Estudo Molecular sobre Elementos Genômicos s/MARs

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ESTUDO MOLECULAR SOBRE ELEMENTOS GENÔMICOS
S/MARs REGULADORES DA EXPRESSÃO GÊNICA E SUA
APLICABILIDADE BIOTECNOLÓGICA
Newton Valério Verbisck, Simone Portela Lucas
[email protected], [email protected]
CCNH, Universidade Federal do ABC
Av. dos Estados, 5001, Santo André, SP
A obtenção de linhagens celulares de mamífero estavelmente produtoras de proteínas recombinantes esbarra na grande variabilidade
da expressão do transgene na população transfectada, em função da estrutura da cromatina e de elementos regulatórios junto aos sítios
de integração genômica (efeito de posição). Para contornar esses problemas a forma mais simples e rápida é utilizar elementos
regulatórios da cromatina que impedem a influência da heterocromatina na expressão do transgene de interesse, de tal modo a obter
ou a expressão regulada do transgene em terapia gênica ex vivo ou a produção duradoura e em altos níveis de uma proteína
recombinante. Os S/MARs (scaffold/matrix attachment regions) são sequências de DNA que se ligam in vitro à matriz nuclear com alta
afinidade, definindo domínios de cromatina independentes.
I. INTRODUÇÃO
Quando um transgene é inserido artificialmente na célula e
integrado ao seu genoma uma expressão eficiente é altamente
dependente do sítio de integração (Grosveld et al, 1987;
revisto por Kwaks & Otte, 2006). Ele pode ser inserido numa
região de heterocromatina. O resultado, nesse caso, é o
silenciamento do gene. Outra possibilidade é sua inserção
numa região de eucromatina, onde se observa que os genes
são menos compactados e apresentam maior probabilidade de
serem transcritos (Kwaks & Otte, 2006).
Figura 1 – (A) Nas regiões mais enroladas estão os genes inativos. Os genes
– tubos sólidos – ativos são encontrados nas alças. (B) A estrutura espiral
indica uma configuração de cromatina fechada, e o cilindro aberto um gene
silenciado. Inversamente, o cilindro fechado e porções lineares de
cromossomos indicam um local de atividade gênica. Os elementos S/MARs
são esquematicamente indicados como cruzes ao longo da fita de DNA.
Os estados ativo e inativo da cromatina podem variar
rapidamente provocando expressões gênicas instáveis
(Galbete et al, 2008). A utilização dos elementos S/MARs
para a manipulação do material genético promete ser uma
ferramenta poderosa para aumentar a produção de proteínas
recombinantes, pois já foi comprovado que S/MARs
permitem alterar o empacotamento do DNA de forma
regulada (regulação epigenética - mudanças na expressão dos
genes que não envolvem uma mudança na sequência do
DNA). Essas mudanças podem ocorrer quando o gene é
translocado para uma região próxima da heterocromatina,
nessa região a estrutura heterocromática pode se propagar ao
longo do cromossomo e tornar o gene inativo. Esse processo
que resulta do espalhamento da heterocromatina é conhecido
como Variegação do Efeito de Posição.
Diferentes estratégias podem ser aplicadas a fim de superar
esses obstáculos aumentando a produção de proteínas
recombinantes e diminuindo a variação da expressão
transgênica relacionada ao empacotamento do DNA nas
estruturas ativa e inativa de cromatina. Uma delas é o uso de
elementos genômicos capazes de realizar regulação
epigenética. Esses elementos podem ser de vários tipos, tais
como os: BEs (do inglês Boundary Elements, também
denominados Insulators), elementos que delimitam a fronteira
da eucromatina, ou domínios transcricionais, e protegem o
gene da influência transcricional de elementos regulatórios
vizinhos (Kwaks & Otte, 2006). LCRs (do inglês, Locus
Control Region), que são sequências específicas de
nucleotídeos necessárias para a ativação da cromatina de um
determinado locus (regulam a iniciação da transcrição no
locus gênico nativo). Eles têm a habilidade de aumentar a
expressão gênica através da abertura e remodelação da
estrutura da cromatina (Kwaks & Otte, 2006). UCOEs (do
inglês, Ubiquitous Chromatin Opening Elements), elementos
que criam um ambiente transcricionalmente ativo (ou de
cromatina aberta) em torno de um transgene integrado a
determinado genoma e maximizam o potencial de uma
proteína ser transcrita (Kwaks & Otte, 2006). S/MARs (do
inglês, Scaffold or Matrix Attachment Region), componentes
que organizam o genoma dos eucariotos em unidades
funcionais através da sua ligação à matriz nuclear com alta
afinidade, definindo assim domínios de cromatina
independentes (Kwaks & Otte, 2006). STARs (do inglês,
Stabilizing and Antirepressor Elements), elementos com a
habilidade de bloquear a expressão transgênica mediada por
heterocromatina e assim aumentar a transcrição do gene de
interesse (Kwaks & Otte, 2006). Todos esses elementos são
trechos de DNA com diferentes características funcionais que
podem atuar conjuntamente de forma complexa na regulação
da expressão gênica em eucariotos. O resultado dessa
interação pode ser a ativação dos genes contidos num trecho
de cromatina delimitado por esses elementos (Lewin, 2008;
Kwaks & Otte, 2006).
