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Biossistemas e Biorreações
Prof. Maria Alice Zarur Coelho
Programa de Pós-graduação em Tecnologia de
Processos Químicos e Bioquímicos
Escola de Química
UFRJ
Redes de Reações Bioquímicas
Evolução resultou em uma complexa rede metabólica
para garantir as funções adequadas das células vivas
Quando o conjunto de reações da rede metabólica é
agrupado em uma única reação:
Modelos caixa-preta
utéis para fechar os balanços de massa (carbono) –
entrada e saída da célula
Um olhar para dentro da célula
• Aumenta a complexidade do sistema conforme as
reações intracelulares são consideradas
• Balanço constante entre a formação e o consumo de
metabólitos intracelulares
impõe um grande número de restrições nos fluxos
através dos diferentes ramos da rede metabólica
Mesmo que a complexidade aumente, o número de graus
de liberdade do sistema não necessariamente aumenta!
Conceitos Básicos
Uso dos fluxos de entrada e saída de material da célula:
diretamente mensurados
In vivo versus In vitro:
Controle enzimático é perdido nas medidas in vitro
Medidas de atividade enzimática usam a concentração de
substrato e de todos os metabólitos que influenciam a
cinética enzimática
Os fluxos in vivo podem ser calculados através dos
diferentes ramos da rede… balanço metabólico
Considere uma rede na qual sejam identificados:
J fluxos ou v1 … vJ taxas de reações
N substratos
M produtos metabólicos (excretados)
µ - taxa específica de crescimento da biomassa
Taxas mensuráveis: r1, …, rN+M+1
Restrições impostas pelos balanços de massa:
a concentração de um dado metabólito é constante, i.e.,
a taxa líquida de produção do metabólito é zero
Formalmente…
para todos os metabólitos intracelulares, os fluxos que
chegam a um dado metabólito são balanceados pelos
fluxos que partem deste metabólito, não havendo
acúmulo líquido do mesmo.
EMP - Exemplo
r3PG = 0
Balanço Redox
• Resultado da oxidação do substrato a produto
• Reações podem envolver mais de um tipo de espécie
redox (NADH ou NADPH)
• Compartimentalização da célula:
NADH do citosol versus NADH da mitocôndria
não são intercambiáveis...
“Equivalentes” de energia
Expressos em ATP
Conversão de um metabólito em outro com menor nível
energético:
• liberação de ATP ou
• dissipação de calor (diferença energia livre de Gibbs)
O grau de redução é especificado pela combinação
linear dos balanços elementares onde os fatores de
multiplicação, na combinação linear, são os níveis
redox (ou grau de redução) dos elementos.
Não introduz nenhum balanço extra... Quando todos os
balanços elementares são satisfeitos, o balanço redox
fecha automaticamente.
Exemplo: Fermentação anaeróbia de levedura
estequiometria:
- CH2O + 0.510 CH3O1/2 + 0.275 CO2 + 0.137 X + 0.077 CH8/3O = 0
balanço redox:
- 4 x 1 + (6 x 0.510 + 0 x 0.275 + 4.18 x 0.137 + 4.67 x 0.077) = -0.0078 ≈ 0
Crescimento Energético
Conteúdo intracelular de ATP deve ser rigorosamente
controlado.... balanço entre a energia livre produzida
pelos processos catabólicos e o subseqüente uso na
biossíntese dos constituintes celulares no anabolismo.
turnover de ATP
é baixo
Consumo de ATP para manutenção celular
Metabolismo endógeno (Hebert, 1959)
resulta no decréscimo da biomassa cuja degradação seria
um processo de 1ª ordem:
µe = taxa específica de degradação da biomassa
(-rS) = YXS µ + YXS µe
degradação da
massa celular
parte associada ao crescimento
mS – coeficiente de
manutenção celular
(Pirt, 1965)
Processos de manutenção celular
• Manutenção de gradientes (H+) e potencial elétrico
através da membrana celular
• Ciclos fúteis:
geração de calor na hidrólise de ATP
frutose-6P ! frutose 1,6-P ! frutose-6P
ATP
• Turnover de macromoléculas (p.ex. mRNA)
Altas taxas de crescimento:
maior turnover de macromoléculas
aumento da atividade intracelular
maior perda de energia em ciclos fúteis
ATP requerido para síntese da biomassa
rATP = YX,ATP µ - mATP
Meios complexos fornecem valores
menores que em meios mínimos
determinado com precisão em condições anaeróbicas
Energética de Processos Anaeróbios
• Nao há consumo de oxigênio
• Obtém ATP para crescimento ao nível da fosforilação do
substrato (usa outros aceptores finais de elétrons)
• Muitos microrganismos anaeróbios facultativos não
