equipe técnica

EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUÁRIA
EMBRAPA RECURSOS GENÉTICOS E BIOTECNOLOGIA
Estratégias moleculares para controle do Bicudo do
algodoeiro e de Lepidópteras
MARIA FÁTIMA GROSSI DE SÁ
Brasília
Setembro/ 2003
2
ÍNDICE
Índice .......................................................................................................................
2
Resumo ....................................................................................................................
4
Introdução ...............................................................................................................
6
Objetivos .................................................................................................................
11
Metas .......................................................................................................................
11
Revisão de literatura ..............................................................................................
13
Material e Métodos
Recursos Físicos .....................................................................................................
41
Recursos Humanos .................................................................................................
44
Certificado de qualidade em biossegurança ........................................................
46
Referências Bibliográficas .....................................................................................
47
Formulários Obrigatórios .....................................................................................
54
Formulário 1 – Carta consulta ........................................................................
55
Formulário 2 – Cronograma de execução e Plano de aplicação ....................
61
Formulário 2.1 – Consolidado geral do orçamento ........................................ 63
Formulário 2.2 – Orçamento: equipamentos e material permanente .............
64
Formulário 2.3 – Orçamento: material de consumo ....................................... 67
Formulário 2.4 – Orçamento: passagens ........................................................
69
Formulário 2.5 – Orçamento: recursos humanos ...........................................
71
Formulário 2.6 – Orçamento: outros serviços de terceiros ............................
73
Formulário 2.7 – Orçamento: manutenção de equipamentos ........................
74
Formulário 2.8 – Orçamento: diárias .............................................................. 75
Formulário 3 – Cronograma de desembolso ................................................... 95
Formulário 4 – Cadastro dos Pesquisadores
Formulário 5 – Declaração de Adimplência ..................................................
104
Formulário 6 – Declaração de Contrapartida .................................................
105
Formulário 7 – Termo de compromisso inicial .............................................. 106
Anexos
Curriculum Vitae
Maria Fátima Grossi de Sá ............................................................................. 107
Rose Gomes Monnerat Solon de Pontes ........................................................
120
Francisco José Lima Aragão ..........................................................................
137
Roseane Cavalcanti dos Santos ......................................................................
141
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RESUMO
As pragas são responsáveis por grandes perdas na agricultura, alimentando-se de tecidos vegetais e
causando doenças em muitas plantas. Em geral, seu controle requer o uso de grande quantidade de pesticidas
que, além de causar danos a saúde humana e ao meio ambiente, elevam substancialmente os custos de produção.
Estima-se que nos últimos anos as perdas agrícolas causadas devido à ação de pragas e patógenos, em todo
mundo, reduziram de 40 a 60% o total de alimentos produzidos (OERKE et al, 1994). No Brasil, as pragas
herbívoras e parasitárias, tais como os insetos e os nematóides, são os que mais contribuem para as perdas na
produção em culturas como algodão, café, cana-de-açucar e feijão, sendo, portanto, fundamental o
desenvolvimento de variedades geneticamente resistentes aos insetos- praga.
A cultura do algodão é de grande expressão socioeconômica para os setores primário e secundário
do Brasil, sendo classificada entre as dez principais culturas agrícolas do Brasil e ocupando o sexto lugar
mundial em superfície cultivada. Todavia, as pragas constituem-se um dos fatores limitantes para sua
exploração; entre estas, as de habito endofítico, o Anthonomus grandis (bicudo do algodoeiro) e Spodoptera
frugiperda (lagarta do cartucho), que têm preferência pelos botões florais e frutos do seu hospedeiro, destacamse entre as mais importantes. As partes infestadas por essas pragas servem como fonte de alimento e como local
de reprodução, causando, portanto, prejuízos diretos ao desenvolvimento dos botões e ao volume da safra e,
conseqüentemente, para a comercialização da fibra do algodão. Os danos provocados podem variar de uma
região a outra, alcançando níveis de até 25% do custo da produção. A disseminação do bicudo do algodoeiro nas
áreas cotonícolas contribuiu para que o Brasil passasse de grande exportador de fibras para importador. No inicio
da década de 90, 8% do consumo nacional de algodão em pluma foi adquirido do mercado externo. Entre os anos
de 94/95, esse percentual de importação passou para 41% e, em 1997 o Brasil já situava como 2 o maior
importador mundial (SANTOS & SANTOS, 1997). Até a década passada, na região do cerrado, a presença do
bicudo não tinha muita expressão. Atualmente, sua presença preocupa os produtores de algodão, onde este se
dissemina em alguns locais em Goiás, Minas Gerais, Bahia e algumas áreas de Mato Grosso, causando enormes
prejuízos (SANTOS, 2001). O cultivo do algodoeiro é uma das atividades agrícolas que mais utiliza produtos
agroquímicos no controle de pragas. Essa realidade tem feito com que pesquisadores da Embrapa vinculada ao
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, busquem alternativas cada vez mais ecologicamente
corretas para o chamado "manejo integrado de pragas”. A pesquisa, ao longo das duas últimas décadas, vem
desenvolvendo tecnologias de semi-controle e convivência com essas pragas, de modo a tentar restabelecer o
montante da área cultivada com o algodão, através da utilização de cultivares precoces e do estabelecimento de
genótipos que apresentam frutificação concentrada que são mais tolerantes ao ataque desses insetos. Porém, até o
presente, a forma mais efetiva de controle é através de inseticidas químicos.
As lagartas são as pragas mais importantes mundialmente, causando perdas e custos com controle por
inseticida, totalizando ao redor de U$ 3 bilhões por ano. Aproximadamente 88% da área global de algodão sofre
com infestações médias à altas de pragas de lepidópteras. Em base global, os cotonicultores usam US$ 1,7
bilhões em inseticidas para controle de pragas - são aplicados no algodão mais inseticida do que em qualquer
outra cultura; o algodão consume 20% de todo o inseticida aplicado no mundo. Nas Américas, o complexo
Heliothis virescens e H. zea tem sido controlado na maioria das áreas cultivadas. Entretanto, muita dificuldade
tem surgido em decorrência do desenvolvimento de resistência aos organofosfatos e piretróides por parte de H.
virescens (ELZEN, 1995). No Brasil, populações de S. frugiperda, têm ampliado sua área de ocorrência nos
estados de Goiás, Mato Grosso, Bahia e Paraíba, causando danos à cultura algodoeira que se ampliam ano a ano
(FERREIRA & SILVA, 1999).
O controle de todos estes insetos-praga na agricultura moderna é realizado principalmente pelo uso de agroquímicos sintéticos em um mercado que movimenta 10 bilhões de dólares anuais. No entanto, além de reduzir
em apenas 7% os prejuízos causados por insetos, este tipo de controle vem causando profundo impacto
ambiental, como a poluição dos solos e águas, desequilíbrios ecológicos e toxicidade sobre organismos não-alvo.
A incorporação de genes, expressando moléculas com atividade inseticida, em espécies vegetais
economicamente importantes, como algodão, café, cana de açúcar e feijão, têm surgido como um método
alternativo que vem apresentando visíveis benefícios a pequenos e grandes produtores de países desenvolvidos e
em desenvolvimento. Entre os principais benefícios podemos destacar a redução de pelo menos 50% do volume
de inseticidas aplicados, levando, conseqüentemente, a uma enorme redução dos custos de produção, aumento de
produtividade e diminuição de resíduos de agrotóxicos em alimentos (JAMES, 2002).
Assim, frente ao cenário dos grandes problemas que os insetos-praga podem causar na cultura do
algodoeiro, este projeto visa contribuir para a redução dos prejuízos causados pelo bicudo do algodoeiro e
lagartas, particularmente, a lagarta do cartucho. Frente a este objetivo, as ações deste projeto incluem a utilização
de diferentes estratégias moleculares na prospecção de genes, codificadores de proteínas com capacidade para
4
controlar, especificamente, as pragas alvo e posterior desenvolvimento de variedades de algodão elite resistentes
a estas pragas.
Estas estratégias incluem:
 O uso de biblioteca combinatória de inibidores mutantes do tipo phage display para seleção de
inibidores de proteinases melhorados, mais ativos e específicos para as pragas alvo.
 O uso de biblioteca combinatória de mutantes de inibidores de α-amilases, construída através da técnica
de DNA shuffling para seleção de inibidores mutantes para as α amilases(s) das pragas alvo.
 O uso de biblioteca combinatória de toxinas Bt (Bacillus thuringiensis), construída através das técnicas
de DNA shuffling e Phage display para seleção de toxinas mutantes para a praga alvo.
 O uso da região-pró das proteinases como fator de inibição da proteinase digestiva cognata do inseto
alvo.
