avaliar a atividade “in vivo”, dos óleos essenciais de Lippia sidoides Cham. dos acessos de Minas Gerais e Ceará, de Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf. e de seus constituintes majoritários, carvacrol, timol e citral, respectivamente, sobre os efeitos causados pelo fitopatógeno Sclerotium rolfsii, em plantas de Phaseolus vulgaris L. 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 OS ÓLEOS ESSENCIAIS Os óleos essenciais são definidos quimicamente como misturas de substâncias orgânicas voláteis, constituído por fenilpropanóides, monoterpenos e sesquiterpenos (CARDOSO et al., 2005). Outra designação dado a eles e que são óleos etéreos ou voláteis que se destacam pelas propriedades organolépticas e físico-químicas tais como: aroma agradável, lipossolúvel, solubilidade em solventes orgânicos apolares, quando recém-extraídos são geralmente incolores ou ligeiramente amarelados, porém, alguns podem apresentar coloração intensa. São instáveis na presença de luz, umidade, calor e metais, podendo sofrer polimerizações, ciclizações, dimerizações e oxidações (RADÜNZ, 2004; CARDOSO et. al, 2005; SIMÕES, 2007; BAKKALI et al., 2008; DUSSAULT et al., 2014). 17 Os óleos essenciais são obtidos por meio de destilação por arraste a vapor ou hidrodestilação de partes de plantas bem como os produtos obtidos por expressão dos pericarpos de frutos cítricos. Podem ser encontrados em todas as partes da planta, como nas flores, folhas, caules, galhos, sementes, frutos, raízes. São armazenados em estruturas diferenciadas, como células secretoras, cavidades, canais oleíferos, tricomas glandulares, entre outras (Simões et al., 2007; BAKKALI et al., 2008). Na natureza, os óleos essenciais, desempenham um papel importante na proteção das plantas, podendo atuar como agentes antibacterianos, antivirais, antifúngicos, inseticidas e também contra herbívoros por redução do apetite (BAKKALI et al., 2008). Eles também podem atrair alguns insetos favorecendo a dispersão de pólen e sementes, ou repelir outros indesejáveis (TAIZ e ZEIGER, 2009). Segundo, Bertolucci e Pinheiro (2007) aos óleos essenciais são atribuídas algumas ações genéricas, como: i) ação eupéptica (digestiva); estimulantes do apetite e da digestão, por via reflexa, com aumento das secreções; salivar, gástrica entérica:óleo essencial de orégano, manjericão, sálvia, tomilho, etc.; ii) carminativa: erva doce, funcho, camomila, melissa; iii) rubefaciente ou hiperemizante local: óleo essencial de menta, pelo alto conteúdo de mentol ecânfora ; iv) antisséptica: ação bactericida/bacteriostática (de uso tópico ou sistêmico), anti-séptica das vias respiratórias, expectorante, diurética: óleo essencial de cravo, devido ao eugenol; de eucalipto; pela presença de grande quantidade de eucaliptol (1,8-cineol); v) ação sobre sistema nervoso central: esta ação pode ser estimulante, como dos óleos essenciais de menta; tomilho, sálvia, e funcho e sedativa ou calmante, como dos óleos essenciais da camomila; alfazema e melissa. 2.1.1 Atividades fungitóxicas dos óleos essenciais Os fungos estabelecem grupos numerosos de organismos, bastante diferenciados filogeneticamente e de grande valor ecológico e econômico (BERGAMIN FILHO et al., 1995). Sua atual classificação inclui todos os microrganismos eucariontes, heterotróficos, que se nutrem por absorção, com desenvolvimento ramificado e que se reproduzem por esporos (KENDRICK, 2000). 18 Na agricultura estes organismos trazem danos severos à produção agrícola, estudos “in vitro” e “in vivo” realizados por pesquisadores constataram que os óleos essenciais com suas propriedades antifúngicas são potenciais no controle dos microrganismos. Aquino et al. (2012) avaliaram o efeito fungitóxico e a composição química dos óleos essenciais das espécies medicinais, alecrim-pimenta (Lippia sidoides Cham.), capim-santo (Cymbopogon citratus (D. C.) Stapf.) e de alfavacacravo (Ocimum gratissimum L.), no manejo da antracnose do maracujá, o óleo de C. citratus proporcionou o menor diâmetro das lesões nos frutos, até a concentração de 6 μL mL-1, na concentração de 8 μL mL-1, todos os óleos inibiram o desenvolvimento do fungo. O timol (30,24%), o citral (77,74%) e o eugenol (92,89%) foram componentes majoritários em L. sidoides, C. citratus e O. gratissimum, respectivamente. Ainda, em estudos realizados “in vitro” com o fitopatógeno do maracujazeiro, Colletotrichum gloeosporioides Penz, Silva et al. (2009) constataram que 100 μL dos óleos essenciais de alecrim de vargem (Família Lamiaceae), alecrim-pimenta (Lippia sidoides), alfavaca cravo (Ocimum gratissimum), lippia (Lippia citriodora), goiaba branca (Psidium guajava), capim-santo (Cymbopogon citratus), acrescido no meio de cultura foram capazes de impedir a germinação deste fungo em até 100%. Nguefack et al. (2009) demosntraram em seus experimentos que os óleos essenciais de C. citratus, O. gratissimum e de T. vulgaris apresentaram alta capacidade de preservação de alimentos contra duas cepas micotoxigênicas de cada fungo: Aspergillus ochraceus , Penicillium expansum e Penicillum verrucosum . Sendo o óleo essencial de O. gratissimum o mais ativo, seguido pelos óleos essenciais de C. citratus e de T. vulgaris. No mesmo trabalho foi observado que os três óleos essenciais são mais ativos do que o conservante sintético, sorbato de potássio. Em outro trabalho, Nguefack et al. (2004) avaliando o efeito do óleo essencial do C. citratus sobre o crescimento micelial de fungos, por meio de ensaios “in vitro”, foi observado que o óleo essencial reduziu em 64% o desenvolvimento de Fusarium moniliforme na concentração de 200 ppm, de Aspergillus flavus em 48% e de Aspergillus fumigatus em 77% na concentração de 500 ppm. O controle total ocorreu a 300 ppm para F. moniliforme e 1200 ppm para A. flavus e A. fumigatus. O óleo essencial de C. citratus e o citral, seu constituinte majoritário, apresentaram efeito fungitóxico, ocasionando a inibição no crescimento micelial de Rhizoctonia solani e 19 Sclerotium rolfsii fungos fitopatogênicos que atacam a cultura do feijão (GONÇALVES, 2012). Estudos de Sarmento-Brun (2012) analisando os efeitos de diferentes concentrações dos óleos essenciais de C. citratus e C. nardus, sobre a inibição do crescimento micelial de fungos fitopatogênicos, constataram que ambos os óleos essenciais foram capazes de inibir o crescimento micelial de Sclerotium rolfsii. No entanto, sobre a inibição do desenvolvimento de Didymella bryoniae, Rhizoctonia solani, o óleo essencial de C. citratus foi o mais eficiente, uma vez que os fitopatógenos apresentaram crescimento micelial somente perante a menor concentração do mesmo. Diante destes estudos é possível observar a importância dos óleos essenciais no controle de doenças causadas por fitopatógenos sobre diversas culturas. Com o aumento da demanda por produtos de maior qualidade, a busca de novas tecnologias é necessária para que o manejo fitossanitário possa ser feito de forma menos agressiva, tanto em termos ambientais quanto econômicos e sociais (DAYAN et al., 2009). 2.1.2 Fatores que influenciam os teores e a composição dos óleos essenciais A produção de óleo volátil em plantas é altamente influenciada por fatores genéticos, ecofisiológicos e ambientais (BROWN Jr 1988; SANGWAN et al., 2001). Além disso Gobbo-Neto e Lopes (2007) citam outros fatores que podem influenciar na produção dos óleos voláteis em plantas, sendo estes: i) sazonalidade, ii) índice pluviométrico, iii) radiação UV, iv) ritmo circadiano, v) composição atmosférica, vi) herbívora e ataque de patógenos, vii) idade da planta, viii) temperatura, viiii) altitude, x) temperatura, xi) água micronutrientes e xii) macronutrientes. Desta forma é de grande importância o reconhecimento e a compreensão dessas variações que auxiliam na ampliação dos conhecimentos sobre interações ecológicas do vegetal com seu ambiente. Botrel et al. (2010), estudaram os rendimentos dos óleos essenciais de Hyptis marrubioides em relação a dois tipos de plantio, em campo e em casa de vegetação, observaram o maior teor de óleo volátil nas folhas das plantas cultivadas no campo do que nas plantas cultivadas em casa de vegetação. De acordo com os autores tal 20 efeito deve-se às condições ambientais a que estas plantas foram submetidas. No cultivo em casa de vegetação as plantas foram cultivadas em vasos, o que pode ter limitado o desenvolvimento e crescimento do sistema radicular. No campo, os fatores que podem ter beneficiado a produção de óleos essenciais, foram o maior desenvolvimento do sistema radicular, ocasionando maior exploração do solo em busca de nutrientes, e outro fator poderia ter sido a luminosidade. Em estudos de Martins et al. (2006) verificaram os fatores ambientais interferentes na composição química do óleo essencial de plantas de Hyptis suaveolens provenientes de uma população cultivada em Alfenas, indicaram os seguintes fatores: i) fatores edáficos; ii) idade da planta, inteirada com a disponibilidade nutricional e iii) fatores endógenos, que segundo o autor contribuiu para o polimorfismo químico verificado em H. suaveolens. Outros estudos demonstraram diferenças na variabilidade do teor e da composição química do óleo essencial de Hyptis suaveolens (erva-canudo), tais variações foram atribuídas à origem geográfica das plantas, tendo em vista que as coletas foram feitas em locais distintos, no país de EL Salvador nas cidades da região sul, norte e leste. (GRASSI et al., 2005). Porém, populações naturais de plantas que ocorrem ao longo de um gradiente ambiental variam quanto à constituição genética e atividade fisiológica, embora pertencendo à mesma espécie, e podem responder de modo muito diferente às condições ambientais vigentes (MARTINS et al., 2006). Sales et al. (2009), enfatizam que o teor e a composição do óleo essencial das plantas aromáticas, como as pertencentes ao gênero Hyptis, dependem de diferentes fatores. As condições de cultivo, clima, origem geográfica, época de colheita, tipo e uso de fertilizantes além da nutrição mineral, podem afetar consideravelmente a produção e a qualidade do óleo. Segundo Silva et al. (2003), os teores de óleo essencial podem ser influenciados pelas diferentes umidades e temperaturas ao longo do dia. Dessa forma, o conhecimento do horário ideal para colheita das plantas, visando à obtenção de maiores teores de princípios ativos, é de fundamental importância nas decisões agronômicas de produção. Leal et al. (2003) notaram haver apenas uma discreta variação nas concentrações de timol nas amostras de tintura de Lippia sidoides produzidas a partir das folhas coletadas antes, durante e depois da floração das plantas. O melhor 21 momento para a coleta da planta é após a sua floração, considerando que o teor determinado neste momento do desenvolvimento da planta (2,34±0,06 mg/ml) foi maior do que o encontrado nas demais tinturas da planta antes da floração (1,97±0,07 mg/ml) e durante a floração (2,00±0,03 mg/ml). 