denise maria cunha de sousa

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SISTEMÁTICA E EVOLUÇÃO
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA E EVOLUÇÃO DOS VÍRUS DENGUE
NO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE
DENISE MARIA CUNHA DE SOUSA
________________________________________________
Dissertação de Mestrado
Natal/RN, fevereiro de 2014
DENISE MARIA CUNHA DE SOUSA
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA E EVOLUÇÃO DOS VÍRUS DENGUE NO
ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Sistemática e
Evolução, Centro de Biociências, Universidade
NATAL
Federal do Rio Grande do Norte, como
requisito parcial à obtenção do título de Mestre
em Sistemática e Evolução.
Orientador: Dr. Josélio Maria Galvão de Araújo
Natal
2014
DENISE MARIA CUNHA DE SOUSA
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA E EVOLUÇÃO DOS VÍRUS DENGUE NO
ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE
Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação em Sistemática e Evolução da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
como requisito parcial para obtenção do título de
Mestre em Sistemática e Evolução.
Área de concentração: Sistemática e Evolução.
Aprovada em 21/02/2014.
BANCA EXAMINADORA:
__________________________________________________________________
Dr. Josélio Maria Galvão de Araújo
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
(Orientador)
__________________________________________________________________
Dr. José Veríssimo Fernandes
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
__________________________________________________________________
Dra. Rita Maria Ribeiro Nogueira
Fundação Oswaldo Cruz/RJ
Este trabalho é dedicado,
aos meus pais José Dezio e Maria Dalvany,
ao meu noivo Diego Machado,
e a Daíse Sousa, minha irmã.
Amo todos vocês.
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Dr. Josélio Maria Galvão de Araújo pela sua excelente orientação,
sempre com muita paciência, dedicação e otimismo, me fazendo acreditar na minha
capacidade.
À família LADIC, principalmente aos meus queridos colegas Daíse Sousa, Diego
Machado, Joelma Dantas, Mário Branco, Renato Almeida e Tábata Lima. As conversas
divertidas nos intervalos dos experimentos foram uma válvula de escape para as dificuldades
do dia a dia. Desejo todo sucesso do mundo para vocês e seus respectivos projetos de
pesquisa.
Ao Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução, aos professores, à
secretária e aos colegas de turma.
À CAPES pela concessão da bolsa de mestrado, ao CNPQ e UFRN pelo auxílio
financeiro para realização deste trabalho.
Ao LACEN/RN pela parceria que nos possibilitou o acesso as amostras biológicas
analisadas neste estudo.
Aos professores Dr. José Veríssimo Fernandes e Dr. João Paulo Matos pela
participação na minha banca de qualificação.
À Dra. Rita Maria Ribeiro Nogueira e mais uma vez ao Dr. José Veríssimo Fernandes
pela participação na minha banca de defesa de mestrado. Nunca vou esquecer as palavras
incentivadoras dos senhores.
À Dra. Laura Gil (FIOCRUZ/PE) pela grande ajuda disponibilizando o sequenciador,
essencial para a realização deste trabalho.
Ao colega Ricardo Victor pela ajuda com as árvores de Máxima Verossimilhança.
Ao colega Mário Branco por sua ajuda durante a realização do sequenciamento e
revisão do abstract.
Aos meus pais Maria Dalvany e José Dezio por acreditarem em mim e investirem na
minha formação. Sem tal apoio não estaria onde estou hoje. Amo vocês!
À minha irmã e colega de trabalho Daíse Sousa por todos os ensinamentos sobre
Biologia Molecular, pelo apoio e amizade nos momentos de dificuldade.
Ao meu noivo Diego Machado pelo apoio incondicional, paciência e amor. Sem seu
apoio tudo seria mais difícil. Amo você!
À minha prima e irmã Rayanne Dezio, que mesmo tão distante geograficamente nunca
me deixou sem uma palavra de apoio e esperança. Muito obrigada por tudo.
À toda minha família e amigos.
Á Deus por ter me proporcionado tantos momentos maravilhosos e realizar tantos
sonhos, entre eles a conclusão deste trabalho.
“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de água no mar. Mas o
mar seria menor se lhe faltasse uma gota”.
Madre Teresa de Calcutá
RESUMO
A dengue é considerada a doença transmitida por artrópodes mais importante do mundo
devido ao elevado número de pessoas que correm o risco de contraí-la, principalmente em
regiões tropicais e sub-tropicais do planeta. O agente etiológico da doença é o vírus dengue
(DENV), um vírus de RNA fita simples e polaridade positiva, pertencente à família
Flavivridae e ao gênero Flavivirus. São conhecidos quatro sorotipos distintos: DENV-1,
DENV-2, DENV-3 E DENV-4. Uma das suas principais características é a elevada
variabilidade genética que torna clara a necessidade da realização de estudos filogenéticos e
evolutivos com o objetivo de compreender aspectos essenciais como: epidemiologia,
virulência, padrões de migração e características antigênicas. O objetivo deste estudo foi
realizar a caracterização genética dos vírus dengue circulantes no estado do Rio Grande do
Norte durante o período de Janeiro de 2010 a Dezembro de 2012. Realizou-se o
sequenciamento do gene do envelope (1485pb) dos sorotipos DENV-1 (N=6), DENV-2 (N=6)
e DENV-4 (N=4) isolados de casos clínicos de diferentes municípios do estado do Rio Grande
do Norte. A análise filogenética foi realizada utilizando o programa Mega v5.2, método de
Neighbor-Joining e modelo Tamura-Nei. No Brasil, foi constada a circulação de apenas um
genótipo de DENV-1 (genótipo V), um genótipo DENV-2 (asiático/americano) e dois
genótipos de DENV-4 (genótipos I e II) no Brasil. As cepas brasileiras de DENV-1 estão
dividas em duas linhagens temporalmente distintas (BR-I e BR-II), as cepas brasileiras de
DENV-2 estão subdividas em quatro linhagens (BRI-IV) e o genótipo II de DENV-4
apresentou três linhagens de cepas brasileiras (LI-III). Os vírus isolados no Rio Grande do
Norte pertencem a linhagem BR-II (DENV-1), BR-IV (DENV-2) e BR-III (DENV-4). A
fonte de importação destes vírus para o Brasil é principalmente o Caribe e países próximos da
América Latina. Foram detectadas substituições de aminoácidos ao longo dos três domínios
da proteína E, tornando clara a necessidade da realização de estudos que associem dados
epidemiológicos e moleculares para melhor compreensão dos efeitos dessas mutações. Este é
o primeiro estudo sobre caracterização genética e evolução dos vírus dengue no Estado do Rio
Grande do Norte, Brasil.
PALAVRAS-CHAVE: Filogenia, DENV, Aedes aegypti, Brasil.
ABSTRACT
Dengue is considered as the most important arthropod-borne viral disease throughout the
world due to the high number of people at risk to be infected, mainly in tropical and
subtropical regions of the planet. The etiologic agent is Dengue Virus (DENV), it is a single
positive-stranded RNA virus of the family Flavivirus, genus Flaviviridae. Four serotypes are
known, DENV-1, DENV-2, DENV-3 and DENV-4. One of the most important characteristic
of these viruses is the genetic variability, which demands phylogenetic and evolutionary
studies to understand key aspects like: epidemiology, virulence, migration patterns and
antigenic characteristics. The objective of this study is the genetic characterization of dengue
viruses circulating in the state of Rio Grande does Norte from January 2010 to December
2012. The complete E gene (1485 pb) of DENV1, 2 e 4 from Brazilian (Rio Grande do Norte)
patients was sequenced. Phylogenetic analysis was performed using MEGA 5.2 software,
Tamura-Nei model and Neighbor-Joining trees were inferred for the datasets. In Brazil, there
is just one DENV-1 genotype (genotype V), one DENV-2 genotype (Asian/American) and
two DENV-4 genotypes (genotypes I and II). Brazilian strains of DENV-1 are subdivided in
two different lineages (BR-I and BR-II), the Brazilian strains of DENV-2 are subdivided in
four lineages (BRI-IV) and genotype II of DENV-4 is subdivided in three Brazilian lineages
(BRI-III). The viruses isolated in RN belong to lineage BR-II (DENV-1), BR-IV (DENV-2)
and BR-III (DENV-4).The Caribbean and near Latin American countries are the main source
of these viruses to Brazil. Amino acids substitutions were detected in three domains of E
protein, this makes clear the necessity of studies that associate epidemiological and molecular
data to better understand the effects of these mutations. This is the first study about genetic
characterization and evolution of Dengue viruses in Rio Grande do Norte, Brazil.
KEYWORDS: Phylogeny, DENV, Aedes aegypti, Brazil.
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 - Árvore Filogenética da Família Flaviviridae baseada na análise da região NS3
(Fonte: LIndenbach et al., 2007). ............................................................................................. 17
Figura 2 - Organização do genoma dos vírus dengue (Fonte: Weaver & Vasilakis, 2009). .... 18
Figura 3 - Estratégia de replicação dos vírus dengue (Fonte: Rodenhuis-Zybert et al., 2010). 20
Figura
4 - Genótipos de DENV-1 representados em árvore de radiação elaborada do
programa MEGA 5.2 usando o método de inferência filogenética Neighbor-Joining, modelo
de substituição Tamura-Nei e bootstrap com 10000 replicações (Osman et al., 2009). .......... 46
Figura 5 - Árvore colapsada no programa Mega 5.2 representando os cinco genótipos DENV1 (Osman et al., 2009). O genótipo V, marcado em verde apresenta amostras brasileiras. Os
números representam os valores de bootstrap. ......................................................................... 47
Figura 6 - Genótipo dos vírus DENV-1 e suas duas linhagens brasileiras (BR I-II) marcadas
em verde. .................................................................................................................................. 48
Figura 7 - Linhagem BR-I do genótipo V de DENV-1. ........................................................... 49
Figura 8 - Linhagem BR-II do genótipo V de DENV-1. As amostras geradas neste estudo
estão sinalizadas com círculos pretos. ...................................................................................... 50
Figura 9 - Mapa representando a possível introdução dos vírus DENV-1 no Brasil. A
introdução da linhagem BR II está representada em vermelho. ............................................... 51
Figura 10 - Genótipos de DENV-2 representados em árvore de radiação elaborada do
programa Mega 5.2 usando o método de inferência filogenética Neighbor-Joining mdelo de
substituição Tamura-Nei e bootstrap de 10000 replicações (Twiddy et al., 2002). ................. 55
Figura 11 - Árvore colapsada no programa Mega 5.2 representando os cinco genótipos de
DENV-2 (Twiddy et al., 2002). O genótipo asiático-americano, marcado em verde apresenta
amostras brasileiras. Os números representam os valores de bootstrap. .................................. 56
Figura 12 - Genótipo asiático-americano dos vírus DENV-2 e suas quatro linhagens
brasileiras (BR I-II) marcados em verde. ................................................................................. 57
Figura 13 - Linhagem BR-I do genótipo asiático-americano do DENV-2. ............................. 58
Figura 14- Linhagem BR-II do genótipo asiático-americano de DENV-2. ............................. 59
Figura 15 - Linhagem BR-II do genótipo asiático-americano de DENV-2. ............................ 60
Figura 16 - Linhagem BR-IV do genótipo asiático-americano de DENV-2. As amostras
geradas neste estudo estão sinalizadas com círculos pretos. .................................................... 61
Figura 17 - Mapa representando as quatro possíveis introduções distintas dos vírus denv-2 no
Brasil. As introduções das linhagens BR-I-IV estão representadas respectivamente em preto,
vermelho, azul e verde. ............................................................................................................. 62
Figura 18 - Genótipos de DENV-4 representados em árvore de radiação elaborada do
programa Mega 5.2 usando o método de inferência filogenética Neighbor-Joining, modelo de
substituição Tamura-Nei e bootstrap de 10000 replicações (Klungthong et al., 2004)............ 66
Figura 19 - Árvore colapsada no programa Mega 5.2 representando os quatro genótipos de
DENV-4 (Klungthong et al., 2004). Os genótipos I e II, marcados em amarelo e verde
apresentam amostras brasileiras. Os números representam os valores de bootstrao. .............. 67
Figura 20 - Genótipo I dos vírus DEN-4 constituído por amostras do Vietnã e Brasil (BA)... 68
Figura 21 - Genótipo III dos vírus DENV-4 com as três linhagens (BRI-III) de cepas
brasileiras marcadas em azul. ................................................................................................... 69
Figura 22 - Linhagem BR-I do genótipo III de DENV-4. Amostras oriundas do Brasil,
suriname, Porto Rico, Dominica, Colômbia e Jamaica. ........................................................... 70
Figura 23 - Linhagem BR-II do genótipo III de DENV-4. Amoatras oriundas do Brasil,
República Dominicana e Porto Rico. ....................................................................................... 71
Figura 24 - Linhagem BR-III do genótipo III de DENV-4. Constituindo apenas de cepas
brasileiras. As amostras oriundas deste estudo estão sinalizadas com um circulo preto.......... 71
Figura 25 - Mapa representando a possível introdução do genótipo I, de origem Vietnamita no
Brasil (Brasil). .......................................................................................................................... 72
Figura 26 - Mapa representando as três possíveis introduções distintas dos vírus DENV-4 no
Brasil. As introduções das linhagens BR I-III estão representadas respectivamente em
vermelho, azul e verde. ............................................................................................................. 73
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1 - Oligonucleotídeos para sequenciamento do gene do envelope dos DENV-1. ........ 39
Tabela 2 - Oligonucleotídeos para sequenciamento do gene do envelope dos DENV-2. ........ 39
Tabela 3 - Oligonucleotídeos para sequenciamento do gene do envelope dos DENV-4. ........ 39
Tabela 4 - Valores de referência para comparação do amplicon obtido com peso molecular de
massa para determinação da quantidade ideal de DNA a ser aplicada na reação de
sequenciamento. ....................................................................................................................... 41
Tabela 5 - Relação de amostras selecinadas para o presente estudo, com seus respectivos
sorotipos, origem e ano de coleta. ............................................................................................ 44
Tabela 6 - Matriz de identidade nucleotídica entre representaNtes dos cinco genótipos de
DENV-1. ................................................................................................................................... 51
Tabela 7 - Substituições de aminoácidos nas amostras de DENV-1 provenientes do Rio
Grande do Norte quando comparadas com isolados provenientes do genótipo V. .................. 52
Tabela 8 - Matriz de identidade nucleotídica entre representantes dos cinco genótipos de
DENV-2. ................................................................................................................................... 62
Tabela 9 - Substituições de aminoácidos nas amostras provenientes do Rio Grande do Norte
quando comparadas com isolados provenientes do genótipo asático-americano. As
substituições que representaram alterações de caráter bioquímico estão em vermelho. .......... 63
Tabela 10 - Matriz de identidade nucleotídica entre os quatro genótipos de DENV-4. ........... 72
Tabela 11 - Matriz identidade nucleotídica entre representantes dos diferentes genótipos de
DENV-4. ................................................................................................................................... 74
SIGLAS E ABREVIATURAS
BR: Brasil
C: Proteína estrutural do capsídeo viral
DC: Dengue clássico
DENV: Vírus dengue
DENV-1: Sorotipo 1 dos vírus dengue
DENV-2: Sorotipo 2 dos vírus dengue
DENV-3: Sorotipo 3 dos vírus dengue
DENV-4: Sorotipo 4 dos vírus dengue
E: Proteína estrutural do envelope
FHD: Febre hemorrágica da dengue
IgG: Imunoglobulina G
IgM: Imunoglobulina M
Kb: Kilobase
M: Proteína estrutural da membrana
NS: Proteína não estrutural do vírus
OMS: Organização Mundial de Saúde
ORF: do Inglês Open reading frame
PAHO: Pan American Health Organization
Pb: Pares de bases
PCR: Reação em cadeia pela polimerase
RN: Rio Grande do Norte
RNA: Ácido ribonucleico
RT-PCR: Transcrição reversa seguida da reação em cadeia pela polimerase
SCD: Síndrome de choque da dengue
TBE: Tris Borato EDTA
SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 15
1.2. Histórico ........................................................................................................................ 15
1.3. Agente etiológico .......................................................................................................... 17
1.4. Variabilidade genética ................................................................................................. 20
1.5. O vetor .......................................................................................................................... 25
1.6. Manifestações clínicas e classificação dos casos de dengue ...................................... 28
1.6.2.
Febre Hemorrágica do Dengue (FHD) ............................................................... 29
1.7.
Patogênese ................................................................................................................. 29
1.8.
Epidemiologia do dengue ........................................................................................ 31
1.8.1.
Dengue no Continente Americano ..................................................................... 31
1.8.2.
Dengue no Brasil ................................................................................................ 33
2.
JUSTIFICATIVA ............................................................................................................ 35
3.
OBJETIVOS .................................................................................................................... 36
4.
3.1.
Objetivo geral ........................................................................................................... 36
3.2.
Objetivos específicos ................................................................................................ 36
Material e Métodos.......................................................................................................... 37
4.1.
Amostras Clínicas .................................................................................................... 37
4.2.
Coleta de sequencias do GenBank para estudos filogenéticos ............................. 37
4.3.
Extração do RNA viral ............................................................................................ 37
4.4.
Transcrição reversa seguida de reação em cadeia pela polimerase (RT-PCR) . 38
4.4.1.
Iniciadores .......................................................................................................... 38
4.4.2.
Reação em cadeia pela polimerase ..................................................................... 39
4.5.
Purificação de produto de PCR .............................................................................. 40
4.6.
Purificação de produto de PCR por extração de gel de agarose ......................... 40
4.7.
Quantificação do DNA............................................................................................. 41
4.8.
Reação de sequenciamento ...................................................................................... 42
4.9.
Purificação e precipitação de DNA para remoção de Dye Terminators............. 42
4.9.1. Hidratação da coluna ............................................................................................... 42
4.9.2. Processamento da amostra ...................................................................................... 42
4.10. Análise de sequencias nucleotídicas ....................................................................... 43
5.
6.
8.
RESULTADOS ................................................................................................................ 44
5.1.
Reconstrução filogenética e filogeografia dos DENV-1 brasileiros ..................... 45
5.2.
Análise das alterações na cadeia peptídica da proteína E dos DENV-1 ............. 52
5.3.
Reconstrução filogenética e filogeografia dos DENV-2 brasileiros ..................... 53
5.4.
Análise das alterações na cadeia peptídica do gene E dos DENV-2 .................... 63
5.5.
Reconstrução filogenética e filogeografia dos DENV-4 brasileiros ..................... 64
5.6.
Análise das alterações na cadeia peptídica dos DENV-4 ...................................... 74
DISCUSSÃO .................................................................................................................... 75
6.1.
Genótipos circulantes no Brasil e filogeografia dos DENV-1 .............................. 75
6.2.
Genótipos circulantes no Brasil e filogeografia dos DENV-2 .............................. 77
6.3.
Genótipos circulantes no Brasil e filogeografia dos DENV-4 .............................. 79
6.4.
Substituições de aminoácidos na glicoproteína E dos DENV isolados no RN .... 82
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 85
15
1. INTRODUÇÃO
Os vírus dengue pertencem a Família Flaviviridae e ao gênero Flavivirus (Ma et a.l,
2003; Gubler, 2002). Existem quatro sorotipos antigenicamente distintos que possuem muitos
epítopos em comum, gerando características clínicas e epidemiológicas semelhantes. As
infecções variam de casos assintomáticos até formas mais graves como a febre hemorrágica
do dengue (FHD) e síndrome de choque por dengue (SCD) (Amarilla et al., 2009; Gubler,
2002b).
Cerca de 2,5 bilhões de pessoas correm risco de contrair a infecção pelos vírus dengue,
transmitida principalmente pelo mosquito Aedes aegypti, que costuma fazer a postura de ovos
em reservatórios artificiais contendo água parada nos domicílios e peri-domicílios, o que
caracteriza a dengue como uma doença urbana (Tauil, 2002; Lupi et al., 2007). O crescimento
populacional, a urbanização descontrolada e o desenvolvimento dos meios de transporte,
contribuíram de forma ativa para a dispersão desses vírus pelo mundo, fazendo da dengue um
grave problema de saúde pública principalmente em regiões tropicais e subtropicais onde vive
cerca de metade da população mundial (Gubler, 2002a; Halstead, 1988).
O estado do Rio Grande do Norte, assim como os demais estados brasileiros, oferece
condições socioambientais ideais para proliferação do principal vetor. Esse fato, aliado a
problemas nos serviços de saúde pública e de vigilância entomológica tornam o estado uma
área de risco para a emergência de epidemias, tornando clara a necessidade do monitoramento
da circulação viral e estudos de caracterização genética.
1.2. Histórico
Acredita-se que os vírus dengue possam ter origem africana, assim como seu principal
vetor, o mosquito Aedes aegypti (Gubler, 2004). No entanto, a constatação da manutenção da
circulação dos quatro sorotipos em ciclos silvestres da Ásia é uma forte evidência de que
esses vírus possam ter evoluído a partir daquele continente (Gubler, 1997). As evidências
científicas sugerem que esses vírus evoluíram de um ancestral comum a cerca de 500 anos
atrás, por meio da separação de populações de primatas não-humanos infectados, o que
provavelmente ocorreu no continente Asiático (Wang, 2000; Halstead, 1988).
Existem relatos na literatura médica que descrevem uma enfermidade com as
características da dengue no período de 1779 e 1780 (Lupi, 2007; Gubler, 1998). O registro
16
mais antigo da doença data da dinastia Chin (265-420 dC). A população da região acreditava
que a doença estava relacionada a insetos voadores e a água, por isso a chamaram de “veneno
da água” (Gubler, 1998). No Brasil, os primeiros registros da circulação do vírus datam de
1846 (Braga & Valle, 2007). Em 1828, o termo dengue foi introduzido na literatura médica
inglesa e em 1869, foi adotado pelo Colégio Real de Medicina de Londres, sendo usado até
hoje (Halstead, 1980).
A dispersão geográfica desses vírus para outras regiões do mundo está intimamente
relacionada com a dispersão de seu principal vetor. A dispersão inicial do A. aegypti ocorreu
inicialmente por meio do comércio marítimo, onde os ovos do mosquito foram transportados
por embarcações para diversas regiões do mundo em reservatórios de água durante os séculos
XVIII e XIX, causando graves epidemias em cidades portuárias (Gubler, 1997; Halstead,
1988; Gubler, 2002; Gubler, 2004;). Atualmente, o desenvolvimento dos meios de transporte,
principalmente o transporte aéreo, facilita o deslocamento de pessoas entre diferentes regiões
do planeta, favorecendo a introdução dos vírus em regiões não-endêmicas, bem como a cocirculação de diferentes variantes virais em uma mesma região (Gubler, 1998).