INTRODUÇÃO
A produção da agricultura mundial é reduzida em até 45% devido, principalmente, ao ataque, pré e
pós-colheita, de uma variedade de pragas, incluindo insetos, nematóides e doenças induzidas por vírus e
bactérias (OERKE et al., 1994). Essas perdas quantificam prejuízos anuais de mais de 100 bilhões de dólares. A
principal forma de controle dessas pragas tem sido feita pela utilização de produtos químicos e, estes são
estimados reduzir as perdas em apenas 7% (OERKE et al., 1994).
A cultura do algodão está classificada entre as dez principais culturas agrícolas do Brasil,
ocupando o sexto lugar mundial em superfície cultivada. A planta de algodão por possuir numerosas glândulas,
denominadas nectários, produz uma secreção líquido-resinosa açucarada, que faz com que sua cultura seja uma
das mais atrativas aos insetos. Os danos provocados pelos insetos podem variar de uma região para outra, e seu
controle pode chegar a até 25% do custo da produção. Dentre os insetos fitófagos associados ao algodoeiro,
destacam-se como pragas importantes o bicudo do algodoeiro- Anthonomus grandis (Coleoptera: Curculionidae),
o Curuquerê - Alabama argilacea (Lepidoptera: Noctuidae), a lagarta da maçã - Heliothis virescens
(Lepidoptera: Noctuidae), a lagarta rosada - Pectinophora gossypiella (Saund, 1844) (Lepidoptera - Gelechiidae)
e a lagarta do cartucho do milho – Spodoptera frugiperda (lepidoptera: Noctuidae). Dentre essas importantes
pragas, o bicudo do algodoeiro é considerado uma das pragas mais sérias da agricultura em todo o Mundo pelos
danos que causa e pelas dificuldades do seu controle. Esta praga tem ampla distribuição em regiões tropicais e
temperadas quentes, sua detecção no Brasil deu-se, pela primeira vez, em fevereiro de 1983, na região de
Campinas, Estado de São Paulo. A rápida disseminação do bicudo, abrangência e danos nas áreas cotoniculturas
do Brasil, indicaram sua grande capacidade de adaptação a novos ambientes que, reforçado pôr suas
características biológicas e comportamentais favoráveis, tornou-se a praga-chave da cultura do algodão no país.
Atualmente o bicudo tem preocupado os produtores de algodão do cerrado; sua presença nas regiões do cerrado
era sem muita expressão, porém, nos últimos anos vem sendo detectado
em alguns locais em Goiás, Minas Gerais, Bahia e algumas áreas de Mato Grosso, causando
enormes prejuízos.
Desde a introdução do bicudo no Brasil e particularmente no Nordeste, estudos têm sido
conduzidos visando gerar tecnologias que sejam econômica e ecologicamente viáveis para serem utilizadas no
seu controle. Entretanto, a maioria dos esforços realizados até hoje tem se concentrado no aspecto agronômico
como o Manejo Integrado de Pragas, melhoramento clássico visando o desenvolvimento de cultivares de ciclo
curto e maturação rápida, desenvolvimento de armadilhas, apresentação de novos inseticidas, etc. Esforços tem
sido de grande valia, entretanto, o bicudo ainda se mantém como praga que mais causa prejuízo à cultura do
algodão no Brasil. A fase larval deste inseto é endofítica, portanto não é passível de ser controlada por
biopesticidas ou por métodos convencionais. Na fase adulta, este inseto se alimenta dos botões florais e das
maçãs, onde deposita seus ovos. Na época da colheita do algodão, o bicudo se abriga em refúgios localizados nas
matas auxiliares ou nas soqueiras aguardando o novo plantio.
A lagarta do cartucho do milho se alimenta das folhas no seu estágio mais jovem e penetra nas
maçãs e nos botões florais, causando grande destruição e dificultando o seu controle (NAKANO et al., 1992).
A principal forma de controle destes insetos tem sido feita pela utilização de produtos químicos (FRANÇA,
1993), cuja aplicação exige um grande investimento, onerando ou mesmo inviabilizando em alguns casos a
produção. Segundo dados do “IPM Working for Development”, quase 25% de todos os pesticidas utilizados pela
humanidade são gastos na cotonicultura, movimentando um mercado de US$ 7,5 bilhões/ano. Nas regiões
Nordeste, Sudeste e Sul do Brasil são efetuadas em média 18 aplicações de produtos durante o ciclo da cultura.
Na região Centro-Oeste, onde as lavouras são mais recentes estão previstas onze aplicações só para controlar o
bicudo.
O controle de pragas, baseado no uso de agroquímicos, além de aumentar os custos da produção,
causam danos à saúde do produtor, e, principalmente, ao meio ambiente. Este fato, associado a outros como a
5
explosão demográfica dos paises pobres, a escassez de áreas agricultáveis nos países industrializados e ao
impacto da destruição de vegetações nativas para a expansão da fronteira agrícola nos países em
desenvolvimento, tem justificado a necessidade de pesquisa e de desenvolvimento de métodos alternativos para
proteger as plantas contra a predação de insetos-pragas. Dessa forma, o desenvolvimento de novos produtos e
variedades de plantas com resistência a pragas e/ou doenças são alternativas de controle que podem ser mais
eficazes, além de evitar danos ao meio ambiente.
Entre as estratégias para o controle de pragas, incluem alternativas biológicas tais como a
utilização de bactérias, fungos, vírus e a obtenção de plantas geneticamente modificadas. A incorporação de
genes expressando proteínas entomotóxicas, em espécies vegetais economicamente importantes, vêm sendo
abordado como um método alternativo e bastante promissor (PERLAK et al., 1990, GATEHOUSE &
GATEHOUSE, 1998, CARLINI & GROSSI DE SA, 2002). Neste aspecto, a engenharia genética visando
resistência de plantas de algodão contra as pragas, Anthonomus grandis e Spodoptera frugiperda, tem o potencial
de superar muitas das limitações típicas dos métodos de controle atuais, além das limitações dos métodos
clássicos de melhoramento. Além disso, a recente aprovação da Lei de Propriedade Intelectual, aliada a uma
crescente conscientização da sociedade contra o uso indiscriminado de agrotóxicos e preservação do meio
ambiente, especialmente em países mais desenvolvidos, nos permite antever um cenário onde plantas
geneticamente modificadas serão, em curto prazo, fortes competidores dos cultivares nacionais.
Diferentes classes de proteínas são hoje conhecidas como proteínas de defesa por conferir
resistência contra insetos predadores e infecção por vírus, fungos, bactérias e nematóides. As mais conhecidas
são as lectinas, proteínas inativadoras de ribossomos (RIPs), glicohidrolases, defensinas, inibidores de enzimas
hidrolíticas digestivas e as toxinas Cry (GATEHOUSE & GATEHOUSE, 1998; CARLINI & GROSSI DE SA,
2002). O potencial biotecnológico de muita dessas proteínas de defesa foram demonstrados através de sua
introdução em plantas de interesse. Hoje existe uma enorme lista de plantas geneticamente modificadas
resistentes a pragas, sendo muitas delas comercializadas (JOUANIN et al., 1998; BRASILEIRO, 2001). Plantas
transgênicas portando genes que codificam toxinas provenientes do Bacillus thuringiensis (Bt), atualmente
ocupam 11,4 milhões de hectares e estão revolucionando a agricultura (SHELTON et al, 2002). O
desenvolvimento de novas cultivares resistentes às pragas mais devastadoras será um dos referenciais futuros
para o incremento da cotonicultura nacional, traçando uma linha divisória entre um agronegócio ecologica e
economicamente promissor e as dificuldades visualizadas no presente.
Considerando a importância do dano causado pelo bicudo do algodoeiro e pelas lagartas, a
carência de métodos eficientes e não poluentes para o controle e a existência de infra-estrutura e material
biológico, foi iniciado no final do ano de 1998 um projeto de pesquisa cujo objetivo é buscar soluções
alternativas, confiáveis, que não agridam o ambiente para controlar estas importantes pragas da cultura de
algodão. Este projeto tem como objetivo principal o controle das pragas do algodoeiro de hábito alimentar
endofítico (A. grandis e S. frugiperda) e de lagartas por meio do uso da engenharia genética. Atualmente, genes,
codificadores de proteínas entomotóxicas foram isolados e estão sendo introduzidos em plantas de algodão.
Ademais, através de estratégias moleculares baseadas, principalmente, em bibliotecas combinatórias de toxinas
Bt e de inibidores de enzimas hidrolíticas digestivas, novos genes, codificadores de moléculas mais ativas e com
maior especificidade serão isolados e utilizados na transformação de plantas de algodão visando o controle
destes importantes insetos-praga.