2.1.3 Influência da secagem na composição dos óleos essenciais A secagem é um processo que consiste na remoção de grande parte da água inicialmente contida no material vegetal, a um nível máximo de teor de água no qual possa ser armazenado por longos períodos, sem que ocorram perdas significativas (MARTINAZZO et al., 2010). O processo de secagem de plantas aromáticas e medicinais consiste em diminuir o máximo possível a perda de substâncias ativas, além de retardar a sua deterioração em decorrência da redução da atividade enzimática. Assim, este procedimento é útil para conservar o material vegetal, já que permite um aumento do tempo para a sua comercialização e/ou uso (COSTA et al., 2005). No entanto, a secagem ideal é aquela que não é rápida e nem lenta demais, porém sua duração depende das características da planta que é colocada para secar, das condições climáticas durante os dias de secagem, bem como, das boas condições das instalações de secagem (VON HERTWIG, 1991; SILVA e CASALI, 2000, PINTO et al., 2006). Os fatores que favorecem uma boa secagem são: i) iniciar a secagem imediatamente após a colheita; ii) ao efetuar a secagem em recinto sombreado; iii) proporcionar uma boa circulação de ar para as partes vegetais; iv) o ar que circula por entre as plantas deve conter algum calor para favorecer a extração da umidade das mesmas e v) dispor de instalações adequadas para a secagem (PINTO et al., 2006). A temperatura de secagem deve ser controlada, tendo em vista a necessidade de estudos que avaliem a influência da mesma, de forma a conhecer a temperatura de secagem mais apropriada para cada espécie, visando assegurar os maiores teores de princípios ativos e composição química adequada dos óleos essenciais (BLANCO et al., 2000). Quando o processo de secagem ocorrer de forma demasiadamente rápida, pode ocasionar um endurecimento da camada superficial das células do tecido, impedido a evaporação da água dentro das células dos órgãos vegetais. Sendo 22 importante ressaltar que teores de umidade acima de 20% permitem que as enzimas atuem e destruam os princípios ativos, comprometendo a eficácia dos mesmos e a composição dos óleos essenciais (PINTO et al., 2006). De acordo com Martins (2000), as pesquisas mais recentes sobre secagem de plantas medicinais têm oportunizado os seguintes parâmetros: i) temperatura e velocidade do ar de secagem, ii) umidade relativa do ar dentro e fora do sistema de secagem, iii) temperatura do material e iv) pressão estática em função da altura da camada do produto. Muitos estudos têm sido realizados com o intuito de verificar a influência das formas de secagem sobre a produção e composição dos óleos essenciais de diversas plantas aromáticas. Arrigoni-Blank et al. (2010), estudando o horário de colheita e a influência da secagem sobre o rendimento do óleo essencial das folhas de Hyptis pectinata L. Poit (Lamiaceae), constataram que a secagem ou não das folhas em diferentes horários de colheita (8:00, 12:00 e 16:00 horas), não influencia no teor do óleo essencial, sendo viável a colheita em qualquer horário do dia, podendo-se utilizar folhas frescas ou secas. Radüz et al. (2001) estudaram diferentes temperaturas de secagem sobre as folhas de L. sidoides obtiveram 2,93% de óleo essencial para a planta fresca (testemunha), entretanto para a amostra seca com ar ambiente ocorreu uma redução de 8% o teor de óleo essencial, enquanto que a secagem com temperatura do ar a 40, 50, 60 e 70ºC não apresentaram diferenças notáveis entre si, ocorrendo 2% de decréscimo em relação à testemunha. Na análise qualitativa o percentual de timol não sofreu variação nas temperaturas estudadas em relação à testemunha, mas o teor de carvacrol teve pequena redução com o acréscimo na temperatura do ar de secagem. Entretanto, Raduz et al. (2002) concluíram em outro trabalho que as temperaturas do ar de secagem de 40, 50, 60 e 70°C não afetaram os rendimentos de p-cimeno e timol do óleo essencial extraído das folhas de L. sidoides , em relação ao material fresco, porém o rendimento extrativo de (E)-cariofileno aumentou com o incremento na temperatura do ar de secagem. Barbosa et al. (2006) observaram que a secagem de L. alba com temperatura do ar variando de ambiente até 80 °C resultou em uma redução entre 12 e 17% no teor de óleo essencial em relação ao obtido para a planta fresca. Nessas condições o teor de citral (geranial + neral) no óleo essencial obtido das plantas secas foi, em 23 média, 82,63% que é aproximadamente 6,89% maior que o encontrado no óleo obtido das plantas frescas (75,74%). Soares et al. (2007), perceberam que a influência da temperatura do ar de secagem e da velocidade do mesmo sobre a composição química do óleo essencial das folhas de manjericão (Ocimum basilicum L), foram estudadas as temperaturas de 40, 50, 60 e 70 ºC, em camada fina, e duas velocidades do ar (0,9 e 1,9 m/s). Por análise de regressão, estimou-se que a temperatura de 54,4 ºC e a velocidade de 1,9 m/s forneceriam o maior rendimento de linalol, percebendo que a composição química do óleo essencial do manjericão é afetada tanto pela temperatura como pela velocidade do ar de secagem. Mohamed Hanaa et al. (2012), realizaram a secagem das folhas de C citratus por meio de três métodos diferentes de secagem (secagem ao sol durante 36 horas, à sombra durante 48 horas e secagem em estufa a 45 °C durante 7 h), demosntraram diferenças significativas nos teores dos óleos essenciais das folhas submetidas aos diferentes métodos de secagem. Sendo observado que as folhas secas em estufa apresentarm o maior percentual de óleo essencial (2,45%) em comparação aos teores apresentados pelas folhas secas à sombra (2,12%) e ao sol (2,10%). Chegaram ao seguinte resultados que a secagem de folhas de C. citratus no forno a 45 ° C durante 7 h. é mais adequado e recomendado para a obtenção de maior teor de óleo essencial. Considerando que, para as maiores porcentagens de componentes principais (geranial e neral) secagem à sombra, com fonte de ventilação para 48 h é mais adequado. 2.2 PLANTAS BIOATIVAS Algumas plantas possuem dentre seus metabólitos secundários, compostos que podem ser utilizados para o desenvolvimento de novos defensivos naturais ou serem precursores de semi-síntese, no desenvolvimento de produtos que não agridam ao meio ambiente e que não seja tóxico para os consumidores (MORANDI e BETTIOL, 2009). O Brasil possui uma grande biodiversidade de espécies vegetais, que se apresentam como uma importante fonte de obtenção destas substâncias (KORDALI et al., 2008). 24 2.2.1 Gênero Hyptis sp. O gênero Hyptis pertece ao reino: Plantae, divisão: Magnoliophyta; classe: Magnoliopsida; família: Lamiaceae. Este gênero é composto por ervas, subarbustos, arbustos ou raramente árvores pequenas. Os caules geralmente são quadrangulares, as folhas opostas, simples ou mais raramente partidas, pecioladas ou sésseis ou curtamente pedunculadas, contendo substâncias aromáticas (BORDIGNON, 1990). As plantas do gênero Hyptis encontram-se distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais, desde a América do Norte e o Caribe, até o Peru e Argentina, com apenas algumas espécies presentes no Velho Mundo. A maioria é encontrada no cerrado, sendo raramente encontradas em áreas úmidas (SILVA-LUZ et al., 2012). A espécie Hyptis glomerata Mart. Ex Schrank (Figura 1) é sublenhosa, odorífera, apresenta flor lilás possuindo poucos registros sobre a mesma, porém sabe-se que ela é originária da Ámerica do Sul. No Brasil sua ocorrência é comum na chapada de Minas Gerais, Tocantins e Goiás (FERREIRA, 2009; SAINT – HILAIRE, acesso em: 02/12/2013). Rocha-Coelho et al. (2005) realizando um levantamento etnobotânico na Comunidade Mumbuca, localizada no Parque Estadual do Jalapão, encontrou a Hyptis glomerata nesta região, onde é conhecida popularmente como pau-da-vitória. Nesta região esta planta é de grande interesse medicinal, sendo utilizada como cadiotônica. 25 Figura 1: Aspecto geral de uma planta da espécie Hyptis glomerata Mart. Ex Schrank no município de Gurupi - Tocantins (Fonte: própria). Estudos sobre a composição química de óleos essenciais de algumas espécies de plantas pertencentes ao gênero Hyptis têm relatado a predominância de compostos terpênicos nos mesmos. Trabalhos com o óleo essencial das folhas de Hyptis pectinata, demonstraram a predominância de sesquiterpenos em sua composição, sendo a calamusenona (24,68%) o constituinte majoritário, seguida pelo (E)-cariofileno (18,34%) e óxido de cariofileno (18,00%) (SANTOS et al., 2008). Moreira et al. (2010), estudaram a caracterização química do óleo essencial de Hyptis suaveolens (L.) e encontraram como constiuintes majoritários 1,8-cineol (47,64%) seguido pelo γelemeno (8,15%), β-pineno (6,55%), (+)-3-careno (5,16%), (E)-cariofileno (4,69%) e germacreno D (4,86 %). A avaliação da composição química dos óleos essenciais das folhas, flores e sementes de Hyptis fruticosa Salzm. Após o tratamento estatístico dos dados por análise de agrupamento, 26 demonstrou a predominância dos compostos 1,8-cineol, espatulenol, α-pineno, βpineno como principais constituintes, havendo a predominância de sesquiterpenos nas sementes (FRANCO et al., 2011). Sales et al. (2007) estudando a variabilidade dos principais constituintes químicos dos óleos essenciais de H. marrubioides, coletadas em duas localidades do cerrado brasileiro, encontraram a predominância dos compostos cariofila4(14),8(15)-dien-5β-ol, eudesma-4(15),7-dien-1β-ol, óxido de cariofleno e (β)cariofleno. A caracterização do óleo essencial das folhas, inflorescência e do tronco de Hyptis glomerata, nativas de Minas Gerais, apresentou um total de 19 compostos, sendo os principais constituintes β(E)-cariofileno (folha 14,3%; caule 8,6%), γcadinene (cerca de 14% em todas as partes), guaiol (folhas 10,7%; inflorescência 9,4%), s-calameneno (caule, 11,4%) e globulol (inflorescência, 16,8%) (SILVA et al., 2000). As atividades biológicas de óleos essenciais de plantas pertencentes ao gênero Hyptis têm sido relatadas em alguns trabalhos, com substâncias com potencial farmacológico, principalmente atividades anti-microbiana, antifúngica, citotóxica, anti-inflamatória, inseticida, antiulcerogênica, nematicida e antinociceptivo (NOVELO, et al., 1993; URONES et al., 1998; OLIVEIRA et al., 2004; FACEY et al., 2005; SILVA et al., 2006; SANTOS et al., 2007; ROCHA-COELHO, 2005). Moreira et al. (2010) avaliaram o efeito inibitório do óleo essencial de Hyptis suaveolens (L.) sobre alguns fungos patogênicos pertencentes ao gênero Aspergillus (A. flavus, A. parasiticus, A. ochraceus, A. fumigatus e A. niger) mostrando que o óleo essencial mostrou atividade de amplo espectro contra as espécies. Em especial os fungos A. fumigatus e A. parasiticus, o efeito do óleo essencial das folhas de H. suaveolens a 40 e 80 mL/mL, teve efeito letal de 100% contra ambos os fungos ao longo de 14 dias de exposição. Também foi constatada a capacidade deste óleo em causar alterações morfológicas sobre o A. flavus, como diminuição da conidiação, vazamento do citoplasma, perda de pigmentação e estrutura celular alterada, sugerindo degeneração da parede fúngica e revelando o potencial de tal óleo essencial no tratamento de aspergilose. Malele et al. (2003) relataram uma forte atividade anti-fúngica para o óleo das folhas de H. Suaveolens a 500 e 1000 μg mL contra Saccharomyces cerevisiae, Mucor sp. e Fusarium moniliforme. Souza et al. (2003) analisaram a atividade 27 antifúngica de Hyptis ovalifolia sobre 60 dermatófitos, na concentração de 1.000 μg/ml o óleo essencial inibiu 100% de 60 dermatófitos testados. 2.2.2 A espécie Lippia sidoides Cham. Esta espécie pertence ao reino: Plantae, divisão: Magnoliophyta; classe: Magnoliopsida; Ordem: Lamilales; Família: Verbanaceae e Gênero: Lippia. Também é conhecida no nordeste brasileiro como alecrim grande, estrepa cavalo entre outros. É uma planta aromática, e muito encontrada nas regiões nordeste do Brasil e norte de Minas Gerais. É um arbusto silvestre (Figura 2), com até 3 m de altura, folhas simples, compostas, com margens crenadas, pelos esbranquiçados na face inferior, aromáticas e de sabor picante, daí a denominação alecrim-pimenta. Apresenta flores de cor branca, em racimos, cálice curto e membranáceo e caule quebradiço (PINTO et al., 2007). Figura 2: Aspecto geral de um arbusto de Lippia sidoides Cham no Município de Gurupi – Tocantins (Fonte: própria). 