Inicialmente a dengue se mostrou um grave problema de saúde pública na Ásia, mais
precisamente no período após a Segunda Guerra Mundial, que gerou uma gama de alterações
socioambientais que favoreceram a proliferação do vetor (Gubler, 1997, Gubler, 2002a).
Nesse momento, a América realizava um bem sucedido programa de erradicação do vetor,
tornando o continente livre da circulação do vírus. No entanto, com o fim dos programas de
erradicação do vetor houve a reintrodução do A. aegypti que, aliado ao aumento da circulação
de pessoas e mercadorias, fez os vírus voltarem a circular no continente, tornando a Dengue
um grave problema de saúde pública em regiões tropicais e sub-tropicais do continente
americano (Halstead, 2006).
Atualmente a dengue é considerada a mais importante arbovirose do mundo,
ocorrendo em cerca de 100 países, com 2.5 bilhões de pessoas vivendo em áreas de risco
(Guzman, 2002; Braga & Valle, 2007). Esse fato pode ser justificado pelo crescimento
desordenado das cidades, que não oferecem serviços básicos de coleta de lixo e fornecimento
de água, favorecendo a proliferação do principal vetor, bem como pelos movimentos
migratórios, propiciados pelo desenvolvimento dos meios de transporte, que favorecem a
dispersão dos vírus por todo o mundo (Bricks, 2004). Estima-se que cerca de 100 milhões de
novos casos de Dengue ocorrem anualmente, tornando clara a necessidade de estudos
17
epidemiológicos e de caracterização genética para o monitoramento viral, visando estabelecer
diretrizes para o controle da doença (Weaver & Vasilakis, 2009).
1.3. Agente etiológico
A família Flaviviridae é composta por três gêneros: O gênero Flavivirus (no qual
estão agrupados os quatro sorotipos do vírus Dengue (DENV 1-4), Vírus da Febre Amarela,
Vírus do Oeste do Nilo e da Encefalite Japonesa), o gênero Pestevirus que alberga os vírus da
diarreia bovina e da peste suína clássica e Hepacivirus no qual estão incluídos os vírus das
hepatites C e G (Figura 1) (Lindenbach et al., 2007; Gubler, 1998; Halstead, 1988). Os quatro
sorotipos do vírus dengue são estreitamente relacionados antigenicamente, no entanto, a
infecção por um determinado sorotipo gera imunidade duradoura apenas para esse sorotipo,
dessa forma, pessoas que vivem em áreas endêmicas podem desenvolver a doença até quatro
vezes (Rigau-Pérez et al., 1998; Rico-Hesse et al., 1997, Osman et al., 2009).
Figura 1 - Árvore Filogenética da Família Flaviviridae baseada na análise da região NS3 (Fonte: Lindenbach
et al., 2007).
Os vírus dengue possuem genoma de RNA de fita simples com polaridade positiva,
contendo 11000 pares de base que codifica uma poliproteína de aproximadamente 3400
aminoácidos, a qual é posteriormente clivada por proteases virais e celulares em três proteínas
estruturais (C, prM e E) e sete não estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5)
(Figura 2). O genoma encontra-se protegido por um capsídeo de simetria icosaédrica
circundado por um envelope lipídico formando uma partícula com 40-50 nm (Gubler, 1998;
Osman et al., 2009; Mendez et al., 2010) e flanqueado por regiões não codificantes
18
denominadas UTRs, que possuem de 100 a 400 pares de bases e tem importante papel na
regulação de processos relativos à replicação viral (Chambers et al., 1990; Lodeiro et al.,
2009; Lindenbach et al., 2007).
Figura 2 - Organização do genoma dos vírus dengue (Fonte: Weaver & Vasilakis, 2009).
A glicoproteína E é o principal determinante antigênico dos vírus dengue, uma vez que
medeia o processo de adsorção, com a consequente penetração do vírus na célula por fusão
dependente de variação de pH (Lindenbach et al., 2007; Ma et al., 2004). Trata-se da maior
proteína dos Flavivírus, com 53 kilodaltons (kDa). Sendo constituída por três domínios. O
domínio I forma uma estrutura denominada barril beta, o domínio II se projeta ao longo da
superfície da partícula viral e o domínio III está envolvido com a ligação aos receptores
celulares, sendo o principal alvo de anticorpos neutralizantes (Lindenbach et al., 2007;
Chambers et al., 1990; Zhang et al., 2003; Allison et al., 1999).
A proteína M, por sua vez, é produzida durante o processo de maturação da partícula
viral na via secretora. Trata-se de um pequeno fragmento (8 kDa) oriundo da proteína
precursora prM (21 kDa) (Lindenbach et al., 2007).
A proteína C, extremamente importante para a montagem dos virions, é altamente
básica e possui peso molecular de 12 kDa (Ferlenghi et al., 2001; Ma et al., 2004). Ela se
apresenta dobrada em um dímero compacto com cada monômero contendo quatro alfas
hélices (Ma et al., 2004). Ainda não é bem claro como os dímeros dessa proteína se
organizam para constituir o capsídeo, no entanto, sabe-se que a interação dos mesmos com o
RNA é fundamental para o processo (Kiermayr et al., 2004; Lindenbach et al., 2007)
A proteína NS1 (46 kDa) é encontrada no interior e na superficie de células infectadas,
bem como na sua forma livre no soro do indivíduo infectado (Lindenbach et al., 2007). Tem
importante função nos estágios iniciais da replicação do RNA e sua interação com a proteína
NS4A, é essencial para atividade da replicase viral (Lindenbach et al., 2007; Khromykh et
al., 1999). NS2A é uma proteína hidrofóbica, relativamente pequena (22kDa) que
aparentemente tem função na replicação do RNA viral (Lindenbach et al., 2007). NS2B
19
possui 14 kDa e está associada a membrana, formando um complexo estável com NS3 que
atua como cofator da enzima NS2B-NS3 serine protease (Clum et al., 1997; Falgout et al.,
1991). NS3, por sua vez, é uma proteína grande (70 kDa) e multifuncional que tem importante
papel na replicação do RNA e no processamento da poliproteína (Lindenbach et al., 2007).
NS4A e NS4B, são hidrofóbicas e relativamente pequenas, possuem respectivamente 16 kDa
e 27 kDa. A interação de NS4A com NS1 é extremamente importante para a atividade da
replicase viral, como foi mencionando anteriormente (Lindenbach et al., 2007; Khromykh et
al., 1999). NS5 é relativamente grande (103 kDa), altamente conservada, multifuncional e
apresenta
atividade
de
metiltransferase
(MTAse)
e
de
RNA
polimerase
RNA
dependente ( RdRp) (Lindenbach et al., 2007).
Os vírus dengue são capazes de interagir com múltiplos receptores celulares no
momento da adsorção, dessa forma, existe uma considerável variedade de células susceptíveis
ao vírus no organismo humano, entre elas, células da linhagem mononuclear fagocitária,
cardíacas, cerebrais, renais, hepáticas, pulmonares e da medula óssea (Araújo et al., 2009;
Jessie et al., 2004; Rodenhus-Zybert et al., 2010).
As partículas virais penetram nas células susceptíveis por um processo denominado
endocitose mediada por receptor que consiste no reconhecimento de proteínas virais do
envelope por parte de receptores celulares específicos. Após o processo de reconhecimento
das proteínas virais pela célula, ocorre a formação de vesículas endocíticas, que ao atingirem
o pH adequado promovem a fusão do envelope viral com a membrana do endossoma,
liberando o nucleocapsídeo no citoplasma da célula. O RNA viral segue três rotas no
citoplasma, atuando como RNA mensageiro, sendo traduzido em poliproteínas virais que
posteriormente são clivadas dando origem às proteínas não estruturais, quem atuam na
regulação do ciclo replicativo e em proteínas estruturais que se organizarão para montar novas
partículas virais. As novas cópias de RNA geradas são empacotadas em novas partículas
virais (Figura 3) (Lindenbach et al., 2007).
20
Figura 3 - Estratégia de replicação dos vírus dengue (Fonte: Rodenhuis-Zybert et al., 2010).
1.4. Variabilidade genética
Os vírus dengue, assim como outros vírus de RNA, apresentam uma considerável
variabilidade genética, que pode ser comprovada pela existência de quatro sorotipos distintos
entre si, os quais são compostos por diferentes genótipos e linhagens (Holmes, 2000; Araújo
et al., 2010; Twiddy, 2002; Holmes & Twiddy, 2003).
Holmes
&
Burch
(2000)
enunciaram quatro hipóteses que tentam explicar a existência dessa variabilidade genética em
seu artigo sobre causas e consequência da variação dos vírus dengue. A primeira hipótese
trata de uma característica compartilhada por todos os vírus de RNA, a ausência de um
mecanismo de reparo da RNA polimerase viral, que gera pelo menos um erro a cada rodada
de replicação (Drake, 1993). A segunda hipótese, fala que além das mutações comuns em
vírus de RNA, acredita-se na possibilidade da recombinação dentro de um mesmo sorotipo,
podendo gerar novas variantes virais e que apesar da probabilidade de ocorrência desse
fenômeno ser considerada rara, com certeza trata-se de um mecanismo que merece atenção
por parte dos pesquisadores da área (Holmes, 2000).
Outra hipótese importante citada pelos autores para a geração de variação é a migração
de populações. Com o desenvolvimento dos meios de transporte, os vírus são transportados
diariamente para diferentes regiões juntamente com seus hospedeiros e vetores, como
consequência disso temos a possiblidade de vários genótipos circularem em um mesmo local,
aumentando assim as chances de ocorrência de recombinação e consequentemente,
variabilidade genética (Gubler, 1997; Rico-Hesse, 1990; Holmes, 2000).
21
Por fim, o crescimento da população humana também pode contribuir para o aumento
da variabilidade. À medida que a população humana cresce a população viral também cresce,
devido ao aumento das oportunidades de transmissão (Zanotto, 1996). Os autores
argumentam que com o aumento da população viral, mais mutações estarão disponíveis e a
seleção natural irá agir com maior intensidade, podendo selecionar vírus com propriedades
específicas como: maior virulência, tropismos diferenciados, capacidade de gerar viremia
elevada, entre outros. (Holmes, 2000).
Twiddy et al. (2002) também citaram a importância da seleção natural para a geração
da variabilidade genética existente entre os vírus dengue. Segundo os autores, a seleção
favorece vírus geneticamente distintos entre si, pois linhagens muitos semelhantes seriam
facilmente neutralizadas por anticorpos num processo de reatividade cruzada, enquanto vírus
geneticamente distintos poderiam gerar infecção em um organismo anteriormente infectado
pelo vírus.
DENV-1 possui cinco genótipos circulantes, o genótipo I (Sudeste Asiático, China e
África Oriental), o genótipo II (Tailândia), genótipo III (Malásia), o genótipo IV (Pacífico
Sul) e do genótipo V (América/África) (Rico-Hesse 1990, Gonçalvez et al., 2002; Myat et al.,
2005; Kukreti et al., 2009) . No entanto, existem evidências de que apenas o genótipo V
circula no Brasil, sendo constatada a circulação de quatro linhagens (A, B, C e D) desse
genótipo no período de 1994-2011, as três primeiras compostas por amostras originárias das
Américas e a última composta por amostras da África Ocidental (Carneiro et al., 2012).
O estudo realizado por Santos e colaboradores em 2011 constatou que os vírus
circulantes no Rio de Janeiro no período entre 2009 a 2010 pertencem à linhagem II do
genótipo V (América/África), diferente dos vírus isolados anteriormente, que pertenciam a
linhagem I, isolados na década de 80 referentes à introdução. Esse fato indica a provável
ocorrência da introdução de uma nova variante viral, uma vez que os isolados brasileiros mais
recentes apresentam baixo percentual de identidade com os isolados mais antigos. No entanto
outras duas amostras agruparam-se com isolados provenientes de outros países da América
Latina (Colômbia, Venezuela e México) formando a linhagem III, indicando uma possível
origem latino-americana dessa linhagem, que provavelmente entrou no Brasil em decorrência
da proximidade geográfica (Carneiro et al., 2012; Santos et al., 2011). No estado do Paraná,
por sua vez, foram identificadas duas cepas também pertencentes ao genótipo V, no entanto,
estas cepas foram agrupadas em dois diferentes subgrupos, sendo um deles mais relacionados
a cepas latino-americanas oriundas de países como Guiana Francesa, Venezuela e Porto Rico
22
e o outro mais relacionado com cepas brasileiras isoladas entre 2008 e 2010, indicando a
possibilidade da ocorrência de uma divergência recente (Bona et al., 2012).
Tendo como base o exposto, a substituição de linhagens que claramente ocorreu em
nosso país ao logo das décadas subsequentes a introdução de DENV-1, reforça a importância
da realização de estudos de caracterização genética para monitoramento da circulação viral.
O DENV-2 possui cinco genótipos circulantes, segundo estudo realizado por Twiddy
et al (2002). A análise filogenética revelou a presença de um genótipo silvestre e quatro
urbanos. Dentre os genótipos urbanos, temos o “genótipo americano” composto por cepas
isoladas recentemente na América Latina e outras isoladas entre os anos de 1950 e 1970 na
Índia, no Caribe e Ilhas do Pacifico. O “genótipo cosmopolita” que tem ampla distribuição
geográfica, estando presentes na Austrália, Ilhas do Pacífico, Sudeste Asiático, Índia, Ilhas do
Oceano Índico, Oriente Médio e África. O “genótipo asiático/americano” que engloba
amostras oriundas da América Latina, Caribe, Vietnã e Tailândia e dois genótipos asiáticos, o
“genótipo asiático 1”, composto por cepas isoladas na China, Filipinas, Sri Lanka, Taiwan e
Vietnã e o “genótipo asiático 2” que engloba cepas oriundas da Malásia e Tailândia (Twiddy
et al., 2002).
No Brasil, um estudo sobre a epidemiologia molecular de DENV-2 realizado por
Miagostovich et al. (1998) comprovou a origem asiática de isolados de DENV-2 encontrados
no Rio de Janeiro. Mais recentemente, Oliveira et al (2010) em estudo sobre duas epidemias
causadas pelo DENV-2 na cidade do Rio de Janeiro, verificaram a circulação do genótipo
“asiático/americano”. No entanto, os vírus que circularam nas duas epidemias (1990/1998 e
2007/2008) são geneticamente diferentes, indicando a possibilidade da ocorrência de evolução
local ou da introdução de uma nova linhagem viral no município.
Em São Paulo, mais especificamente nos municípios do Guarujá e Santos, foi
constatada a mesma origem para os DENV-2 circulantes em 2010, estando esses vírus
estreitamente relacionados aos vírus que causaram a epidemia de 2007/2008 no Rio de Janeiro
e também a vírus oriundos de Cuba e República Dominicana, indicando que a inserção dessa
variante pode ter ocorrido no Rio de Janeiro a partir do Caribe (Romano et al., 2010). No
estado do Paraná, localizado na região sul do país, foi isolada uma cepa também pertencente
ao genótipo asiático/americano, sendo esta cepa estreitamente relacionada com uma cepa
oriunda da Guiana Francesa datada de 2006 (Bona et al., 2012).
É importante ressaltar que é comum, em se tratando de DENV-2, a existência de mais
de um genótipo circulando em uma mesma região, fato que já foi documentado em diversas
23
regiões do mundo como China, Tailândia, Malásia, Caribe, Américas, Ilhas do Pacifico e
Vietnã. Bem como a existência de genótipos mais restritos, como os asiáticos e outros mais
dispersos, como o cosmopolita, que tem distribuição praticamente global (Twiddy et al.,
2002).
Estudos realizados com amostras de DENV-3 demonstraram que existem cinco
genótipos dentro desse sorotipo. O genótipo I agrupa vírus provenientes da Indonésia, Malásia, Filipinas e do Sul do Pacífico, o genótipo II agrupa vírus da Tailândia, Bangladesh,
Malásia e Mianmar e o genótipo III refere-se a vírus do Sri Lanka, Índia, Samoa, África e das
Américas. Os genótipos IV e V são compostos por cepas antigas provenientes de Porto Rico
(GIV), Filipinas, Japão e China (GV), sendo os genótipos I, II, e III os de maior importância
Epidemiológica (Araújo et al., 2009; Lanciotti et al., 1994).
Após a introdução do DENV-3 no Brasil, estudos apontaram que os vírus circulantes
eram pertencentes ao genótipo III, sendo este genótipo considerado a maior linhagem
estabelecida nas Américas (Cruz et al., 2010). Em 2012, Araújo et al. realizaram um estudo
filogenético com 564 sequencias de DENV-3 pertencentes ao genótipo III, todas as amostras
se apresentaram agrupadas em um único grupo monofilético, reforçando a hipótese de uma
introdução única do vírus no continente americano que provavelmente ocorreu partindo da
Ásia, passando pela África antes de chegar a América Central e México, se espalhando pelo
continente, imunizando naturalmente a população e assim evitando a introdução de novas
variantes asiáticas/africanas do sorotipo. Na América, o vírus se dividiu em linhagens, numa
primeira rota de dispersão o genótipo se espalhou por Porto Rico, Venezuela e Colômbia
dando origem a linhagem Caribe/América do Sul I, numa segunda rota o vírus se espalhou
pela porção da América próxima ao Oceano Pacífico, seguindo pelo Peru, Equador e
Colômbia, seguindo para Venezuela, Cuba Porto Rico e Nicarágua formando a linhagem
Caribe/América do Sul II. E por fim, na terceira rota, o vírus se dispersou do Caribe para a
América do Sul, constituindo a linhagem Caribe/América do Sul III (Araújo et al., 2012).
No Brasil, a rápida dispersão, o aumento da circulação viral e as múltiplas introduções
independentes do genótipo III geraram sua subdivisão em quatro linhagens independentes
(Cruz et al., 2010). Temos assim o grupo BR-1, grupo monofilético formando por amostras de
todas as regiões do Brasil isoladas de 2001 a 2009 juntamente com sequencias isoladas na
Argentina Bolívia e Paraguai dentro do grupo Caribe/América do Sul III. O grupo BR-2,
compostos por sequencias isoladas na região norte de 2003 a 2008 e São Paulo em 2006
juntamente com sequencias paraguaias e argentinas, também dentro do grupo Caribe/América
24
do Sul III. O grupo BR-III, composto por apenas um isolado brasileiro de Roraima (2002)
com sequencias oriundas de ilhas do Caribe e por fim o grupo BR-IV, também composto por
um único isolado brasileiro oriundo da região norte (2003) com sequencias da Venezuela e
Colômbia, dentro do grupo Caribe/América do Sul I (Araújo et al., 2012). Estudos
filogeográficos indicam que possivelmente BR-I entrou no país pelo estado do Rio de Janeiro,
estado esse reconhecido em estudos anteriores como importante porta de entrada de novas
linhagens do vírus dengue no país e que os outros grupos (BR-II, BR-III e BR-IV)
provavelmente entraram no país pela região norte devido sua maior proximidade com o
Caribe (Cruz et al., 2010; Araújo et al., 2012).
Recentemente, estudos apontaram a introdução de um novo genótipo do DENV-3
circulante no Brasil e na Colômbia classificado como GI por Figueiredo et al. (2008) e UsmeCiro et al. (2008)
e como GV por Nogueira et al. (2008). Tomando como base essa
divergência na classificação, Araújo et al. (2009) realizou um estudo sobre as relações
filogenéticas do grupo constatando que sua classificação foi concordante com aquela feita por
Nogueira et al. (2008). No entanto ainda permanece uma lacuna sobre a origem das linhagens
brasileiras isoladas recentemente pertencentes ao genótipo I, uma vez que estas se mostraram
semelhantes ao protótipo de DENV-3 isolado nas Filipinas há 48 anos e também ao fato deste
genótipo não ter sido detectado em estudo semelhante realizado recentemente, reforçando a
necessidade de estudos futuros (Araújo et al., 2009; Cruz et al., 2010; Araújo et al., 2012).
Com relação ao DENV-4, estudos filogenéticos detectaram três genótipos, sendo o
Genótipo-1 composto por vírus das Filipinas, Tailândia e Sri Lanka, o genótipo-2 por vírus da
Indonésia, Nova Caledônia, Taiti, Caribe e América do Sul e o genótipo III encontrado
exclusivamente no ambiente silvestre da Malásia. Acredita-se que os vírus pertencentes ao
genótipo II se espalharam a partir da Indonésia, seguindo para as ilhas do Pacífico, chegando
ao ocidente em 1981, com uma posterior disseminação pela América do Sul, gerando um
considerável aumento na sua taxa de evolução (Lanciotti et al., 1997; Lanciotti et al., 1994;
Klungthong et al., 2004).
No Brasil, após um período de 28 anos sem detecção da circulação de DENV-4, o
sorotipo foi reintroduzido no país através do estado de Roraima localizado na Região Norte
do país, onde foi detectado no ano de 2010 (Temporão et al., 2011). A variante circulante foi
classificada como pertencente ao genótipo II, associado a amostras do Caribe (Temporão et
al., 2011). Em 2012, outro genótipo (genótipo I) foi detectado no estado da Bahia (Região
Nordeste). Análises filogeográficas indicaram uma elevada probabilidade de esse genótipo ter
25
entrado no país a partir do sudeste asiático, fato que pode ser justificado pelas relações
econômicas estabelecidas entre o Brasil e países desse continente, principalmente com a
China (Nunes et al., 2012; De Melo, 2009).
Atualmente, o DENV-4 é o sorotipo de circulação predominante no país, fato que
pode ser justificado pela imunidade específica aos outros sorotipos do vírus adquirida pela
população ao longo dos anos. Com a introdução de um novo genótipo (genótipo I), torna-se
clara a necessidade de uma vigilância da circulação desse vírus no país por meio da
intensificação de ações de controle e monitoramento.
Tendo em vista o que foi exposto fica claro que o estudo da diversidade genética dos
vírus dengue tem grande importância para compreensão da doença, sendo o entendimento dos
processos que geram essa variabilidade fundamental para o conhecimento da origem e
monitoramento da circulação das variantes virais (Twiddy et al., 2002; Klungthong et al.,
2004).
1.5. O vetor
O principal vetor dos vírus dengue é o mosquito Aedes aegypti (Jansen et al., 2010),
um mosquito pequeno, de coloração preta e branca, altamente adaptado às condições urbanas,
encontrado em regiões tropicais e subtropicais do mundo (Gubler, 1998; Jansen et al., 2010).
Sua distribuição não está ligada somente as condições meteorológicas, mas também a fatores
inerentes ao ambiente doméstico que oferece condições ideais, mesmo quando o ambiente
externo encontra-se temporariamente adverso, evidenciando a importância do comportamento
humano para a distribuição do vetor (Jansen et al., 2010). Além do A. aegypti, várias outras
espécies do complexo Ae. scutellaris, como por exemplo, Ae. albopictus e Ae. polynesiensis
que foram relacionadas a epidemias em diversas regiões do mundo, no entanto, nenhuma
delas é um vetor tão eficiente quanto à primeira (WHO, 1997).