OBJETIVOS
O objetivo deste projeto é a utilização de genes com potencial inseticida no controle do bicudo do
algodoeiro e de lagartas através de plantas de algodão geneticamente transformadas. Pretende-se prospectar
genes codificadores de toxinas Bt e com atividade sobre o bicudo e lagartas e introduzi-los em variedades de
algodão brasileiras. O objetivo final é ter uma variedade de algodão agronomicamente melhorada e resistente ao
bicudo do algodoeiro, o que contribuirá para o aumento da produção, redução do uso de inseticidas e custos da
produção. O projeto se encontra em fase onde, paralelamente, experimentos de transformação de plantas de
algodão estão sendo conduzidos (utilizando-se genes, previamente identificados, codificadores de proteínas
ativas para as pragas) e novos genes estão sendo identificados e isolados. O objetivo final é ter uma variedade
de algodão agronomicamente melhorada e com resistência a viroses (Gossipium hirsutum-Cedro) resistente ao
bicudo e as lagartas, o que contribuirá enormemente para o aumento na produção, redução do uso de inseticidas
e de custos da produção.
6
METAS

Construção de vetores de expressão de plantas contendo o(s) gene(s) codificadores de toxinas ativas
para o bicudo e a lagarta do cartucho (Genes: BCTI, tarina e cry8Bc).

Regenerar e Transformar plantas de algodão com os genes identificados, codificadores de proteínas
ativas para o bicudo e lagarta do cartucho.

Selecionar inibidores de -amilases mutantes com alta eficiência em inibir as-amilases do bicudo do
algodoeiro, através do uso de bibliotecas do tipo Phage display de inibidores mutantes recombinados,

Selecionar mutantes de toxinas Bt com alta atividade e especificidade para o bicudo do algodoeiro e a
lagarta do cartucho do milho, através do uso de bibliotecas do tipo Phage display de genes para toxinas
Bt recombinados,

Prospectar genes codificadores para as tóxinas Bt eficazes para o bicudo do algodoeiro, lagarta do
cartucho, lagarta rosada e curuquêre, a partir de novas cepas de B. thuringiensis.

Expressar os genes isolados em sistema heterólogo (Escherichia coli, células de inseto, plantas) e testar
contra as diferentes pragas-alvo.

Realizar bioensaios com as toxinas e produtos de genes expressos.

Truncar o gene cry8Bc para obter o correto códon preferencial e introdução em plantas de algodão.

Isolar e caracterizar as proteinases da lagarta do cartucho, lagarta da maça, curuquêre visando a seleção
de inibidores de proteinases específicas para estas pragas
7
REVISÃO DE LITERATURA
O agronegócio brasileiro foi responsável no ano de 2002 por 44,5% das exportações brasileiras, o que
correspondeu a um superávit comercial de US$ de 24 bilhões, se constituindo, portanto no principal sustentáculo
da economia brasileira. Este excepcional desempenho deve-se entre outros fatores ao desenvolvimento de
variedades de diferentes culturas resistentes a estresses bióticos e abióticos e adaptadas a ambientes diversos.
Neste tocante, a biotecnologia moderna tem um papel fundamental já que permite isolar genes que conferem
características agronômicas importantes e que podem ser utilizados como marcadores moleculares em programas
de seleção assistida no melhoramento genético ou serem incorporados diretamente em plantas transgênicas.
Estas novas ferramentas são, portanto, essenciais para o desenvolvimento de novas variedades de commodities
economicamente importantes como soja, milho, café e algodão, assegurando a manutenção do importante papel
do agronegócio na economia nacional. Estas mesmas ferramentas que são freqüentemente utilizadas em
commodities também podem ser aplicadas a espécies tipicamente de agricultura familiar e conseqüentemente
beneficiar um enorme número de pequenos agricultores.
A participação do setor público é fundamental na biotecnologia agropecuária e definirá o quanto o País
irá se beneficiar destas novas tecnologias e quais setores sociais serão atingidos por estes benefícios. O valor das
taxas tecnológicas, embutidas em produtos biotecnológicos, está diretamente relacionado ao tamanho da
participação do Estado no desenvolvimento destes produtos. Estes podem ser oferecidos por preços reduzidos e
conseqüentemente tornando o produtor nacional mais competitivo quando desenvolvidos pelo Estado. Por outro
lado, a aplicação de alta tecnologia voltada para o benefício de pequenos produtores só será realizada pela
participação do setor público. Um exemplo que ilustra bem esta situação vem do algodão Bt gerado na China.
Neste caso, empresas agropecuárias estatais isolaram genes, desenvolveram eventos elite e licenciaram diversas
variedades. Isto possibilitou que mais de 4 milhões de pequenos produtores de algodão se beneficiassem deste
produto, o que corresponde a cerca de 75% do número total de produtores do mundo que fazem uso de plantas
geneticamente modificadas. Portanto fica claro que a participação da EMBRAPA é essencial para manter o
agronegócio nacional competitivo e evitar a dependência do País em relação ao monopólio do setor
biotecnológico exercido por empresas transnacionais.
O papel da EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia na Biotecnologia agropecuária nacional é
extremamente relevante já que este Centro é responsável por cerca de 50% das atividades da moderna
biotecnologia realizadas por toda a EMBRAPA. As atividades de pesquisa em biotecnologia agrícola conduzidas
envolvem a identificação de marcadores moleculares que serão utilizados em programas de melhoramentos e o
desenvolvimento de linhagens elite transgênicas desde o isolamento de genes e seqüências regulatórias até o
desenvolvimento destas linhagens que também entrarão nos programas de melhoramento realizados pelos
Centros de produtos. Portanto, a EMBRAPA Recursos genéticos e Biotecnologia através das suas atividades e do
seu relacionamento com os centros de produtos exercem um papel primordial no desenvolvimento de novas
variedades para o agronegócio e a agricultura familiar.
Para a identificação de genes que conferem resistência as principais pragas e patógenos de culturas
importantes estão em curso uma série de projetos em diferentes culturas como café, algodão, banana e feijão de
corda Ademais, projetos de transformação genética de feijão, soja, algodão e café para obtenção de linhagens
elite resistentes as principais pragas e doenças destas culturas Os avanços em diversas áreas da biotecnologia,
particularmente da engenharia genética, tem proporcionado o estabelecimento de inúmeros processos visando à
melhoria das características agronômicas de culturas de interesse econômico. Processos biotecnológicos visando
resistência de plantas a pragas têm sido desenvolvidos para culturas importantes tais como, batata, tomate,
canola, algodão e soja, entre outras. As técnicas avançadas em biologia molecular, visando a prospecção de
genes e a obtenção de resistência de plantas de interesse contra as pragas, têm o potencial de superar muitas das
limitações típicas dos métodos de controle atuais, além das limitações dos métodos clássicos de melhoramento.
Diferentes estratégias vêm sendo utilizadas para desenvolver plantas transgênicas resistentes ao ataque de
insetos. Entre essas estratégias estão o uso de toxinas de Bacillus thuringiensis (Bt), dos inibidores de enzimas
hidrolíticas digestivas (amilases e proteinases), de lectinas, de proteínas para genes de resistência (genes R),
entre outras (CARLINI & GROSSI DE SA, 2002). Além do uso dessas proteínas, outras estratégias estão sendo
desenvolvidas que permitem selecionar mutantes dessas proteínas específicos para as pragas de interesse bem
como para quaisquer outras pragas alvo. Essas estratégias envolvem o uso de bibliotecas combinatórias de
proteínas (inibidores e/ou toxinas) do tipo phage display, as quais são construídas visando a geração de milhões
de variantes de uma proteína que poderão, então, serem testadas para selecionar ligantes alvo.
8
Pragas do Algodão
O algodão (Gossypiun hirsutum) é uma cultura anual adaptado a regiões tropicais e sub-tropicais
(GRIMES & EL-ZIK, 1990). No Brasil, classifica-se entre os dez principais cultivos agrícolas e o sexto lugar à
nível mundial em superfície cultivada. A produção nacional de algodão em pluma atingiu um recorde de 965 mil
ton na safra 1984/1985, porém reduziu drasticamente a 285 mil ton em 1996/1997. A área cultivada diminuiu de
1,9 milhões de hectares (ha) em 1992, a 668 mil ha em 1997. Atualmente, o Brasil produz 808,6 mil ton em
715,0 mil ha, sendo que os estados do Mato Grosso, Goiás e Bahia são os principais produtores (398,9, 111,5,
96,1 mil ton, respectivamente). A região Centro-Oeste é a principal região cotonicultora do país (579,9 mil ton,
correspondendo a 71,7% do total), seguida pelas regiões Nordeste (117,1 mil ton), Sudeste (85,2 mil ton), Sul
(24,7 mil ton) e Norte (1,7 mil ton), segundo levantamento da safra 2002/2003 (CONAB, 2003).