possuem a via da fosforilação oxidativa
bactérias do ácido lático – ausência de citocromo C
presença de O2 ajuda a manter baixos os níveis de NADH
através da ação das NADH-oxidases que usam O2 como
aceptores de elétrons
• Produtos finais do catabolismo em crescimento
anaeróbico: etanol, ácido lático e acetato
• Outros produtos como acetoína, acetona e butanol
podem ser formados em condições anaeróbicas
(Clostridium acetobutylicum)
• Microrganismos heterofermentativos ! formam mais de
um produto para balancear co-fatores NADH e NADPH
(exceto para crescimento em meio rico)
Rede metabólica mais complexa
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o com a produção de ATP
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Produção de ácido lático
correlacionada
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dác. lático produzido):
(1 mol de ATP
por
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0.3
YX,ATP = 15 mmoles ATP (g p.s.)-1
mATP = 18 mmoles ATP (g p.s. h)-1
u
re
Meio rico, i.e. célula usa ATP para reações de polimerização
µ < 0.3 h-1
YX,ATP = 50 mmoles ATP (g p.s.)-1
mATP = 7 mmoles ATP (g p.s. h)-1
Exaustão de um ou mais componentes do meio - uso de ATP para crescimento é maior
Energética de Processos Aeróbios
• Obtém mais energia pela completa oxidação do
substrato
• ATP é formado na fosforilação oxidativa
• Processo de crescimento celular começa com a
formação de precursores metabólicos (1); blocos de
construção são sintetizados (2) a partir destes
precursores; e depois polimerizados em
macromoléculas (3)
(1) CO2 e NADH são obtidos como co-produtos
(2) NADPH e ATP são requeridos
(3) requer ATP
Síntese de Biomassa:
biomassa + Yxc CO2 + YX,NADH NADH – (1+YXC) CH2O
– YX,ATP ATP – YX,NADPH NADPH = 0
Redes Metabólicas Simples
(i) Crescimento anaeróbio de S. cerevisiae
Etanol = principal produto metabólico
Glicerol = formado como resultado do balanço redox
(balancear nível de NADH)
di-hidroxiacetona fosfato
NAD
glicerol – 3P
NADH
glicerol
Glicose (s)
v1
v2
Biomassa (x)
v5
P
v4
Acetaldeído (a)
v3
Glicerol (g)
Etanol (p)
V1: -1.12 CH2O + CH1.74O0.6N0.12 + 0.12 CO2 + 0.15 NADH – 2.42 ATP = 0
V2: -1.5 CH2O + CH2O0.5 + 0.5 CO2 + 0.5 NADH + 0.5 ATP = 0
V3: - CH2O0.5 + CH3O0.5 – 0.5 NADH = 0
V4: - CH2O + CH8/3O – 0.333 NADH – 0.333 ATP = 0
V5 = V2 – V3
Análise de fluxos em grandes redes metabólicas
• Identificação da estrutura da rede metabólica (topologia)
• Quantificação dos fluxos através dos ramos da rede
Ensaios enzimáticos para confirmar presença de enzimas
específicas e determinar as exigências em co-fatores;
Substratos marcados (glicose – 13C)
Emprego de taxas mensuráveis
Abordagem similar aos modelos de redes metabólicas
simplificadas, e.g.
"
"
"
"
"
EMP
Ciclo TCA
Via do glioxilato
Carboxilação do piruvato
Formação de macromaléculas (proteínas,
carboidratos e lipídios)
• 16 compostos
• 8 metabólitos intracelulares
• Taxas de formação e consumo mensuráveis para:
glicose, amonia, CO2, citrato, isocitrato, proteína,
carboidratos e lipídios
• Pseudo estado estacionário para os metabólitos
intracelulares: glicose – 6P, piruvato, acetil-CoA, 2oxoglutarato, succinato, malato, oxaloacetato e
glioxilato.
• Citrato e isocitrato constantemente produzidos
Com 15 fluxos e 8 equações de balanço = 7 graus de
liberdade… 7 taxas de reação a serem especificadas,
a saber:
1. Consumo de glicose
2. Produção de CO2
3. Produção de acido cítrico
4. Produção de isocitrato
5. Síntese de proteína
6. Síntese de carboidrato
Impor uma restrição colocando uma das taxas
da rede igual a zero (Aiba e Matsuoka, 1979)
Modelo 1: via do glioxilato inativa; v11 = 0
Modelo 2: piruvato carboxilase inativa; v4 = 0
Modelo 3: ciclo TCA incompleto; v8 = 0
Medidas in vitro das atividades das enzimas piruvato carboxilase,
citrato sintase, isocitrato desidrogenase e isocitrato liase
Via do glioxilato é inativa ou opera com uma taxa reduzida em
C.lipolytica sob condições de produção de ácido cítrico
Emprego de substratos marcados
O enriquecimento dos
metabólitos intermediários
de uma via depende da
atividade desta via.
Biossíntese de lisina
Fluxo relativo aumenta com o aumento da concentração de amônia
e ao mesmo tempo eleva a secreção de lisina ! super-produção