Ao picar um indivíduo infectado que está passando pelo período de viremia, a fêmea
pode adquirir o vírus, que passa por um período de incubação extrínseca de 8 a 10 dia,
dependendo das condições ambientais. Durante esse período o vírus se replica no intestino do
inseto e se dissemina pela hemolinfa, chegando aos ovários e as glândulas salivares de onde é
regurgitado no momento do repasto sanguíneo. Após esse período o mosquito passa a
transmitir o vírus no momento do repasto sanguíneo e para as gerações seguintes por
transmissão transovariana, permanecendo infectado por toda vida (WHO, 1997).
26
Essa espécie de mosquito está intimamente associada às habitações humanas, uma vez
que tem preferência pelo repasto sanguíneo em humanos, usa as residências para descansar e
realizar a postura de ovos em recipientes que armazenam preferencialmente água limpa
comumente encontrados no ambiente domiciliar e peridomiciliar, como por exemplo: vasos
de plantas, caixas d’água e cisternas, pneus velhos e qualquer resíduos da atividade humana
que possa acumular água (Gubler, 1998; Tauil, 2001; Gomes et al., 1998). Todas essas
características, aliadas ao fato do mosquito fazer vários repastos sanguíneos em um único
ciclo gonadotrófico, e possuir ovos com elevada resistência à dessecação, tornam o A. aegypti
um vetor extremamente eficiente (Gubler, 1998).
A abundância da espécie na África, aliada a existência de espécies silvestres (Ae.
aegypti formosus) nesse continente, sugerem uma possível origem africana (Tabachnick &
Powell, 1979). Foi no período de intenso comércio marítimo, entre os séculos XVII e XIX,
que o mosquito se espalhou pelas regiões tropicais e subtropicais do mundo transportado em
reservatórios de água limpa pelos navios vindos da África, causando epidemias em cidades
portuárias (Moncayo et al., 2004; Gubler, 2002).
Após a Segunda Guerra Mundial, a prevalência e distribuição dos A. aegypti cresceu
na Ásia e nas ilhas do Pacífico (Moncayo et al., 2004). Nas Américas Central e do Sul, o
mosquito foi considerado erradicado no período de 1940/1960 como consequência de
atividades de combate a Febre Amarela (Gubler, 2002; Gratz, 2004; Martins et al., 2010). Nas
décadas subsequentes, com a redução dos esforços de combate ao vetor, aliada as mudanças
demográficas causadas pela migração da população do campo para as cidades, não
acompanhadas pelo oferecimento de condições de infraestrutura que comportasse o aumento
da população urbana, ocorreu a reintrodução do vetor, causando epidemias de dengue e a
emergência de casos de FHD (Gubler, 1998; Gubler, 1989; Gratz, 2004; Martins et al., 2010).
No Brasil, a reintrodução ocorreu em 1976 na cidade de Salvador, estado da Bahia,
ocorrendo uma subsequente epidemia em Roraima no período de 1981/1982, após um longo
período anterior sem detecção de circulação viral (Tauil, 2001).
A espécie Aedes alpopictus é considerada um vetor secundário dos vírus dengue,
perdendo apenas para o A. aegypti em importância (Knudsen, 1995). Apesar de o mosquito ter
hábitos menos antropofágicos quando comparado ao A. aegypti, ele é considerado um elo
importante no ciclo de transmissão da dengue, uma vez que teve papel importante nas
27
primeiras fases do surgimento da doença urbana, além do fato de se encontrar disseminado
por diversas regiões endêmicas para arboviroses no mundo, transitando entre os ambientes
silvestres e urbanos (Moncayo et al., 2004; Santos, 2003).
Conhecido popularmente como tigre asiático, o A. albopictus se espalhou nas últimas
duas décadas a partir do sudeste asiático e pacífico ocidental para a Europa, África, Américas
e Caribe, rompendo barreiras intercontinentais e deixando as autoridades de saúde pública e
pesquisadores da área em alerta (Gratz et al., 2004; Gomes et al., 1998). Existem relatos de
epidemias atribuídas ao A. albopicus entre elas, podemos citar a ocorrida em Nagasaki no
Japão em 1942, causada pelo armazenamento de água em tanques para apagar incêndios
ocasionados pela guerra e que acabaram por servir de criadouros para a espécie que foi
encontrada nas principais ilhas do Japão (Kobayashi, 2002).
O primeiro registro da ocorrência da espécie no Brasil ocorreu em 1986, nos estados
do Rio de Janeiro e Minas Gerais se espalhando pelo território nacional de modo que apenas
alguns estados não possuem notificações da espécie (Forattini, 1986; Santos, 2003). No
entanto, acredita-se que esses dados estejam subestimados por diversos fatores, entre eles o
fato dos programas de controle não terem como espécie alvo o A. albopictus, a ausência de
conhecimento sobre a espécie, elevada demanda de trabalho para os técnicos em saúde e
ausência de vigilância entomológica em alguns municípios brasileiros (Santos, 2003).
Atualmente, o mosquito se encontra presente em áreas rurais e urbanas de vários continentes,
tornando clara a necessidade de ações de controle objetivando a redução da densidade do
vetor afim de sessar a transmissão, uma vez que programas de erradicação e controle efetivo
não estão sendo bem sucedidos (Gratz, 2004).
Com base no exposto, torna-se evidente que o único elo vulnerável no ciclo de
transmissão da dengue é o vetor. Dessa forma, medidas como: investimentos em saúde,
treinamento eficiente dos agentes de saúde, investimento em infraestrutura, educação em
saúde e mobilização comunitária são essenciais para a redução das densidades populacionais
dos referidos vetores e a consequente redução do número de casos da doença (Tauil, 2001;
Gratz, 2004; Gomes et al., 1998).
28
1.6. Manifestações clínicas e classificação dos casos de dengue
Os DENV podem gerar desde infecções assintomáticas a um vasto espectro de
manifestações clínicas, ocasionando até mesmo a morte (Rigau-Pérez et al., 1998). A doença
pode se manifestar em diferentes formas clínicas, que de acordo com a Organização Mundial
de Saúde podem ser classificadas como: assintomática, indiferenciada, Dengue Clássica e
Febre Hemorrágica do Dengue.
Em 2009, a OMS publicou um documento atualizando a última classificação com objetivo
de auxiliar os profissionais de saúde a diagnosticar precocemente os casos graves da doença.
Nessa nova classificação são descritas três categorias: 1) Dengue sem sinais de alerta; 2)
Dengue com sinais de alerta e; 3) Dengue grave. A dengue sem sinais de alerta corresponde a
casos característicos, ou seja, que apresentam os sintomas clássicos da doença,
correspondentes ao Dengue Clássico. A Dengue com sinais de alerta, engloba os pacientes
com manifestações clinicas que podem indicar a evolução para as formas graves da doença
(Febre Hemorrágica do Dengue e Síndrome do Choque por Dengue). A Dengue Grave, por
sua vez, é caracterizada por intenso extravasamento de plasma, hemorragia e
comprometimento vários órgãos, sendo correspondentes as formas graves da doença (FHD e
SCD).
1.6.1. Dengue clássico (DC)
Trata-se de uma doença febril, auto limitante e raramente fatal, cujos principais sintomas
são: febre, dor de cabeça frontal, dor retrorbital, dor muscular e articular, náuseas, vômitos e
erupções cutâneas (Kalayanarooj et al., 1997; Cobra et al., 1995; Rigau-Pérez et al., 1998;
Mendez et al., 2010).
A infecção pode gerar um vasto espectro de manifestações clínicas, no entanto, a grande
maioria delas é assintomática ou minimamente sintomática, tornando evidente que o número
de casos da doença é muito superior ao número de casos notificados pelas autoridades em
saúde (Rigau-Pérez et al., 1998). Em alguns casos pode ocorrer anorexia, alteração de paladar
e dor leve na garganta. Alguns casos de constipação também foram relatados. Diarreia e
sintomas respiratórios, por sua vez, não são frequentes e podem ser indicativos de uma
infecção simultânea (Gubler, 1998). Podem ocorrer manifestações hemorrágicas leves, sendo
as mais comuns, as de pele, juntamente com a gengival, nasal, gastrointestinal e menorragia
(Gubler, 1998). A fase aguda da doença dura de 3 a 7 dias, no entanto o período de
29
recuperação pode se prolongar por algumas semanas. Na maioria dos casos a infecção é autolimitante e não são conhecidas sequelas associadas a ela (Gubler, 1998).
1.6.2. Febre Hemorrágica do Dengue (FHD)
A FHD se inicia com febre e outros sintomas semelhantes aos que ocorrem no DC e
em outras doenças comuns em regiões tropicais e sub-tropicais, os sintomas específicos da
FHD e do choque, por sua vez, se desenvolvem por volta do terceiro ao sétimo dia de infecção
(Rigau-Pérez et al., 1998; Gubler, 1998; OMS, 1997). As principais alterações
fisiopatológicas que determinam a gravidade da infecção e a diferencia do DC são o aumento
da permeabilidade vascular, lesões de natureza imunopatológica nas paredes dos vasos e
queda acentuada no número de plaquetas que podem ocasionar extravasamento de plasma
resultando em hemoconcetração, pressão arterial baixa e sinais de choque caso a perda de
plasma seja critica (OMS, 1997). As principais manifestações clínicas são: febre alta,
fenômenos hemorrágicos como petéquias, lesões purpúricas e equimose. Em muitos casos
ocorre hepatomegalia e falha no sistema circulatório (Gubler, 1998; OMS, 1997). A
ocorrência do choque é comumente precedida de sintomas tais como: dor abdominal intensa e
contínua, vômitos persistentes, queda da pressão arterial, redução da diurese e confusão
mental, os quais são considerados como sinais de alerta para a forma grave da doença.
A administração de fluidos intravenosos pode ser suficiente para a recuperação do
paciente, porém é essencial o monitoramento do mesmo, uma vez que alterações do quadro
podem evoluir rapidamente, podendo levar ao estado crítico de choque (Rigau-Pérez et al.,
1998).
1.7. Patogênese
A ausência de um modelo animal eficiente torna difícil a elucidação da patogênese da
infecção pelos vírus dengue em humanos (Halstead, 1988). Conhecimentos nessa área são
extremamente importantes para a compreensão da ação desse e de outros patógenos
semelhantes no organismo humano, ajudando no desenvolvimento de vacinas e medicamentos
(Halstead, 1988).
Após a entrada do vírus no organismo, através da picada da fêmea da espécie A.
aegypti, as partículas virais migram imediatamente para os lifonodos regionais, caindo
subsequentemente na corrente sanguínea (viremia), ocasionando aumento de temperatura
30
corporal em virtude da liberação de citocinas tais como: fator de necrose tumoral alfa e
interleucina 6 (IL-6) (Lupi et al., 2007; Tavares et al., 2005).
Durante a primeira semana de infecção, o sistema imunológico começa atuar através
de um mecanismo denominado citotoxidade dependente de anticorpo, onde células NK se
ligam a porção FC de anticorpos IgG que estão recobrindo células infectadas, destruindo as
mesmas (Lupi et al., 2007). Anticorpos da classe IgM são produzidos a partir do quarto dia de
doença, podendo permanecer por 2 a 3 meses. Os anticorpos da classe IgG, por sua vez,
começam a ser produzidos na primeira semana e podem ser detectados no organismos durante
anos, sendo responsáveis pela imunidade específica a cada um dos quatro sorotipos do vírus
(Lupi et al., 2007).
Existem teorias que tentam explicar o desenvolvimento de casos graves da Dengue
(FHD/SCD), entre elas temos a teoria da infecção sequencial proposta por Halstead (1988).
Essa teoria se baseia no fato de que os anticorpos produzidos em reposta a infecção primária
por um determinado sorotipo do vírus não são capazes de neutralizar um sorotipo diferente no
caso de uma infecção secundária. Durante a segunda infecção, ocorreria a opsonização de
partículas virais por anticorpos produzidos durante infecção anterior, formando complexos
antígeno-anticorpo que se ligam aos receptores de FC expressos em monóctios e macrófagos e
são endocitados por essas células. No interior dessas células as partículas virais replicam
livremente, liberando novos vírus que formarão novos complexos e se ligarão a outros
macrófagos, dessa forma, a replicação e a infecção é amplificada. Os macrófagos ativados,
por sua vez, liberam mediadores vasoativos que ocasionam aumento da permeabilidade
vascular, que pode evoluir para hipovolemia e choque (Halstead, 1998; Lupi et al., 2007;
Gubler, 1998).
Por outro lado, esses complexos imunes formados por partículas virais recobertas por
anticorpos ficam circulando no organismo e podem se fixar em determinados locais tais
como: glomérulos renais articulações e paredes dos vasos sanguíneos, desencadeado uma
reação de hipersensibilidade do tipo III, que resulta em inflamação e lesão tecidual. Quando
isso corre nas paredes dos vasos aumenta o extravasamento de plasma. Esses complexos
imunes circulantes, também podem ativar o complemento pela via clássica o que leva a
clivagem dos componentes C3 e C5 resultando na geração de C3a e C3b, C5a e C5b. As
frações C3b e C5b resultantes dessa clivagem aumentam a permeabilidade vascular e o
extravasamento do plasma. Além disso, os anticorpos livres circulantes no soro, ao entrar em
31
contato com células do endotélio dos vasos sanguíneos que estão infectadas, expressando
proteínas virais em sua superfície eles se ligam a essas células, o que leva a ativação do
complemento causando a lise dessas células e lesões nas paredes dos vasos o que também
causa extravasamento de plasma.
Em 1998, Martinez formulou uma hipótese que une aborda fatores inerentes a variação
de virulência de diferentes cepas virais e a teoria da infecção sequencial de Halstead (1988),
mostrando que o desenvolvimento de formas graves da doença não está relacionado a apenas
um fator e sim a muitos, entre eles características do vírus e do hospedeiro.
1.8. Epidemiologia do dengue
1.8.1. Dengue no Continente Americano
A Segunda Guerra Mundial gerou destruição e uma série de alterações ecológicas no
continente asiático que favoreceram a proliferação do A.aegypti e, consequentemente, o
aumento do número de casos de dengue. Aliada a essas alterações, alguns fatores como o
número de pessoas susceptíveis ao vírus, a migração de pessoas durante o período de guerra e
pós-guerra e programas de saúde pública ineficientes, foram essenciais para a dispersão desse
vírus em diversas regiões do mundo, inclusive no continente americano (Gubler, 1997, Gubler
2002a).
Os primeiros relatos de dengue nas Américas datam do período de 1827 a 1880, no qual
ocorreram três pandemias em países do Caribe e sul dos Estados Unidos com intervalos de 20
a 30 anos entre elas (Enherkrans et al., 1971; Guzman, 2002). Em um segundo momento, o
incremento das atividades comerciais e o uso de ferrovias que interligavam diversas cidades
do interior dos EUA favoreceram surtos no Texas, Bermudas, Cuba, Panamá, Porto Rico e
Venezuela e pela primeira vez foram observados casos de Febre Hemorrágica por Dengue
(FHD) no Texas e em Havana, no período de 1890 a 1920 (Guzman, 2002).
No período de 1920 a 1950, o crescimento das cidades norte-americanas e o aumento do
fluxo de pessoas no pós-segunda guerra mundial favoreceram a proliferação do vetor e
consequentemente a circulação viral, ocasionando surtos da doença no Texas (1922) e na
Flórida (1934) (Guzman, 2002). Durante o período de 1951 a 1980 ocorreram dois surtos da
doença atribuídos entre outros fatores, ao crescimento dos países caribenhos. Na segunda
epidemia detectada na região, DENV-2 e DENV-3 foram isolados e pela primeira vez se teve
noticia de epidemias causadas por dois sorotipos no Caribe (Guzman, 2002).
32
Durante os anos que antecederam a década de 70, os vírus dengue ficaram restritos ao
continente asiático devido ao bem sucedido programa de erradicação do A. aegypti nas
Américas, sendo o genótipo V de DENV-2 a única variante viral encontrada circulando em
meados da metade do século XX (Halstead, 2006) . No entanto, com o aumento da circulação
de pessoas e mercadorias entre os continentes, o mosquito e consequentemente os vírus
voltaram as Américas causando novas epidemias. No período de 1980 e 1990 o vetor e os
vírus continuaram expandindo-se geograficamente de modo que em 2001, a distribuição do
vetor já era semelhante à distribuição anterior a erradicação (Gubler, 2002a; Halstead, 2006,
Gubler 2007).
Em 1977 ocorreu uma grande epidemia na Jamaica, causada pelo genótipo III de
DENV-1, de origem asiática, que se alastrou por diversos países do Sul da América do Norte,
Caribe, Venezuela, chegando ao Norte da América do Sul (Guzman, 2002; Halstead, 2006).
Os anos 80, por sua vez, foram marcados pela circulação de três sorotipos do vírus
(DENV 1, 2 e 4), sendo DENV 4 o último a chegar nas Américas representado pelo genótipo
I, em 1981 (Pinheiro & Corber, 1997). Nesse período, apesar do grande número de casos,
existiram poucos casos de FHD, sendo que a maioria estavam relacionados à infecção por
DENV-4 (PAHO, 1994). No final da década (1989-1990), o número de casos de FHD
aumentou na Venezuela, com um consequente aumento do número de casos fatais que na
maioria das vezes estavam relacionados com o sorotipo 2. Fato que se repetiu nas epidemias
que ocorreram no Brasil e em Cuba no mesmo período (PAHO, 1992; Pinheiro,1989).
Nos anos 90, todos os países tropicais já apresentavam circulação dos vírus dengue, os
últimos foram Costa Rica e Panamá em 1993 (PAHO, 1994). Em 1994, o genótipo III de
DENV-3 chegou a América Central, se alastrando pelo Caribe e outros países próximos
(Gubler, 1997). Durante as últimas décadas do século 20, o aumento da circulação do
principal vetor e a co-circulação dos quatro sorotipos do vírus, tornou os casos da doença
mais frequentes fazendo com que a mesma fosse considerada endêmica no continente
(Gubler, 1997).
Alguns fatores explicam o motivo do surgimento e manutenção dos vírus dengue,
principalmente na América Latina e esses são basicamente de natureza social e demográfica.
Os movimentos migratórios do campo para os centros urbanos são intensos nesses países
gerando, na maioria dos casos, crescimento desordenado das cidades, que não oferecem
infraestrutura de saneamento básico e distribuição de água regular para a população. Essa, por
sua vez, vive em condições inadequadas e exposta a inúmeras doenças. Esses fatos aliados a
33
um sistema de saúde pública ineficiente agravam ainda mais a situação e explicam o porquê
dos vírus dengue terem se estabelecido com sucesso nesse continente (Guzman, 2002).
1.8.2. Dengue no Brasil
Os motivos pelos quais a dengue se tornou um grave problema de saúde pública em
regiões tropicais e subtropicais não são bem compreendidos, mas sabe-se que envolvem
diversos fatores relacionados ao agente etiológico (sorotipos, genótipos mais virulentos, taxa
de replicação), ao hospedeiro (condições imunológicas, infecções sequenciais, raça, idade) e
ao vetor (adaptação ao ambiente, taxa de reprodução). Além disso, existem regiões do planeta,
como o Brasil, que oferecem condições ideais para o estabelecimento e sucesso dos vírus,
como por exemplo: população em crescimento, urbanização descontrolada, condições
climáticas ideais para proliferação do vetor, sistema de saúde pública e controle de epidemias
ineficientes, entre outros (Teixeira et al., 2009; Teixeira et al., 1999; Gubler, 1998).
Na década de 1970, com a reintrodução do A. aegypti devido à falta de sucesso de
alguns países em manter o inseto erradicado, DENV-1 e DENV-4 entraram no Brasil pelo
estado de Roraima, causando um surto na capital Boa vista durante o ano de 1981 (Nogueira
et al., 2000; Siqueira et al., 2005; Neto et al., 2005; Osanai et al., 1983; Tauil, 2002). No
entanto, foi a partir de um surto ocasionado por DENV-1, ocorrido no Rio de Janeiro em
1986, que a doença passou a chamar atenção da sociedade e dos governantes devido ao
grande número de indivíduos infectados, cerca de 1 milhão (Figueiredo et al., 1991). A partir
da capital fluminense, o vírus se espalhou pelo Nordeste e Centro-Oeste do país (Nogueira et
al., 1989).
Em 1990, DENV-2 (genótipo III) foi introduzido no Rio de Janeiro causando os
primeiros casos de FHD e se espalhando pelo país (Teixeira et al., 2005; Nogueira et al.,
1995; Siqueira et al., 2005). Durante a década de 90 os vírus se expandiram para 22 dos 26
estados do país, gerando um grande aumento do número de infectados que chegou a 345.7 mil
para 100 mil habitantes, totalizando 1.513.784 casos, fazendo com que, no final de 1998, o
Brasil fosse responsável por 85% dos casos registrados nas Américas (Teixeira et al., 2009;
Nogueira et al., 2000).
No início do século XXI, mais precisamente durante o ano de 2002, o DENV-3 foi
introduzido no país causando uma grave epidemia no Rio de Janeiro, com vários casos de
Dengue Clássica e FHD, se espalhando em seguida pelo território nacional (Teixeira et al.,
2009; Nogueira et al., 2005). O DENV-4 foi reintroduzido no Brasil, no estado de Roraima,
no ano de 2010 após um período de 28 anos sem circulação (Temporão et al., 2011). Esse
34
sorotipo esteve relacionado a casos de FHD durante a década de 80 no continente americano,
inclusive no Brasil e atualmente tem circulação predominante, sendo relacionado a epidemias,
fato que pode ser justificação pela imunidade adquirida pela população brasileira especifica
aos outros sorotipos circulantes anteriormente (PAHO, 1994).
Existem diferenças significativas entre a dinâmica da enfermidade no Sudeste Asiático
e no Brasil. Apesar do número de casos de FHD no Brasil ser considerado alto, 6.455 casos
entre 2000 e 2007 (0,21% dos casos registrados), esse número ainda é considerado baixo
quando comparado aos índices asiáticos. Os especialistas explicam que isso pode ocorrer por
uma falha de diagnostico por parte dos profissionais de saúde brasileiros e também pela
miscigenação racial verificada em nosso país, onde a maior parte da população tem
ascendência africana e podem ter herdado de seus ancestrais marcadores genéticos que
conferem uma resistência maior a FHD, quando comparados a descendentes de europeus e
asiáticos (Teixeira et al., 2009; Teixeira et al., 1999; Blanton et al., 2008).