Vários fatores foram responsáveis pela redução da produção, principalmente o ataque de pragas
fitófagos tais como o bicudo do algodoeiro (A. grandis), o curuquerê (Albama argilacea), a lagarta da maçã
(Heliothis virescens), a lagarta rosada (Pectinophora gossypiella) e a lagarta do cartucho do milho (Spodoptera
frugiperda), associados a falta de política agrícola do setor. A disseminação do bicudo do algodoeiro nas áreas
cotonicultoras contribuiu enormemente para que o Brasil passasse de grande exportador de fibras à importador.
No início da década de 90, 8% do consumo nacional de algodão em pluma foi adquirido do mercado externo,
entre os anos de 94/95, esse percentual de importação passou para 41% e em 1997 o Brasil já situava como
segundo maior importador mundial (SANTOS & SANTOS, 1997).
O bicudo do algodoeiro apresentam ovos brancos e brilhantes, de formato elíptico, medindo 0,8 mm de
comprimento por 0,5 mm de largura, sendo postos em cavidades abertas nos botões florais ou maçãs e os
orifícios cobertos por cera. Após 3 ou 4 dias, eles eclodem originando larvas com aproximadamente 1 mm de
comprimento que se alimentam diretamente nestes órgãos (sendo que a fase larval dura 11 e 31 dias nas maçãs e
botões florais, respectivamente), posteriormente entram no estágio de pupa com duração de 3 a 5 dias, seguido
pelo período de pré-oviposição (3 a 4 dias) e a fêmea com vida média de 20 a 30 dias apresenta oviposição de
100 a 300 ovos e 3 a 7 gerações por estação, possuindo alta capacidade de proliferação (SILVA et al., 1995).
Desde a introdução do bicudo do algodoeiro no Brasil e particularmente no Nordeste, pesquisas visando obter
novas tecnologias que sejam econômicas e ecologicamentes viáveis de serem aplicadas no controle do inseto
alvo têm sido desenvolvidas. Entretanto, a maioria dos esforços realizados concentram-se nos aspectos
agronômicos como o manejo integrado de pragas, o melhoramento clássico visando o desenvolvimento de
cultivares de ciclo com maturação rápida, desenvolvimento de armadilhas, apresentação de novos inseticidas,
entre outros. Estes esforços têm sido de grande importância, porém, pragas como o bicudo ainda se mantém
como o fator primário de prejuízos à cotonicultura no país. A situação possui como agravante a característica
endofítica da fase larvária deste inseto, dificultando o controle com biopesticidas ou por métodos convencionais.
A grande quantidade de inseticidas utilizada, atualmente, na cultura do algodoeiro, causa danos à saúde humana
e ao meio ambiente, portanto o desenvolvimento de plantas transgênicas reduziria a quantidade de inseticidas
necesssária para a obtenção de produtividades rentáveis, contribuiria para viabilizar o agroecossistema,
garantindo sua sustentabilidade.
Estratégias de Defesa
A sobrevivência das plantas requer resposta imediata a estímulos externos oriundos de predadores, ou
adversidade ambiental, como temperatura e estiagem. A principal resposta consiste no desencadeamento de
sinais internos, capazes de ativar a produção das substâncias de ataque ao patógeno (REINBOTHE et al., 1994;
GRAHAM & GRAHAM, 1996; YANG et al., 1997; KELLER et al., 1999), ou devido a presença de proteínas
tóxicas contra patógenos/herbívoros capazes de proteger os nutrientes endógenos, garantindo o desenvolvimento
do novo indivíduo e perpetuação da espécie (GUTIÉRREZ et al., 1990). Na relação planta-patógeno, a
resistência resulta da incapacidade do patógeno em reconhecer/infectar a planta, ou capacidade de ativação
rápida e efetiva dos mecanismos de defesa, conduzindo à proteção. As diferentes respostas fisiológicas frente a
um patógeno conferem resistência ou suscetibilidade, cujo especificidade seria explicada pelo conceito de
interação gene-por-gene; i.e., a especificidade é determinada pela interação entre os produtos do gene de
resistência dominante (R) e gene correspondente de avirulência (Avr) do patógeno, assim as relações
incompatíveis requerem a interação de ambos produtos gênicos para iniciar uma resposta (HAMMONDKOSACK & JONES, 1996; Van der HOORN et al., 2002). Neste contexto, o modelo evocador-receptor é o mais
aceito, destacando-se a importância do processo de reconhecimento entre o hospedeiro e patógeno. Postula-se
que os produtos do gene de avirulência, ou metabólitos resultantes da atividade catalítica de uma proteína
(evocador) são reconhecidos por moléculas alvo específicas nas plantas (receptores), codificados por genes de
resistência.
Para estabelecer a infecção, o patógeno deverá romper as barreiras físicas que protegem as células
vegetais do ambiente externo, como cutícula e parede celular (JACKSON & TAYLOR, 1996). A cutícula
consiste de ácido graxo hidroxilado, esterificado com compostos fenólicos (quitina) ou álcool primário (ceras); a
9
parede celular contém polímeros de carboidratos (celulose, hemicelulose e pectina), proteínas (glicoproteínas
ricas em hidroxiprolina ou extensinas, que constituem proteínas ricas em glicina e enzimas hidrolíticas) e
compostos fenólicos, representados pela lignina e ésteres fenólicos (BOUDART et al., 1995). Estes compostos
participam nas interações intermoleculares, incorporando compostos fenólicos (lignificação da parede celular),
ou proteínas estruturais (glicoproteínas ricas em hidroxiprolina) na parede celular, sendo regulados por
peroxidases, pH ou Ca2+, desencadeando rearranjo estrutural e consequente diminuição da permeabilidade ao
patógeno (SHOWALTER, 1993).
Conhecendo-se os processos de interações entre a planta e o patógeno durante o mecanismo de ataque,
GATEHOUSE et al. (1992) dividiram as estratégias de defesa da planta em dois grupos: o primeiro,
representado por estruturas físicas, isto é, prevenção contra penetração de patógenos e o segundo, pela defesa
bioquímica oriunda da ação de compostos tóxicos contra pragas e patógenos, que o elimina por competição no
decorrer do desenvolvimento da planta.
As proteínas de defesa dividem-se em três classes, conforme função desempenhada. A primeira
classe agrupa produtos capazes de mudar diretamente as propriedades extracelulares da matriz, aumentando a
defesa por reforçar, reparar ou alterar a parede celular. O grupo inclui proteínas estruturais constituídas de
glicoproteínas ricas em hidroxiprolina/glicina e enzimas envolvidas na construção/modificação de polímeros da
parede celular (lignina, suberina, compostos fenólicos e calose) (GOMES & XAVIER-FILHO, 1994). O
segundo grupo contém proteínas com atividade antimicrobiana direta, exemplificando-se hidrolases pertencentes
a quitinase e β-1,3-glucanase, catalisadores da síntese de antimicrobianos ou contra herbívoros (inibidores de
proteinases e amilases), proteínas tóxicas (lectinas, tioninas e toxinas Bt), além de enzimas envolvidas na síntese
de metabólitos secundários como taninos, quinonas e fitoalexinas com atividade antimicrobiana (BOWLES,
1990; FRANCO et al., 2002). A terceira classe envolve proteínas com resposta de defesa relacionada com
patogênese (PR) (GOMES & XAVIER-FILHO, 1994).
As pesquisas vêm se acelerando nos últimos anos para identificar novas substâncias produzidas por
plantas ou microrganismos, capazes de participar direta ou indiretamente nas estratégias de defesa contra insetos
e patógenos microbianos. As substâncias envolvidas pertencem ao grupo de fenóis, aminoácidos não protéicos,
alcalóides, lectinas e inibidores de proteinases e de -amilases (GATEHOUSE et al., 1992) e toxinas de B.
thuringiensis (Bt) ou proteínas Cry (MARZARI et al., 1997), entre outras. Destaque especial tem sido dado as
toxinas Bt com alta especificidade a determinados insetos, cujo o setor com marcante evolução, vem
introduzindo na era das plantas biotecnologicamente melhoradas resistentes a insetos (BURKNESS et al., 2002;
BAUR & BOETHEL, 2003; ZOERB et al., 2003).
Toxinas Bt ou Proteínas Cry
B. thuringiensis é uma bactéria gram positiva, da família Bacillaceae que durante esporulação
produz inclusões protéicas cristalinas, contendo proteínas denominadas δ-endotoxinas. Elas compõem uma
família com 110 membros, classificados em 22 grupos, cujo as características encontram-se na Tabela 1. As
proteínas Cry 16, 17 e 18 são excessões, sendo produzidas por Clostridium bifermentans spp. malaysia e
apresentam atividade contra três espécies de mosquitos: Aedes aegypti, Culex pipiens e Anopheles stephensis
(BARLOY et al., 1996; ZHANG et al., 1997).