28 A planta de alecrim pimenta possui um grande potencial para a exploração comercial devido suas diversas aplicações (LOPES et al., 2011), destacando-se pelo uso na produção de antissépticos, que têm grande importância na área da farmácia, medicina, odontologia e saúde pública. Na medicina popular, L. sidoides tem sido utilizada para tratamento de acnes, sarna infectada, pitiríase versicolor, dermatomicoses, impinges, pano branco, escabiose, caspa, maus odores nos pés e axilas, aftas, inflamação de boca e de garganta (MATOS, 2002; MATOS, 2004). Sendo a principal forma de aproveitamento das substâncias ativas desta planta ocorrendo por meio da extração do óleo essencial, que possui como constituinte majoritário o timol (Figura 3), composto responsável pelo alto poder antisséptico do óleo essencial das folhas desta espécie (MATOS et al., 1999; SOUSA et al., 2004). Segundo Matos (2000) suas folhas podem apresentar um teor de óleo essencial de até 4,5%, sendo encontrados compostos como o timol, carvacrol, 1,8cinelol, ƿ-cimeno, 4-terpineol, timol-metiléter, (E)-cariofileno, entre outros. De acordo com Leal et al. (2003) o óleo essencial obtido das folhas de alecrim-pimenta possui uma ampla diversidade química, tendo como principal constituinte o timol, cujo teor pode variar entre 34,2 a 95,1% e/ou o carvacrol. Marco et al. (2012) teve como um dos objetivos de seu trabalho caracterizar quimicamente o óleo essencial de L. sidoides, cultivadas na região do Cariri cearense, do qual caracterizaram 97,82% de sua composição química, encontrando o timol como constituinte principal, com um teor de 84,90%. Por outro lado, Lima et al. (2011) trabalhando com o óleo essencial das folhas de L. sidoides nativas do sul de Minas Gerais, caracterizou 92,53% dos constituintes do mesmo, encontrando como constituinte majoritário o carvacrol (31,68%) (Figura 3),seguido pelo ρ-cimeno (19,58%), 1,8-cineol (9,26%), γ-terpineno (9,21%) e sabinene (5,26%), em menores teores foram encontrados timol-metil-éter (2,92%), timol (2,30%) e mirceno (1,97%) entre outros. OH OH A B Figura 3: Estruturas químicas do timol (A) e do cravcrol (B) (Fonte: própria). 29 De acordo com Cavalcanti et al. (2010), o óleo essencial de L. sidoides pode ser utilizado como um pesticida alternativo ecologicamente seguro contra Tetranychus urticae. Tais autores afirmam a possibilidade da atividade acaricida deste óleo essencial ser devido a provável sinergia entre os seus principais constituintes, timol, carvacrol e (E)-cariofileno. Oliveira et al. (2006) avaliaram a atividade óleo essencial da L. sidoides na inibição do crescimento de cepas de Staphylococcus aureus observando halos de inibição do crescimento bacteriano entre 15-21 mm. Botelho et al. (2007) avaliaram a atividade antibacteriana e antifúngica do óleo essencial da L. sidoides sobre microrganismos da cavidade bucal e os resultados mostraram atividade antimicrobiana frente Steptococcus mutans, S. mitis S.salivaris, S.sanguis e Candida albicans, com halo de inibição entre 8,5 e 34 mm. Girão et al. (2003) avaliando atividade de um creme dental preparado com óleo essencial desta espécie em cães que apresentavam doenças gengivais, demonstraram redução significativa nos parâmetros avaliados, como placa bacteriana, calculo dental, gengivite e infiltrado inflamatório em relação ao grupo controle. Alburqueque et al. (2013), observaram que a atividade antiaderente da folha da L. sidoides por meio de uma simulação “in vitro”, de um biofilme dental com as linhagens bacterianas Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis e Lactobacillus, mostrou-se efetiva na inibição de aderência das bactérias ensaiadas até uma concentração de 1:16. O seu efeito sobre Streptococcus mutans foi semelhante ao da clorexidina, demonstrando o efeito antiaderente de extrato de L. sidoides sobre os principais microrganismos responsáveis pela consolidação do biofilme dental. Ultee, Kets e Smid (1999), estudaram o mecanismo de ação do carvacrol sobre Bacillus cereus, demonstraram a capacidade do mesmo em interagir com a membrana desse microrganismo, alterando sua permeabilidade para cátions H+ e K+ e diminuindo a concentração intracelular de ATP. Para esses autores, a dissipação do gradiente de íons leva ao comprometimento dos processos essenciais na célula e, finalmente, à morte celular. Grupos polares e apolares presentes no anel aromático de compostos presentes nos óleos essenciais, ou nos compostos isolados, podem influenciar suas atividades biológicas. Segundo Sikkema, Bont e Poolman (1995), a presença de grupos hidroxilas presentes no eugenol e carvacrol podem aumentar a solubilidade 30 dessas moléculas na suspensão aquosa e, consequentemente, sua capacidade de passar através da porção hidrofílica da membrana celular. Gustafson et al. (1998), examinaram células de Escherichia coli expostas ao óleo essencial de melaleuca, com microscopia eletrônica de transmissão, confirmaram as alterações na membrana celular causadas pelos compostos presentes nesse óleo essencial, demonstrando a perda de material eletro-denso pela membrana e coagulação de alguns constituintes citoplasmáticos. Lambert et al. (2001), avaliaram a influência do óleo essencial de orégano e de seus constituintes majoritários timol e carvacrol sobre a integridade da membrana, demonstraram a perda de íons e a diminuição do pH interno das células de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus. De acordo com esses mesmos autores, tanto o óleo essencial quanto seus constituintes majoritários causam danos à membrana celular, atuam sobre os ácidos nucléicos intracelulares e causam a perda de potássio e fosfato das células desses microrganismos. O timol tem sido encontrado em formulações de cremes e antissépticos bucais (Euthymol® e Listerine®), pomadas descongestionantes (Vick®), pastilhas que aliviam tosse e irritação da garganta (Valda®), adesivos antiinflamatórios (Salonpas®) e como anti-séptico para higienização bucal de cães e gatos (Gelsept®) (VERAS, 2011). O que confirma o potencial comercial deste composto e de suas fontes, principalmente aquelas de origem natural, como o óleo essencial de L. sidoides. Por outro lado deixa claro o potencial deste óleo essencial no controle de microrganismos, e a possibilidade de substituição de compostos sintéticos na agricultura. 2.2.3 A espécie Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf. O capim-limão (Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf) (Figura 4) esta inserido no Reino: Plantae; Divisão: Magnoliophyta; Classe: Liliopsida; Ordem: Poales; Família: Poaceae; Gênero: Cymbopogon. É uma erva aromática, originária da Índia, de ciclo anual, bianual, ou perene, podendo chegar a até 2 m de altura, possui rizoma curto e horizontal com raízes fortes e finas, formando touceiras compactas. Suas folhas são eretas ou com curvas invaginantes, medindo aproximadamente 1 m de comprimento por 1,5 cm de largura, apresentando bainha de cor roxa na base e branco 31 esverdeado na parte interna. Suas flores são hermafroditas e seu fruto do tipo aquênio. Trata-se de planta bastante odorífera, que produz um óleo essencial de aroma semelhante ao da erva-cidreira ou do limão. (PINTO et al., 2007). Figura 4: Aspecto Geral de uma touceira de Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf, no município de Gurupi - Tocantins (Fonte: própria). O componente mais importante do óleo essencial do Cymbopogon citratus é o citral (que pode variar de 47% a 85%). Este é constituindo por uma mistura dos isômeros, geranial (α-citral) e neral (β-citral) (Figura 5) (SIDIBE et al., 2001). Brito (2007) observou que o óleo essencial do C. citratus extraído de folhas frescas apresentou como compostos majoritários geranial (α – citral) com 40,55%, neral (β – citral) com 28,36% e mirceno com 24,21%. Poonpaiboonpipat et al. (2013), identificaram por GC- MS seis compostos do C. citratus, que representaram 92,59 % que indicou o citral monoterpeno como uma mistura dos isomeros geranial ( 41,94 % ) e neral ( 34,06 % ) , bem como β mirceno ( 10,39 % ) , Z - β - ocimeno (0,22 %) e geraniol ( 4,63% ) como principais compostos. Ainda, Bassolé et al. (2011), analisando a composição quimica do C. 32 citratus, constatou que foram identificados o geranial (48,1%) , neral (34,6%) e mirceno (11,0%). CHO A OHC B Figura 5: Estruturas químicas do geranial (A) e do neral (B) (Fonte: própria). O óleo essencial de C. citratus, têm apresentado vários efeitos biológicos sobre diversos microrganismos fitopatogênicos. Neste intuito, Medeiros et al. (2011), objetivaram em seu trabalho desenvolver sachês incorporados com óleos essenciais de orégano (Origanum vulgaris) e capim-limão (C. citratus), onde suas atividades antimicrobianas foram testadas sobre os fungos Colletotrichum gloeosporides, Lasiodiplodia theobromae, Xanthomonas campestris pv. mangiferae indica, Alternaria alternata. Frutos de manga „Tommy Atkins‟ foram acondicionados individualmente em sacos de papel contendo em seu interior um sachê antimicrobiano e mantidos a 25 °C ± 2 °C e UR 80% ± 5% por nove dias. Os sachês ativos incorporados com óleos essenciais de orégano e capim-limão apresentaram controle no crescimento dos microrganismos testados, sendo o capim-limão mais eficiente, reduzindo em aproximadamente 2 ciclos Log a contagem de mesóflos aeróbios, fungos filamentosos e leveduras em relação ao tratamento do controle empregado. Santos e Vogel (2012), examinando seis diluições do óleo de C. citratus (1; 5; 10; 25; 50 e 100%) em uma população de carrapatos resistentes a amidínicos e piretróides sintéticos. Notou que a inibição de postura foi de 3; 23; 46; 66; 46 e 46%, a eclosão larval foi de 83; 58; 31; 0; 38 e 25% e a eficácia do tratamento foi de 32; 64; 83; 100; 88 e 82%, respectivamente. O óleo de C. citratus apresentou controle parcial em teleóginas ingurgitadas de R. microplus em ensaios in vitro. Ahmad Khan e Ahmad (2012), verificaram a inibição de biofilme devido a presença dos óleos essenciais de C. citratus e Syzygium aromaticum em cepas de Candida albicans, constataram que não houve nenhuma tolerância aumentada para 33 C. citratus mostrando efeito mais inibitório sobre a formação de biofilme em 0,5 × e 0,25 × MIC seguido de Syzygium aromaticum. Antifúngicos testados foram menos eficazes na prevenção da formação de biofilmes. Os resultados evidenciaram a forte atividade inibitória de C. citratus seguido de Syzygium aromaticum contra células planctônicas de Candida para formar biofilmes. Machado et al. (2012), para contribuir na busca de novas drogas contra a leishmaniose, estudaram a susceptibilidade de Leishmania infantum , Leishmania tropica e Leishmania major frente ao óleo essencial de C. citratus e seus compostos principais, mirceno e citral. A partir dos resultados, constataram que o citral foi o mais ativo inibindo L. Infantum para IC50 entre 25-52 mg/ml, para Leishmanioses L. tropica e L. major com valores de 34-42 mg/ml. Tzortzakis e Economakis (2007), testando o óleo essencial C. citratus nas concentrações entre 25 e 500 ppm para atividade antifúngica contra Coccodes Colletotrichum, Botrytis cinerea, Cladosporium, Rhizopus stolonifer herbarum e Aspergillus niger, por meio de ensaios in vitro. Observaram uma redução significativa (P<0,05) sobre o desenvolvimento da colônia para os patógenos analisados. Millezi et al. (2012), pesquisaram os óleos essenciais das plantas Thymus vulgaris (tomilho), C. (capim-limão) e Laurus nobilis (louro), e verificaram que o óleo essencial de C. citratus demonstrou atividade bacteriana em todas as concentrações testadas ( 0,5 , 1,5 , 2,5 , 5,0 , 10,0 , 15,0 , 25,0 , e 50,0 %),sobre as bactérias Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella enterica enteritidis e Pseudomonas aeruginosa. 2.4 MICRORGANISMOS FITOPATOGÊNICOS DO FEIJÃO As leguminosas desempenham um papel importante na agricultura e na alimentação e o feijão destaca-se por ser um componente alimentar básico na dieta da população brasileira (YOKOYAMA et al., 2000). Entre as principais doenças, cujos agentes causais apresentam capacidade de sobreviver no solo encontram-se: i) Mela e a podridão radicular do feijoeiro comum causadas pelo fungo Rhizoctonia solani e ii) Podridão do colo do feijoeiro comum causada pelo fungo Sclerotium rolfsii. (MAPA, acesso: 27/11/2012). 