Apesar dos índices de FHD serem considerados baixos quando comparados a outras
regiões do mundo, a taxa de mortalidade brasileira no tocante a dengue é considerada alta e
apresenta crescimento com o passar dos anos, variando de 1,45% em 1995 a 11,25% em 2007,
quando taxas de até 1% são consideradas aceitáveis (Teixeira et al., 2009).
Atualmente o Brasil é considerado o país com o maior índice de infectados pelos vírus
dengue no mundo. É interessante ressaltar que os dados sobre o número de infectados pela
doença no Brasil, apesar de alarmantes, são subestimados, uma vez que existem casos de
infecções assintomáticas que não são registradas pelo Sistema Único de Saúde (SUS). Assim,
acredita-se que o número de pessoas infectadas seja superior aos números oficiais (Teixeira et
al., 2009).
Dentro desse contexto, estudos filogenéticos e epidemiológicos se constituem em
ferramentas importantes para compreensão da origem e do padrão de circulação viral em
determinadas regiões, gerando informações que poderão ser úteis para prevenção e controle
de epidemias.
35
2.
JUSTIFICATIVA
No Brasil, após a re-emergência da dengue em decorrência da reintrodução do A.
aegypti na década de 70, várias epidemias foram notificadas (Tauil, 2001). Atualmente, o país
é considerado o primeiro lugar no ranking internacional referente ao número de casos
reportados da doença (Teixeira et al., 2009).
O Rio Grande do Norte, por sua vez, teve o primeiro caso da doença registrado a mais
de duas décadas, em 1994. No ano seguinte, o aumento do número de casos na capital (Natal)
e a proliferação do vetor promoveram a dispersão do vírus pelo estado (Cunha et al., 1999).
Fatores como índice de infestação predial elevado, irregularidade no abastecimento de água e
coleta de lixo, bem como o elevado número de imóveis e terrenos abandonados, oferecem
condições ideais para a proliferação do vetor aumentando a possibilidade de circulação viral e
o consequente aumento do número de casos da doença (Secretaria Estadual de Saúde, 2008).
A variabilidade genética dos vírus dengue pode ser comprovada pelos diferentes
genótipos e linhagens detectados em estudos evolutivos realizados nos últimos anos. Diante
desse fato, é evidente a importância de estudos de caracterização genética desses vírus, a fim
de detectar variantes genéticas, compreender suas origens, bem como monitorar a introdução
de novos genótipos ou linhagens virais (Mendez et al., 2010; Osman et al., 2009; Rico-Hesse
et al., 1997).
Com objetivos de realizar a caracterização genética e compreender a evolução dos
vírus dengue circulantes no estado do Rio Grande do Norte, analisamos sequências do gene
do envelope viral de amostras oriundas de dez municípios do estado coletadas no período de
2010 a 2012. Tais informações poderão ser úteis para a elaboração de estratégias de controle
da doença, uma vez que estudos de caracterização genética tem se mostrado essenciais para a
compreensão dos padrões epidêmicos e de propagação viral (Mendez et al., 2010).
36
3.
OBJETIVOS
3.1.
Objetivo geral
Caracterizar geneticamente os vírus dengue isolados no estado do Rio Grande do
Norte durante os anos 2010-2012.
3.2.
Objetivos específicos
 Sequenciar o gene do envelope dos vírus dengue circulantes no estado do Rio Grande
do Norte durante o período de 2010 a 2012;
 Realizar a análise filogenética por meio de comparações das sequencias obtidas neste
estudo com sequencias armazenadas no GenBank, provenientes de outros estados
brasileiros e de outros países;
 Identificar os genótipos e linhagens dos DENV circulantes no estado do Rio Grande
do Norte e no Brasil;
 Pesquisar a origem e o padrão de migração dos DENV isolados no estado do Rio
Grande do Norte e no Brasil;
 Verificar a ocorrência de possíveis substituições de aminoácidos na proteína E dos
DENV isolados no estado do Rio Grande do Norte, em comparação com linhagens
ancestrais.
37
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1.
Amostras Clínicas
As amostras de sangue ou soro utilizadas nesse estudo foram provenientes de casos
suspeitos de dengue atendidos por demanda espontânea em diferentes Unidades de Saúde
(Hospitais, Centros e Postos de Saúde) de diferentes Municípios do estado do Rio Grande do
Norte, durante o período de Janeiro de 2010 a Dezembro de 2012. Essas amostras foram
recebidas pelo Laboratório Central Doutor Almino Fernandes (LACEN-RN) para a realização
do isolamento viral em cultura de células C6/36, e encaminhadas para o Laboratório de
Biologia Molecular de Doenças Infecciosas e do Câncer (LADIC) para a realização das
técnicas de transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) e
sequenciamento do gene do envelope viral. Cada amostra veio acompanhada de ficha de
identificação e dados de coleta em relação ao início da doença. As amostras foram
transportadas até o Laboratório de Biologia Molecular de Doenças Infecciosas e do Câncer
(UFRN) sob refrigeração e foram acondicionadas a -70 ºC até o momento da utilização.
Para a realização deste estudo, este projeto foi previamente submetido à apreciação e
aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte (Protocolo N° 136/2009 CEP-UFRN).
4.2.
Coleta de sequencias do GenBank para estudos filogenéticos
Foram coletadas sequências armazenadas no GenBank (banco de dados de sequências
nucleotídicas) e suas respectivas traduções em proteínas mantido pelo NCBI, Centro Nacional
de Informações Biotecnológicas dos EUA (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), para estudos
filogenéticos.
4.3.
Extração do RNA viral
O RNA viral das amostras de soro dos pacientes foi extraído usando o QIAMP Viral
Mini Kit (QUIAGEM, Inc., Valencia, EUA) para posterior realização de RT-PCR (transcrição
reversa seguida de reação em cadeia pela polimerase).
Em um tubo de 1,5 mL, foram adicionados 560 L do tampão AVL, 5,6 L de RNA
transportador (carrier) e 140 L da amostra. Em seguida, a solução foi homogeneizada com o
auxílio do vórtex e incubada a temperatura ambiente por 10 minutos. Foram adicionados 560
L de etanol 96%-100% em cada tubo e, em seguida, vórtex. Foram transferidos 630 L da
solução para a coluna de sílica e as centrifugamos por 1 minuto a 8000 rpm. Em seguida
38
transferimos as colunas para novos tubos coletores, adicionamos os 630 L restantes da
solução e centrifugamos por 1 minuto a 8000 rpm. Transferimos a coluna para um novo tubo
coletor, adicionamos 500 L do tampão AW1 e centrifugamos por 1 minuto a 8000 rpm.
Transferimos novamente a coluna para um novo tubo coletor, adicionamos 500 L do tampão
AW2 e centrifugamos por 3 minutos a 14000 rpm. Por fim, transferimos as colunas para
microtubos de 1,5 mL, adicionamos 60 L de tampão AVE, incubamos por 1 minuto a
temperatura ambiente e submetemos a amostras a uma última centrifugação de 1 minuto a
8000 rpm. O RNA viral foi estocado a -70 ºC até o momento do uso.
4.4.
Transcrição reversa seguida de reação em cadeia pela polimerase (RT-PCR)
Foram realizados dois protocolos de RT-PCR. O primeiro protocolo, descrito por
Lanciotti et al. (1992), foi utilizado para o monitoramento viral, aplicado em todas as
amostras recebidas durante o estudo (2010-2012). Este protocolo detecta os quatro sorotipos
simultaneamente em um procedimento semi-nested, gerando produtos amplificados
(amplicons) com tamanhos específicos (em pares de base) para cada sorotipo dos DENV. Em
uma primeira etapa, foram utilizados iniciadores consensuais (D1 e D2) para os quatro
sorotipos dos DENV, complementares as seqüências dos genes que codificam as proteínas C e
prM. No procedimento semi-nested, foram utilizados iniciadores específicos TS1, TS2, TS3 e
TS4 para detecção dos DENV-1 a 4, respectivamente. O segundo protocolo, detalhado a
seguir, foi realizado para a amplificação da região do envelope viral, seguindo a estratégia de
“primer walking”.
4.4.1. Iniciadores
Os iniciadores utilizados neste estudo para amplificação do gene do envelope dos vírus
dengue 1 e 2 foram descritos por Araújo (2009). Os iniciadores para dengue 4 foram
desenhados para este estudo. Cada um dos iniciadores foi desenhado para amplificar regiões
de aproximadamente 900 pares de bases com regiões sobrepostas de 200 pares de bases
(Tabelas 2, 3 e 4).
39
Tabela 1 - Oligonucleotídeos para sequenciamento do gene do envelope dos DENV-1.
Região
Primer sense A
(5’-3’)
Primer antisense B
(5’-3’)
1
TTA GTC TAC GTG
GAC CGA CAA GAA
TGA CCT ATG GGA
CGT GTT CTC A
GAC GCG AAC TTT
GTG TGT CG
GTG GGA TCA CAA
GAA GGA GCA
GGG ATT AAA TTC
AAG GAG CAC G
GCC TAT TCC CAC GCA
TCG
GAG TCC AAT GTG AGG
GCT CC
GGC GCA TCT GTT CCT
TCG TA
CCA ATG GCT GCT GAC
AGT CTT
ACT TGC CTA GAT GCC
ATG GC
2
3
4
5
Posição do genoma
(de acordo com
AF513110)
6 - 938
Produto
(pb)
932
Tm
(ºC)
A/B
62/63
660 - 1469
809
63/63
1193 - 1900
707
63/64
1691 - 2539
848
63/63
2332 - 3217
885
62/62
Posição do genoma
(de acordo com
AF489932)
14 - 906
Produto
(pb)
892
Tm
(ºC)
A/B
62/64
708 - 1586
878
62/62
1467 – 2405
938
62/63
2202 - 3106
904
63/63
2958 - 3800
842
62/62
Posição do genoma
(de acordo com
JN559741.2)
11 - 978
Produto
(pb)
967
Tm
(ºC)
A/B
59/60
767 - 1678
911
58/58
1416 - 2352
936
59/59
2206 - 3187
981
58/59
2932 - 3932
1000
59/60
Tabela 2 - Oligonucleotídeos para sequenciamento do gene do envelope dos DENV-2.
Região
Primer sense A
(5’-3’)
1
CGT GGA CCG
AAG ACA GA
GAT CAG TGG
TCG TTC CA
ATG GCA CTG
CGA TGG AG
GGA TCC CTG
GGA GTG TT
GAC TCA AAA
ATG TCA GCG G
2
3
4
5
Primer antisense B
(5’-3’)
ACA
CAC
TCA
GGA
CTC
GGA GCG ACG GCT GTC
AGT AA
CTC CGC GTA GCC ATG
GTA AC
CAC TAT CAG CCT GCA
CCA TAG CT
TCC ATT GCT CCA GAG
GGT GT
GTC CTT TGG GAA AGG
AGT GC
Tabela 3 - Oligonucleotídeos para sequenciamento do gene do envelope dos DENV-4.
Região
Primer sense A
(5’-3’)
Primer antisense B
(5’-3’)
1
TCC AAA TCG GAA
GCT TGC TT
GGA AGC ATG CTC
AGA GAG TAG AGA
GTC ACC ATC GGT
TGA AGT CAA A
TCA TTG GGA AAG
GCT GTG C
GTG TGT GAC CAC
AGG CTG ATG
GAC CCA TGC TCC ACC
TGA GA
ATC CCA GCA CTG TCA
CAT CCT
GCA CGT CAT GGC CAT
TGA
CCA TGG ACC CAC GGT
TTG
CCT CA AGC CAT GAC
CAA TG
2
3
4
5
4.4.2. Reação em cadeia pela polimerase
Em um tubo tipo eppendorf adicionamos 14 µL de água livre de nucleases (Promega,
Madison, EUA), 2,5 µL (500 nM) do iniciador sense (Invitrogen, EUA), 2,5 µL (500 nM) do
iniciador antisense (Invitrogen, EUA), 1 µL da enzima AMV-RT (Promega, Madison, EUA)
e 25 µL do Acessquick Master Mix (2x) (Promega, Madison, EUA). Em seguida foram
adicionados 5 µL do RNA extraído e o tubo foi submetido à agitação com auxilio de um
vórtex.
40
O RNA extraído foi reversamente transcrito a 45 °C por 60 minutos, inativação da
enzima a 95 ºC por 2 min, diretamente seguidos de 30 ciclos de desnaturação 94 °C por 30
segundos, 54 °C-62 °C por 1 minuto (dependendo do par de iniciadores utilizado) e 72 °C por
2 minutos, com uma extensão final a 72 °C por 10 minutos. A amplificação foi realizada
utilizando termociclador modelo 22331 (Eppendorf AG, Hamburg, GER).
Após o término da RT-PCR, analisamos os produtos amplificados por eletroforese em
gel de agarose (BioAmerica Inc., Miami, USA – cat nº D1500 – LE) a 1% em TBE 0,5X, por
60 minutos a 100V.
4.5.
Purificação de produto de PCR
Quando foram observados amplicons únicos na eletroforese em gel de agarose descrita
no item 3.5.1, a purificação foi feita diretamente do produto da PCR usando o “kit comercial
PCR Purification” (Qiagen, Inc., Valencia, CA).
Em um tubo de 1,5 mL, adicionamos 5 volumes de Buffer PB para 1 volume de reação
de RT-PCR, ou seja, 225 L de Buffer para 45 L de reação. Levamos a solução para o
vórtex para homogeneização. Transferimos a solução para a coluna e centrifugamos por 60
segundos a 14.000 rpm. Desprezamos o líquido que foi filtrado pela coluna, adicionamos 750
L do buffer PE e centrifugamos novamente por 60 segundos a 14.000 rpm. Após a
centrifugação, desprezamos mais uma vez o liquido filtrado e centrifugamos a coluna por 1
minutos a 14.000 rpm. Transferimos a coluna para um tubo de 1,5 mL, adicionamos 30 L de
buffer EB ou de H2O livre de nucleases, incubamos por 1 minuto a temperatura ambiente,
seguida por uma última centrifugação de 1 minuto a 14.000 rpm. O DNA purificado foi
armazenado a -20 ºC até o momento do uso.
4.6.
Purificação de produto de PCR por extração de gel de agarose
Quando foi observada a presença de amplicons inespecíficos, ou seja, além do amplicon
de interesse, realizamos um gel de purificação. A eletroforese foi feita em gel de agarose a
0,7%, a 110V. Aplicamos todo volume da reação de PCR, 5 L de GelRed e 5 L de
sacarose nos poços gerados pelo pente. O gel foi analisado no transiluminador e os amplicons
de interesse foram cortados usando lâminas de bisturi estéreis. Após o corte, o fragmento de
gel contendo o amplicon de interesse foi transferido para um tubo de 1,5 L e foi realizada a
purificação utilizando o “kit comercial Gel Extraction” (Qiagen, Inc., Valencia, CA).
41
Adicionamos 300 L de Buffer QG para cada 100 g de gel e incubamos a 50 ºC por
10 minutos, homogeneizando a cada 2-3 minutos com auxílio do vórtex. Após o período de
incubação, com o gel totalmente dissolvido, checamos a cor da mistura, que deve está
amarela, semelhante ao buffer QG. Em seguida adicionamos 100 L de isopropanol à
amostra e adicionamos a mistura à coluna previamente preparada. Com as amostras já nas
colunas, centrifugamos por 1 minuto a 13.000 rpm, desprezamos o filtrado, adicionamos 500
L do Buffer QG e centrifugamos novamente seguindo os mesmo parâmetros. Em seguida,
desprezamos o filtrado, adicionamos 750 L de Buffer PE, centrifugamos novamente por 1
minuto, desprezamos o filtrado e incubamos a amostra durante 2 a 5 minutos antes das duas
próximas centrifugações. Por fim, colocamos a coluna em um tubo de coleta de 1,5 mL,
adicionamos 30 L de Buffer EB ou H2O livre de nucleases no centro da coluna e
centrifugamos por 1 minuto. O DNA purificado foi estocado a -20 ºC até o momento do uso.
4.7.
Quantificação do DNA
A partir do produto da purificação direta da reação de PCR ou de gel-purificação,
realizamos uma eletroforese em gel de agarose a 2% em TBE 0,5X com objetivo de
quantificar o DNA presente em cada amostra e com isso determinar a quantidade ideal de
DNA deve ser adicionada a reação de PCR de sequenciamento. Aplicamos 4 L de peso
molecular de Massa (Invitrogen, Carlsbad, CA) no primeiro orifício do gel e 4 L do DNA a
ser quantificado nos demais orifícios, juntamente com 2 L de GelRed e 2 L de sacarose. O
procedimento teve duração de 60 minutos a 100v.
A concentração do DNA foi estimada através da comparação dos amplicons com o
peso molecular de massa (Tabela 5).
Tabela 4 - Valores de referência para comparação do amplicon obtido com peso molecular de massa para
determinação da quantidade ideal de DNA a ser aplicada na reação de sequenciamento.
Tamanho do fragmento
Low DNA Mass (4 L)
DNA (L/reação)
1200 pb
120 ng
2 L
800 pb
80 ng
4 L
400 pb
40 ng
5 L
200 pb
20 ng
6 L
100 pb
10 ng
8 L
42
4.8.
Reação de sequenciamento
Em um microtubo, adicionamos 2 L do primer específico, 2 L de Big Dye
Terminator Cicle Sequencing Randy (Applied Biosystems, Foster City, CA), a quantidade de
DNA determinada pelo processo de quantificação (descrito no item 4.8) e completamos o
volume com H2O livre de nucleases até atingir 10 L.
A solução foi submetida aos seguintes parâmetros de termociclagem: 30 ciclos de
94ºC por 1 minuto, 30 ciclos de 2 minutos com a TM específica do primer utilizado e 30
ciclos de 3 minutos a 72 ºC. A amplificação foi realizada utilizando termociclador modelo
22331 (Eppendorf AG, Hamburg, GER).
4.9.
Purificação e precipitação de DNA para remoção de Dye Terminators
O DNA foi purificado e precipitado utilizando colunas “Centri-Sep” (Princeton
Separations, Inc, Adelphia, NJ).
4.9.1. Hidratação da coluna
Adicionamos 800L de água livre de nucleases a coluna, misturamos por inversão
com auxílio de um vórtex e deixamos a mesma em repouso por 30 minutos evitando a
formação de bolhas. Após a incubação verificamos se haviam bolhas, removemos as bolhas
existentes com auxílio de uma micropipeta e removemos a tampa inferior da coluna
permitindo a drenagem do excesso de água para um tubo de 2mL. Em seguida, desprezamos
á água drenada e centrifugamos a coluna no tubo de 2mL por 2 minutos a 3000 rpm. Por fim,
desprezamos o tubo de coleta juntamente com o excesso de água drenada.
4.9.2. Processamento da amostra
Com o gel pronto, transferimos 10L da reação de sequenciamento para a coluna, no
centro do gel. Colocamos a coluna em um tudo do tipo eppendorf de 1,5mL e centrifugamos
por 2 minutos a 3000 rpm. Desprezamos a coluna e secamos a amostra em estufa por 18
horas a 37ºC. O sedimento foi ressuspenso em 10L de formamida Hi-Di (Applied
Biosystems, P/N 4311320), aquecido por 2 minutos a 95ºC e mantido no banho de gelo até
que os 10L tenham sido aplicados na placa do sequenciador automático “Applied
Biosystems Prism” 3100 (Perkin-Elmer, Applied Biosystems, Foster City, CA).
43
4.10. Análise de sequencias nucleotídicas
As sequencias obtidas foram visualizadas no programa Chromas Lite 2.1
(Technelysium Pty Ltd) e editadas manualmente por meio de alinhamentos feitos no Clustal
W2 (Thompson et al., 1997) com sequências referência obtidas no banco de dados do NCBI.
Para a construção do banco de sequencias nucleotídicas de outros estados e países,
foram coletadas do GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) todas as seqüências do gene do
envelope viral dos DENV-1, DENV-2 e DENV-4 com vistas a estabelecer relações
filogenéticas entre os DENV estudados neste projeto e os DENV isolados em outras
localidades ou países. Apenas seqüências com ano de isolamento e local de origem foram
coletadas. Seqüências previamente identificadas como recombinantes (Worobey et al., 1999)
foram excluídas, utilizando os mesmos critérios descritos por Twiddy et al. (2003). Até
quatro sequências idênticas do mesmo ano e local foram coletadas.
Após a construção do banco de sequências nucleotídicas, foi realizado o alinhamento
múltiplo com o auxílio do programa Clustal W2 (Thompson et al., 1997). O Programa
ModelTest v3.7 (Posada, 2008) foi utilizado para a pesquisa do melhor modelo evolutivo a
ser seguido. As árvores filogenéticas foram construídas pelo método de Neighbor-Joining a
partir do programa MEGA versão 5.2 (http://www.megasoftware.net/).
44
5. RESULTADOS
Foram estudados 1581 casos suspeitos de dengue, provenientes de diferentes
municípios do estado do Rio Grande do Norte, durante o período de janeiro de 2010 a
dezembro de 2012. Desses casos, a infecção por DENV foi confirmada em 30,2% (478/1581).
O sorotipo predominante durante o período estudado foi o DENV-1, representando 47%
(225/478) dos casos positivos, seguido do DENV-4 com 33,4% (160/478), DENV-2 com
19,2% (92/478) e DENV-3 com 0,2% (1/478). Dos vírus identificados, os genes dos
envelopes virais foram sequenciados em 16 isolados, sendo 6 de DENV-1, 6 de DENV-2 e 4
de DENV-4 (Tabela 5). O RNA do único DENV-3 identificado nesse estudo não pôde ser
recuperado para o sequenciamento do gene do envelope viral.
Tabela 5 - Relação de amostras selecinadas para o presente estudo, com seus respectivos sorotipos, origem e ano
de coleta.
AMOSTRA
SOROTIPO
ORIGEM
ANO
35
DENV-1
Florânia
2010
76
DENV-1
Caicó
2011
78
DENV-1
Natal
2011
81
DENV-1
Caicó
2010
123
DENV-1
Mossoró
2011
129
DENV-1
Guamaré
2011
08
DENV-2
Natal
2010
45
DENV-2
Natal
2011
54
DENV-2
Santo Antônio
2011
119
DENV-2
João Câmara
2011
169
DENV-2
Caicó
2010
383
DENV-2
Jaçanã
2011
05
DENV-4
Guamaré
2012
39
DENV-4
Natal
2012
380
DENV-4
Santa Cruz
2011
446
DENV-4
Caicó
2012
45
Três bancos de dados foram elaborados para este estudo. O primeiro com 522
sequências nucleotídicas correspondentes ao gene E (1485 pb) de DENV-1, outro com 883
sequências correspondentes ao gene E de DENV-2 e o último com 397 sequências
correspondentes a DENV-4. Cada uma das cepas foi identificada pelo local (utilizando a sigla
de duas letras dos países, disponível em http://www.inf.ufrgs.br/~cabral/Paises.html, ano de
isolamento e número de acesso ao GenBank.