As toxinas Bt apresentam massa molecular de 65 a 138 kDa e são classificadas segundo a
similaridade de sequência de aminoácidos (CRICKMORE et al., 1998). Estas são produzidas, na forma de
protoxina, a partir do segundo estágio de esporulação do B. thuringiensis e os cristais liberados com a lise
celular. A toxina é composta por três domínios, sendo que o domínio I (N-terminal) possui 8 α-hélices com a
hélice central relativamente hidrofóbica, enquanto que o domínio II (intermediário) e o domínio III (C-terminal)
são constituídos por regiões β. A distribuição do potencial eletrostático na superfície da molécula não é uniforme
e identifica um sítio do domínio α-helical com carga negativa, porém a predominância de resíduos de arginina
mantém a distribuição de cargas positivas em meio alcalino encontrado no intestino do inseto (GROCHULSKI et
al., 1995). Na Figura 1 apresenta-se a estrutura tridimensional das toxinas Cry, com os respectivos domínios.
Os domínios da toxina possuem funções distintas no exercício da atividade tóxica. O domínio II
(Figura 1C) é o responsável pela interação e reconhecimento do receptor nas células intestinais do inseto; o
domínio I (Figura 1B) sofre hidrólise proteolítica, seguido de oligomerização e inserção na membrana da células
epiteliais no intestino do inseto e consequentemente a formação do poro de lise, além de apresentar atividade
sobre as propriedade do canal iônico; e o domínio III (Figura 1D) apresenta atividade sobre as propriedades do
canal iônico e participa no reconhecimento do receptor (DEAN et al., 1996).
As protoxinas são transformadas em peptídeos tóxicos no intestino do inseto, pela ação de proteinases e do pH
alcalino, causando a morte das células epiteliais ao inativar o sistema de manutenção do gradiente de pH e por
citólise osmótica (ARONSON et al., 1986; KNOWLES & ELLAR, 1987; WOLFERSBERGER, 1992). As
toxinas Bt aumentam a permeabilidade das microvilosidades apicais aos cátions, ânions, água e moléculas de
maior tamanho, resultando no colapso da diferença de potencial elétrico e perda da força motriz que dirige a
entrada de aminoácidos em direção ao interior celular, assim como a redistribuição dos cátions entre o lúmem e o
10
citoplasma. Considera-se que o efeito mais devastador deste processo seja a alcalinização do citoplasma,
interferindo no metabolismo celular e consequente destruição do epitélio intestinal, seguido de morte das larvas
por inanição (HARVEY, 1992; WOLFERSBERGER, 1992).
As vantagens da utilização de toxinas Bt são: especificidade a grupos de insetos, não é poluente ao
meio ambiente, inocuidade aos mamíferos e vertebrados e não possui toxicidade sobre as plantas (WHITELEY
& SCHNEPF, 1986; OMS.,1987). A 50 anos os produtos obtidos de B. thuringiensis são comercializados no
controle de pragas de interesse econômico na agricultura com um mercado anual de aproximadamente 100
milhões de dólares, sendo que no início de 1998, havia aproximadamente 200 produtos comerciais à base de Bt
registrado nos EUA, com perspectivas crescente do uso destes compostos devido ao desenvolvimento de
legislações de proteção ambiental mais rigorosas (RIGBY, 1991; DIAS, 1992; BRAVO & QUINTERO, 1993;
SCHNEPF et al., 1998).
As técnicas de engenharia genética permitiram o desenvolvimento de um sistema que consiste na
transferência e expressão de genes que codificam δ-endotoxinas de Bt em plantas (AZEVEDO, 1998). Os
primeiros resultados de transferência de genes de Bt foram obtidos no fumo e tomate em 1987, desde então,
vários genes cry foram introduzidos em diversas plantas como algodão, arroz, milho, batata, soja, canola e outras
(VAECK et al., 1987; BARTON et al., 1987; FISCHHOFF et al., 1987; JOUANIN et al., 1998; BURKNESS et
al., 2002; BAUR & BOETHEL, 2003; ZOERB et al., 2003). Nos EUA, em 1995, foram liberadas em nível
comercial as primeiras plantas geneticamente modificadas expressando proteínas Cry (JOUANIN et al., 1998).
Nas plantas, a produção de proteínas Cry oferece várias vantagens, pois é um sistema ambientalmente seguro, já
que o produto pode ser expresso apenas em tecidos de interesse ficando retido no interior destes tecidos não
deixando resíduos ambientais, além de não possuir relatos sobre a atividade contra insetos benéficos (RUUD et
al., 1999). Como as proteínas são produzidas continuamente persistem por algum tempo na planta, sendo
necessário menor aplicação de outros inseticidas, reduzindo o custo da produção (JOUANIN et al., 1998;
SCHNEPF et al., 1998; AZEVEDO, 1998).
O algodão é o terceiro principal cultivo transgênico ocupando globalmente 6,8 milhões de hectares,
correspondendo a 12% da área global de transgênicos, sendo plantado nos EUA, México, China, Argentina,
África do Sul, Índia, Honduras, Colômbia e Filipinas. Do total plantado, 2,4 milhões de hectares correspondem a
algodão Bt, 2,2 milhões de hectares a algodão tolerante a herbicidas e 2,2 milhões de hectares correspondem a
algodão transgênico contendo as duas características. Desde o início da adoção do algodão transgênico, a área
total plantada tem crescido anualmente. A única exceção foi o período 2001-2002 onde a área se manteve
inalterada. A ausência de crescimento ocorreu principalmente devido à redução em 10% de toda área de algodão
cultivada nos EUA, o que levou a uma redução da área transgênica desta cultura na mesma proporção. Dados do
ISSA,2002 demonstram que a redução da área de algodão nos EUA foi devida aos preços internacionais que
levaram alguns produtores de algodão a optarem pelo cultivo de commodities mais rentável como soja e milho.
Na Austrália também ocorreu uma redução da área de algodão que foi acompanhada pela redução da área
transgênica, neste caso devido a condições climáticas extremas. Em todos os outros países houve aumento da
área de algodão transgênico. Dos novos países que adotaram o uso comercial de transgênicos, a Índia, maior
produtor mundial de algodão (8,7 milhões de hectares – o que corresponde a 25% da área mundial), cultivou em
2002 cerca de 45.000 hectares com algodão Bt. A Colômbia iniciou, em 2002, o cultivo em escala pré-comercial
de algodão Bt, em área de 2.000 hectares, e Honduras foi, nesse mesmo ano, o primeiro país da América Central
a introduzir o cultivo transgênico. Em 2002, nas Filipinas, o algodão Bt foi aprovado para utilização em escala
comercial e na Austrália foi aprovada a utilização comercial do algodão Bt Bollgar®II. Este tem estimativa de
plantio de até 5.000 hectares na safra 2002/2003 - a área plantada com esse produto deverá ocupar 70% do total
cultivado com algodão no país.
Entre os benefícios relatados por esses países, pelo uso de algodão transgênico, citamos a redução de
46% no uso de inseticidas pelos EUA, e a redução de 6 para 3,5% as aplicações de inseticidas pelo México. Na
África do Sul, 65% dos pequenos produtores e 25% dos grandes produtores utilizam algodão Bt, com aumento
de produção de 21,5%. A Argentina economizou cerca de 65% no uso de inseticidas, com benefício de US$
65,00 por hectare. A China apresentou um crescimento de 1,5 milhões de hectares em 2001 para 2,1 milhões de
hectares em 2002, representando 40% de aumento em sua área de algodão Bt, totalizando 51% do algodão total
cultivado. Desse total, cerca de 72% não recebeu inseticidas e 29% foram feitas apenas de 1a 3 aplicações.
11
Figura 1: Estrutura das proteínas Cry. A. Estrutura tridimensional das proteínas Cry com os três
domínios. B. Estrutura do domínio I. C. Estrutura do domínio II. D. Estrutura do domínio III.
12
Tabela 1: Características dos principais grupos de proteínas Cry, produzidas por B. thuringiensis.
