título do resumo

COMPARAÇÃO DA CONTAGEM DIFERENCIAL DE CÉLULAS
NUCLEADAS NA CENTRIFUGAÇÃO SIMPLES E NA
CITOCENTRIFUGAÇÃO EM LÍQUIDOS CORPORAIS
João Pedro Marmol de Oliveira (Bolsista Fundação Araucária/Inclusão Social),
Karina Keller Marques da Costa Flaiban; [email protected]
Universidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Agrárias,
Departamento de Medicina Veterinária Preventiva
Medicina Veterinária, Patologia Clínica Animal
Palavras-chave: macrófagos, análise de líquidos, citologia.
Resumo
A análise citológica dos líquidos corporais foi realizada a partir do uso de uma
citocentrífuga, que tem a capacidade de produzir a concentração de células de
um líquido em uma pequena região da lâmina de microscopia, permitindo a
visualização do conjunto de células contida no fluido. O objetivo foi criar um
protocolo de padronização para o uso da citocentrífuga, para fazer lâminas de
contagem diferencial de células nucleadas do líquido cefalorraquidiano e de
líquidos cavitários e comparar a contagem diferencial com a metodologia de
centrifugação simples, utilizada anteriormente. Foi procedida a contagem total
de células nucleadas por meio da Câmara de Fuchs-Rosenthal. Foram
preparadas lâminas por centrifugação simples e por citocentrifugação. A
contagem celular diferencial nas duas preparações foi diferente, sendo obtido
maior número de macrófagos na citocentrifugação. Amostras com menos de
300 células/µL precisaram ser concentradas para a preparação citológica. A
nova metodologia produz lâminas de melhor qualidade para a visualização
morfológica das células nucleadas, além de proporcionar a identificação de
macrófagos.
Introdução e objetivo
A análise acurada do líquor fornece informações sobre a saúde neurológica e
frequentemente evidencia a presença de doença (VERNAU, 2008). Assim
como o hemograma, o exame de LCE tem alta sensibilidade, porém baixa
especificidade para a detecção de uma doença. As possíveis alterações são
relativamente limitadas dadas a variedade de doenças neurológicas (BRAUND,
2003). O exame do LCE na maioria das espécies é baseado principalmente na
análise citológica e na concentração de proteína total, embora algumas
análises mais específicas possam ser úteis (BEHR et al., 2006).
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O exame do líquor considera o teor de proteínas e a celularidade,
contribuindo desta forma, para viabilizar o diagnóstico específico de uma
doença neurológica quando avaliada em conjunto com o exame clínico,
neurológico e outros testes laboratoriais. As alterações possíveis do LCE são
relativamente limitadas comparadas a variedade de doenças neurológicas
existentes.
Neste caso, a análise citológica do LCE foi realizada a partir do uso de
uma citocentrífuga, que tem a capacidade de produzir a concentração de
células de um líquido em uma pequena região da lâmina de microscopia,
permitindo a visualização do conjunto de células contida no fluido, e desta
forma tornando uma amostra que anteriormente não poderia ser quantificada
ou qualificada morfologicamente, analisada de forma mais confiável. O objetivo
foi criar um protocolo de padronização para o uso da citocentrífuga, utilizada no
projeto para fazer lâminas de leitura diferencial de células do líquido
cefalorraquidiano e comparar a contagem diferencial com a metodologia de
centrifugação simples, utilizada anteriormente.
Procedimentos metodológicos
As amostras biológicas provenientes dos animais atendidos no projeto
intitulado “Doenças neurológicas dos bovinos no estado do Paraná diagnóstico diferencial e epidemiologia” (CNPq nº 14/2012) constituíram onze
amostras de LCE e catorze amostras de líquidos corporais, com celularidade
variável. O projeto está aprovado pelo CEEA, sob protocolo nº 32340.2012.04.
A análise citológica dos líquidos corporais procedeu-se primeiramente
com a contagem total do número de células nucleadas e do número de
hemácias por meio da Câmara de Fuchs-Rosenthal (COLES, 1984). Após esta
etapa, foram preparadas duas lâminas, uma utilizando o método de
centrifugação simples, em que cerca de um mililitro da amostra é centrifugado
por cinco minutos a velocidade de 1500rpm, e outra lâmina foi preparada na
citocentrífuga modelo CT-14, da empresa TekLab, utilizando 200 µL de
amostra e mesmo tempo e velocidade.