5.1.
Reconstrução filogenética e filogeografia dos DENV-1 brasileiros
A análise das 522 sequências foi realizada no programa Mega 5.2, usando o método de
inferência filogenética Neighbor-Joining, modelo de substituição de nucleotídeo Tamura-Nei
e bootstrap de 10000 replicações. O método identificou a existência de cinco genótipos (GIV) (Figuras 4 e 5). O genótipo I apresenta amostras oriundas da Tailândia, Laos, Estados
Unidos, Japão, Myanmar, China, Vietnã, Camboja, Taiwan, Sri Lanka, Cingapura, Coréia do
Sul, Malásia, Indonésia e Irlanda. O genótipo II possui cepas oriundas da Tailândia e
Indonésia. O genótipo III é constituído apenas por cepas da Malásia. O genótipo IV possui
cepas da China, Filipinas, Austrália, Ilha Reunião, Malásia, Tailândia e Indonésia. O genótipo
V possui amostras do Brasil, Ilhas Virgens, Índia, Ilha Reunião, Cingapura, Porto Rico,
Paraguai, Peru, Barbados, Granada, Trinidad Tobago, Colômbia, México, Aruba, Bahamas,
Jamaica, Suriname, Angola, El Salvador, Nicarágua, Venezuela, Honduras, Belize, Haiti e
Martinica. O genótipo V se apresentou subdividido em duas linhagens de amostras brasileiras
(BR-I e BR-II) (Figura 6), BR-I apresenta amostras do Rio de Janeiro, Distrito Federal,
Roraima, Alagoas e algumas amostras sem identificação do estado de origem (Figura 7). BRII apresenta amostras do Rio Grande do Norte geradas por este estudo, Rio de Janeiro, Ceará,
São Paulo e algumas amostras sem identificação do estado de origem (Figura 8).
Foram selecionadas 18 sequências pertencentes aos cinco genótipos em questão com
objetivo de inferir sobre seu percentual de identidade nucleotídica. O percentual de identidade
entre as mesmas variou de 90,50% a 99%. Com relação às linhagens brasileiras BR-I e BR-II,
verificamos que o percentual de simlaridade variou entre 95,40% a 97,20%. Todos os
genótipos estudados apresentaram valores de divergência superiores a 6% entre si (Figura 9).
Com base na análise filogenética sugerimos que ocorreram duas introduções dos vírus
DENV-1 no território brasileiro, no entanto, não foi possível a determinação da possível
origem das cepas brasileiras pertencentes a BR-I, provavelmente pela pouca quantidade de
sequências disponíveis no GenBank ou devido ao método de inferência utilizado. No entanto,
46
a análise sugere que a linhagem BR-II, por sua vez, entrou no país importada das Ilhas
Virgens Britânicas (Figura 10).
19
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.
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1
3 979837.1.1
03
6Q
JN
2010 0C020
J
H
T
9
.
H
5
.1
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6 TAB4600385
2 2500W
.1
757079.1
687
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.119111
Q
1
T
.
J
J
8
6
9
F
0
W
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1
0
N
.
T
.1
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F97
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51
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20080M
JN
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HHJH
T
20
T
8
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JH
2019 KLKF
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1 7 544794
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0
0
2
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VSNG
63
2
1 9987
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11
45
LK
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6
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7
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2200
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V
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F 2 H 1 7..11
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2 20 TH0J0 1K92944279530...11
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H
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1TH99
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96
19
38
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09
9
19
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8 0
2205 K000 TT TH
4
J
H
H
0
H
0
3
H
V
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Q 477 78
0
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N T3W
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3 22 24
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200004 0V50VVN
VNNNFG
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G
5 VN CEN
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U
J
J
4
N
N
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3
8
0
7
6
27398891783.381557.616.9672..6.1.1.11
9.
81.1 1 1
1
2.1
0.01
100
CN JN029816
96
GI
GII
GIII
GV
GV
Figura 4 - Genótipos de DENV-1 representados em árvore de radiação elaborada do programa MEGA 5.2 usando
o método de inferência filogenética Neighbor-Joining, modelo de substituição Tamura-Nei e bootstrap com 10000
replicações (Osman et al., 2009).
47
100
GV
100
GIV
67
100
73
GIII
GII
100
GI
99
0.01
Figura 5 - Árvore colapsada no programa Mega 5.2 representando os cinco genótipos DENV-1 (Osman et al.,
2009). O genótipo V, marcado em verde apresenta amostras brasileiras. Os números representam os valores de
bootstrap.
48
BR-I
41
16
49
69
30
99
2004 VE JN819425.1
2006 US PR EU482591.1
79
52
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19
GV
1
0
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2011 BR RJ JN122281.1
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52
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49
VE 1997-00
39
100
BR-I
VE 1998-07
32
PR 2010
MQ 2008
HT 2010
92
VE 1996-2007
97
VE/ CO 1997-01
2
4
1999 VE FJ639743.1
2008 VE FJ850104.1
2005 VE GU131837.1
67 2008 GY JN415506.1
61
2008 BR FJ850093.1
70
2010 BR RR JN713897.1
97
2005 CO GQ868562.1
3
37
37
VE 2004
100
100
73
41
35
2
GIV
67
19
GIII
GII
CO 2006-08
VE 2004-05
68
4
VE/ BB 1994-06
100
8
26
VE/ NI/ SV 2006-12
70
2009 US JQ425067.1
81
92
US 2009-10
NI 2006-08
31
90
96
20
NI/ MX/ BZ/ SV/ HN 2004-10
20
2001 BR HQ603917.1
2001 BR DF AB519681.1
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1986 BR RJ HQ026760.1
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1996 US PR FJ478457.1
61
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53
GI
99
21
35
93
38
PR 1985-93
1996 CO AF425617.1
1993 SV JN819417.1
21
31
21
13
0.01
1988 AO AF425610.1
25
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35
12
1981 SR JN379485.1
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1977 BS JN379475.1
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80
10
14
22
23
67
MX 1980-83
1977 GD JN379480.1
23
11
47
15
97
44
1985 CO AF425616.1
1986 TT AF425639.1
1981 TT JN379483.1
1981 GD JN379484.1
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1995 BB JN379486.1
1991 PE AF425626.1
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PR 1987-94
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1999 PY AB111065.1
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PR 1987-98
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40
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52
66
2006 IN EU448413.1
2005 SG EU081258.1
2004 RE DQ285554.1
2005 IN JF297583.1
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66
2006 BR FJ850087.1
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6
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2010 BR RJ HQ696613.1
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16
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17
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BR-II
55
87
43
BR-II
0.005
Figura 6 - Genótipo dos vírus DENV-1 e suas duas linhagens brasileiras (BR I-II) marcadas em verde.
49
41
16
2008 VE FJ850103.1
2011 BR RJ JN122281.1
2010 BR AL JQ015185.1
69
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49
49
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VE 1997-00
39
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2004 VE JN819425.1
2006 US PR EU482591.1
79
52
42 46
21
19
1
0
BR-I
VE 1998-07
32
PR 2010
MQ 2008
HT 2010
92
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37
37
41
VE 1998-07
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VE 2004
41
35
2
19
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68
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49
16
CO 2006-08
30
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8
26
70
92
79
US 2009-10
52
NI 2006-08
31
90
1
96
NI/ MX/ BZ/ SV/ HN 2004-10
2001 BR HQ603917.1
2001 BR DF AB519681.1
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1996 US PR FJ478457.1
4
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76
21
93
38
3
25
20 GD 1987-88
35
13
12
10
14
22
23
19
VE/ BB 1994-06
8
26
VE/ NI/ SV 2006-12
70
81
NI/ MX/ BZ/ SV/ HN 2004-10
76
21
PR 1987-94
0.002
PR 1987-98
40
90
52
66
2006 IN EU448413.1
2005 SG EU081258.1
2004 RE DQ285554.1
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1985 VG GQ868601.1
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2000
BR
FJ850071.1
26
28 2000 BR FJ850070.1
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32
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7
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6
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68
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16
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17
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BRBR-II
II
55
87
43
NI 2006-08
20
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27
US 2009-10
90
61
2003 BB JN379472.1
61
92
96
20
1995 BB JN379486.1
1991 PE AF425626.1
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2009 US JQ425067.1
31
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43
86
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VE 2004-05
68
4
1988 AO AF425610.1
1993 US PR FJ410184.1
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41
35
2
1985 CO AF425616.1
1986 TT AF425639.1
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1981 GD JN379484.1
44
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2008 BR FJ850093.1
2010 BR RR JN713897.1
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VE 2004
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1977 GD JN379480.1
23
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VE 1996-2007
1999 VE FJ639743.1
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2004 AW JN379473.1
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HT 2010
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21
PR 2010
MQ 2008
37
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21
31
46
VE/ CO 1997-01
2
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42
21
19
0
20
53
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2004 VE JN819425.1
2006 US PR EU482591.1
2009 US JQ425067.1
81
20
VE 1997-00
39
VE/ NI/ SV 2006-12
0.005
Figura 7 - Linhagem BR-I do genótipo V de DENV-1.
1997 BR AF425614.1
1986 BR RJ HQ026760.1
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41
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49
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VE 1997-00
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2006 US PR EU482591.1
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BR-I
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MQ 2008
HT 2010
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VE/ CO 1997-01
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VE 2004-05
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70
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US 2009-10
NI 2006-08
31
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PR 1985-93
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1993 SV JN819417.1
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1985 VG GQ868601.1
1988 AO AF425610.1
1985 CO AF425616.1
1986 TT AF425639.1
1981 TT JN379483.1
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1995 BB JN379486.1
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59
16
1999 PY AB111065.1
61
PR 1987-98
27
40
90
52
66
2006 IN EU448413.1
2005 SG EU081258.1
2004 RE DQ285554.1
2005 IN JF297583.1
1985 VG GQ868601.1
81
2007 BR FJ850090.1
57
2005 BR FJ850084.1
47
2003 BR FJ850077.1
2002 BR FJ850075.1
62
2000 BR FJ850071.1
26
28 2000 BR FJ850070.1
2004 BR FJ850081.1
2010 35 BR RN FLORANIA
2011 76 BR RN CAICO
32
44
2011 78 BR RN NATAL
2011 123 BR RN MOSSORO
66
2006 BR FJ850087.1
16
2010 BR CE JN982362.1
9
2010 81 BR RN CAICO
10 38
2011 129 BR RN GUAMARE
7
2008 BR SP GU131863.1
2009 BR HM043709.1
6
2010 BR RJ HQ696614.1
68
2010 BR RJ HQ696613.1
58
2010 BR RJ HQ026762.1
16
2009 BR RJ HQ026761.1
17
95 2009 BR RJ HM043710.1
BRBR-II
II
55
87
43
44
2003 BB JN379472.1
43
86
97
2011 76 BR RN CAICO
2011 78 BR RN NATAL
2011 123 BR RN MOSSORO
2006 BR FJ850087.1
2010 BR CE JN982362.1
9
2010 81 BR RN CAICO
10
2011 129 BR RN GUAMARE
38
7
2008 BR SP GU131863.1
2009 BR HM043709.1
6
2010 BR RJ HQ696614.1
68
2010 BR RJ HQ696613.1
58
2010 BR RJ HQ026762.1
16
2009 BR RJ HQ026761.1
17
95 2009 BR RJ HM043710.1
0.001
0.005
Figura 8 - Linhagem BR-II do genótipo V de DENV-1. As amostras geradas neste estudo estão sinalizadas com
círculos pretos.
51
Tabela 6 - Matriz de identidade nucleotídica entre representantes dos cinco genótipos de DENV-1.
SEQUÊNCIA
1. 2011_78_BR_RN_NATAL
2. 2011_123_BR_RN_MOSSORO
3. 2010_35_BR_RN_FLORANIA
4. 2011_76_BR_RN_CAICO
5. 2010_81_BR_RN_CAICO
6. 2011_129_BR_RN_GUAMARE
7. 1986_BR_RJ_HQ026760.1
8. 2010_BR_AL_JQ015184.1
9. 2011_BR_RJ_JN122281.1
10. 2002_PH_AY422782.1
11. 2010_CN_JN029816.1
12. 1972_MY_EF457905.1
13. 2012_ID_KC589010.1
14. 1964_TH_AF180817.1
15. 1960_TH_JF297570.1
16. 1999_MM_AY618878.1
17. 2010_CN_JN029817.1
18. 1990_TH_JN638337.1
1
ID
99,00%
97,60%
99,00%
98,70%
99,40%
96,70%
95,50%
95,50%
90,90%
91,70%
91,90%
92,80%
92,80%
92,30%
92,10%
92,10%
91,80%
2
99,00%
ID
97,30%
98,60%
98,50%
99,00%
96,10%
95,10%
95,10%
90,50%
91,30%
91,50%
92,30%
92,30%
91,80%
91,50%
91,50%
91,20%
3
97,60%
97,30%
ID
98,00%
97,70%
98,00%
96,70%
97,10%
97,20%
90,60%
91,30%
91,70%
92,60%
92,60%
92,10%
91,00%
91,10%
90,70%
4
99,00%
98,60%
98,00%
ID
98,90%
99,40%
97,10%
96,20%
95,90%
91,10%
91,70%
91,90%
92,70%
92,70%
92,30%
91,90%
91,80%
91,50%
5
98,70%
98,50%
97,70%
98,90%
ID
99,10%
96,50%
95,40%
95,40%
90,80%
91,30%
91,50%
92,30%
92,30%
91,80%
91,40%
91,50%
91,10%
6
99,40%
99,00%
98,00%
99,40%
99,10%
ID
96,80%
95,60%
95,60%
91,20%
91,90%
92,10%
92,90%
92,90%
92,50%
92,00%
92,10%
91,70%
7
96,70%
96,10%
96,70%
97,10%
96,50%
96,80%
ID
97,90%
97,70%
91,30%
91,80%
92,70%
92,90%
92,90%
92,50%
92,10%
92,20%
91,90%
8
95,50%
95,10%
97,10%
96,20%
95,40%
95,60%
97,90%
ID
99,40%
90,90%
91,50%
92,10%
92,50%
92,50%
92,40%
91,30%
91,40%
91,10%
9
95,50%
95,10%
97,20%
95,90%
95,40%
95,60%
97,70%
99,40%
ID
90,70%
91,40%
92,00%
92,50%
92,50%
92,40%
91,30%
91,40%
90,90%
10
90,90%
90,50%
90,60%
91,10%
90,80%
91,20%
91,30%
90,90%
90,70%
ID
98,40%
93,10%
93,10%
93,10%
93,00%
92,00%
92,50%
92,10%
11
91,70%
91,30%
91,30%
91,70%
91,30%
91,90%
91,80%
91,50%
91,40%
98,40%
ID
93,60%
93,70%
93,70%
93,40%
91,90%
92,60%
92,10%
12
91,90%
91,50%
91,70%
91,90%
91,50%
92,10%
92,70%
92,10%
92,00%
93,10%
93,60%
ID
94,10%
94,10%
93,90%
92,70%
93,00%
92,60%
13
92,80%
92,30%
92,60%
92,70%
92,30%
92,90%
92,90%
92,50%
92,50%
93,10%
93,70%
94,10%
ID
99,80%
98,30%
92,50%
93,20%
92,50%
14
92,80%
92,30%
92,60%
92,70%
92,30%
92,90%
92,90%
92,50%
92,50%
93,10%
93,70%
94,10%
99,80%
ID
98,30%
92,50%
93,20%
92,50%
15
92,30%
91,80%
92,10%
92,30%
91,80%
92,50%
92,50%
92,40%
92,40%
93,00%
93,40%
93,90%
98,30%
98,30%
ID
92,70%
93,40%
92,60%
16
92,10%
91,50%
91,00%
91,90%
91,40%
92,00%
92,10%
91,30%
91,30%
92,00%
91,90%
92,70%
92,50%
92,50%
92,70%
ID
98,30%
98,70%
17
92,10%
91,50%
91,10%
91,80%
91,50%
92,10%
92,20%
91,40%
91,40%
92,50%
92,60%
93,00%
93,20%
93,20%
93,40%
98,30%
ID
98,70%
18
91,80%
91,20%
90,70%
91,50%
91,10%
91,70%
91,90%
91,10%
90,90%
92,10%
92,10%
92,60%
92,50%
92,50%
92,60%
98,70%
98,70%
ID
British Virgin
Islands
BR-II
Figura 9 - Mapa representando a possível introdução dos vírus DENV-1 no Brasil. A introdução da linhagem
BR II está representada em vermelho.
52
5.2.
Análise das alterações na cadeia peptídica da proteína E dos DENV-1
Comparamos oito cepas pertencentes ao sorotipo 1 (1985-2011). Quatro sequências
geradas por este estudo provenientes de Florânia, Caicó, Mossoró e Guamaré, todas isoladas
no período de 2010-2011, uma cepa das Ilhas Virgens Britânicas (1985), ancestral da
linhagem BR-II, uma cepa do estado do Rio de Janeiro (1986) pertencente a BR-II e duas
cepas pertencentes à linhagem BR-I, sendo que uma delas não possui dados sobre estado de
origem e foi isolada em 2000 e a segunda oriunda do Rio de Janeiro (2010).
Apesar de terem sido verificadas várias mutações ao longo da glicoproteína E das
cepas comparadas, foi constatada apenas uma substituição de aminoácidos que ocorreu na
posição E124 (R-K) (Tabela 6) do domínio II, não representativa de alteração de caráter
bioquímico, uma vez que ambos os aminoácidos pertencem a mesma categoria classificatória,
possuindo o radical polar carregado positivamente.
Tabela 7 - Substituições de aminoácidos nas amostras de DENV-1 provenientes do Rio Grande do Norte quando
comparadas com isolados provenientes do genótipo V
ISOLADOS DE DENV-1
1985_VG_GQ868601
1986_BR_RJ_HQ026760
2000_BR_FJ850071
2010_BR_RJ_HQ696612
2010_35_BR_RN_FLORÂNIA
2010_81_BR_RN_CAICÓ
2011_123_BR_RN_MOSSORÓ
2011_129_BR_RN_GUAMARÉ
DII
E94
R
.
.
.
Q
.
.
.
DII
E96
F
.
.
.
.
.
.
.
DII
E124
R
K
K
K
K
K
K
K
DII
E261
H
.
.
.
.
.
P
.
POSIÇÃO DO AMINOÁCIDO
DI
DI
DIII DIII DIII
E282 E294 E297 E299 E300
H
L
M
Y
V
.
.
T
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
P
F
.
F
W
.
L
.
.
.
DIII
E304
G
.
.
.
.
.
A
.
DIII
E338
L
S
.
S
S
.
.
.
DIII
E394
K
.
.
R
R
.
.
.
INSO INSO
E428 E436
L
I
V
V
.
.
V
V
V
.
.
T
.
.
.
.
DI: domínio I; DII: domínio II; DIII: domínio III, INSO: região insolúvel; VG: Ilhas Virgens Britânicas; BR:
Brasil; RJ: Rio de Janeiro; RN: Rio Grande do Norte.
53
5.3.
Reconstrução filogenética e filogeografia dos DENV-2 brasileiros
A análise das 883 sequências foi feita no programa Mega 5.2, utilizando o método de
inferência filogenética Neighbor-Joining, modelo de substituição nucleotídica Tamura-Nei e
bootstrap de 10000 replicações. O método identificou a existência de cinco genótipos. O
genótipo cosmopolita apresenta amostras oriundas de Bangladesh, Índia, Sri Lanka,
Cingapura, Austrália, Arábia Saudita, Uganda. O genótipo asiático II apresenta amostras de
Burkina Fasso, Arábia Saudita, Gana, Indonésia, Somália, Austrália, Papua Nova-Guiné,
Nova Caledônia, Polinésia Francesa, Ilhas Wallis e Futuna, Filipinas, China, Taiwan, Malásia,
Micronésia, Timor Leste, Japão, Brunei e Guam. O genótipo americano contém amostras da
Nova Caledônia, Polinésia Francesa, Fiji, Samoa Ocidental, Tonga, Índia, Porto Rico, Peru,
Colômbia, México e Honduras. O genótipo asiático I contém amostras das Filipinas, Taiwan,
Indonésia, Guam, Papua Nova-Guiné, Estados Unidos, Tailândia, Myanmar, Camboja,
Vietnã, Austrália, Laos e Cingapura. O genótipo asiático-americano apresenta amostras do
Brasil, Paraguai, Bolívia, Peru, Jamaica, São Cristóvão e Névis, Porto Rico, Venezuela, Costa
Rica, Nicarágua, Honduras, Guatemala, México, Belize, El Salvador, Ilhas Virgens, Equador,
Vietnã (Figuras 11 e 12). As cepas brasileiras, incluindo as amostras geradas neste estudo, se
apresentaram agrupadas em quatro linhagens dentro do genótipo asiático-americano (BRI-IV)
(Figura 13). BR-I se apresentou constituída por cepas do Rio de Janeiro, Rio Grande do
Norte, Espirito Santo e algumas cepas sem a identificação do estado de origem (Figura 14).
BR-II constituído por cepas sem identificação do estado de origem (Figura 15), BR-III
constituído por apenas uma amostra brasileira sem identificação do estado de origem (Figura
16) e BR-IV se apresentou constituído por cepas oriunda do Rio de Janeiro, São Paulo e Rio
Grande do Norte, incluindo as amostras provenientes deste estudo (Figura17).
Foram selecionadas 30 sequências representativas dos cinco genótipos para a
construção de uma matriz de similaridade nucleotídica. Com base nos resultados, verificou-se
que o percentual de identidade entre as sequências variou de 90,10% a 99,50%. Com relação
às quatro linhagens brasileiras, verificamos percentual de identidade de 96,70% a 97,70%
entre BR-I e BR-II, 96,40% a 96,70% entre BR-I e BR-III, 96,40% a 97,20% entre BR-I e
BR-IV, 96,40% a 97,30% entre BR-II e BR-III, 96,80% a 97,70% entre BR-II e BR-IV e
96,80% a 97,30% entre BR-III e BR-IV. O percentual de divergência mais alto ocorreu entre
as linhagens BR-I e BR-IV variando entre 2,8% e 3,6%. A divergência entre os genótipos
comparados foi superior a 6% (Figura 18).