34 2.4.1 Rhizoctonia solani Pertencente à classe dos basidiomicetos, o fungo Rhizoctonia solani é habitante do solo e grande causador de doenças em culturas economicamente importantes (CAMPOS e CARESINI, 2006). Afeta principalmente a cultura do feijão comum (Phaseolus vulgaris) causando a mela ou podridão radicular incluindo também o tombamento das plântulas na primeira fase de crescimento em praticamente todas as regiões do Brasil onde a cultura é produzida (TOLÊDOSOUZA et al., 2009). O micologista francês De Candolle, no início do século XIX, descreveu o gênero Rhizoctonia pela primeira vez ao dizer que se trata de um fungo não esporulante, que sintetiza escleródios a partir dos quais são produzidos os filamentos de hifas (SNEH et al., 1991). Os micélios de Rhizoctonia solani são caracterizados por uma ramificação em ângulo reto com septação no ramo e após o mesmo. Este fungo, quando em fase sexuada, teleomófica, é identificado como Thanatephorus cucumeris (DOMSCH et al., 1980; ADAMS, 1988). Sobrevive no solo como saprófita, causando infecções em plantas nativas. Seus propágulos são visualizados com facilidade e encontrados nos primeiros 10 cm da camada superficial do perfil do solo pela presença, ainda, de oxigênio (CARDOSO, 1994). Sua elevada proliferação depende de fatores ambientais como altas temperaturas e chuvas frequentes determinando umidade também alta, em torno de 95 % (ZAUMEYER e THOMAZ, 1957). Polífago, pode permanecer nas plantas de um ano para o outro, além de sobreviver em restos de culturas. Quando no solo, ele atravessa a parede celular das raízes por meio de seus micélios (KRUGNER, 1980). O gênero Rhizoctonia é bastante heterogêneo, sendo que são divididos em grupos de anastomoses (fusão de hifas) para que uma caracterização morfológica específica seja realizada com sucesso. Conforme Carling et al. (2002) existem 13 grupos de anastomoses (GA) reconhecidos. Assim, estas reações de anastomoses entre hifas de isolados pareados de Rhizoctonia solani podem ser identificados como fusão perfeita, fusão imperfeita, fusão por contato e sem reação (YANG e LI, 2012). Trata-se de um fitopatógeno de difícil controle devido a presença dos escleródios, além da sua sobrevivência em condições ambientais adversas (FALTIN 35 et al., 2004). Apesar do tratamento químico (na maioria das vezes poluente), do uso de fumigantes e o tratamento de sementes com fungicidas as perdas podem ser relativamente altas (LUCON et al. 2009). 2.4.2 Sclerotium rolfsii Identificado pela primeira vez em 1892 por Rolfs, em tomate (Solanum lycopersicum), Sclerotium rolfsii é um fungo fitopatogênico e habitante natural do solo (PUNJA, 1985). Na maioria das vezes, ataca dicotiledôneas, podendo também agredir algumas espécies de monocotiledôneas (PUNJA, 1993). Athelia rolfsii é o nome dado ao fungo S. rolfsii quando em forma sexuada, o que ocorre raramente (SARM e SINGH, 2002), entretanto, seus basidiósporos podem provocar uma infecção inicial. De diversidade geográfica ampla é encontrado nos trópicos, subtrópicos, regiões temperadas como África, Japão, Índia, América do Sul, América Central, sul dos Estados Unidos, Filipinas e Havaí (KOKUB et al., 2007). No feijão comum (Phaseolus vulgaris), as infecções podem ocorrer na superfície do solo, em qualquer fase de crescimento da planta, sendo que os sintomas incluem tombamento, lesões no tronco inferior e tecidos da raiz, amarelecimento progressivo, murchamento e desfolha prematura (ABAWI e PASTOR-CORRALES, 1990). Com capacidade de produzir uma grande quantidade de escleródios, os quais podem permanecer no solo por pelo menos um ano, o fungo sobrevive na ausência de hospedeiros, sendo disseminado principalmente, por meio do transporte de solo infestado (MARTINS et al., 2003). Assim, muitas culturas podem ficar comprometidas. Os escleródios são esféricos podendo atingir um tamanho entre 1,0 e 3,5 mm de diâmetro. Quando imaturos são brancos e quando maturos são marrons aparecendo sobre os micélios (PEREIRA NETO e BLUM, 2010). A identificação de S. rolfsii pode ser realizada pela cor, tamanho e estrutura dos escleródios. Devido a este fungo ser encontrado em variadas regiões e em distintas espécies vegetais, suas características morfológicas também variam desde 36 a compatibilidade micelial até as diferenças genéticas observadas (KOKUB et al., 2007). Este fungo destaca-se por atuar tanto no período de pré-emergência das mudas, ou seja, quando concorre para a morte das sementes, quanto no período de pós-emergência, onde o coleto se anela, a planta murcha e tomba (MAFIA et al., 2007). Dessa forma, é extremamente relevante buscar métodos alternativos de controle desta praga sem a utilização de produtos químicos que degradam o meio ambiente. A baixa tecnologia e o manejo inadequado das doenças não é capaz de auxiliar no controle do fitopatógeno estudado. Portanto, novos métodos mais eficientes devem ser estudados e experimentados no campo (MAFIA et al., 2007). 2.5 BIOCONTROLE A utilização de produtos naturais no controle de doenças de plantas pode - se tornar um meio eficiente para a redução do uso indiscriminado de defensivos sintéticos. Segundo Bizzo e Rezende (2009), os apelos de políticas de preservação ambiental são instrumentos de marketing muito eficientes, particularmente no mercado europeu, sendo esta uma ótima oportunidade para o desenvolvimento de processos sustentáveis de exploração da biodiversidade. Este ano o Governo Federal, em busca de fomentar a agriculta agroecológica e orgânica, lançou o Plano Nacional de Agroecologia e Produção Orgânica – Brasil Agroecológico - PNAPO, para ampliar a produção e o consumo de alimentos orgânicos e agroecológicos no País. O objetivo deste plano é promover a transição agroecológica e a produção Orgânica como base do desenvolvimento rural sustentável, possibilitando à população a melhoria de qualidade de vida por meio da oferta de alimentos saudáveis e do uso sustentável dos recursos naturais (BRASIL, acesso em: 16/11/2013). A utilização de produtos naturais de origem vegetal no controle alternativo de pragas e doenças de plantas vai de encontro com os objetivos do PNAPO, e vem ganhando espaço no meio científico. Uma vez que, a sociedade vem pressionando as autoridades para uma possível redução no uso indiscriminado de defensivos agrícolas, numa tentativa de mudança no modo de viver, com a busca por produtos 37 mais saudáveis e livres de substâncias químicas que causam problemas de saúde e ao meio ambiente (MAIRESSE e COSTA, 2009). Ainda Morandi e Bettiol (2009) enfatizam que a sociedade preocupada com o impacto das práticas agrícolas no ambiente e a contaminação com pesticidas vem alterando o cenário agrícola resultando na presença de segmentos de mercado que visam à aquisição de produtos diferenciados. Essas pressões têm levado ao desenvolvimento de sistemas de cultivo mais sustentáveis e, portanto menos dependentes do uso de pesticidas. Proveniente disto deve-se buscar alternativas sustentáveis que mesmo pouco explorada no Brasil, encontram-se presentes em extratos vegetais ou em óleos essenciais de plantas medicinais, para desempenharem funções importantes em interações planta-patógeno, através de ação antimicrobiana direta ou ativando mecanismos de defesa de outras plantas que venham ser tratadas com esses compostos (SCHWAN-ESTRADA e STANGARLIN, 2003). 3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABAWI, G.S.; PASTOR-CORRALES, M.A. Root rots of beans in Latin America and Africa: diagnosis, research methodologies, and management strategies. Cali: CIAT, 1990. 114 p. ADAMS, G.C. Thanatephorus cucumeris (Rhizoctonia solani), a species complex of wide host range. Advances in Plant Pathology, v.6, p.535-552, 1988. ALBUQUERQUE, A.C.L.; PEREIRA, M.S.V.; SILVA, D.F.; PEREIRA, L.F.; VIANA, F.A.C.; HIGINO, J.S.; BARBOSA, M.R.V. The anti-adherence effect of Lippia sidoides Cham: extract against microorganisms of dental biofilm. 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A monographic study of bean diseases and methods for their control. Washington: USDA, 1957. p. 63-5 (Technical Bulletin, 868) 52 CAPITULO II Óleo essencial de Hyptis glomerata Mart. Ex Schrank: Influência de métodos de secagem sobre o rendimento e a composição química e atividades fungitóxicas. 53 1 INTRODUÇÃO O gênero Hyptis é composto por ervas, subarbustos, arbustos ou raramente árvores pequenas. Este gênero apresenta uma grande diversidade morfológica, principalmente na região do cerrado brasileiro, com cerca de 300 a 400 espécies (HARLEY 1988; BORDIGNON, 1990). As espécies de Hyptis são encontradas nas regiões tropicais e subtropicais, distribuindo-se desde a América do Norte e o Caribe até o Peru e Argentina, com apenas algumas espécies presentes no Velho Mundo. A maioria destas espécies são nativas do cerrado, raramente encontradas em áreas úmidas. (HARLEY 1988, 1992, 2006). As plantas pertencentes a este gênero se caracterizam pela presença de substâncias com potencial farmacológico, apresentando uma composição muito diversificada, além de grande parte delas serem aromáticas, apresentando altos teores de óleos essenciais (FALCÃO e MENEZES, 2003). A espécie Hyptis glomerata Mart. Ex Schrank é um arbusto de folhas odoríferas, apresenta flores lilás. É uma planta originária da Ámerica do Sul, no Brasil se localiza na chapada de Minas Gerais, Tocantins e Goiás (FERREIRA, 2009; SAINT – HILAIRE, acesso em: 02/12/2013). Rocha-Coelho et al. (2009) realizando um levantamento etnobotânico na Comunidade Mumbuca, localizada no Parque Estadual do Jalapão, encontraram a H. glomerata nesta região, onde é conhecida popularmente como pau-da-vitória, esta planta é de grande interesse medicinal, sendo utilizada como cadiotônica. No entanto, a composição e teor dos constituintes majoritários dos óleos essenciais de plantas do gênero Hyptis tem apresentado elevada variabilidade, sendo estas variações atribuídas à origem geográfica das mesmas. Porém, populações naturais de plantas que ocorrem ao longo de um gradiente ambiental variam quanto a constituição genética e atividade fisiológica. Embora pertencendo à mesma espécie, podem responder de modo muito diferente às condições ambientais vigentes (MARTINS et al., 2006). Outro fator que pode influenciar estas variações é o processo de secagem. Soares et al. (2007), examinaram a influência de quatro temperaturas do ar de secagem (40, 50, 60 e 70 ºC), verificaram que os maiores rendimentos de óleos essenciais de manjericão (Ocimum basilicum L) foram obtidos no processo de secagem com temperatura do ar igual a 40 ºC e 1,9 m/s de velocidade do mesmo. Os maiores rendimentos de linalol foram obtidos com temperatura do ar de secagem 54 na faixa de 50 a 60 ºC e 1,9 m/s de velocidade (2,23 e 2,47 ppm, respectivamente) e que a composição química do óleo essencial do manjericão é afetada tanto pela temperatura como pela velocidade do ar de secagem. Oliveira e Berbert (2011), avaliaram o efeito da temperatura do ar de secagem sobre o teor e a composição química do óleo essencial de Pectis brevipedunculata, das folhas e capítulos das flores que foram submetidos a quatro temperaturas de secagem ( 40, 50 e 60 ° C) e temperatura ambiente (≅30°C). A secagem por convecção, tanto em temperatura ambiente (≅30°C) quanto em altas temperaturas (50 e 60º C), teve efeito deletério sobre o teor de óleo essencial de folhas e capítulos florais desta espécie. A melhor temperatura para a secagem desta espécie foi de 40 °C. Desta forma torna-se evidente a importância de estudos que visam determinar o método de secagem mais adequado para a obtenção de compostos ou extratos bioativos. Tendo em vista os problemas ocasionados por produtos químicos à saúde dos consumidores e ao meio ambiente, e o potencial biológico apresentado pelos óleos essenciais, estes tornam-se uma possível alternativa para o controle de agentes fitopatogênicos, pragas agrícolas e plantas infestantes (OOTANI, et al., 2013). Entende-se também no trabalho do Salgado et al. (2003) que analisaram três diferentes espécies de Eucalyptus: E. camaldulensis Dehnh., E. citriodora Hook. e E. urophylla Blake., extraídos de suas folhas sobre os fitopatogenos, Fusarium oxysporum, Botrytis cinerea e Bipolaris sorokiniana. As concentrações utilizadas foram (5, 50 e 500 mg/Kg). Nas concentrações de 500 mg/Kg dos óleos, foram observadas inibições significativas no crescimento micelial das espécies fúngicas. Porém, o óleo essencial de Eucalyptus urophylla foi o que apresentou maior ação fungitóxica, que foi atribuída à presença do composto denominado globulol, ausente no E.camaldulensis e no E. citriodora. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o rendimento e a composição química do óleo essencial das folhas de Hyptis glomerata Mart. Ex Schrank submetidas a diferentes condições de secagem e a atividade fungitóxica do mesmo sobre a inibição do crescimento micelial dos fitopatógenos Sclerotium rolfsii e Rhizoctonia solani. 55 2 MATERIAL E MÉTODOS 2.1 OBTENÇÃO DO MATERIAL VEGETAL E EXTRAÇÃO DOS ÓLEOS ESSENCIAIS. As folhas de H. glomerata Mart. Ex Schrank foram coletadas no período da manhã, no município de Gurupi, Tocantins/Brasil. A colheita foi realizada no mês de abril (estação chuvosa), entre 8-10 horas da manhã. O material foi encaminhado para o laboratório de Química do Campus Universitário de Gurupi - UFT. Em seguida, o mesmo foi submetido às operações de separação e seleção das folhas sadias, sendo descartadas aquelas atacadas por praga ou doenças. Para a confirmação da autenticidade da espécie coletada, uma exsicata foi preparada e encaminhada para o Herbário Municipal de São Paulo. A espécie foi devidamente identificada pela biológa Graça Maria do referido herbário e uma exsicata da mesma encontra-se registrada com o número de registro PMSP 14700. 2.2 SECAGEM As folhas frescas de H. glomerata foram submetidas aos seguintes processos de secagem: i) Secagem ao ar livre, onde as folhas foram colocadas sobre uma tela situada a trinta centímetros do solo e expostas ao sol e à temperatura ambiente; ii) Secagem ao ar livre e à sombra, as folhas foram colocadas sobre uma tela situada a trinta centímetros do solo e localizada á sombra e a temperatura ambiente iii) secagem em estufa ventilada na temperatura de 40ºC. Em todos os processos as folhas foram secas até peso constante. 2.3 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE UMIDADE A umidade dos materiais vegetais frescos e secos, foi realizada de acordo com o método oficial da AOCS, adaptado por Pimentel et al. (2006). Foram utilizados 5 gramas das folhas frescas e secas. Este material foi inserido em um 56 balão volumétrico de 250 mL, em seguida adicionou-se 50 mL de cicloexano (C6H12) sobre o material vegetal, acoplou-se ao balão um “Dean starck” graduado e neste um condensador de bolas. O aquecimento foi realizado por meio de manta aquecedora, permanecendo em ebulição por 2 horas, para posterior verificação do volume de água contido no material vegetal (AAOCS, 1994; PIMENTEL et al., 2006). 2.4 EXTRAÇÃO DOS ÓLEOS ESSENCIAIS Foi empregado a metodologia de hidrodestilação, utilizando-se o aparelho de Clevenger modificado. As folhas frescas e secas de Hyptis glomerata foram picadas e colocadas em um balão de 1 litro de capacidade, recobertas com água destilada, sendo o processo de extração realizado em um período de 2 horas mantendo a solução em ebulição (GUIMARÃES et al., 2008). Terminada a extração, o hidrolato coletado foi centrifugado a 1000 x g por 10 minutos. Após, o óleo essencial foi retirado com o auxílio de uma pipeta de Pasteur e inserido em pequenos frascos envoltos com papel laminado e bem vedados e acondicionados em refrigerador. Os rendimentos dos óleos essenciais foram calculados e expressos em peso de óleo por peso de folhas com base livre de umidade (% p/p BLU). Todas as extrações foram realizadas em triplicada. 2.5 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS A análise qualitativa e quantitativas dos óleos essenciais foram realizadas no Departamento de Química da Universidade Federal de Sergipe (UFS) – Aracaju – SE, por Cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massa CGEM. O cromatógrafo utilizado foi o modelo Shimadzu G-17A equipado com detector seletivo de massa modelo QP5050A. O equipamento foi operado nas seguintes condições: coluna capilar de 30 m x 0,25 mm x 0,25 DI com fase ligada DB-5MS (Folsom, CA, USA); temperatura da fonte de íons de 280 ºC; programação da coluna com temperatura inicial de 50 °C por 2 min, com um aumento de 4 °C/min., até 200 °C , depois 10 °C/min até 300 °C , finalizando com uma temperatura de 300 °C por 10 min; gás carreador hélio (1mL min-1); pressão inicial na coluna de 100,2 KPa; taxa 57 de split 1:83 e volume injetado de 0,5 µL (1% de solução em diclorometano). Para o espectrômetro de massas (EM), foram utilizadas as seguintes condições: energia de impacto de 70 eV; velocidade de decomposição 1000; intervalo de decomposição de 0,50; e fragmentos de 40 Da e 550 Da decompostos. A identificação dos compostos foi realizada por meio da comparação dos espectros obtidos com o banco de dados da biblioteca Wiley 229, e as análises quantitativas foram realizadas por normalização interna (expressas em porcentagens relativas das áreas dos picos correspondentes a cada constituinte, assumindo o mesmo fator de resposta do detector para todos os constituintes). 2.6 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E ANÁLISE ESTATÍSTICA O experimento foi conduzido no delineamento inteiramente casualizado, com 3 repetições. A variável analisada foi o rendimento de óleo essencial (gramas/100 gramas da matéria-prima em base seca). Os dados obtidos foram submetidos às análises de variâncias e aos testes de comparações múltiplas de médias (Tukey), utilizando o programa SISVAR ( FERREIRA, 2011). 2.7 OBTENÇÃO DOS ISOLADOS Os fungos fitopatogênicos Sclerotium rolfsii e Rhizoctonia solani foram isolados de plantas de feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris) afetadas pelas doenças, podridão do colo e podridão radicular, respectivamente. Partes das plantas que visivelmente apresentavam lesões necróticas causadas pelos fungos foram retiradas e levadas para o laboratório. superficialmente em água Estes fragmentos vegetais foram corrente e cortados em partes lavados menores de aproximadamente 5 cm nos locais lesionados. Em seguida, os mesmos foram levados para uma câmara asséptica de fluxo laminar. As amostras vegetais passaram por uma assepsia para eliminação de microrganismos saprófitas colocando-se 5 Placas de Petri na câmara de fluxo laminar, uma ao lado da outra. Assim, os fragmentos doentes foram colocados na primeira placa que continha Álcool 70 % e mantidos imersos por 30 segundos, em seguida eram retirados por 58 meio de pinça e colocados numa segunda placa que continha hipoclorito de Sódio 1% por 45 segundos. Em seguida, os fragmentos foram repassados para três placas contendo água destilada esterilizada, retirados e colocados em papel filtro para remoção do excesso de água. Placas de Petri de 9 cm de diâmetro com meio de cultura BDA (batata, dextrose e ágar), anteriormente preparadas, foram utilizadas para incubação dos fragmentos de forma a permitir que os fungos se desenvolvessem com outra fonte nutritiva. Foram colocados em cada placa contendo meio de cultura 5 fragmentos, em seguida as mesmas foram vedadas com plástico "film". Posteriormente, as placas foram mantidas em câmara BOD, a 24 ºC (± 1 ºC) e fotoperíodo de 12 horas, sob luz fluorescente. Após observação do crescimento micelial dos referidos fungos, discos de micélio-ágar de 5 mm foram retirados e transferidos para outra placa contendo BDA e incubados nas mesmas condições anteriormente descritas (VALADARES et al, 2008). 2.8 ATIVIDADE FUNGITÓXICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Hyptis glomerata Culturas puras dos dois fungos fitopatogênicos S. rolfsii e R. solani foram testados separadamente para avaliação da atividade fungitóxica do óleo essencial Hyptis glomerata em diferentes concentrações. Foram utilizados os óleos essenciais desta planta medicinal extraídos a partir de folhas secas à sombra. Em seguida o óleo essencial foi diluído em éter etílico dentro de câmara asséptica de fluxo laminar para obtenção das cinco concentrações selecionadas 50, 250, 500, 750 e 1000 µg mL-1. As mesmas foram elaboradas para placas de Petri de 8 cm de diâmetro, sendo preenchidas com meio de cultura BDA com 15 mL. Como emulsificante, água destilada foi mistura ao leite em pó até atingir a concentração de 10 mg mL -1. Assim, em proveta esterilizada, adicionou-se a solução de leite em pó, em seguida uma das concentrações do óleo essencial estudado e posteriormente, o meio de cultura foi fundido sob temperatura de aproximadamente 45 ºC. Agitação manual foi necessária para a completa homogeneização do meio. Para cada concentração, três repetições foram efetuadas, bem como para a testemunha absoluta. Dos dois fungos testados, discos de micélio-ágar eram repicados para o centro de cada placa já com meio solidificado e vedada com filme plástico. A temperatura de incubação foi mantida em 24 ºC (± 1 ºC), fotoperíodo de 12 horas. A avaliação foi verificada no momento em 59 que a testemunha atingiu completamente a borda da placa. Dessa forma, as placas que continham as concentrações foram medidas com paquímetro digital em diâmetros perpendicularmente opostos. Para os cálculos dos percentuais de inibição do crescimento (PIC) micelial, utilizou-se a seguinte fórmula de acordo com (BASTOS 1997); PIC= crescimento da Testemunha – crescimento tratamento x 100 , em que: Crescimeto testemunha Os tratamentos foram dispostos em esquema fatorial de 2 x 5 para avaliação da atividade antifúngica sendo constituídos por dois fungos fitopatogênicos e cinco concentrações de óleo essencial, sendo as análises realizadas em triplicadas. Foi feita a análise de variância para verificação dos efeitos dos tratamentos, aplicando o teste de Scott-Knott para agrupamento das médias, referentes à porcentagem de inibição do crescimento micelilal dos fitopatógenos avaliados. utilizando o programa estatístico SISVAR (FERREIRA, 2011). 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Hyptis glomerata. O estudo do método de secagem sobre o rendimento do óleo essencial das folhas de Hyptis glomerata, demonstrou influência significativa do método de secagem sobre o rendimento do mesmo. Observou-se que o melhor método de secagem foi a secagem à sombra na temperatura ambiente. O menor rendimento foi observado na extração das folhas frescas, enquanto que os rendimentos das folhas secas ao sol e em estufa a 40°C não diferiram significativamente, e foram superiores aqueles apresentados pelas folhas frescas, como demonstrado na Tabela 1. 60 Tabela 1 - Valores médios dos rendimentos dos óleos essenciais das folhas de Hyptis glomerata no município de Gurupi/Tocantins submetidas a diferentes métodos de secagem, expressos em p/p BLU (base livre de umidade). Método de secagem Rendimentos (%) Folhas frescas 0,672ª Secagem ao sol 1,090b Secagem em estufa 1,123b Secagem à sombra 1,560c Médias seguidas pela mesma letra minúscula não diferem significativamente pelo teste de ScottKnott, com CV: 9,42. Estudo realizado por Mohamed Hanaa et al., (2012), avaliaram os teores de óleos essenciais nas folhas de Cymbopogon citratus, submetidas à secagem ao sol durante 36 horas, à sombra durante 48 horas e em estufa a 45 °C durante 7 h, tembém demonstraram a influência do procedimento de secagem sobre o rendimento de óleo essencial, sendo observado rendimentos de 2,45% nas folhas secas em estufa, de 2,12% nas folhas secas à sombra e de 2,10% nas folhas secas ao sol. Corrêa et al. (2004), estudando o rendimento de óleo essencial do assa-peixe (Vernonia polyanthes), constataram que dentre os métodos de secagem utilizados, o que mostrou maior teor de óleo essencial e conservação das características organolépticas foi a secagem à sombra. Em outro estudo, no qual verificou-se o rendimento dos óleos essenciais das folhas frescas que foram coletadas do Horto de Plantas Medicinais do Departamento de Agricultura da UFLA e secas, adquiridas no comércio da cidade de Lavras, de alfavaca (Ocimum gratissimum L.), orégano (Origanum vulgare L.) e de tomilho (Thymus vulgaris L.), observou-se rendimento de 0,13% de óleo essencial nas folhas frescas de alfavaca e 1,02% para as folhas secas, para o óleo essencial de orégano foram encontrados teores de 0,77% nas folhas frescas e 0,62% nas folhas secas, e as folhas frescas de tomilho apresentaram rendimento de 0,64% enquanto que nas folhas secas foi encontrado teor de 0,80% (BORGES et al., 2012). Diante destes resultados, percebe-se que a alfavaca e o tomilho tiveram o rendimento de folhas frescas menor, resultados que corroboram com os encontrados para Hyptis glomerata. Resultado semelhante foi encontrado para o óleo essencial das folhas de 61 erva-baleeira (Cordia verbenacea), o qual apresentou rendimento de 0,47% nas folhas frescas e de 1,92% para as folhas secas (RODRIGUES et al., 2011). Tais resultados demonstram a importância de se realizar estudos para determinar os melhores métodos de secagem, para que se possa extrair óleos essenciais com melhores rendimentos, tendo em vista a possibilidade de variações de acordo com as espécies vegetais (RADÜNZ et al. 2002; OLIVEIRA et al., 2011). 