Proteína Cry
(Classes)
Cry1
Cry1 Aa,
Cry1 Ka
Massa Molecular
Tipo de Cristais
Fragmento
tóxico:
60 – 70 kDa
-
Cry2
Cry2 Aa
Cry2 Ab
Cry2 Ac
Cry3
4 proteínas
65 kDa
Cubóides
72 – 73 kDa
Rombóides
Cry4
Cry4 Aa
Cry4 Ba
Cry 4 Aa: 135 kDa
Cry 4 Ba: 128 kDa
Ovóides
Cry5
Cry5 Aa
Cry5 Ab
Cry5 Ac
Cry5 Ba
Cry6
Cry6 Aa
Cry6 Ba
Cry7
Cry7 Aa
Cry7 Ab
Cry8
Cry8 Aa
Cry8 Ba
Cry8 Ca
Cry9
Cry10
Cry10 Aa
Cry11
Cry11 Aa
Cry11 Ba
Cry12
Cry12 Aa
Cry13
Cry8
Cry8 Aa
Cry8 Ba
Cry8 Ca
Cry9
Cry10
Cry10 Aa
Praga Alvo
Fonte
Geral: lepidópteros
Cry1 Ca: lepidópteros e dípteros
Cry1
Ba:
lepidópteros
e
coleópteros
Cry2 Aa: lepidópteros e dípteros
Cry2 Ab e Ac: lepidópteros
HOFTE & WHITELEY, 1989
Geral:
coleóptero
(L.
decemlineata)
Cry3: (M. euphorbiae)
Cry3 Bb: (D. undecimpunctata)
Dípteros
WALTERS
1995
HOFTE & WHITELEY, 1989
LERECLUS et al., 1989
&
ENGLISH,
HOFTE & WHITELEY, 1989
LERECLUS et al., 1989
Cry5Aa e Cry5Ab: nematóides e
ácaros
Cry5Ac e Cry5Ba: formigas e
coleópteros
HOFTE & WHITELEY, 1989
Nematóides e ácaros
HOFTE & WHITELEY, 1989
Coleópteros
HOFTE & WHITELEY, 1989
-
-
-
-
-
-
-
Cry8 Aa: coleópteros e afídeos
Cry8 Ba e Ca: coleópteros
HOFTE & WHITELEY, 1989
-
78 kDa
-
Dípteros
HOFTE & WHITELEY, 1989
HOFTE & WHITELEY, 1989
72 kDa
-
Dípteros
HOFTE & WHITELEY, 1989
-
-
Nematóides e ácaros
HOFTE & WHITELEY, 1989
-
-
HOFTE & WHITELEY, 1989
HOFTE & WHITELEY, 1989
-
-
Nematóides
Cry8 Aa: coleópteros e afídeos
Cry8 Ba e Ca: coleópteros
78 kDa
-
Dípteros
HOFTE & WHITELEY, 1989
HOFTE & WHITELEY, 1989
Inibidores de Proteinases de Plantas
Em plantas, inúmeras proteínas têm a capacidade de inibir enzimas hidrolíticas. As proteínas,
inibidoras de enzimas hidrolíticas, ocorrem naturalmente em muitas plantas, estando presentes em muitas
sementes (RYAN, 1990). As principais classes são os inibidores de -amilases e os inibidores de
proteinases.Nos últimos anos, as proteinases digestivas dos insetos têm sido forte candidatos alvo para o controle
de pragas porque são facilmente acessíveis ao material da planta ingerido. Plantas de interesse expressando
proteínas que podem seletivamente inibir as enzimas digestivas do intestino de uma praga particular, mas não de
outros artrópodes ou dos consumidores (homem/mamíferos), poderiam proporcionar um caminho para a redução
no uso de pesticidas químicos em plantações de culturas e/ou em sistemas de estocagem.
A transformação de plantas, com genes de defesa, codificantes para tais proteínas, visando à obtenção de
variedades resistentes a pragas tem sido alvo de muitos estudos nos últimos anos (BRASILEIRO, 2001). Genes
para diferentes proteínas foram introduzidos em plantas e, muitas plantas transgênicas resistentes a insetos foram
geradas (GATEHOUSE & GATEHOUSE,1998).
O papel dos inibidores de proteinases na defesa de plantas contra predadores e patógenos é bem estabelecida.
Embora diferentes funções endógenas para essas proteínas tenham sido propostas, que vão desde reguladores de
13
proteinases endógenas a proteínas de estocagem (WALKER et al., 1997), evidências para muitos desses papeis é
ainda parcial, ou confinado a isolados exemplos. Entretanto, muitos inibidores de proteinases têm sido mostrados
agir como compostos defensivos através de ensaios in vitro ou pela sua expressão em plantas transgênicas; um
número grande de evidências consistentes com seu papel na defesa de plantas tem se acumulado.
Os inibidores de proteinases têm sido considerados como agentes naturais de controle contra
insetos herbívoros, porque estes reduzem a atividade proteolítica in vitro e afetam o desenvolvimento larval de
um numero grande de diferentes espécies de coleópteras e lepidópteras (BROADWAY & DUFFEY, 1986;
HILDER et al., 1987). Muitas famílias de plantas possuem inibidores de proteinases distribuídos através de seus
órgãos reprodutivos, órgãos de reserva e tecidos vegetativos (SHEWRY & LUCAS, 1997). A maioria destes
inibidores são moléculas pequenas, estáveis, abundantes e fáceis de purificar. O mecanismo pelo qual os
inibidores de proteinases interferem no processo digestivo das pragas se deve à diminuição da assimilação de
nutrientes através de sua ligação específica a enzimas proteolíticas de seus intestinos, impedindo que estas
executem suas funções primordiais no processo de digestão protéica (RYAN, 1990). Por exemplo, quando
insetos-praga são submetidos a uma dieta artificial contendo inibidores específicos para a principal classe de
proteinases de seus intestinos, estes têm seu desenvolvimento retardado, bem como podem apresentar índices de
mortalidade bastante significantes (MCMANUS & BURGESS 1995).
Um dos mais importantes determinantes para o sucesso no uso de inibidores de proteinases contra
insetos-praga é a seleção de inibidores apropriados. Existem quatro classes de inibidores de proteinases
digestivas estabelecidas de acordo com suas atividades específicas: inibidores de serino-proteinases; de cisteinoproteinases (cistatinas); aspártil e de metalo-proteinases. O número de inibidores de proteinases de plantas
identificados e isolados é grande, sendo os inibidores de serino e cisteino-proteinases, os mais caracterizados
(RYAN, 1990, BODE & HUBER,1992).
Muitos desses inibidores, tais como o inibidor de tripsina de soja e o de feijão-de-corda, afetam o
desenvolvimento de vários insetos lepidópteros (BROADWAY & DUFFEY, 1986), os quais possuem uma
grande quantidade de serino-proteinases em seus tratos digestivos (APPLEBAUM, 1985). A maioria dos
inibidores de serino-proteinases, reagem com suas enzimas cognatas através de um mecanismo semelhante ao
que ocorre na ligação entre enzima e substrato (LASKOWSKI & KATO, 1980). A formação do complexo
enzima-inibidor ocorre rapidamente, mas a sua dissociação é lenta e resulta em enzima livre e em um inibidor
clivado, o qual sofre desnaturação. Na formação desse complexo, estão envolvidas interações entre as cadeias do
inibidor e da proteinase, tais como pontes de hidrogênio e forças de Van der Waals, entre outras. Para que o
inibidor adquira uma conformação que o possibilite conectar-se à proteinase é também necessária a formação de
pontes dissulfeto (ARDELT & LASKOWSKI, 1991). A formação do complexo enzima-inibidor envolve ainda a
formação de uma ligação peptídica no sítio reativo do inibidor, e a presença de alguns elementos essenciais no
sítio ativo da enzima. O mecanismo da catálise é comum para as proteinases e a estrutura foi bastante estudada
através de técnicas de Difração de Raios-X (BODE & HUBER, 1992).
Os inibidores de proteinases cisteínicas, conhecidos também como cistatinas, são um grupo de
proteínas que se ligam às proteinases cisteínicas inibindo sua atividade (Kudo et al., 1998). Em animais, existem
três famílias de cistatinas, classificadas de acordo com sua massa molecular, número de pontes dissulfeto,
localização subcelular e estrutura primária. São elas: família das cistatinas I , cistatinas II e kininogenios
(WALSH & STRICKLAND, 1993). Assim como os inibidores de serino-proteinases, as cistatinas se ligam
reversivelmente às proteinases. Através de estudos de cristalografia (BODE et al., 1988) determinou-se que essas
proteínas são formadas por uma longa α-hélice central envolvida por cinco folhas β-antiparalelas. Na
extremidade das folhas β, uma alça rígida em forma de grampo, formada pela seqüência altamente conservada
em todas as cistatinas (QVVAG ou seqüência similar) é exposta interações no subsítio S2 parecem fortalecer
consideravelmente o complexo (BODE & HUBER, 1992). Várias pontes de hidrogênio são estabelecidas e a
ligação é canônica, ou seja, ocorre de maneira similar à ligação do substrato à proteinase (DRENTH et al.,
1976).