54
Os nossos resultados sugerem a ocorrência de quatro possíveis introduções distintas do
sorotipo no país. A inferência aponta que os vírus pertencentes à linhagem BR-I do genótipo
asiático-americanos possivelmente entraram no país através de uma introdução que partiu de
países sul-americanos vizinhos (Venezuela, Equador ou Peru), passando pelo estado do Rio
de Janeiro e em seguida para o Rio Grande do Norte. Os vírus pertencentes à linhagem BR-II
teriam entraram no território brasileiro partindo de Porto Rico. BR-III teria vindo da
Colômbia e BR-IV, linhagem das amostras geradas neste estudo, teve origem no Caribe
(Porto Rico ou São Cristóvão e Névis), entrou no Brasil possivelmente pelo estado do Rio
Grande do Norte, município de Natal (Figura 19).
55
99
PE-1
-9
96 1
43
10
348
53
19
.
7
4
PF 263
989
8
39
GQ
ID
7.51
1911
90
58
KC
-76
ID
75
.1
99
62 ID 19
12
20
82.1
90
391.611
GQ96080.2
3
54 416
ID 8321
9
6
Q
76 G35
39
DQ0
19EGIU
7
D6
34
9I7F
61B
96731.
97
86
1.1 1928
19
86.6 612
BF
2842 74
586 M
56 A
JN
9999
JN A
PG S
3AU 1994
11
030 81.
20
202 525
SO
00
.1.1
.1
.1
03
02
99
.1
00
21
04
21
20
.1
05
10
58
21
08
58
21
09
21
.1
16
58
HM
58
17
EU
58
HM
21
06
.1
.1
07
HM
NC
HM
HM
14
58
NC
13
21
01
00
72
21
FJ
PF
1.1
71
58
HM
21
M21
AS
.1
58
71
86
19
19
4.
73
.1
M
H
58
58
M
PF
80
H
1919
72
19
.1
86
05
57
M
H
43
0.1 GH
TO
19
Q
71
63
89
HRM
H
12
AS
64
82
72
G
AS
74
53
96
19
FJ
68
72
F2
39
TO
91
72
FJ
A
P
JX
05
Q
71
Q
19
3 891
74
D
R
IN
RG
19P19
69
EU
P
P
R69
ID
05
71
19
21F.1J5
69
19
77
9IN
19
19
1977 19
20
.1 F1J956348
.1
92IN
.1
409.1
984850.1
989.1
8855165988
7
9
88.1
66
J63
88F
686Q
6
G1N
O
Q
7G
9Q
Q
G
5X
JG
H
6XE
M
0C
X
4X
20
V
J8
98M
98149E
31792M
10
09199P
20A
20011
0U6
33
5-99
69 72
43
19
23
18
38
24
11
3
1
0880
99
3341 61
27
8537
741
99
-71 654 9
99
67
9
3149
IN
IN
19
56
-6
4
94
20
05
51 95
86
401619
27
25
27
7-09
2006-07
SG
44
489930
SG 200
91
95
45 88
9644
SG
200
6
10
BD
959
1
84
579690
1
55135 96 1
7
98
75
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8
RPP
P
9
80
U
22
1
S
RS
98S
T J US PR
707
S
3UP
19P
U
541S
9U
52
0U
9493
S
7T
94U
1
1916199459U
199
11919
90
99
30
.11 8
95 522
73
9819.1
99
311.1
76.1
640.1
82.1
.
1
9
74.1
JN8194
8.1
EU045
1.1
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85.1
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BR
8.1
FJ8500
PY
BR
FJ8500
BR
.
BR
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9
2000
9
FJ8500
JX05180
BR
2002
2001
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2003
FJ85008
BO
BR
-07
2004
BR
2001
91
2003
PY EU045312.1
20062005
20052003
BO 2006
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23
98
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55
901
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G898197J10
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G
87
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O
20
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N
C
0
I
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N
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X
0
N
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1
2
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X 20
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2007
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TW
20
EU
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AU
20
2004
10
201
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09
201
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PH
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24
JN
.1
PH
PH
PH
0PH
PH
ID
.1
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79
79
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1
.1
80
82
79
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.1
.1
.1
.11
JTN
H
5
J6F8
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.1
TH
20
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TH 19 9
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518 997 M 20 TH
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JQ6
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JQ6
JQ6
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199
WF
WF
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199
199
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.1
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58.1
FM 2011
6Q
D
5Y
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6Q
D
NA
W
F
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Y
JP
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H
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H
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P
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KH
119
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NN
CN
CCJJFC
P
QQ
JJQ
J6Q
J6Q
5Q
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1
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78
54
LA
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-1
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20
31.14.1
.1
6.17094 625.1
65
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E
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V
QN
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J7V
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N5E
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0
V
J
0
1
W
6
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.1.1 40
.1
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52
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.1
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.1
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15
.1
JF
14
99
JN
FJFJ -10
11
JF
81
32
20 2
02
TH
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JQ
N93
N
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JF
99
TH
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V
V
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TH
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JQ
TH
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U
1
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FM
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20
JQ
2
G
05
20
1
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TH
20
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IE
N 19
20
20
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10
VN
09
20
20V
20
20
1000
1
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2010 TH JF9
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20.1
223
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000
18
86JQ
.1993
1996-2
TH
927
18
TH
4GQ
-0586
KH131
200
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DQ
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KH
H 20
TKH
TW
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98
.1
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19
19
DQ1818 93
-1191 TH
99
200419
Q
MD
4M
64
VN
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04
20
IN
80
FJ
.1
32
76
0.01
G COSMOPOLITA
G ASIÁTICO II
G AMERICANO
G ASIÁTICO I
G ASIÁTICO-AMERICANO
Figura 10 - Genótipos de DENV-2 representados em árvore de radiação elaborada do programa Mega 5.2
usando o método de inferência filogenética Neighbor-Joining mdelo de substituição Tamura-Nei e bootstrap de
10000 replicações (Twiddy et al., 2002).
56
99
ASIÁTICO/ AMERICANO
75
82
ASIÁTICO I
69
AMERICANO
99
ASIÁTICO II
91
COSMOPOLITA
75
0.01
Figura 11 - Árvore colapsada no programa Mega 5.2 representando os cinco genótipos de
DENV-2 (Twiddy et al., 2002). O genótipo asiático-americano, marcado em verde apresenta
amostras brasileiras. Os números representam os valores de bootstrap.
57
90 2011 BR RJ JQ710657.1
5
2001 BR RJ JQ710659.1
0
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2007 BR HQ012525.1
ASIÁTICO/ AMERICANO
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17
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JM 2007-08
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99
ASIÁTICO I
69
99
DO 2003
42
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98
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2010 08 BR RN NATAL
61
2001 KN FJ898460.1
44
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97
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1998 US PR EU482560.1
1999 US PR EU677142.1
99
AMERICANO
99
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65
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34
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55
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ASIÁTICO II
BR-III
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1999 CO GQ868553.1
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COSMOPOLITA
75
VE 1991-2001
52
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2007 GT GU586492.1
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95
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NI 2004-09
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40
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1
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2002 MX GU369819.1
2001 NI GQ199898.1
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MX 2002
34
7
SV 2012
99
MX 2006-07
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96
99
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92
95
BO 2006-07
2005 PY EU045312.1
48
90
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2001 PY EU045311.1
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BR-II
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95
2003 BR FJ850078.1
73
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98
99 2006 BR FJ850088.1
79
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70
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81
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54
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9
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60 1989 US PR EU482743.1
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27
22
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98
30
84
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23
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11
1991 VE GQ868541.1
1998 CO GQ868552.1
99
15
38
40
76
43
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83
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64
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PE 2002
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55
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VN 2006
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35
99
58
1998 VN AF410346.1
KH 2002-04
83
0.005
Figura 12 - Genótipo asiático-americano dos vírus DENV-2 e suas quatro linhagens brasileiras (BR I-II)
marcados em verde.
58
90 2011 BR RJ JQ710657.1
5
2001 BR RJ JQ710659.1
0
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BR-IV
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2
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7 56
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7
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2008 BR HQ012528.1
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83
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17
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2011 54 BR RN SANTOANTONIO
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11
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VE 2005
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2002 BR RJ HQ012522.1
Figura 13 - Linhagem BR-I do genótipo asiático-americano do DENV-2.
59
90 2011 BR RJ JQ710657.1
5
2001 BR RJ JQ710659.1
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BR-IV
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10
1996 US PR EU482561.1
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1994 US PR GQ398302.1
19
1998 US PR EU482735.1
1994 US PR GQ398303.1
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1997 TT JF804038.1
54
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1990 US PR EU482590.1
1988 US PR EU482578.1
9
2007 BO JX051804.1
1988 US PR EU482579.1
1988 US PR EU482747.1
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1989 US PR EU482581.1
1989 US PR EU482582.1
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22
2007 BO JX051809.1
1988 US PR EU482742.1
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1993 US PR EU482589.1
2006 BO JX051808.1
US PR 1989-90
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US PR 1986-87
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2007 BO JX051802.1
1989 US PR EU482580.1
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PE 2007-09
83
2007 BO JX051806.1
79
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1996 BR HQ012512.1
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KH 2002-04
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Figura 14- Linhagem BR-II do genótipo asiático-americano de DENV-2.
60
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Figura 15 - Linhagem BR-II do genótipo asiático-americano de DENV-2.
61
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11
1991 VE GQ868541.1
1998 CO GQ868552.1
99
15
38
40
76
43
2001 PE JX051770.1
2000 PE JX051768.1
2001 PE JX051769.1
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24
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94
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63
1991 VE GQ868598.1
32 1991 BR HQ012534.1
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37
BR-I
1991 BR HQ012508.1
37
1990 BR HQ012533.1
98
PE 2007-09
83
2007 BO JX051806.1
79
1998 BR RJ HQ012536.1
64
1999 BR RJ HQ012517.1
87
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PE 2002
17
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0
1996 BR HQ012512.1
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79
2005 PY EU045313.1
2003 BR ES HQ012524.1
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9
23
1998 BR HQ012516.1
1999 BR HQ012537.1
2002 BR RJ HQ012522.1
1988 VN JN819418.1
1988 TH DQ181846.1
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56
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91
VN 1997-2006
60
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40
59
55
KH 2001-03
VN 2006
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1998 VN AF410346.1
KH 2002-04
83
2011 BR RJ JQ710657.1
2001 BR RJ JQ710659.1
2009 PE JX051784.1
2010 BR JX286522.1
2010 BR JX286521.1
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2012 PE KC847996.1
2011 45 BR RN NATAL
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2011 54 BR RN SANTOANTONIO
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2010 169 BR RN CAICO
2008 JM JF804034.1
2007 JM GQ199892.1
2008 BR GQ199890.1
2001 DO AB122022.1
2005 VI FJ898453.1
2001 DO AB122021.1
2001 DO AB122020.1
2005 US PR EU687216.1
2003 DO JF804031.1
2003 DO FJ898451.1
2005 US PR EU482731.1
2005 US PR EU687217.1
2007 US PR EU596491.1
2006 US PR EU482726.1
2011 119 BR RN JOAOCAMARA
2010 08 BR RN NATAL
2001 KN FJ898460.1
1998 US PR EU687212.1
1999 US PR EU677145.1
0.005
Figura 16 - Linhagem BR-IV do genótipo asiático-americano de DENV-2. As amostras geradas neste estudo
estão sinalizadas com círculos pretos.
62
Tabela 8 - Matriz de identidade nucleotídica entre representantes dos cinco genótipos de DENV-2
SEQUÊNCIA
1. 2002_BR_RJ_HQ012522.1
2. 2002_BR_ES_HQ012523.1
3. 1998_BR_RJ_GQ368159.1
4. 1997_BR_RN_HQ012514.1
5. 2004_BR_FJ850082.1
6. 2000_BR_JN819419.1
7. 2003_BR_FJ850078.1
8. 2006_BR_JF804028.1
9. 2005_BR_FJ024475.1
10. 2011_45_BR_RN_NATAL
11. 2011_383_BR_RN_JACANA
12. 2011_54_BR_RN_SANTOANTONIO
13. 2011_119_BR_RN_JOAOCAMARA
14. 2010_169_BR_RN_CAICO
15. 2010_08_BR_RN_NATAL
16. 2010_IN_JN568259.1
17. 2004_SA_AM746221.1
18. 1992_AU_AF410370.1
19. 2003_LK_GQ252676.1
20. 2010_ID_JF968032.1
21. 2010_PH_JN568264.1
22. 2001_TW_DQ518630.1
23. 1999_NC_JQ650039.1
24. 1971_FJ_HM582099.1
25. 1994_MX_JX966379.1
26. 1969_PR_GQ868600.1
27. 1972_AS_HM582105.1
28. 2010_TH_JF968029.1
29. 2009_VN_GU908506.1
30. 1998_TW_DQ518645.1
1
ID
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ID
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ID
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91,90%
92,70%
20
91,90%
91,90%
92,10%
92,40%
91,90%
91,90%
91,70%
91,40%
92,10%
91,60%
91,60%
91,50%
91,90%
91,90%
91,90%
94,50%
94,20%
94,70%
94,30%
ID
97,00%
96,90%
97,20%
90,40%
90,20%
90,70%
90,40%
91,50%
91,40%
91,90%
21
92,40%
92,30%
92,50%
92,70%
92,40%
92,50%
92,10%
91,70%
92,30%
91,70%
91,60%
91,50%
92,10%
92,00%
91,80%
94,60%
93,90%
94,80%
94,40%
97,00%
ID
98,80%
97,50%
90,80%
90,30%
91,10%
90,80%
92,50%
92,10%
92,90%
22
92,30%
92,30%
92,60%
92,70%
92,50%
92,50%
92,20%
91,80%
92,30%
91,70%
91,50%
91,50%
91,90%
91,90%
91,70%
95,00%
94,20%
95,00%
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98,80%
ID
97,50%
90,70%
90,10%
91,00%
90,70%
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23
92,70%
92,60%
92,80%
92,90%
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92,70%
92,40%
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92,70%
91,90%
91,90%
91,80%
92,30%
92,30%
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94,60%
94,30%
97,20%
97,50%
97,50%
ID
90,90%
90,40%
91,10%
90,90%
92,10%
91,60%
92,50%
24
91,10%
90,90%
91,00%
90,70%
90,90%
90,90%
90,70%
90,60%
90,50%
90,50%
90,50%
90,60%
90,50%
90,60%
90,70%
91,00%
90,90%
91,70%
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90,80%
90,70%
90,90%
ID
98,40%
99,40%
100,00%
90,50%
90,00%
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25
90,90%
90,70%
90,70%
90,30%
90,10%
90,10%
90,10%
90,10%
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89,80%
89,80%
89,90%
89,80%
89,90%
90,10%
90,20%
90,30%
90,90%
90,70%
90,20%
90,30%
90,10%
90,40%
98,40%
ID
98,40%
98,40%
89,80%
89,40%
89,80%
26
91,30%
91,10%
91,10%
90,80%
90,80%
90,80%
90,70%
90,50%
90,20%
90,40%
90,40%
90,50%
90,50%
90,50%
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90,90%
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91,00%
91,10%
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ID
99,40%
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27
91,10%
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91,00%
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90,90%
90,70%
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90,50%
90,50%
90,60%
90,50%
90,60%
90,70%
91,00%
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90,70%
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100,00%
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ID
90,50%
90,00%
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28
92,20%
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92,10%
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92,30%
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ID
98,50%
98,70%
29
91,80%
91,70%
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91,90%
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91,30%
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90,00%
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90,00%
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ID
98,30%
30
92,60%
92,60%
93,10%
92,70%
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93,00%
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92,40%
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93,10%
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93,00%
92,50%
90,60%
89,80%
90,50%
90,60%
98,70%
98,30%
ID
BR-I
BR-II
BR-III
BR-IV
Figura 17 - Mapa representando as quatro possíveis introduções distintas dos vírus denv-2 no Brasil. As
introduções das linhagens BR-I-IV estão representadas respectivamente em preto, vermelho, azul e verde.
63
5.4.
Análise das alterações na cadeia peptídica do gene E dos DENV-2
Comparamos nove cepas (1982-2011) pertencentes ao sorotipo 2. Quatro cepas
provenientes deste estudo, duas do ano de 2010 e duas de 2011, duas cepas do Rio Grande do
Norte (1997 e 2007) pertencentes à linhagem BR-I, uma cepa tailandesa (1982), uma
vietnamita (1988) e uma brasileira isolada em 1990, pertencente a BR-I.
Foram encontradas quatro substituições de aminoácidos nas posições E91 (V-I), E170
(I-T), E340 (M-T) e E380 (I-V). Sendo que as substituições das posições E340 e E380
ocorreram apenas nas amostras isoladas no RN analisadas provenientes deste estudo e apenas
as substituições ocorridas nas posições E170 e E340 representaram alterações de caráter
bioquímico. Todas as amostras apresentaram uma asparagina (N) na posição E390 (Tabela 7).
Tabela 9 - Substituições de aminoácidos nas amostras provenientes do Rio Grande do Norte quando comparadas
com isolados provenientes do genótipo asiático-americano. As substituições que representaram alterações de
caráter bioquímico estão em vermelho
ISOLADOS DE DENV-2
1982_TH_DQ_181820
1988_VN_JN819118
1990_BR_HQ912538
1997_BR_RN_HQ011214
2007_BR_RN_HQ012515
2010_08_BR_RN_NATAL
2010_169_BR_RN_CAICÓ
2011_54_BR_RN_STO. ANT.
2011_145_BR_RN_NATAL
DII
E91
V
.
I
I
I
I
I
I
I
DII
DII
E129 E131
I
Q
V
L
V
L
V
L
V
L
.
.
.
.
.
.
.
.
POSIÇÃO DO AMINOÁCIDO
DI
DI
DI
DI
DII DIII DIII DIII INSO INSO INSO
E133 E160 E170 E173 E203 E340 E380 E390 E406 E430 E449
E
K
I
A
D
M
I
N
M
T
S
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
E
.
.
E
.
.
.
.
.
.
K
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.
.
E
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.
.
.
I
.
.
E
.
.
K
.
.
.
.
.
.
.
.
.
T
.
T
V
.
.
.
N
.
.
T
.
.
T
V
.
.
.
.
.
.
T
.
.
T
V
.
V
.
.
.
.
T
.
.
T
V
.
.
.
.
DI: domínio I; DII: domínio II; DIII: domínio III, INSO: região insolúvel; TH: Tailândia; VN: Ilhas Virgens
Britânicas; BR: Brasil; RN: Rio Grande do Norte.
64
5.5.
Reconstrução filogenética e filogeografia dos DENV-4 brasileiros
A análise das 397 sequencias foi realizada através do método de reconstrução
filogenética Neighbor-Joining, modelo de substituição nucleotídica Tamura-Nei e bootstrap
de 10000 replicações. O método identificou a existência de quatro genótipos (genótipo I-III e
genótipo selvagem) (Figura 19 e 20). O genótipo I se apresentou constituído por cepas
oriundas do Vietnã e Brasil (BA) (Figura 21). O genótipo II agrupou amostras oriundas do
Brasil (RN, RR, AM, PA), Venezuela, Colômbia, Peru, Equador, Porto Rico, República
Dominicana, Bahamas, Montserrat, Trinidad e Tobago, Barbados, México, Honduras,
Suriname, Haiti, Costa Rica, Polinésia Francesa, Jamaica, Dominica, El Salvador e Malásia.
Sendo que as amostras brasileiras se apresentaram subdivididas em três linhagens (BRI-II)
(Figura 22): BR-I (Brasil, Suriname, Porto Rico, Dominica, Colômbia e Jamaica) (Figura 23),
BR-II (Brasil, República Dominicana e Porto Rico) (Figura 24) e BR-III constituída apenas
por cepas brasileiras oriundas dos estados de Roraima, Rio Grande do Norte e Amazonas
(Figura 25). O genótipo III apresentou amostras provenientes da China, Filipinas, Cingapura,
Timor Leste, Indonésia, Polinésia Francesa, Nova Caledônia, Ilhas Wallis e Futuna, Ilhas
Salomão, Samoa Ocidental, Fiji, Ilhas Cook, Chile, Austrália, Tailândia, Ilhas Marshall,
Taiwan e Malásia. O genótipo selvagem, por sua vez, se apresentou constituído por cepas da
Malásia. As sequências brasileiras armazenadas no grupo de dados analisado pertencem aos
genótipos I e II, sendo que as sequencias do RN geradas neste estudo pertencem ao genótipo
II (BR-III). Além dos genótipos previamente citados, a reconstrução filogenética mostrou um
grupo de amostras tailandesas (1997-1999) com mais de 6% de divergência nucleotídica
quando comparadas a estes cinco genótipos e por isso não foi incluída em nenhum deles.
Sugerimos que o genótipo I se originou no Vietnã, entrando no Brasil pelo estado da Bahia
(Figura 26).
Foram selecionadas 18 sequências representativas dos quatro genótipos de DENV-4
para a construção de uma matriz de identidade nucleotídica. O percentual de similaridade
entre elas variou de 85,30% a 100%. Com relação às linhagens brasileiras o percentual variou
de 96,60% entre BR-I e BR-II, 96,40% a 96,90% entre BR-II e BR-III e 97,50 entre BR-I e
BR-III. O maior percentual de divergência entre as linhagens foi observado entre BR-II e BRIII (3,1% a 3,6%). O percentual de divergência entre os diferentes genótipos foi superior a 6%
(Figura 27).
65
Com relação ao genótipo III, sugerimos a ocorrência de três introduções distintas no
território brasileiro. A primeira introdução ocorreu em BR- I, onde sugerimos que o vírus se
deslocou de Trinidad e Tobago para o estado de Roraima, a segunda ocorreu na Linhagem II,
onde sugerimos que o vírus se deslocou de Porto Rico para o Pará e a terceira e última
introdução ocorreu em BR-III, com o vírus possivelmente se deslocando da Venezuela para o
Amazonas, passando por Roraima e chegando ao estado do Rio Grande do Norte (Figura 28).
0.1
83250
PF JN 80
40.2
.1
97
52
55
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.1
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BR
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MX
23
.1
US
.1 19
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6
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1
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X
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15
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SV
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M
.1
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19
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F
8
Y
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6673.1
93183.1
92
Y
97
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21
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JMGAU99
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3.1.610.1
0
250
O
9
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1999MY FFM98
3364
201C
Y
2481
88
21325
8.1
1A15F
5678.13
9
50231
1
M
50A
98
4
3Y
1997 MY
Y
1RDAM
105
8
1252.31.1
A
9
P
D
R
1997
A9YA81Y
U1S
3498078 .1
9S881P
SR
R
152523 86
9S 2P YY
11998822 1U
A 11523 .1
2 1U
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RRAAY 238847.1
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191898219
R Y12233.11.1
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0
S
0A011
2
1Y
3583.81
JM
19883 T
18
8
1A54AY
5257229.11
1892 TTATYA15Y2123954.
99
1200475
19198T2TTATY91515024.10 1.1
674
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54
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994
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12
26 839
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10 76
1919O
J E QQ13
C O CVG
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GQ
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1900 10900 EEC
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2 00
2
.1.1
61
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85
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7.1
1
C
99.J1K
66.1
2.1
9553
4.3N
..1
81
7
898Q
5F2
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2
C
2G
.11
58
6ID
.1
62
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7
.1
H
.1
77
83.