3.2 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DAS FOLHAS DE Hyptis Glomerata SUBMETIDAS A DIFERENTES MÉTODOS DE SECAGEM. Os constituintes químicos do óleo essencial das folhas frescas e secas, por diferentes métodos de secagem, de Hyptis glomerata, seguidos pelos seus tempos de retenção e seus teores expressos em porcentagem (calculados por normalização de áreas) encontram-se na Tabela 2. Tabela 2 - Constituintes químicos dos óleos essenciais das folhas frescas e secas de Hyptis glomerata coletados no Município de Gurupi/TO e os seus respectivos teores expressos em porcentagem. a Compostos TR α-tujeno α-pineno Canfeno Sabineno β-pineno ο-cimeno Limoneno 1,8-cineol cis-sabineno hidratado Linalol Óxido de α-pineno Acetato de octen-1-ol óxido de limoneno α-canfoleno aldeído trans-pinocarveol Verbenol Pinocarvona 1-borneol 4-terpineol 9,01 9,26 9,76 10,51 10,66 12,18 12,31 12,44 13,63 14,59 14,72 14.87 14,99 15,57 16,09 16,27 16,85 17,03 17,28 Folhas Métodos de secagem Sombra Sol 40°C t c T 1.86684 0.25346 12.47242 t 0.86713 6.16174 0.13913 1.94610 5.14905 0.30524 6.94917 0.12976 0.60051 3.59829 0.15303 1.17529 4.59500 0.21974 10.91275 - 0.66587 0.75503 0.37695 1.25994 0.33855 1.08660 0.95921 0.78709 - T 0.37648 0.24397 0.28649 0.45867 T - 0.23614 0.13066 T T t T 0.70499 0.74005 0.73929 0.95767 0.36601 0.92125 0.18995 1.02681 0.62380 0.29020 0.12866 0.20947 frescas - b 0.31253 1.73532 T 0.90257 5.28614 T t T 0.36115 0.89051 1.02989 0.31779 T 0.90995 4.71356 0.17628 1.39963 6.52935 0.50190 62 α-terpineol 17,70 (1R)-(-)-mirtenal 17,93 Verbenona 18,36 Pulegona 19,25 trans-pinocarveol 21,34 cis-verbenol 21,46 Mirtenol 21,74 Bicicloelemeno 22,14 Copaeno 23.32 β-borboneno 23,61 β-elemeno 23.68 E-cariofileno 24,64 α-bergamoteno 24,87 Aromadendrene 25,19 α-humuleno 25.59 Germacreno D 26,32 Torreiol 26,66 Selin-6-en-4-ol 27,23 Spatulenol 28.94 Óxido de cariofileno 29,13 Óxido de humuleno 29,76 β-eudesmol 30,77 Total a TR = Tempo de retenção (minutos), T T 0.54732 T 0.49405 0.53071 0.46711 T T T T T - 1.18879 4.36442 9.93065 43.97890 3.41370 5.46847 b t t t t t - 0.78775 0.38872 0.11138 0.24965 17.86032 0.41205 0.14626 2.54872 0.57449 5.31537 3.97515 7.81652 18.70067 1.33059 4.15146 T T 0.37036 0.26257 0.59691 0.25346 0.35426 0.32171 T 0.18910 T 0.59603 0.52754 0.36032 - - 0.16741 0.18654 T T T T 4.37426 0.31706 0.18766 1.05183 1.42799 0.16792 - - 1.81830 4.59826 10.41720 38.46165 3.02556 5.29845 1.23761 3.77550 10.06864 37.08471 1.23761 3.25279 92,03 98,66 99,35 c - = não detectado e Traços (valores < 0,1%). T 0.46363 99,15 Os constituintes majoritários do óleo essencial das folhas frescas de Hyptis glomerata foram óxido de cariofileno (43,98%), spatulenol (9,93%), β-eudesmol (5,47%), 1,8-cineol (5,29%) e selin-6en-4-ol (4,36%), observa-se a predominância de sesquiterpenos oxigenados. O óleo essencial das folhas submetidas à secagem ao sol, também apresentou como constituinte majoritário o óxido de cariofileno (38,46%) seguido pelo spatulenol (10,42%) e em menores teores os compostos αpineno (6,95%), β-eudesmol (5,29%), 1,8-cineol (4,59%) e selin-6-en-4-ol (4,59%) e o (E)-cariofileno (4,37%). O óxido de cariofileno foi o constituinte majoritário (37,08%) do óleo essencial das folhas secas em estufa a 40°C, seguido pelo αpineno (10,91%), spatulenol (10,07%), 1,8-cineol (6,53%) e β-pineno (4,71%). Por outro lado, o óleo essencial das folhas secas à sombra apresentou como constituintes majoritários, com teores próximos o óxido de cariofileno (18,70%) e o (E)-cariofileno (17,86%) seguidos pelo α-pineno (12,47%), spatulenol (7,81%), βpineno (6,16%), torreiol (5,31%) e o 1,8-cineol (5,14%). Em todos os óleos essenciais independente da secagem, ou do modo como a mesma foi realizada, observa-se a predominância do óxido de cariofileno. No entanto, verificou-se algumas variações em relação aos teores de alguns compostos em decorrência da mesma. Nos óleos essenciais obtidos das folhas secas constatou 63 um aumento nos teores do α-pineno, β-pineno, limoneno e o aparecimento do (E)cariofileno, com um teor semelhante ao constituinte majoritário do óleo essencial seco à sombra, e do α-humuleno que apresentou teores iguais a 2,55, 1,05 e 1,43 nos óleos obtidos das folhas secas à sombra, ao sol e em estufa a 40°C, respectivamente. Por outro lado os teores de alguns compostos que se encontram entre os majoritários dos óleos essenciais, como o β-eudesmol, spatulenol, selin-6em-4-ol e 1,8-cineol, não sofreram variações consideráveis perante os procedimentos de sacagem. Entre as variações observadas, a mais proeminente foi a grande diminuição do teor do óxido de cariofileno, que passou de 43,98% no óleo essencial das folhas frescas para 18,70% no óleo essencial obtido das folhas secas à sombra. No entanto, esta diminuição coincide com o aparecimento do (E)-cariofileno neste óleo essencial, em um teor próximo aquele de óxido de cariofileno que foi perdido, em relação ao óleo essencial das folhas frescas. Nos óleos essenciais obtidos das folhas secas ao sol e em estufa a 40°C, também observa-se o aparecimento do (E)cariofileno, no entanto em tores muito menores, mas que também se encontram próximos aos teores de óxido de cariofileno que foram perdidos em relação ao óleos essencial das folhas frescas. Tal fato pode ser um indicativo de que o óxido de cariofileno foi convertido a (E)-cariofileno nos processos de secagem. O maior teor (E)-cariofileno encontrado no óleo essencial seco à sombra pode estar relacionado ao tempo de secagem, tendo em vista que este método é o mais demorado. Estes resultados não corroboram com os encontrados por Silva et al. (2000) que realizaram a caracterização do óleo essencial das folhas, inflorescência e do troco de Hyptis glomerata, nativas de Minas Gerais, onde foram identificados um total de 19 compostos, encontrando o (E)-cariofileno (folha 14,3%; caule 8,6%), γcadinene (cerca de 14% em todas as partes), guaiol (folhas 10,7%; inflorescência 9,4%), s-calameneno (caule, 11,4%) e globulol (inflorescência, 16,8%) foram os constituintes majoritários. Rahimmalek e Goli (2013), fizeram a avaliação de seis tipos de secagem em relação ao rendimento de óleo, composição e cores características essenciais do Thymys daenensis subsp. daenensis, (sol, sombra , forno de 50 ° C , 70 ° C forno, microondas e liofilização). Constatou-se que a secagem ao ar à temperatura ambiente, aumentou significativamente o rendimento do óleo essencial. As 64 temperaturas mais elevadas (microondas e forno 70°C) aumentou o timol, carvacrol e conteúdo β –cariofileno. Cunha et al. (2012), estudando folhas secas a sombra da erva-cidreira (Lippia alba), verificou que em sua constituição química, obteve o geranial (E-citral) (27,9%), seguido de neral (Z-citral) (17,4%) e óxido de cariofileno (17,4%). 3.3 ATIVIDADE FUNGITÓXICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Hyptis glomerata. De acordo com os resultados obtidos na avaliação in vitro do efeito do óleo essencial de Hyptis glomerata sobre a inibição do crescimento micelial de Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii., verificou-se efeito significativo dos fatores concentração, fitopatógeno e também da interação desses fatores sobre as inibições dos crescimentos miceliais de ambos fitopatógenos, devido ao óleo essencial de Hyptis glomerata. Por meio dessa interação, observou-se a existência da variação da atividade fungitóxica, dependendo da concentração do óleo essencial e do fitopatógeno. As porcentagens de inibição do crescimento micelial dos fungos estudados, causadas pelas diferentes concentrações do óleo essencial de Hyptis glomerata, encontra-se na Tabela 3. Tabela 3 – Atividade fungitóxica do óleo essencial de Hyptis glomerata expressa em relação a inibição do crescimento micelial dos fitopatógenos Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii. Concentrações (μg mL1) 50 250 500 750 1000 Inibição micelial (%) S. rolfsii R. solani 26,3aA 59,0aB 35,1bA 62,9aB 37,5bA 68,8bB 41,8cA 73,9bB 47,3cA 74,4bB Médias seguidas pela mesma letra minúscula na mesma coluna e pela mesma letra maiúscula na mesma linha não diferem significativamente pelo teste de agrupamento Scott-Knott (p = 0,05) com CV% 8,6. O óleo essencial de H. glomerata, apresentou efeito fungitóxico sobre o crescimento micelial dos dois fitopatógenos estudados. No entanto, para a mesma concentração de óleo essencial, pode-se observar diferença significativa entre as 65 porcentagens de inibição apresentadas sobre cada fitopatógeno. O fungo fitopatogênico R. solani, foi mais sensível ao óleo essencial de H. glomerata em todas as concentrações utilizadas, apresentado os maiores valores de inibição, em comparação as inibições apresentadas sobre o crescimento micelial de S. rolfsii. A maior inibição do crescimento micelial dos dois microrganismos ocorreu perante a maior concentração utilizada do óleo essencial (1000 μg mL-1). Sendo de 74,40% sobre o R. solani e de 47,34% sobre o S. rolfsii. No entanto, sobre a inibição do crescimento micelial do R. solani observa-se que a partir da concentração de 500 μg mL-1 não observa-se diferença significativa sobre as porcentagens de inibição. Já sobre o fitopatógeno S. rolfsii, observa-se que as inibições causadas pelas concentrações de 750 e 1000 μg mL-1 não apresentam diferenças significativas. Outras espécies de Hyptis, também possuem esta propriedade antimicrobiana, Malele et al., (2003), mostraram uma forte atividade anti-fúngica para o óleo essencial das folhas de H. Suaveolens nas concentrações de 500 e 1000 μg / mL contra Saccharomyces cerevisiae, Mucor sp. e Fusarium moniliforme. Da mesma forma Moreira et al., (2010) relatam o efeito fungitóxico do óleo essencial Hyptis suaveolens (L.) sobre o crescimento micelial de algumas espécies de Aspergillus potencialmente patogênicos (A. flavus, A. parasiticus, A. ochraceus, A . fumigatus e A. niger). Tais autores observaram que este óleo essencial nas concentrações de 40 e 80 μg/mL inibiu o crescimento micelial das espéceis A. fumigatus e A. parasiticus em 100% ao longo de 14 dias. Em menores concentrações, 10 e 20 μg/mL, este óleo essencial causou alterações morfológicas nos micélios de A. Flavus, como diminuição da conidiação, vazamento de citoplasma, perda de pigmentação e rompimento da estrutura celular, ocasionando a degeneração da parede fúngica. Linde et al. (2010) estudaram a atividade antifúngica in vitro do óleo essencial de Lippia rehmannii comparando-a com as atividades apresentadas pelo óleo de Cympopogon citratus e seu constituinte majoritário, citral, sobre o crescimento micelial de Fusarium oxysporum e Rhizoctonia solani. Na concentração de 3000 µL/L, o óleo de C. citratus e o citral, causaram inibição total do crescimento dos fitopatógenos utilizados. O óleo essencial de Lippia rehmannii, foi eficaz nesta mesma concentração inibindo em com 63 e 69 % de inibição de R. solani e F. oxysporum