Foi realizada a contagem celular diferencial nas duas preparações, e a
comparação entre métodos, por meio do teste t, considerando uma
probabilidade de erro de 5%. Também foi realizada a comparação morfológica
das células nas duas preparações.
Resultados e discussão
Os resultados da concentração de células comparados nos métodos de
citocentrifugação (CC) e centrifugação simples (CS) estão dispostos na Tabela
1. O pequeno número de amostras não permitiu a comprovação da efetividade
da CC em líquidos com baixa celularidade.
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Tabela 1: Valores de média, desvio padrão e mediana da contagem total de
células nucleadas (CTCN) e de neutrófilos, linfócitos e macrófagos nos líquidos
cerebroespinhal e cavitários submetidos à citocentrifugação (CC) ou à
centrifugação simples (CS).
Material
Células
Desvio
Método
Média
Mediana
Biológico
padrão
CTCN (/µL)
39
55
18
CC
8
7
6
Neutrófilos (%)
CS
13
4
21
LCE
CC
76
26
82
Linfócitos (%)
CS
81
17
85
CC
20
20
18 *
Macrófagos (%)
CS
11
10
9
CTCN (/µL)
3554
6574
1056
CC
62
28
71
Neutrófilos (%)
CS
63
32
76
Líquidos
CC
22
24
17
Cavitários
Linfócitos (%)
CS
35
32
24
CC
16
13
12 *
Macrófagos (%)
CS
6
5
5
LCE: líquido cerebroespinhal; CTCN: contagem total de células nucleadas;
*p<0,05%;
Outro fator limitador à comparação de metodologias foi o baixo volume
de amostra encaminhado para análise. Três amostras foram descartadas da
comparação por não ser possível a preparação das lâminas com as duas
metodologias diferentes.
Não foi possível comparar as metodologias com amostras contendo
menos do que 12 células nucleadas/µL. Nestas amostras, mesmo após a
preparação na citocentrifugação não foi possível a constatação de celularidade
adequada na lâmina para a realização da contagem.
As amostras contendo número de células nucleadas inferior a 300/ µL
foram concentradas por meio de centrifugação simples antes da preparação
com a citocentrifugação para possibilitar a concentração de células e a
contagem diferencial.
Na comparação da contagem diferencial entre os dois métodos
utilizados foi possível observar que houve maior número de macrófagos nas
lâminas preparadas por meio da utilização da citocentrífuga (Tabela 1).
Macrófagos são células de defesa do organismo, que estão presentes na
maioria dos tecidos e são responsáveis por realizar fagocitose e apresentação
de antígenos em caso de processos inflamatórios. Como características
morfológicas, possuem núcleo redondo ou oval, não segmentado, e citoplasma
variável, podendo ou não conter vacúolos.
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A morfologia celular de neutrófilos segmentados, linfócitos e macrófagos
mostrou-se mais nítida na preparação por meio da citocentrífuga, o que
proporcionou incremento no diagnóstico, uma vez que a correta identificação
celular foi possibilitada.
Conclusão
Amostras com menos de 300 células/µL devem ser concentradas para a
preparação citológica. A nova metodologia produz lâminas de melhor qualidade
para a visualização morfológica das células além de proporcionar maior
identificação de macrófagos.
Agradecimentos
Agradeço à orientadora, à colaboradora e à Fundação Araucária/Inclusão
Social, pelo incentivo e oportunidade.
Referências
BEHR, S. et al. High resolution protein electrophoresis of 100 paired canine
cerebrospinal fluid and serum. J Vet Intern Med, v. 20, n. 3, p. 657-62, MayJun 2006.
BRAUND, K. G. Clinical neurology in small animal: localization, diagnosis
and treatment. New York: IVIS, 2003.
COLES, E. H. Patologia Clínica Veterinária. São Paulo: Manole, 1984. 566
VERNAU, W. Cerebrospinal Fluid. In: KANEKO, J. J., HARVEY, J. W., BRUSS,
M. L. (Ed.). Clinical Biochemistry of Domestic Animals. USA: Academic
Press, 2008. cap. Cerebrospinal Fluid, p.769-820.
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