65
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7
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N
2
JF9
.1
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E
E
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08
J4
NN2C
5H
N20
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ID
477
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E
7F
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E96
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25
2551
JQ650093.1
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83
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JN83
83
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JN
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2010
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WF
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5
200
PF
3
20
JN
7
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SB
09
F
N83SB2EU
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N08
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220
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ASJN
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4
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2332
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1 4
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.1
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2
1
20
H
0
KH
0
T
7
05
1
H
0
200
2
05
H
H
0
H
TH
TKH
8455.1
20
6400
TTH
05TH
A
2TH
H
JH
TH
2005
H
JTYAJQ99
TJQ993264.1
E
E
1152 3666
JQ
JEU44
2005
U
AY
N
Q
U
9JQ
44
A
JQ
32
5999
Q
70
T
4
3272
79984
TH
Q
2006
.1
H
4
6JQ
59
5356
8
Y
93
H
9271
4
56 641
4.1
5
5307
.1
1
6Y16A919
932
4
339
.1
937
29
27
6
6695
78
5
A1A
29
681Y981Y89Y
881
0984.1
.
5
12.1
86398994962335320
61891841796.841.1.81..11
838295.9.1.1914
.441 8.1
45. .
11
41
GS
62780.1
JF2
3 MY
1975
MY
JF262779.1
197
197
5 MY
EF457906.1
GI
GIII
GII
Figura 18 - Genótipos de DENV-4 representados em árvore de radiação elaborada do programa Mega 5.2
usando o método de inferência filogenética Neighbor-Joining, modelo de substituição Tamura-Nei e bootstrap de
10000 replicações (Klungthong et al., 2004).
67
Figura 19 - Árvore colapsada no programa Mega 5.2 representando os quatro genótipos de DENV-4
(Klungthong et al., 2004). Os genótipos I e II, marcados em amarelo e verde apresentam amostras brasileiras. Os
números representam os valores de bootstrap.
68
2004 VN JN376798.1
2010 VN JF967791.1
2010 VN JN376777.1
2010 VN JF967787.1
2012 VN JX644006.1
2012 VN JX644011.1
2012 VN JX644009.1
2011 VN JX556938.1
2011 VN JX556930.1
2001 VN JN376795.1
2005 VN JN376799.1
2009 VN JN376803.1
2011 BR BA JQ513345.1
2002 VN EU448451.1
2002 VN JN376796.1
2012 VN JX644008.1
2008 VN JN376802.1
2006 VN JN376800.1
2006 VN EU448450.1
2007 VN JN376801.1
Figura 20 - Genótipo I dos vírus DEN-4 constituído por amostras do Vietnã e Brasil (BA).
69
2011 BR JN848496.1
2011 BR JN848500.1
2011 BR JN848497.1
2011 BR JN092553.1
2010 BR RR JN983813.1
2012 BR RN 05 GUAMARE
2012 BR RN 39 NATAL
2011 BR RN 380 SANTACRUZ
2012 BR RN 446 CAICO
2010 BR RR JN559741.2
2010 BR RR JQ513333.1
2010 BR RR JQ513341.1
2011 BR AM JQ513339.1
2011 BR AM JQ513338.1
2011 BR AM JQ513344.1
2011 BR AM JQ513342.1
2011 BR AM JQ513343.1
2007 VE HQ332176.1
2007 VE FJ882589.1
2005 VE GQ139590.1
2005 CO GQ868585.1
BR-III
2006 VE JN819406.1
2007 VE HQ332173.1
2007 VE FJ182017.1
2008 VE FJ882592.1
2005 VE GQ139589.1
2007 VE HQ332172.1
2006 EQ GQ139572.1
2001 VE FJ639773.1
2011 BR PA JQ513335.1
2010 BR PA JQ513334.1
2011 BR PA JQ513337.1
2011 BR PA JQ513336.1
1997 DO JF804053.1
BR- II
1998 BS AY152366.1
1998 BS AY152365.1
1998 BS AY152364.1
1994 MS AY152369.1
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1994 MS AY152370.1
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1999 TT AY152367.1
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2006 MX JF804055.1
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1995 VE JF262781.1
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BR- I
1982 PF JN832500.1
Figura 21 - Genótipo III dos vírus DENV-4 com as três linhagens (BRI-III) de cepas brasileiras marcadas em
azul.
70
2011 BR JN848496.1
2011 BR JN848500.1
2011 BR JN848497.1
2011 BR JN092553.1
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2012 BR RN 39 NATAL
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2011 BR AM JQ513339.1
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2011 BR AM JQ513342.1
2011 BR AM JQ513343.1
2007 VE HQ332176.1
2007 VE FJ882589.1
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2005 VE GQ139589.1
2007 VE HQ332172.1
2006 EQ GQ139572.1
2001 VE FJ639773.1
2011 BR PA JQ513335.1
2010 BR PA JQ513334.1
2011 BR PA JQ513337.1
2011 BR PA JQ513336.1
1997 DO JF804053.1
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1998 BS AY152365.1
1998 BS AY152364.1
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1994 MS AY152371.1
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2000 TT JF804059.1
1999 TT AY152367.1
1999 BB AY152368.1
1994 US PR AY152096.1
2006 MX JF804055.1
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1994 SR AY152374.1
1994 HT JF262782.1
1994 SR AY152373.1
1996 CR AY152104.1
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1995 VE JF262781.1
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1982 SR AY152387.1
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1982 SR AY152386.1
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1982 SR AY152385.1
1993 SV AY152300.1
1982 PF JN832500.1
2000 EC GQ139576.1
2000 PE GQ139564.1
2000 EC GQ139573.1
2000 EC GQ139577.1
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1995 VE JF262781.1
2006 CO JF804052.1
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1991 HN AY152379.1
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1981 DM AF326573.1
1981 DM AY152360.1
1982 CO GU289913.1
1981 JM AY152389.1
1982 US PR AY152352.1
1982 BR RR JN559740.2
1982 SR AY152385.1
Figura 22 - Linhagem BR-I do genótipo III de DENV-4. Amostras oriundas do Brasil, suriname, Porto Rico,
Dominica, Colômbia e Jamaica.
71
2011 BR JN848496.1
2011 BR JN848500.1
2011 BR JN848497.1
2011 BR JN092553.1
2010 BR RR JN983813.1
2012 BR RN 05 GUAMARE
2012 BR RN 39 NATAL
2011 BR RN 380 SANTACRUZ
2012 BR RN 446 CAICO
2010 BR RR JN559741.2
2010 BR RR JQ513333.1
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2011 BR AM JQ513339.1
2011 BR AM JQ513338.1
2011 BR AM JQ513344.1
2011 BR AM JQ513342.1
2011 BR AM JQ513343.1
2007 VE HQ332176.1
2007 VE FJ882589.1
2005 VE GQ139590.1
2005 CO GQ868585.1
2006 VE JN819406.1
2007 VE HQ332173.1
2007 VE FJ182017.1
2008 VE FJ882592.1
2005 VE GQ139589.1
2007 VE HQ332172.1
2006 EQ GQ139572.1
2001 VE FJ639773.1
2011 BR PA JQ513335.1
2010 BR PA JQ513334.1
2011 BR PA JQ513337.1
2011 BR PA JQ513336.1
2011 BR PA JQ513335.1
1997 DO JF804053.1
1998 BS AY152366.1
1998 BS AY152365.1
1998 BS AY152364.1
2010 BR PA JQ513334.1
1994 MS AY152369.1
1994 MS AY152371.1
1994 MS AY152370.1
2000 TT JF804059.1
1999 TT AY152367.1
1999 BB AY152368.1
2011 BR PA JQ513337.1
1994 US PR AY152096.1
2006 MX JF804055.1
2007 HN GU586124.1
1993 BB AY152375.1
1994 SR AY152374.1
1994 HT JF262782.1
1994 SR AY152373.1
1996 CR AY152104.1
2011 BR PA JQ513336.1
1994 US PR AY152288.1
2000 EC GQ139576.1
2000 PE GQ139564.1
2000 EC GQ139573.1
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2000 EC GQ139574.1
1995 VE JF262781.1
2006 CO JF804052.1
1997 CO FJ024476.1
1999 EC JF804054.1
1994 EC AY152292.1
1991 HN AY152379.1
1997 DO JF804053.1
1983 JM AY152384.1
1982 SR AY152387.1
1982 US PR AY152308.1
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1982 SR AY152386.1
1982 US PR AY152356.1
1982 US PR AY152340.1
1982 US PR AY152312.1
1982 SR AY152388.1
1981 DM AF326573.1
1981 DM AY152360.1
1982 CO GU289913.1
1981 JM AY152389.1
1982 US PR AY152352.1
1982 BR RR JN559740.2
1982 SR AY152385.1
1993 SV AY152300.1
1982 PF JN832500.1
Figura 23 - Linhagem BR-II do genótipo III de DENV-4. Amoatras oriundas do Brasil, República Dominicana e
Porto Rico.
2011 BR JN848496.1
2011 BR JN848500.1
2011 BR JN848497.1
2011 BR JN092553.1
2010 BR RR JN983813.1
2012 BR RN 05 GUAMARE
2012 BR RN 39 NATAL
2011 BR RN 380 SANTACRUZ
2012 BR RN 446 CAICO
2010 BR RR JN559741.2
2010 BR RR JQ513333.1
2010 BR RR JQ513341.1
2011 BR AM JQ513339.1
2011 BR AM JQ513338.1
2011 BR AM JQ513344.1
2011 BR AM JQ513342.1
2011 BR AM JQ513343.1
2007 VE HQ332176.1
2007 VE FJ882589.1
2005 VE GQ139590.1
2005 CO GQ868585.1
2006 VE JN819406.1
2007 VE HQ332173.1
2007 VE FJ182017.1
2008 VE FJ882592.1
2005 VE GQ139589.1
2007 VE HQ332172.1
2006 EQ GQ139572.1
2011 BR JN848496.1
2011 BR JN848500.1
2001 VE FJ639773.1
2011 BR PA JQ513335.1
2010 BR PA JQ513334.1
2011 BR PA JQ513337.1
2011 BR PA JQ513336.1
1997 DO JF804053.1
1998 BS AY152366.1
1998 BS AY152365.1
1998 BS AY152364.1
1994 MS AY152369.1
1994 MS AY152371.1
1994 MS AY152370.1
2000 TT JF804059.1
1999 TT AY152367.1
1999 BB AY152368.1
1994 US PR AY152096.1
2006 MX JF804055.1
2007 HN GU586124.1
1993 BB AY152375.1
1994 SR AY152374.1
1994 HT JF262782.1
1994 SR AY152373.1
1996 CR AY152104.1
1994 US PR AY152288.1
2000 EC GQ139576.1
2000 PE GQ139564.1
2000 EC GQ139573.1
2000 EC GQ139577.1
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1995 VE JF262781.1
2006 CO JF804052.1
1997 CO FJ024476.1
1999 EC JF804054.1
1994 EC AY152292.1
1991 HN AY152379.1
1983 JM AY152384.1
1982 SR AY152387.1
1982 US PR AY152308.1
1982 US PR AY152348.1
1982 SR AY152386.1
1982 US PR AY152356.1
1982 US PR AY152340.1
1982 US PR AY152312.1
1982 SR AY152388.1
1981 DM AF326573.1
1981 DM AY152360.1
1982 CO GU289913.1
1981 JM AY152389.1
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1982 BR RR JN559740.2
1982 SR AY152385.1
1993 SV AY152300.1
1982 PF JN832500.1
2011 BR JN848497.1
2011 BR JN092553.1
2010 BR RR JN983813.1
2012 BR RN 05 GUAMARE
2012 BR RN 39 NATAL
2011 BR RN 380 SANTACRUZ
2012 BR RN 446 CAICO
2010 BR RR JN559741.2
2010 BR RR JQ513333.1
2010 BR RR JQ513341.1
2011 BR AM JQ513339.1
2011 BR AM JQ513338.1
2011 BR AM JQ513344.1
2011 BR AM JQ513342.1
2011 BR AM JQ513343.1
2007 VE HQ332176.1
Figura 24 - Linhagem BR-III do genótipo III de DENV-4. Constituindo apenas de cepas brasileiras. As amostras
oriundas deste estudo estão sinalizadas com um circulo preto.
72
Tabela 10 - Matriz de identidade nucleotídica entre os quatro genótipos de DENV-4
SEQUÊNCIAS
1. 2012_BR_RN_05_GUAMARE
2. 2012_BR_RN_39_NATAL
3. 2011_BR_RN_380_SANTACRUZ
4. 2012_BR_RN_446_CAICO
5. 2011_BR_PA_JQ513335.1
6. 2010_BR_PA_JQ513334.1
7. 2011_BR_PA_JQ513337.1
8. 2011_BR_PA_JQ513336.1
9. 1982_BR_RR_JN559740.2
10. 2011_BR_BA_JQ513345.1
11. 2007_VN_JN376801.1
12. 1975_MY_EF457906.1
13. 2008_SG_JN019830.1
14. 2010_TW_JQ403526.1
15. 2000_TH_AY618993.1
16. 1998_TH_AY618981.1
17. 1997_TH_AY618978.1
18. 1999_TH_AY618986.1
1
ID
100,00%
100,00%
99,50%
96,90%
96,40%
96,70%
96,50%
97,50%
90,20%
90,50%
85,90%
93,90%
93,40%
93,40%
90,00%
90,00%
90,10%
2
100,00%
ID
100,00%
99,50%
96,90%
96,40%
96,70%
96,50%
97,50%
90,20%
90,50%
85,90%
93,90%
93,40%
93,40%
90,00%
90,00%
90,10%
3
100,00%
100,00%
ID
99,50%
96,90%
96,40%
96,70%
96,50%
97,50%
90,20%
90,50%
85,90%
93,90%
93,40%
93,40%
90,00%
90,00%
90,10%
4
99,50%
99,50%
99,50%
ID
96,90%
96,40%
96,70%
96,50%
97,50%
90,30%
90,50%
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94,00%
93,50%
93,50%
90,00%
90,00%
90,10%
5
96,90%
96,90%
96,90%
96,90%
ID
99,30%
99,40%
99,30%
97,10%
89,90%
90,10%
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93,10%
93,20%
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90,00%
6
96,40%
96,40%
96,40%
96,40%
99,30%
ID
98,80%
98,70%
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89,60%
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85,70%
92,90%
92,70%
92,90%
89,40%
89,60%
89,70%
7
96,70%
96,70%
96,70%
96,70%
99,40%
98,80%
ID
99,70%
97,00%
90,10%
90,30%
86,10%
93,60%
93,40%
93,60%
89,50%
89,60%
89,80%
8
96,50%
96,50%
96,50%
96,50%
99,30%
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99,70%
ID
96,80%
89,90%
90,10%
86,10%
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93,10%
93,30%
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89,40%
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9
97,50%
97,50%
97,50%
97,50%
97,10%
96,60%
97,00%
96,80%
ID
91,30%
91,50%
86,30%
94,60%
94,20%
94,60%
90,70%
90,60%
90,90%
10
90,20%
90,20%
90,20%
90,30%
89,90%
89,60%
90,10%
89,90%
91,30%
ID
98,30%
85,30%
90,90%
90,70%
91,00%
89,30%
89,10%
89,40%
11
90,50%
90,50%
90,50%
90,50%
90,10%
89,80%
90,30%
90,10%
91,50%
98,30%
ID
85,80%
91,70%
91,10%
91,70%
90,00%
89,80%
90,10%
12
85,90%
85,90%
85,90%
86,10%
86,10%
85,70%
86,10%
86,10%
86,30%
85,30%
85,80%
ID
86,50%
86,60%
86,70%
85,50%
85,70%
85,70%
13
93,90%
93,90%
93,90%
94,00%
93,30%
92,90%
93,60%
93,40%
94,60%
90,90%
91,70%
86,50%
ID
98,40%
97,90%
91,00%
90,70%
91,00%
14
93,40%
93,40%
93,40%
93,50%
93,10%
92,70%
93,40%
93,10%
94,20%
90,70%
91,10%
86,60%
98,40%
ID
97,40%
90,40%
90,10%
90,40%
15
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93,40%
93,40%
93,50%
93,20%
92,90%
93,60%
93,30%
94,60%
91,00%
91,70%
86,70%
97,90%
97,40%
ID
91,10%
91,00%
91,10%
16
90,00%
90,00%
90,00%
90,00%
89,70%
89,40%
89,50%
89,30%
90,70%
89,30%
90,00%
85,50%
91,00%
90,40%
91,10%
ID
99,30%
99,50%
17
90,00%
90,00%
90,00%
90,00%
89,80%
89,60%
89,60%
89,40%
90,60%
89,10%
89,80%
85,70%
90,70%
90,10%
91,00%
99,30%
ID
99,70%
18
90,10%
90,10%
90,10%
90,10%
90,00%
89,70%
89,80%
89,60%
90,90%
89,40%
90,10%
85,70%
91,00%
90,40%
91,10%
99,50%
99,70%
ID
GI: Vietnã >>> Brasil (Bahia)
Figura 25 - Mapa representando a possível introdução do genótipo I, de origem Vietnamita no Brasil (Brasil).
73
BRI
BRII
BRII
I
Figura 26 - Mapa representando as três possíveis introduções distintas dos vírus DENV-4 no Brasil. As
introduções das linhagens BR I-III estão representadas respectivamente em vermelho, azul e verde.
74
5.6.
Análise das alterações na cadeia peptídica dos DENV-4
Foi realizada a comparação entre oito sequencias do gene E de cepas brasileiras
recentes (2010-2012), incluindo as cepas provenientes deste estudo, e três cepas referência,
uma cepa da Polinésia Francesa, responsável por uma introdução do vírus no Brasil em 1982
e ancestral do genótipo II, uma cepa brasileira isolada no estado de Roraima em 1982 e uma
cepa venezuelana isolada em 2007, ancestral da linhagem III na qual estão incluídas as
amostras provenientes deste estudo.
No gene em questão, foram encontradas seis substituições de caráter bioquímico.
Quatro substituições ocorreram de aminoácidos hidrofóbicos para hidrofílicos, nas posições
E46 (I-T), E155 (I-T), E221 (A-T) e E222 (A-T) em todos os isolados gerados neste estudo e
duas substituições ocorreram de um aminoácido hidrofílico para um hidrofóbico nas posições
E64 (S-L) e E354 (S-A) em todas as amostras Norte Rio-Grandenses. Constatamos que as
substituições das posições E64, E222 e E354 ocorreram em todas as amostras analisadas
quando comparadas a amostra polinésia de 1982, com exceção da amostra do Pará que se
mostrou semelhante à amostra mais antiga da tabela. (TABELA 8).
Tabela 11 - Matriz identidade nucleotídica entre representantes dos diferentes genótipos de DENV-4.
ISOLADOS DE DENV-4
1982_PF_JN832500
1982_BR_RR_JN559740
2007_VE_HQ332176
2010_BR_RR_JQ513341
2010_BR_RR_JN983813
2011_BR_AM_JQ513343
2011_BR_PA_JQ513336
2011_380_BR_RN_STA CRUZ
2012_446_BR_RN_CAICÓ
2012_05_BR_RN_GUAMARÉ
2012_39_BR_RN_NATAL
DI
E46
I
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
DII
E64
S
.
L
L
L
L
.
L
L
L
L
DII
E123
G
.
.
.
.
.
E
.
.
.
.
POSIÇÃO DO AMINOÁCIDO
DI
DI
DI
DI
DII DII
DII
DII
DII
DII
DII
E149 E155 E163 E174 E196 E221 E222 E230 E238 E252 E275
H
I
T
K
M
A
A
H
V
V
G
R
.
M
.
.
T
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
T
T
.
.
.
.
.
T
.
.
.
T
T
.
.
.
.
.
T
.
.
.
T
T
.
.
.
.
.
T
.
.
.
T
T
.
E
L
E
.
T
.
E
.
.
.
.
.
.
.
.
T
.
.
V
T
T
P
.
.
.
.
T
.
.
.
T
T
.
.
.
.
.
T
.
.
V
T
T
P
.
.
.
.
T
.
.
V
T
T
P
.
.
.
DI
E287
I
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
DIII
E351
V
I
.
.
.
.
.
.
.
.
.
DIII
E354
S
.
A
A
A
A
.
A
A
A
A
DIII
E355
T
.
.
.
.
.
I
.
.
.
.
INSO
E414
I
.
.
.
.
.
.
.
F
.
.
INSO
E455
I
.
.
.
.
.
V
.
.
.
.
INSO
E461
F
.
.
.
.
.
.L
.
.
.
.
DI: domínio I; DII: domínio II; DIII: domínio III, INSO: região insolúvel; PF Polinésia Francesa; VE:
Venezuela; BR: Brasil; RR: Roraima; PA: Pará; AM: Amazonas; RN: Rio Grande do Norte.
75
6. DISCUSSÃO
6.1.
Genótipos circulantes no Brasil e filogeografia dos DENV-1
O DENV-1 foi detectado pela primeira vez no Brasil em 1981, causando uma
importante epidemia em 1986 (Schatzmayr et al., 1986). Desde então vem circulando de
maneira esporádica no país, com exceção do período entre 2009-2011, no qual esses vírus
apresentaram alta circulação talvez pela presença de pessoas sem imunidade específica
(Carneiro et al., 2012). Existem cinco genótipos referentes a este sorotipo circulando
atualmente no mundo (Osman et al., 2009). No Brasil, estudos sugerem que apenas o
genótipo V é circulante no país (Carneiro et al., 2012; Drummond et al., 2012; Bona et al.,
2012; Santos et al., 2011).
Vários estudos filogenéticos vêm sendo realizados com objetivo de compreender
fatores relacionados à origem, dispersão e potencial epidêmico de novas linhagens. Nesse
contexto, o presente estudo constatou que todas as cepas analisadas pertencem ao genótipo V
circulante nas Américas e na África, corroborando com estudos realizados anteriormente
(Carneiro et al., 2012; Drummond et al., 2012; Bona et al., 2012; Santos et al., 2011).
Verificamos que de acordo com a inferência filogenética realizada, as cepas brasileiras se
apresentaram divididas em duas linhagens (BR-I e BR-II), sendo a linhagem BR-I compostas
por algumas cepas mais antigas (1986-2010), reportadas a introdução desse sorotipo no país,
caracterizada por uma massiva epidemia seguida por baixa circulação (Carneiro et al., 2012)
e BR-II composta por cepas mais recentes (2000-2011), reportadas a reintrodução do sorotipo.