obtidos, respectivamente. Hillen et al. (2012) ao analisarem os efeitos dos óleos essenciais de alecrim, candeia e palmarosa utilizados em diferentes alíquotas, verificaram que houve inibição do crescimento micelial de Alternaria 66 carthami, Alternaria sp. e Rhizoctonia solani. As maiores taxas de inibição do crescimento micelial de todos os patógenos (100%) foram observadas quando se adicionou o óleo essencial de palmarosa ao meio de cultura a partir da concentração de 20 μL. O óleo essencial de candeia e de alecrim proporcionou 100% de inibição do crescimento micelial de todos os fitopatógenos a partir da concentração de 200 μL. Zellner et al. (2009) avaliaram uma espécie rara do cerrado brasileiro, Hyptis passerina Mart., quanto a composição química do óleo essencial e atividade antibacteriana das folhas de flores, contra as bactérias Gram-positivas Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis, bactéria Gram-negativa Pseudomonas aeruginosa, e a levedura Candida albicans, constataram que o óleo essencial derivado da folha nas concentrações de 500 mg e 250 mg inibiu o crescimento de S. aureus e P. aeruginosa em proporção idêntica. O óleo derivado da flor foi apenas na concentração de 500 mg e de 250 mg mais ativo no P. aeruginosa. A levedura, foi mais susceptível à óleo derivado de flor, com uma resposta mais ou menos constante, o óleo derivado de folha não foi muito ativa contra C. albicans . Sharma e Tripathi (2008) pesquisando o controle integrado de pós-colheita da podridão de Fusarium (Fusarium oxysporum f. Sp.) de rebentos de gladíolo (Gladiolus spp. (Tourn.) L.), utilizando água quente, UV-C e óleo essencial de Hyptis suaveolens (L.) Poit., verificaram que para controlar o crescimento da população do patógeno após o armazenamento de 4 e 12 semanas. O tratamento com água quente a 55 °C durante 25 min, ou um tratamento com UV- C com uma dose de 3,63 kJ m-2 foi suficiente para inibir germinação de conídios. Em relação ao óleo essencial, observou-se que na concentração de 0,6 μL/cm-3 o óleo foi capaz de inibir completamente o crescimento dos fungos e na concentração de 0,4 μL/cm-3 o óleo inibiu completamente a germinação dos esporos.Santos et al. (2008), analisando a concentração mínima inibitória (MIC) e concentração microbicida mínima (CMM) do óleo essencial de Hyptis pectinata frente a diversas leveduras e bactérias, Observaram que os valores de CIM negativos foram mantidos para as leveduras e as bactérias gram ( + ). O mais sensível leveduras foram C. albicans (CIM = 0,58 mg mL- 1), C. neoformans (CIM = 1,17 mg mL- 1) E C. dubliniensis ( CIM = 3,12 mg mL-1). para Gram (+) bactéria ( S. aureus , S. epidermidis , B. subtilis e E.faecalis ) testados, o óleo essencial apresentou valores de CIM entre 12,5 e 50 mg mL - 1. S. 67 aureus e B. subtilis apresentados menores CIM (12,5 mg mL- 1) , e E. faecalis o maior MIC (50 mg mL- 1). 4 CONCLUSÕES Os teores do óleo essencial das folhas de Hyptis glomerata que foram submetidas a secagem, teve o melhor rendimento à secagem a sombra. Os métodos de secagem (sombra, sol e estufa), influenciou na composição do óleo essencial Hyptis glomerata. O óleo essencial desta espécie apresentou efeito fungitóxico, sendo capaz de causar a inibição do crescimento micelial de Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii. No entanto, em relação a sua atividade fungitóxica, os valores observados não faz com que futuras avaliações in vivo sejam realizadas. 5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AOCS Official Method Da2b-42. 1994. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists Society. 4. ed. American Oil Chemists Society, Champaign, USA. BASTOS, C.N. Efeito do óleo de Piper aduncum sobre Crinipelise outros fungos fitopatogênicos. Fitopatologia Brasileira, v.22, n.3, p.441-3, 1997. BORDIGNON, S.A.L. O Gênero Hyptis Jacq. (Labiatae) no Rio Grande do Sul. Campinas, Dissertação de Mestrado, Institutode Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul,1990. BORGES, A. M.; PEREIRA, J.; CARDOSO, M. G.; ALVES, J. A.; LUCENA, E. M. P. 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NO CONTROLE DA PODRIDÃO DO COLO DO FEIJOEIRO COMUM. 74 1 INTRODUÇÃO As leguminosas desempenham um papel importante na agricultura e na alimentação, e o feijão (Phaseolus vulgaris) destaca-se por ser um componente alimentar básico na dieta da população brasileira (YOKOYAMA et al., 2000). Salgado et al. (2011), estudando o comportamento de genótipos de feijão, no período da entressafra, no Sul do Estado do Tocantins, verificaram que o Estado possui grande potencialidade para o cultivo no período da entressafra. Entre os problemas da cultura as doenças se destacam por afetar diariamente a produtividade. Entre as principais doenças, cujos agentes causais apresentam capacidade de sobreviver no solo encontram-se: i) Mela e podridão radicular do feijoeiro comum causadas pelo fungo Rhizoctonia solani e ii) Podridão do colo do feijoeiro comum causada pelo fungo Sclerotium rolfsii. (MAPA, acesso: 27/11/2012). Atualmente para o controle das pragas e doenças normalmente são utilizados vários pesticidas, sendo necessárias pulverizações preventivas de inseticidas e fungicidas para a diminuição destes problemas fitossanitários. Porém, o uso indiscriminado desses produtos vem causando impactos em inimigos naturais e promovendo resistência dos insetos e dos microrganismos (ALMEIDA et al., 2008).A Lippia sidoides, conhecida como alecrim-pimenta, é uma planta medicinal da família Verbenaceae, encontrada principalmente no nordeste brasileiro (LORENZI e MATOS, 2008). O seu óleo essencial é rico em timol ou carvacrol, compostos com grande potencial biológico. Outra planta que é produtora de óleo essencial de importância econômica e o capim-limão (Cymbopogon citratus (D. C.) Stapf), pertencente a família das Poaceae, é uma planta aromática cultivada para produção comercial de óleo essencial, o qual possui como constituintes majoritários o citral (mistura isomérica de neral e geranial) e o mirceno (PRINS et al., 2008).Verifica-se que vários estudos têm atribuído diversas atividades biológicas para o óleo essencial de Cymbopogon citratus, por conter compostos voláteis, por apresentarem componentes naturais, evitando-se o uso de aditivos sintéticos, deteriorações, oxidações e o ataque de microrganismos, apresentando eficiência nas funções antioxidantes, antirradicais e antimicrobianas em alimentos (SACCHETTI et al., 2005). 75 Nguefack et al. (2004), porém avaliando o efeito do óleo essencial do C. citratus sobre o crescimento micelial de fungos, por meio de ensaios “in vitro”, foi observado que o óleo essencial reduziu em 64% o desenvolvimento de Fusarium. moniliforme na concentração de 200 ppm, de Aspergillus flavus em 48% e de Aspergillus fumigatus em 77% na concentração de 500 ppm. O controle total ocorreu a 300 ppm para F. moniliforme e 1200 ppm para A. flavus e A. fumigatus.Cimanga et al. (2002) verificaram que o óleo de Cympobogon citratus foi efetivo no controle de cepas de bactérias Citrobacter diversus, mostrando-se eficiente no controle de 77% de 22 cepas avaliadas. Silva et al. (2008) demonstraram a atividade antifúngica do óleo essencial de capim-limão e de seu constituinte majoritário citral sobre espécies de candida spp, quando empregados 8.0 µL de cada composto, encontrando halos de inibição maiores que 40 mm de diâmetro, sendo a espécie C. albicans a mais sensível diante ao efeito fungitoxico do óleo essencial utilizado. Guimarães et al. (2011) verificaram a inibição do crescimento micelial, do óleo essencial de C. citratus e o citral, sobre os fungos fitopatogênicos Fusarium oxysporum cubense, Colletotrichum gloeosporioides, Bipolaris sp. e Alternaria alternata, com valores de IC50 variando entre 75,0 e 162,18 μg mL-1 para o óleo essencial e entre 58,24 a 126,97 μg mL-1 para o citral. As novas alternativas devem ser estudadas, visando à conservação do meio ambiente e à qualidade de vida dos consumidores e trabalhadores, com práticas de controle de doenças com uso de produtos ou substâncias naturais, objetivando otimizar a produção de alimentos saudáveis, de alta qualidade e menor impacto ao meio ambiente. O objetivo do trabalho foi avaliar a atividade “in vivo”, dos óleos essenciais de Lippia sidoides Cham. dos acessos de Minas Gerais e Ceará, de Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf. e de seus constituintes majoritários, carvacrol, timol e citral, respectivamente, sobre os efeitos causados pelos fitopatógeno e Sclerotium rolfsii, em plantas de Phaseolus vulgaris L. 76 2 MATERIAL E MÉTODOS 2.1 OBTENÇÃO DO MATERIAL VEGETAL E EXTRAÇÃO DOS ÓLEOS ESSENCIAIS. As folhas de Lippia sidoides Cham. e de Cymbopogon citratus (D.C) Stapf foram coletadas no período matutino, no município de Gurupi, Tocantins/Brasil. Os óleos essenciais utilizados foram extraídos no Laboratório de Química - UFTCampus de Gurupi. Foi empregado a metodologia de hidrodestilação, utilizando-se o aparelho de Clevenger modificado. As folhas frescas de cada espécie vegetal foram picadas e colocadas em um balão de 1 litro de capacidade, recobertas com água destilada, sendo o processo de extração realizado em um período de 2 horas mantendo a solução em ebulição. (GUIMARÃES et al., 2008). Terminada a extração, o hidrolato coletado foi centrifugado a 1000 x g por 10 minutos. Após, o óleo essencial foi retirado com o auxílio por meio de uma pipeta de Pasteur e inserido em pequenos frascos envoltos com papel laminado, bem vedados e acondicionados em refrigerador. 2.2 ISOLAMENTO DOS FUNGOS UTILIZADOS NOS BIOENSAIOS Os fungos fitopatogênicos Sclerotium rolfsii e Rhizoctonia solani foram isolados de plantas de feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris) acometidas pelas doenças, podridão do colo e podridão radicular, respectivamente. Partes das plantas que visivelmente apresentavam necroses causadas pelos fungos foram retiradas e levadas para superficialmente o laboratório. em água Estes corrente fragmentos e cortados vegetais em foram partes lavados menores de aproximadamente 5 cm nos locais lesionados. Em seguida, os mesmos foram levados para uma câmara asséptica de fluxo laminar. As amostras vegetais passaram por uma assepsia para eliminação de microrganismos saprófitas colocando-se 5 Placas de Petri na câmara de fluxo laminar, uma ao lado da outra. Assim, os fragmentos doentes foram colocados na primeira placa que continha 77 Álcool 70 % e mantidos por 30 segundos, em seguida foram retirados por meio de pinça e colocados numa segunda placa que continha Hipoclorito de Sódio 1% por 45 segundos. Em seguida, os fragmentos foram repassados para três placas contendo água destilada esterilizada, retirados e colocados em papel filtro para retirada do excesso de água. Placas de Petri de 9 cm de diâmetro com meio de cultura BDA (Batata Dextrose Ágar), anteriormente preparadas, foram colocadas para incubação dos fragmentos e permitir que os fungos se desenvolvessem com outra fonte nutritiva. Foram colocados em cada placa com meio de cultura 5 fragmentos e vedadas com plástico "film". Posteriormente, as placas foram deixadas em câmara BOD, a 24 ºC (± 1 ºC) e fotoperíodo de 12 horas, sob luz fluorescente. Após observação do crescimento micelial dos referidos fungos, discos de micélio-ágar de 5 mm foram retirados e transferidos para outra placa contendo BDA e incubados nas mesmas condições anteriormente descritas (VALADARES et al, 2008). 