Particularmente, a utilização dos
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elementos S/MARs para a manipulação do material genético
promete ser uma ferramenta poderosa para aumentar a
produção de proteínas recombinantes, pois já foi comprovado
que S/MARs permitem alterar o empacotamento do DNA em
estruturas de cromatina ativa ou inativa de forma regulada
(regulação epigenética - mudanças na expressão dos genes
que são hereditárias através da mitose e/ou meiose e que não
envolvem uma mudança na sequência do DNA, ou seja, uma
mutação).
Realizou-se um estudo detalhado desses motivos comuns
através da utilização da ferramenta de bioinformática
MapDraw, que possibilita a criação de mapas gênicos
indicando a localização de cada motivo dentro das sequências
estudadas. Olhando para esses mapas viu-se um padrão de
motivos que se repete em quase todos os trechos observados.
A Figura 3 ilustra essa assinatura encontrada em nove dos
onze S/MARs analisados. Somente os menores elementos, αGlobina e HPRT, não apresentam o padrão de motivos em sua
sequência.
II. RESULTADOS
Nesse estudo foram analisados onze diferentes S/MARs. O
cLysMAR, os S/MARs do genoma humano X-29, 1-6, 1-42,
1-68, β-globina, HPRT, β-interferon e CSP-B, o S/MAR
DHFR intron da célula CHO e o da α-globina de galinha.
Estudou-se a literatura a fim de se conhecer quais motivos,
atualmente, são associados às sequências de S/MARs. Pode-se
entender como motivos pequenos pedaços de DNA que
obedecem a um padrão e têm alguma função biológica. Eles
frequentemente são representados por alguma sequência à
qual se ligam proteínas como as nucleases e os fatores de
transcrição. São eles: Origens de Replicação, Regiões do
DNA ricas em AT/TG, DNA Dobrado/Torcido, DNA na
forma Z, Sítios para Topoisomerase, T/A/Y-box, Regra H,
MRS, Ilhas de CpG entre outros. Feitas as devidas
comparações entre essas onze sequências foi possível verificar
que alguns motivos estruturais estão presentes em todas as
sequências (Origem de Replicação, Regiões ricas em AT (ATRich), DNA Torcido, Regra H, Y-box, MTAATA e Sítios
para Lamina Nuclear). A fim de se encontrar um padrão de
motivos que permitisse caracterizar e identificar possíveis
S/MARs foi feito mapa a seguir que contêm apenas esses
motivos comuns:
Figura 3 – Assinatura característica encontrada nos trechos dos elementos
S/MARs estudados.
III. CONCLUSÃO
Ainda há muito para se saber sobre S/MARs e outros
elementos genômicos, porém, é difícil estudá-los com as
ferramentas que temos hoje. Por isso, é de grande importância
não somente conhecer cada vez mais os processos químicos e
biológicos envolvidos com a expressão gênica, mas tentar
desenvolver novos algoritmos computacionais (programas)
que permitam identificar as regiões do genoma responsáveis
pelas diversas funções regulatórias relacionadas com a
expressão de genes codificadores de proteínas.
O desenvolvimento de tecnologias para a produção de
biofármacos é de grande importância para o Brasil, pois é uma
forma de gerar divisas através da substituição da importação
e/ou através da exportação de produtos e também de reduzir
as taxas de internação e mortalidade da população e melhorar
a qualidade de vida de pacientes que sofrem de doenças
crônico-degenerativas.
IV. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Bode, J., Goetze S., Heng H., Krawetz S. A., & Benham C.
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Research 11: 435-445, 2003.
Bode, J., Kohwi, Y., Dickinson, L., Joh, T., Klehr, D., Mielke,
C and Kohwi-Shigematsu, T. Biological significance of
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Evans, K. et al. A comparative study of S/MAR prediction
tools. BMC Bioinformatics, 2007.
Figura 2 – Identificação dos motivos para assinatura de S/MARs.
Galbete J. L., Bucetaza M. and Mermod N. MAR elements
regulate the probability of epigenetic switching between
active and inactive gene expression. Molecular BioSystems ,
2008.
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Gautam B. Singh, Jeffrey A. Kramer and Stephen A. Krawetz.
Mathematical model to predict regions of chromatin
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1419-1425. 1997.
Girod P. A., Mermod, N. Use of scaffold/matrix-attachment
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Transfer and Expression in Mammalian Cells, Chapter 10,
2003.
Glazko, G.V., Rogozin, I.B and Glazkov, M.V. Comparative
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various elements of the nuclear matrix. Biochim. Biophys.
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Grosveld, F. et al. Position-independent, high-level
expression of the human beta-globin gene in transgenic
mice. Cell 51, 975-985, 1987.
Kwaks T. H. J., Otte A. P. Employing epigenetics augment
the expression of therapeutic proteins in mammalian cells.
Trends Biotechnol. 24, 137-142, 2006.