As amostras do Rio Grande do Norte se apresentaram agrupadas em BR-II uma vez que foram
isoladas no período de 2010-2011. As duas linhagens de amostras brasileiras apresentaram
percentual de divergência variando entre 2,8% e 4,6%, o que era esperado devido ao período
de circulação distinto de algumas cepas.
Tais resultados se mostraram semelhantes aos obtidos por Santos e colaboradores
(2011), que constataram a subdivisão de cepas oriundas do estado do Rio de Janeiro em duas
linhagens temporalmente distintas. O estudo sugere que o baixo percentual de similaridade
entre as cepas das diferentes linhagens é um indicativo de reintrodução e não de evolução
local e que BR-II pode ter origem asiática, uma vez que está proximamente relacionada com
amostras provenientes de Cingapura. A análise filogenética realizada neste estudo sugere que
76
BR-II pode está relacionada com amostras do Caribe. Dessa forma, pode-se sugerir que o
Caribe possa ter sido o ponto de introdução da nova linhagem vinda da Ásia no continente
americano, uma vez que essa região geográfica é reconhecida como fonte de introdução de
novas cepas no Brasil (Rico-Hesse et al., 1997).
Em estudo realizado por Carneiro et al. (2012) com sequencias do gene do envelope,
foi reportada a existência de três linhagens distintas de amostras brasileiras (A, B e C), o que
reforça a hipótese da circulação simultânea de múltiplas linhagens, confirmando que novas
linhagens vem se estabelecendo no país desde a introdução do sorotipo.
A circulação de mais de uma linhagem em uma mesma região geográfica não é um
fato novo, já tendo sido reportada em estudos anteriores (Drummond et al., 2012; Kukreti et
al., 2009; Mendez et al., 2010; Carrillo-Valenzo et al., 2010). Trata-se de um fenômeno
comum que consiste na diminuição de frequência de circulação ou extinção de uma
determinada linhagem que circulou por um longo período em determinada região, sendo
algumas vezes substituída por outra (Zhang et al., 2005). Fenômeno este que pode ser
ocasionado pela circulação de outro sorotipo na região em questão, no caso DENV-2 que
causou duas epidemias (1998 e 2007/2008) no período de baixa circulação de DENV-1.
É importante ressaltar que a inferência filogenética realizada neste estudo foi baseada
em sequencias do gene do envelope viral. No entanto, um estudo realizado recentemente com
sequencias do genoma completo enfatizou a evidencia da circulação de diferentes linhagens
no país (Drummond et al., 2012) reforçando que análises feitas com este gene são eficientes
para determinação de genótipos e linhagens.
Com relação à origem e introduções de DENV-1 no Brasil, não foi possível inferir
sobre a origem das cepas pertencentes a BR-I. Esse fato pode ser justificado pelos baixos
valores de bootstrap gerados na análise e/ou pelo baixo número de sequencias disponíveis no
GenBank, tornando clara a necessidade de utilização de métodos de inferência filogenética
mais robustos, como a Máxima Verossimilhança, que está sendo realizada para complementar
o presente trabalho.
No entanto, a inferência sobre a origem de BR-II foi possível, sugerindo que os vírus
possam ter entrado no país importados do Caribe, mais precisamente vindos das Ilhas Virgens
Britânicas corroborando com estudo realizado recentemente por Drummond et al. (2012).
Este fato confirma o Caribe como uma das principais fontes de variantes dos DENV para o
77
Brasil (Rico-Hesse et al., 1997). A linhagem BR-II foi associada a amostras asiáticas em
estudos anteriores (Santos et al., 2011), dessa forma, podemos sugerir que antes de entrar no
território brasileiro, vindos da Ásia, os vírus tenham circulado no Caribe. Drummond et al.
(2012) sugeriram que o ancestral mais recente desta linhagem provavelmente entrou no país
pela região norte em 1998/99 chegando a região sudeste nos anos de 2006/07. Não foi
possível confirmar o padrão de migração dos vírus entre as regiões brasileiras neste estudo
devido à escassez de sequencias com informações completas sobre sua origem.
Adicionalmente, Cardoso et al. (2012) constataram que os isolados brasileiros
analisados em seu estudo se apresentaram proximamente relacionados com isolados
provenientes de outros países da América Latina, dessa forma, podemos sugerir que as cepas
brasileiras possam ter vindo do Caribe, entrado em países latino-americanos próximos e em
seguida no Brasil.
6.2.
Genótipos circulantes no Brasil e filogeografia dos DENV-2
Os vírus DENV-2 foram detectados no país pela primeira vez em 1989 de um caso
importado da África (Cruz et al., 2010). No ano seguinte (1990), o primeiro caso autóctone
foi registrado no estado do Rio de Janeiro, associado aos primeiros registros de formas graves
da doença e se espalhando por outros estados da federação (Oliveira et al., 2010; Cruz et al.,
2010). Desde sua introdução, esse sorotipo causou três grandes epidemias no país, a primeira
ocorreu em 1998, a segunda em 2007-2008 e a terceira em 2010 (Oliveira et al., 2010;
Drummond et al., 2012
), sendo esta última ocasionada por duas linhagens pertencentes ao genótipo
asiático/americano, mostrando a circulação temporal de vírus geneticamente distintos,
ocasionada por evolução local ou pela introdução de uma nova linhagem (Oliveira et al.,
2010). O aumento do número de casos graves da doença no continente americano está
diretamente associado à introdução do genótipo asiático/americano que aconteceu
concomitantemente a substituição do genótipo americano, descrito como menos virulento
(Rico-Hesse et al., 1997; Cruz et al., 2010).
A inferência filogenética realizada por Twiddy e colaboradores (2002) constatou a
existência de cinco genótipos de DENV-2. A partir da análise das cepas deste estudo, foi
verificada a existência de cinco genótipos de DENV-2 (cosmopolita, asiático I e II, americano
e asiático/americano), sendo que todas as amostras brasileiras foram pertencentes ao último.
78
Tais resultados corroboraram com estudos realizados anteriormente, onde apenas o genótipo
asiático/americano foi atribuído ao Brasil (Oliveira et al., 2010; Drummond et al., 2012; Cruz
et al., 2010; Pires-Neto et al., 2005). Verificamos também, que o genótipo asiático/americano
teve origem do genótipo asiático II. Este resultado confirma a origem asiática do genótipo
asiático/americano, previamente descrito por Rico-Hesse (1990).
De acordo com a análise realizada neste estudo, as amostras brasileiras se
apresentaram subdivididas em quatro linhagens bem definidas, com origens distintas (BRIIV) evidenciando a circulação de cepas virais geneticamente diferentes no país (Dettogni et
al., 2012). A linhagem BR-I é constituída por cepas oriundas do Peru, Equador, Bolívia e
Brasil (RN, RJ, ES), com cepas brasileiras isoladas entre 1990 e 2007. A BR-II é composta
por cepas de Porto Rico, Bolívia, Paraguai e Brasil, com cepas brasileiras isoladas entre 20002006. BR-III é composta por cepas oriundas da Colômbia, Venezuela e Brasil, com a única
cepa brasileira isolada em 2005 e por fim, BR-IV, a maior das linhagens encontradas,
constituída por amostras de Porto Rico, São Cristóvão e Névis, República Dominicana, Ilhas
Virgens, Jamaica, Peru, Bolívia, Paraguai e Brasil (SP, RJ e RN), com cepas brasileiras
isoladas entre 2001 e 2011.
A presença de quatro linhagens circulantes no país pode ter sido resultado de evolução
local ou devido à introdução de novas linhagens (Romano et al., 2010), que pode ter sido
gerada por diferenças de aminoácidos que favoreceram o escape dos vírus de anticorpos
específicos produzidos em infecções prévias por DENV-2 ou pela co-circulação com DENV1 e DENV-3 (Nogueira et al., 2007; Araújo et al., 2012; Drummond et al., 2012). A análise
filogenética realizada neste estudo sugere a maior probabilidade da ocorrência de introdução
de novas linhagens, uma vez que as mesmas se apresentaram em agrupamentos distintos com
possíveis origens também distintas na árvore filogenética.
Constatamos por meio da matriz de identidade nucleotídica o alto percentual de
similaridade entre essas linhagens. A partir desta análise observamos que as linhagens com o
menor percentual de identidade entre si foram BR-I e BR-III, fato esperado uma vez que as
duas linhagens se agruparam em ramos distintos com bootstrap de 79%.
No tocante a origem e introdução destes vírus no Brasil, sugerimos a ocorrência de
quatro introduções distintas de DENV-2 no Brasil. A linhagem mais antiga (BR-I), entrou no
território brasileiro provavelmente vinda da Venezuela, Equador ou Peru, passando pelos
79
estados do Rio de Janeiro e Rio Grande do Norte, tendo circulado no país por
aproximadamente 17 anos. Os isolados associados às epidemias de 1990, que ocorreu durante
a introdução do genótipo no Rio de Janeiro e as epidemias subsequentes que ocorreram em
2007/2008 estão agrupados nessa linhagem. A linhagem BR-II, segunda mais antiga,
provavelmente entrou no país importada de Porto Rico, tendo circulado por seis anos (20002006), não estando relacionada a nenhum dos graves surtos epidêmicos, conforme foi descrito
em estudo anterior (Drummond et al., 2012).
BR-III foi detectada pela primeira vez no presente estudo e provavelmente entrou no
país pela Colômbia, sendo constituída por apenas uma amostra brasileira, isolada em 2005 e
por tanto não associada às epidemias graves. BR-IV, a linhagem mais recente importada do
Caribe (Porto Rico ou São Cristóvão e Névis), teria entrado no país pelo estado do Rio
Grande do Norte, estado provavelmente associada às graves epidemias ocorridas em 20072008 e 2010 (Romano et al., 2010; Dettogni et al., 2012).
Nossos resultados, juntamente com estudos realizados anteriormente, sugerem que a
principal fonte de introdução dos vírus dengue no território brasileiro é o Caribe, por onde
provavelmente o genótipo asiático/americano penetrou no continente, importado do sudeste
asiático, estando relacionado à emergência de casos de FHD (Rico-Hesse et al., 1997;
Drummond et al., 2012). Tal observação pode ser consequência da proximidade geográfica
entre o Caribe e os estados da região norte do país, facilitando assim, introduções de
genótipos e linhagens (Araújo et al., 2012).
6.3.
Genótipos circulantes no Brasil e filogeografia dos DENV-4
Os vírus dengue tipo 4 foram inicialmente identificados no continente americano em
1981, tendo sido importados da Indonésia e dispersado inicialmente no Caribe. Foram
identificados dois genótipos (I e II), sendo o primeiro constituído por cepas do sudeste
asiático e Pacífico e o segundo por cepas do continente americano (Lanciotti et al., 1997). Em
2005, foram identificados quatro genótipos (I-III e selvagem) (Klungthong et al., 2004).
Após um período de 28 anos sem circulação no Brasil, os vírus DENV-4 reemergiram
no território brasileiro no ano de 2010 através do estado de Roraima, se espalhando por
diversos estados do país como Amazonas, Pará, Bahia, Pernambuco, Piauí, Rio de Janeiro e
São Paulo (Temporão et al., 2011; Ministério da Saúde, 2011). Desde então, estudos sobre a
origem da cepa re-emergente, usando diferentes métodos de inferência filogenética vem sendo
80
realizados, uma vez que pouco se sabe a respeito de padrão de dispersão e evolução desses
agentes infecciosos (Souza et al., 2011).
Um desses estudos, realizado por Souza e colaboradores (2011) analisou amostras
oriundas dos primeiros casos autóctones ocorridos nos estados de São Paulo e Rio Grande do
Sul, verificando que as cepas brasileiras pertenciam ao genótipo II, agrupadas com amostras
do Norte da América do Sul e do Caribe e ao genótipo I agrupadas com amostras da Malásia,
Jamaica, Trinidad e Tobago, México, Porto Rico, Polinésia Francesa, Indonésia e República
Dominicana. Nunes et al. (2012) realizaram estudo semelhante, usando sequencias do gene do
envelope e do genoma completo de cepas oriundas de estados da Região Norte do país (Pará,
Amazonas e Roraima), confirmando que as cepas brasileiras pertencem aos genótipos I e II,
sendo o primeiro constituído por uma cepa isolada no estado da Bahia e o segundo por cepas
do Caribe e América do Sul.
A análise filogenética realizada neste estudo mostrou que as cepas brasileiras
analisadas, incluindo as cepas do Rio Grande do Norte, pertencem aos genótipos I e II. O
genótipo I se apresentou constituído por uma amostra brasileira isolada na Bahia e por
amostras do Vietnã e o genótipo II, apresentou-se subdivido em três linhagens de amostras
brasileiras com elevado percentual de identidade nucleotídica, a linhagem I (BR-I) constituída
por uma amostra isolada em Roraima em 1982, amostras da América do Sul e Caribe, a
linhagem II (BR-II) por cepas do estado do Pará (2010-2011), Porto Rico e República
Dominicana e a linhagem III (BR-III) constituída por amostras brasileiras oriundas do Rio
Grande do Norte, Amazonas e Roraima (2010-2012). Os dados obtidos corroboraram com
estudos recentes sobre o sorotipo, adicionando conhecimentos sobre as diferentes linhagens
dentro do genótipo II e constatando que as cepas do Rio Grande do Norte (BR-III) estão
proximamente relacionadas com a cepa de Roraima isolada após a reintrodução do sorotipo
no país, em detrimento das cepas isoladas em 1981-1982 reportadas a casos de dengue no
mesmo estado (Osnai, et al. 1983), que de acordo com a presente análise pertence à BR-I.
No tocante aos padrões de migração dos DENV-4, acredita-se que o mais recente
ancestral dos genótipos I-III tenha origem do sudeste asiático (Dussart et al., 2012; Nunes et
al., 2012), fato constatado pela presença de cepas asiáticas nos ramos de origem de um
genótipo cosmopolita como o II (Klungthong et al., 2004) e também observado nas análises
realizadas neste estudo.
81
O estudo filogeográfico realizado por Nunes et al. (2012), já citado anteriormente
sugeriu que as principais fontes de exportação desse vírus para o Brasil seriam o sudeste
asiático, o Caribe e a Venezuela. Tendo ocorrido múltiplas introduções distintas no país, a
mais recente tendo ocorrido de países sul-americanos vizinhos, particularmente a Venezuela
onde o vírus se estabeleceu há um longo tempo. Outra introdução ocorreu após o
estabelecimento dos vírus no Caribe, se dispersando para o Brasil (RR) e países próximos
(Venezuela e Colômbia) e mais recentemente no Brasil pelo estado do Pará.
Os resultados obtidos neste estudo confirmaram os achados de Nunes et al. (2012),
uma vez que foi verificada a ocorrência de três possíveis introduções distintas dos DENV-4
pertencentes ao genótipo II no país, sugerimos que a primeira introdução ocorreu de Trinidad
e Tobago para o estado de Roraima em 1982 (BR-I), quando os vírus foram detectados pela
primeira vez no país, a segunda de Porto Rico para o estado do Pará (BR-II) e a terceira (BRIII) teve origem na Venezuela, entrando no Brasil possivelmente pelos estados de Roraima ou
Amazonas e chegando ao estado do Rio Grande do Norte. Os resultados sugerem que as cepas
mais antigas, referentes a introdução dos DENV-4 são geneticamente distintas das cepas mais
recentes, confirmando a possível ocorrência de evolução local ou de reintrodução, sendo a
última opção a mais provável devido as linhagens em questão terem apresentado origens
distintas na árvore filogenética. Assim como ocorreu nos outros sorotipos estudados
anteriormente neste estudo, a circulação de vírus distintos ocasionada por múltiplas
introduções pode ter ocorrido pela introdução de outros sorotipos na região no período onde
não foi detectada a circulação de DENV-4 no país, como por exemplo o DENV-2 que causou
epidemias em 1998, 2007/2008 e 2010 (Oliveira et al., 2010; Drummond et al., 2012).
Com base nos resultados discutidos, torna-se clara a necessidade da análise de
sequências provenientes de um maior número de estados brasileiros para uma compreensão
mais detalhada dos padrões de migração dos vírus Dengue no país, bem como a realização de
métodos de inferência filogenética mais robustos com objetivo de melhorar a confiabilidade
das relações que em alguns ramos foi inferior aos 75% recomendados. Por fim, ressaltamos
que a prevenção da emergência de novas epidemias depende claramente de conhecimentos
sobre origem, padrão de dispersão desses vírus e identificação de genótipos e linhagens (RicoHesse et al., 1997; Drummond et al, 2012), tornando clara a importância de estudos desta
natureza.
82
6.4.
Substituições de aminoácidos na glicoproteína E dos DENV isolados no RN
O gene E possui 1485 pares de bases de comprimento e codifica um polipeptídeo de
495 aminoácidos, subdivididos em três domínios (I, II e III) (Mandl et al., 2001; Aquino et
al., 2008). Essa proteína exerce importantes funções nos mecanismos de patogênese dos vírus
dengue, como por exemplo: composição estrutural dos vírus, determinação de tropismo
celular, ligação com anticorpos neutralizantes e interações dos vírus com a membrana
plasmática da célula hospedeira (Aquino et al., 2008; Mandl et al.,1989; Rey et al., 1995).
Estudos anteriores mostraram que substituições de aminoácidos em proteínas estruturais
ocorrem principalmente na região da glicoproteína E, localizada na superfície viral (Carneiro
et al., 2012). Por esses motivos, essa proteína se tornou alvo de diversos estudos moleculares
e filogenéticos (Twiddy et al., 2002) que objetivam revelar relações evolutivas entre as cepas
isoladas, bem como identificar substituições nucleotídicas que possam estar associadas a
casos de maior gravidade da doença.
As cepas de DENV-1 apresentaram um considerável número de mutações ao longo da
proteína E, no entanto apenas uma mutação foi persistente, se constituindo em uma
substituição e ocorreu na posição E124 (R-K) localizado no domínio II, não se constituindo
numa alteração de caráter bioquímico uma vez que ocorreu entre aminoácidos
monocarboxílicos carregados positivamente.
No tocante a DENV-2, foram identificadas quatro substituições, duas ocorreram de um
aminoácido hidrofóbico para hidrofílico (posições E170 e E340), representando alteração de
caráter bioquímico, uma vez que aminoácidos hidrofílicos comumente estão localizados na
superfície da proteína e estão relacionados à resposta imune (Krukreti et al., 2009). Uma
dessas substituições ocorreu no domínio I (aa 1-52, aa 132-193 e aa 280-296) e outra no
domínio III (aa 296-394) da proteína. Todas as cepas de DENV-2 submetidas à comparação
apresentaram uma asparagina (N) na posição E390, característica comum a cepas
componentes do genótipo asiático/americano e que está relacionada à maior probabilidade do
desenvolvimento de FHD, uma vez que resulta na otimização de replicação viral e
exacerbação da resposta imune do hospedeiro (Pryor et al., 2001; Leitmeyer et al., 1999).
Verificamos seis substituições de aminoácidos ao longo da proteína E das amostras de
DENV-4 que representaram modificações de caráter bioquímico. Três substituições
ocorreram no domínio II (aa52-132 e aa193-280), onde estão localizados os peptídeos de
fusão e duas no domínio I (aa1-52, aa132 a 193 e aa280-296), que se liga a anticorpos que
83
conferem especificidade a esses vírus (Stiasny et al., 2006; Allison et al., 2001). Uma dessas
substituições (E354 S-A) ocorreu ao longo do domínio III (aa 296-394) da proteína, o mais
variável de todos e que contém regiões relacionadas à ligação dos vírus dengue aos receptores
da superfície celular a e anticorpos neutralizantes, além de conter resíduos responsáveis por
tropismo e virulência (Weaver & Vasilakis, 2009; Gritsun et al., 1995; Mandl et al., 2001;
Rey et al., 1995).
Substituições no domínio III são comuns devido à pressão seletiva do sistema imune e
podem induzir atenuação, virulência ou até mesmo o escape do vírus pelo sistema
imunológico (Rey et al., 1995; Mandl et al., 2001; Lin & Wu, 2003), tornando evidente a
importância desse domínio no processo de adaptação dos vírus aos hospedeiros humanos e
não humanos e a subsequente evolução viral (Wang et al., 2000).
Análises desta natureza não vêm mostrando relação entre variabilidade genética e
manifestações clínicas em infecções por vírus dengue, muito provavelmente devido ao fato de
se tratar de um processo multifatorial, onde outras características como susceptibilidade do
hospedeiro são importantes (Carneiro et al., 2012). No entanto, estudos futuros que associem
dados clínicos e moleculares, como a modelagem molecular, podem fornecer informações que
ajudem a elucidar os efeitos dessas substituições na dinâmica de infecção dos vírus dengue.
84
7. CONCLUSÕES

A análise filogenética baseada no gene E de cepas de três sorotipos (DENV1, 2 e 4)
isoladas no Rio Grande do Norte e em outros estados brasileiros revelou a circulação de
apenas um genótipo de DENV-1 (genótipo V), um genótipo DENV-2 (asiático/americano)
e dois genótipos de DENV-4 (genótipos I e II) no país;

As cepas brasileiras de DENV-1 se apresentaram dividas em duas linhagens
temporalmente distintas (BR-I e BR-II), estando às amostras isoladas no RN agrupadas
em BR-II e relacionadas à reemergencia do sorotipo no país;

As cepas brasileiras de DENV-2 se apresentaram subdividas em quatro linhagens (BRIIV), estando às amostras isoladas no RN agrupadas em BR-IV;

O genótipo II de DENV-4 apresentou três linhagens de cepas brasileiras (BRI-III), estando
às amostras oriundas do RN agrupadas em BR-III;

Não foi possível determinar a origem da linhagem BR-I do genótipo V de DENV-1. No
entanto, sugerimos que a linhagem BR-II entrou no país importada das Ilhas Virgens
Britânicas;

Sugerimos que as linhagens BR-I, II, III e IV do genótipo asiático/americano de DENV-2,
entraram no país importadas respectivamente da Venezuela, Porto Rico, Colômbia e
Caribe;

Sugerimos que genótipo I de DENV-4 entrou no Brasil vindo do Vietnã e as linhagens
BR-I, II e III do genótipo II entraram no país provavelmente importadas respectivamente
de Trinidad Tobago, Porto Rico e Venezuela;

Substituições de aminoácidos foram detectadas ao longo dos três domínios da proteína E
das cepas comparadas. Todavia, estudos que associem dados clínicos e de modelagem
molecular podem contribuir para a elucidação do papel dessas substituições na dinâmica
de infecção dos vírus dengue;
85
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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