2.3 ATIVIDADE BIOLÓGICA IN VIVO PARA INIBIÇÃO DOS MICÉLIOS O experimento foi realizado em casa de vegetação na Universidade Federal do Tocantins, Campus de Gurupi. Para a correta semeadura, ao solo foi adicionado uma mistura de esterco bovino e areia (proporção 1:1:1). As sementes de P. vulgaris foram adquiridas em supermercados e semeadas em vasos de polietileno furados com capacidade de 7 kg. Decorridos 13 dias, durante o estágio vegetativo, os óleos essenciais de Lippia sidoides (quimiotipo carvacrol), Lippia sidoides (quimiotipo timol), Cimbopogon citratus e seus respectivos compostos majoritários, timol, carvacrol e citral foram aplicados de acordo com os seguintes períodos: 5 dias antes de inocular os fungos (A), 5 dias antes e 5 dias depois da inoculação dos fungos (AD) e 5 dias depois da inoculação. As concentrações utilizadas foram de 50, 300, 400, 500, 1000 e µg mL-1, cada uma com três repetições. Em bancada de laboratório, seis erlenmeyers de 1L foram utilizados para obtenção das soluções estoque (500 mL com concentração de 1000 µg mL -1). Foram necessários 200 mL de cada solução para borrifar as plantas até o ponto de escorrimento da solução pelas folhas. Assim, vasos foram separados como testemunha absoluta, sendo borrifado apenas água destilada. Também foi preparada uma testemunha relativa, na qual foi borrifada uma solução de água e leite em pó. Para os outros tratamentos, 78 500 mg de cada óleo ou composto eram pesados e emulsificados em 500 mL de uma solução de leite em pó e água destilada (4 mg mL -1). A partir desta solução estoque foram preparadas as demais dosagens. A irrigação das plantas era realizada duas vezes ao dia afim de manter o solo sempre úmido. A inoculação dos micélios de S. rolfsii foi realizada, prendendo discos de 5 mm de diâmetros, contendo micélios de culturas com 7 dias de inoculação, nos caules das plantas. Para a fixação dos discos, utilizou-se adesivos de papel. 2.4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL O delineamento foi inteiramente casualizado em esquema fatorial de (8 compostos x 5 doses) e 4 repetições. Utilizou as seguintes formula: Severidade = [(número de plantas na classe 1 de severidade) + (número de plantas na classe 2 x 2) + (número de plantas na classe 3 x 3) + (número de plantas na classe 4 x 4) + (número de plantas na classe 5 x 5)+ (número de plantas na classe 6 x 6) ]/21. Portanto, os valores finais médios de severidade foram de 0,190cm a 1,142cm. Os critérios de nota utilizados estão apresentados na Tabela 4. Tabela 4: Critérios de notas para avaliar a severidade. NOTAS % SINTOMAS 0 0% sem infecção 1a Lesão com presença de micélio na região do colo ou caule da 25% planta. Micélio claro começa a surgir 26 a Lesões de infecto aquoso marrons sobre o colo que circunda o 50% caule, amarelecimento das folhas baixeiras e superiores. 51 a Colo totalmente colonizado acarretando a murcha na parte área e 75% consequentemente seca e queda das folhas, 1 2 3 4 5 76 a 90% 91 a 100% Destruição do córtex Destruição da raiz principal e morte da planta 79 Após a coleta dos dados realizou-se a análise de variância e compararam-se as médias de incidência (%) ou severidade de cada pelo teste de Tukey (5%). 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 AÇÃO FUNGITÁSTICA As avaliações da severidade da doença foram realizadas a cada dois dias, havendo um total de 5 avaliações realizado mediante o progresso temporal (avanço da doença em relação ao tempo). Foram utilizados os valores finais médios de severidade que variaram de 0,190 cm a 1,142 cm de acordo com o aumento da doença nos diferentes tratamentos, sendo concentrações de todos os óleos e compostos utilizados em relação aos três períodos de aplicação, cinco dias antes da inoculação, cinco dias depois e cinco dias antes e cinco dias depois. Os resultados obtidos para avaliação “in vivo” do efeito dos óleos essenciais das plantas medicinais de L. sidoides (dois acessos Minas Gerais e Ceará) C. citratus, bem como de seus constituintes majoritários Carvacrol, Timol e Citral, respectivamente, sobre a infecção de S. rolfsii inoculado em plantas de P. vulgaris (feijão comum) encontram-se nas Figuras 6,7 e 8. 80 Figura 6: Efeito das concentrações do óleo essencial C. citratus e seu constituinte majoritário citral em relação a severidade da podridão do colo, causada por Sclerotium rolfsii em caule de plantas de feijoeiro comum. 81 De acordo com os resultados apresentados graficamente na Figura 6, observa-se que o comprimento da lesão (cm) no caule do feijoeiro submetido ao tratamento preventivo com o óleo essencial de C. citratus foi de 0,8 cm, na dosagem de 50 μgmL-1. Para o tratamento com o Citral, o tamanho da lesão foi de 0,9 cm na dosagem de 300 e 1000 μgmL-1. Este resultado obtido em comparação com a testemunha absoluta demonstra que a severidade foi controlada em 34% e 24% respectivamente. Na aplicação curativa (depois da inoculação do S. rolfsii) as plantas tratadas com o óleo essencial de C. citratus apresentaram lesão de 0,9 cm, nas dosagens de 50, 500 e 1000 μgmL -1. Já as plantas tratadas com o citral também apresentaram comprimento da lesão no caule de 0,9 cm nas mesmas dosagens citadas anteriormente, onde obteve-se em ambos tratamentos o controle de 24% em relação a testemunha absoluta. Com relação à aplicação 5 dias antes e 5 dias depois do óleo de C. citratus também verificou-se lesão dede 0,9 cm, na dosagem de 400 μg mL-1, sendo que com relação ao Citral o comprimento da lesão foi de 0,7 cm, resultando desta forma, em respectivo controle de 24% e 44% em relação à testemunha. 82 Figura 7 - Efeito das concentrações do óleo essencial de Lippia sidoides - MG e seu constituinte majoritário Carvacrol em relação à severidade da doença causada pelo fungo Sclerotium rolfsii em caule de plantas de feijoeiro comum. De acordo com os resultados apresentados graficamente na Figura 8, observa-se que as plantas tratadas com o óleo essencial de L. sidoides – MG na aplicação preventiva apresentaram comprimento de lesão (cm) no caule de 0,9 cm, na dosagem de 500 μgmL-1. Já na aplicação preventiva do composto e o Carvacrol, foi verificada lesão de 0,8 cm, nas dosagens de 500 e 1000 μgmL-1, sendo que com a relação à testemunha absoluta ficou demonstrado que a severidade foi controlada em 24% e 34% respectivamente. Na aplicação dos óleos de forma curativa (depois da inoculação do S. rolfsii aplicou-se o óleo essencial de L. sidoides – MG) foi obtido um tamanho de lesão de 0,8 cm, na dosagem de 50 μgmL1; e de 0,7 cm, para o composto Carvacrol, na dosagem de 400 μg mL-1, sendo obtido o controle de 34 e 44%, respectivamente, em relação à testemunha absoluta. Com relação à aplicação com 5 dias antes e 5 dias depois de L. sidoides – MG foi medido uma lesão de 0,9 cm tanto para dosagem de 400 μg mL-1 como também para o Carvacrol nas dosagens de 50 e 500 e 1000 que tiveram um percentual de 24% de controle em relação à testemunha. 83 Figura 8 - Efeito das concentrações do óleo essencial Lippia sidoides - CE e seu constituinte majoritário Timol em relação à severidade da podridão do colo, causada pelo fungo Sclerotium rolfsii em plantas de feijoeiro comum. 84 De acordo com os resultados apresentados na Figura 9, observa-se que o tratamento do feijoeiro com o óleo essencial de L. sidoides – CE em aplicação preventiva (antes da inoculação do fungo) teve lesão no caule de 0,8cm, na dosagem de 1000 μgmL-1. Com relação ao Timol aplicado da mesma forma, foi observada lesão de 0,9 cm, nas dosagens de 500 e 1000 μg mL -1, sendo que com a relação à testemunha absoluta demonstra que a severidade foi controlada em 34% e 24% respectivamente. Na aplicação curativa das plantas com o óleo essencial de L. sidoides – CE foi obtida lesão de 0,8cm, tanto para a dosagem de 1000μg mL -1 como também para o tratamento com o Timol na dosagem de 1000 μg mL-1, onde ambos os tratamentos tiveram o controle de 34%, em relação à testemunha absoluta. E na aplicação 5 dias antes e 5 dias depois no L. sidoides – CE foi de 0,8 cm na dosagem de 50 μgmL-1 e o Timol nas dosagens de 300 que tiveram o controle de 34% em relação a testemunha absoluta. As dosagens observadas das Figuras (6, 7 e 8), foram os melhores resultados em comparação com as demais doses, mas todos os tratamentos não foram satisfatórios, uma vez que houve pouca eficiência dos óleos essenciais e de seus constituintes majoritários sobre o controle da podridão do colo do feijoeiro causada pelo fungo S. rolfisii em plantas de feijoeiro comum. Uma possível justificativa para os resultados encontrados pode estar relacionada com a metodologia utilizada, pois os óleos essenciais e seus constituintes podem ter evaporado com o decorrer do tempo, tendo em vista as suas altas volatilidades, diminuindo as suas concentrações junto as plantas, acarretando a menor atividade dos mesmos. Em outros estudos avaliando a atividade in vivo de outros óleos essenciais sobre fungos fitopatogênicos, é possível observar efeitos significativos dos mesmos no controle dos sintomas causados pelas respectivas doenças. Bastos e Albuquerque (2004), estudando o efeito do óleo essencial de pimenta de macaco (Piper aduncum) sobre a podridão de frutos de banana (Musa spp.) causada por Colletotrichum musae no período de pós-colheita, observaram o controle de podridões nos frutos de banana, com o óleo essencial presente na concentração de 1% Carnelossi et al. (2009), por meio de ensaio in vivo, utilizaram os óleos essenciais Cympobogon citratus (1%) e Eucalyptus citriodora (1%), observaram o controle do progresso da doença causado por Colletotrichum gloeosporioides em frutos de mamão (Carica papaya). Também foi observado influência do período de 85 aplicação dos óleos essenciais em relação a inoculação do fitopatógeno, constatando uma maior AACPD (Área Abaixo da Curva do Progresso da Doença) nos frutos tratados imediatamente após a inoculação. Porém, frutos tratados e inoculados 24h após os tratamentos apresentaram maior controle da doença, confirmando o potencial dos óleos essenciais avaliados. Resultados contrários aos observados pelos óleos essenciais estudados foram encontrados por Aquino et al. (2012), que avaliando o efeito fungitóxico dos óleos essenciais Lippia sidoides, Cymbopogon citratus e Ocimum gratissimum no manejo da antracnose do maracujá, demonstraram desenvolvimento do fungo a partir da concentração de a inibição total do 6 μL mL-1 dos óleos essenciais. Fungicidas naturais à base de óleos essenciais de L. sidoides, Mentha arvensis, O. gratissimum, Eucalyptus terenticornis apresentaram resultados satisfatórios no tratamento pós-colheita do pedúnculo do melão, sendo observado a influência do período de aplicação, tendo em vista a maior eficiência dos mesmos perante o tratamento preventivo em relação ao curativo. Entre os óleos avaliados o mais efetivo foi o de L. sidoides que inibiu a incidência de Fusarium subglutinans, quando aplicado antes da inoculação, em 100%, na concentração de (Gadelha et al., 2003). Além da baixa atividade dos compostos avaliados sobre o controle da podridão do colo do feijoeiro, deve-se ressaltar o difícil controle do fitopatógeno S. rolfisii devido a sua alta capacidade de sobrevivência no solo (BLUM et al., 2003). O que ocasiona dificuldades de controle dessa doença. 4 CONCLUSÃO São necessários a utilização de novas metodologias para averiguar o potencial fungitóxico, por meio de ensaios in vivo, dos óleos essenciais de Lippia sidoides, Cymbopogon citratus e seus constituintes majoritários para o controle de fitopatógenos. 86 5 REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA ALMEIDA, G. D.; PRATISSOLI, D.; HOLTZ, A. M.; VICENTINI, V. B. Fertilizante organomineral como indutor de resistência contra a colonização da mosca branca no feijoeiro. IDESIA, v. 26, n. 1, jan-abr, 2008. AQUINO, C. F.; SALES, N. L. P.; SOARES, E. P. S. e MARTINS, E. R. Ação e caracterização química de óleos essenciais no manejo da antracnose do maracujá. Revista Brasileira Fruticultura. 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FV Método secagem Erro CV (%) Média geral GL 3 11 9,42 1,11 SQ 1,18 0,08 QM 0,39 0,01 FC 36,11 Pr>Fc 0,00 Tabela 6 - Análise de variância com aplicação do teste F para o efeito do óleo essencial de Hyptis glomerata sobre a inibição do crescimento micelial de Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii. FV Fungo Concentração Concentração*fungo Erro CV (%) Média geral GL 1 4 4 20 8,64 52,75 SQ 6838,48 1001,27 278,39 415,58 QM 6838,48 250,31 69,59 20,77 FC 329,09 12,04 3,34 Pr>Fc 0,00 0,00 0,02