Em plantas, as cistatinas de arroz (oryzacistatinas) são as mais bem caracterizadas. A partir da
sequência genômica, essas proteínas foram inicialmente consideradas como pertencentes à família das cistatinas
II, apesar de não possuírem pontes dissulfeto ou resíduos de cisteína. Entretanto, a organização genômica das
oryzacistatinas e de outras cistatinas, como a do milho, diferem grandemente da organização das cistatinas
animais (KONDO et al., 1991 & BROW et al., 1997). Elas podem também, ser distinguidas por serem proteínas
de cadeia única, já que não contêm resíduos de cisteína para formar pontes dissulfeto. Todos esses dados
suportaram a hipótese de que as cistatinas de plantas deveriam ser classificadas dentro de uma família individual:
as fitocistatinas (ABE et al., 1987). Muitas fitocistatinas têm suas seqüências de aminoácidos conhecidas. Entre
elas estão as oryzacistatinas I e II (ABE et al., 1991), a cistatina de feijão-de-corda (FERNANDES et al.,1993), a
do fruto abacate (KIMURA et al., 1995) e a do milho (ABE et al., 1991). O nível de identidade de aminoácidos
entre cistatinas de sementes e de frutos de diferentes espécies de plantas é alto, o que sugere uma função
conservada para estas proteínas (KIMURA et al.,1995).
14
Atualmente, a função de defesa das fitocistatinas é bem aceita e baseia-se na sua capacidade de inibir, in
vitro e in vivo proteinases de insetos-praga, como coleópteros, e proteinases de nematóides (URWIN et al., 1995,
URWIN et al., 1998). Um aumento no nível de resistência de plantas transgênicas expressando fitocistatinas e
outros inibidores de proteinases é bem documentado (KURODA et al., 1996, URWIN et al., 1995, URWIN et
al., 1998, JOUANIN et al., 1998). Outro fato que suporta a afirmativa de que as inibidores de proteinases estão
envolvidos nos mecanismos de defesas de plantas é a indução desses inibidores por injúria e/ou metil jasmonato,
o que foi verificado em folhas de tomateiro e de soja (BOTTELA et al., 1996). Jasmonatos são moléculas
octadecanóides envolvidas em vias de sinalização, e representam um dos hormônios não-tradicionais de plantas,
os quais desempenham diversas funções, incluindo função de defesa de plantas contra o ataque de fungos e
insetos (Randeep et al., 2000). A síntese de cistatinas, além de induzida por estresse biótico, também pode ser
induzida por estresse abiótico, como um sistema geral de resposta, como foi observado em castanheira (Castanea
sativa). Provavelmente, este sistema de defesa deve ser mediado por diferentes hormônios, como observado em
plantas herbáceas, onde esse sistema é mediado por jasmonato ou por ácido abscíssico (MOONS et al., 1997).
O potencial biotecnológico desses inibidores na obtenção de plantas resistentes é devido a sua
capacidade de reduzirem ou impedirem a atividade de enzimas digestivas, causando a morte e/ou redução de
desenvolvimento larval. Entretanto, a proteção eficiente contra insetos em plantas transformadas demanda que os
mesmos sejam acumulados em células vegetais em um nível maior do que em plantas não transformadas
(AUGUSTYNIAK et al., 1997).
Em 1987, Hilder et al. obtiveram a primeira planta transgênica de tabaco expressando o inibidor de
proteinase serínica de feijão-de-corda, Vigna unguiculata. Estas plantas, que são naturalmente susceptíveis ao
inseto Heliothis virescens, adquiriram altos níveis de resistência ao mesmo. Estudos subsequentes mostraram que
estas plantas também eram resistentes aos insetos Lacanobia oleracea e Otiorhynchus sulcatus (GATEHOUSE
& GATEHOUSE, 1998). Desde estão, outras plantas de interesse comercial foram transformadas com genes de
inibidores de proteinases, apresentando resistência a pragas (URWIN et al., 1995; JOUANIN et al., 1998;
GATEHOUSE & GATEHOUSE, 1998). Entretanto, apesar de plantas transgênicas contendo genes para
inibidores de proteinases apresentarem um efeito letal e/ou de retardamento do desenvolvimento larval, a
possibilidade de surgimento de quebra de resistência é ainda um fator em discussão (GATEHOUSE et al., 1999).
Essa quebra de resistência pode ocorrer se, por exemplo, alguns insetos aumentarem o nível de expressão de
proteinases em resposta à ingestão crônica de inibidores de proteinases, como foi observado em Helicoverpa zea
e Lymantria díspar, os quais aumentaram o nível de expressão de proteinases do tipo tripsina ao alimentarem-se
de plantas de repolho contendo inibidores de tripsina (BROADWAY, 1995). Também é possível que a ingestão
de inibidores cause a indução de novas proteinases ‘insensíveis’ ao inibidor, fato que foi observado com o
lepidóptero Spodoptera exígua (JONGSMA et al., 1995). Estas mudanças nas enzimas proteolíticas do fluido
intestinal de insetos foram explicadas a nível molecular por BROW et al., 1997, os quais demonstraram que a
ingestão de inibidor de tripsina de soja (SKTI) por larvas de H. armigera causa variações na expressão de genes
da família das proteases serínicas. Enquanto alguns mRNAs que codificam para um tipo de proteinase serínica
têm seu nível aumentado, como resultado da ingestão do SKTI, outros diminuem, resultando em uma variação
das proporções relativas de diferentes proteinases, bem como na indução de novas proteinases ‘insensitivas’ ao
SKTI.
Considerando a alta complexidade da interação proteinase/inibidor no sistema hospedeiro-praga e a
diversidade das enzimas proteolíticas usadas pelas pragas e patógenos para hidrolizar enzimas digestivas ou para
clivar ligações peptídicas em processos mais específicos, a escolha de um apropriado inibidor ou set de
inibidores representa um determinante primário no sucesso de qualquer estratégia de controle de pragas baseada
no uso de inibidores de proteinases. Desta forma, o uso de genes que codificam inibidores de enzimas digestivas
para a transformação de plantas, com o intuito de controlar o ataque de pragas, representa uma estratégia
bastante promissora, desde que estes inibidores sejam selecionados adequadamente para a(s) especificas
proteinase(s) das pragas de interesse. O conhecimento das proteinases da praga de interesse é extremamente
importante, muitas vezes é necessário o uso de combinações de dois ou mais inibidores ou mesmo combinação
de inibidores com outras proteínas que induzem estresse ou inibem o crescimento dos insetos a serem
controlados, para tentar evitar uma rápida quebra de resistência.
Trabalhos recentes obtidos pelo nosso grupo no Cenargen mostraram o potencial de alguns inibidores
serino-proteinases sobre larvas e adulto insetos do bicudo do algodoeiro, através de bioensaios conduzidos, com
maior enfoque para o efeito de inibidores de enzimas sobre a oviposição, eclosão e sobrevivência de larvas.
Através de análise bioquímica demonstrou-se que as proteinases digestivas do bicudo do algodoeiro apresentam
os quatro tipos básicos de proteinases, sendo predominante as serino-proteinases (FRANCO et al., 2003).
Resultados preliminares têm evidenciado que em larvas do bicudo a atividade digestiva da tripsina é alta,
enquanto que, em adultos a maior atividade é de quimotripsina (FRANCO et al., 2003). O inibidor de tripsina do
tipo Kunitz proveniente de soja (SKTI), purificado através de coluna de fase reversa de HPLC (C18-TP) mostrou
atividade in vitro tanto contra proteinases digestivas de larvas quanto de insetos adultos (FRANCO et al., 2003).
Resultados semelhantes foram observados com o inibidor do tipo Bowman-Birk de caupi (BTCI). Este inibidor
15
apresentou atividade tanto contra as proteinases digestivas do tipo tripsina quanto do tipo quimotripsina de larvas
de bicudo.Ambos inibidores, SKTI e o BTCI, foram então colocados em dieta artificial para testar o seu
potencial biotecnológico contra o bicudo do algodoeiro. O inibidor SKTI, na concentração de 500 mM, mostrou
uma mortalidade de 60% e uma redução do peso larval de aproximadamente 65%. Além disso, severas
deformidades em larvas, pulpas e insetos foram observadas (Fig 2). Por outro lado, o inibidor BTCI na
concentração de 50 mM apresentou uma alta taxa de mortalidade, mostrando ser, provavelmente, mais efetivo
que o inibidor SKTI.
O efeito desses inibidores sobre a oviposição das fêmeas do bicudo utilizando dieta artificial e o próprio
botão floral. Mostrou uma redução na ovoposição em 47% quando adultos foram alimentados com botões florais
contendo SKTI. A produção de ovos/dia também foi reduzida a 50%. O ciclo de oviposição foi de
aproximadamente 57 dias; em ambos tratamentos com dieta artificial a distribuição de ovos durante a oviposição
apresentou pequena variação. O efeito do inibidor também se fez notar quando do contato do SKTI durante 15
minutos na membrana do ovo, o que interferiu significativamente na eclosão das larvas. A redução na eclosão foi
de 59% em relação ao controle, após 96 H de incubação. Com relação à viabilidade de larvas neonatas
alimentadas com dieta artificial contendo SKTI, verificou-se que o risco relativo de mortalidade foi de 1,58%
após 96 H de incubação. O tempo letal desse inibidor, LT (95%), foi estimado em 98 H (IC95%: 55; 122),
indicando que o maior efeito na mortalidade das larvas alimentadas com dieta contendo SKTI é visto logo nos
primeiros 4 dias, quando as larvas estão ainda no 2º ínstar. Isso é muito importante no aspecto do controle da
praga visto que, nessa fase, o tamanho da larva não provoca quedas acentuadas do botão floral. O efeito inibidor
do SKTI sobre a fisiologia das larvas se fez notar através do retardo no desenvolvimento e baixa mobilidade das
mesmas no período mencionado.
Fig 2- Efeito do SKTI sobre as diferentes fases de desenvolvimento do bicudo do
algodoeiro.
Com o objetivo de introduzir o gene desse inibidor em plantas transgênicas de algodão, testes no campo
foram feitos, com o objetivo de verificar a influência do SKTI na redução da abscisão dos frutos do algodoeiro.
Para tanto, inoculou-se ovos nos botões previamente imersos em solução de SKTI (500 mM). Os resultados
mostraram que a queda dos frutos foi reduzida em 40% em relação ao controle, que mostrou alto percentual de
queda (73% dos 60 botões testados). O comportamento fisiológico das larvas foi idêntico ao observado no ensaio
com dieta artificial.
Inibidores de -Amilase de Plantas
Os inibidores de -amilases são encontrados principalmente em sementes (FENG et al, 1996; GROSSI
DE SÁ et al, 1997), enquanto que os inibidores de proteinases estão presentes, não apenas nas sementes, mas
também nos frutos, folhas e tubérculos (BODE & HUBER, 2000). Entre os inibidores de -amilases mais
estudados estão os inibidores de trigo (Triticum aestivum), denominados 0.19, 0.53 e 0.28 (FENG et al., 1996) e
os inibidores de -amilases de sementes de feijão comum (P. vulgaris) denominados, -AI-1 e AI-2.
Os inibidores protéicos de α-amilases provenientes do trigo são muito abundantes no endosperma,
representando uma fração substancial das albuminas e globulinas (FENG et al., 1996). Entre os inibidores de αamilase encontrados neste cereal, observa-se diferentes especificidades contra as α-amilases de diferentes fontes.
Um dos inibidores de -amilases do trigo mais estudado é o inibidor dimérico 0.19, ativo contra α-amilases dos
insetos T. molitor, Sitophilus oryzae, Tribolium castaneum, C. maculatus, Z. subfasciatus e A. obtectus (FENG et
al., 1996, FRANCO et al., 2000). Além do inibidor 0.19, o inibidor 0.53, também dimérico, é ativo contra a -
16
amilase de T. molitor e -amilase dos bruquídeos acima citados (FRANCO et al., 2000). Em adição, muitos
estudos têm sido feitos com o objetivo de se compreender melhor as propriedades do inibidor monomérico 0.28,
ativo contra a α-amilase de T. molitor – TMA. Estudos de modelagem molecular vêm sendo utilizados para
elucidar questões da especificidade dos inibidores provenientes de trigo em relação as -amilases. Utilizando-se
do complexo inibidor/enzima (RBI/TMA) disponível no PDB (Protein Data Bank), foi sugerido que os
inibidores de trigo com um um longo loop C-terminal, tal como 0.19, são capazes de interagir com o profundo
pocket no sítio ativo presente em α-amilases de mamíferos. Entretanto, inibidores como o inibidor 0.53, WRP25
e WRP26, são incapazes de inibir as -amilases de mamíferos, porque apresentam este mesmo loop encurtado
(PNP, ao invés de VVDA). Este fato os capacita a apenas inibir com eficiência as α-amilases de inseto, que
apresentam um pocket muito menos profundo. Em adição, nos inibidores específicos para as insetos, o loop N-terminal apresenta fortes cargas negativas (Asp 47), capazes de causar uma redução na interação
entre os inibidores e as enzimas de mamíferos, que apresentam um pocket com resíduos carregados
negativamente. Em enzimas de insetos, este problema não existe, pois seus sítios ativos não possuem estes
resíduos onde as cadeias laterais são carregadas negativamente. Baseado nestes dados, pode-se sugerir que
alguns aminoácidos, bem como algumas regiões na estrutura dos diferentes inibidores de trigo (0.53. 0.19,
WRP25, WRP26), seriam responsáveis pela interação e pela especificidade dos mesmos a determinadas amilases (FRANCO et al, 2000).
Os inibidores de -amilases presentes em sementes de feijão fazem parte de uma família de
proteínas de defesa que inclui adicionamente as fitohemaglutininas e as arcelinas. Assim como outras proteínas
de defesa, o inibidor de -amilase pode ser codificado por mais de um gene. Atualmente, alguns inibidores de
-amilases presentes em sementes de P.vulgaris foram caracterizados. Entre estes,os dois inibidores de αamilases mais conhecidos são o α-AI-1 e o α-AI-2, , os quais diferem em suas especificidades contra diferentes
α-amilases. Enquanto o α-AI-1 inibe fortemente a α-amilase de pâncreas de porco (PPA) bem como as αamilases de C. maculatus e de C. chinensis (Kasahara et al., 1996), o inibidor α-AI-2 inibe somente a α-amilase
do Z. subfasciatus (ZSA) (GROSSI DE SÁ et al., 1997; GROSSI DE SÁ & CHRISPEELS, 1997). Nenhum
destes inibidores, presentes em sementes de feijão, teve efeito inibitório contra a α-amilase do bruquídeo, A.
obtectus . O mecanismo de interação e especificidade dos complexos inibidores/-amilases, ainda não está
completamente elucidado, porém alguns avanços tem sido demonstrados nos últimos anos. Sabe-se que a
formação do complexo é dependente de tempo e pH e, estudos recentes demonstraram que o α-AI-1 não atua
competitivamente. Para melhor compreender a especificidade de interações desses complexos, estudos
envolvendo estruturas moleculares vêm sendo realizados por diferentes grupos. Utilizando-se de dados
cristalográficos do complexo (α-AI-1/PPA) (BOMPARD-GILLES et al., 1996) e da -amilase TMA, bem como
através de Modelagem Molecular, foi possível a construção de modelos computacionais que simulam a formação
de complexos encontrados na natureza, tal como o inibidor α-AI-2 e a α-amilase de Z. subfasciatus (α-AI2/ZSA), assim como a simulação de complexos artificiais (α-AI-2/PPA e α-AI-1/ZSA) (DA SILVA et al., 2000).
A construção e expressão destes mutantes, baseados nos modelos computacionais, poderá determinar os motivos
envolvidos na especificidade de interação entre inibidores/enzimas, e poderão oferecer subsídios para o desenho
de inibidores mutantes com a especificidade desejada.
O grande potencial biotecnológico dos inibidores proteicos foi demonstrado quando os genes que
codificam inibidores de α-amilases foram introduzidos em culturas econômicamente importantes, visando o
aumento da resistência destas, a diferentes insetos. Ervilhas transformadas com o gene que codifica para o
inibidor α-AI-1 se apresentaram completamente resistentes ao besouro da ervilha Bruchus pisorum, um inseto
que danifica tanto as ervilhas armazenadas (SHADE et al., 1994; SCHROEDER et al., 1995) quanto em
condições de campo (Morton et al., 2000). Os ovos eclodem e as larvas penetram na vagem, se desenvolvendo
na semente até emergirem como inseto adulto. Em sementes transgênicas de ervilhas, contendo
aproximadamente 1,0 % de α-AI-1, as larvas não conseguem se desenvolver, morrendo no 1 o ou 2o ínstar de
desnvolvimento (SCHROEDER et al., 1995). Utilizando-se esse mesmo gene, Ishimoto et al. (1996)
demonstraram que plantas transgênicas de feijão azuki, são totalmente resistentes aos bruquídeos C. maculatus,
C. analis e C. chinensis, levando ao não desenvolvimento e a morte de larvas. Posteriormente, Puztai et al.
(1999), em experimentos para avaliação alimentar animal, demostraram que estas ervilhas transgênicas,
expressando o α-AI-1, não apresentam redução significativa na digestão e na absorção de nutrientes, quando
adicionadas na dieta de ratos. Esses dados estão em favor, apesar da atual polêmica, de que leguminosas
transgênicas, contendo inibidores de -amilases, podem ser totalmente seguras para a alimentação, desde que as
sementes sejam cozidas ou processadas antes do consumo por seres humanos. Uma vez desnaturados, estes
inibidores não funcionam como anti-nutrientes, mas sim como fonte de aminoácidos, da mesma forma que as
proteínas de armazenamento.
17
DNA shuffling
\
DNA shuffling é um processo prático na evolução molecular, usando a recombinação para acelerar,
bruscamente, o desenvolvimento de genes melhorados com aplicações comerciais. Essa tecnologia tem sido
significativamente utilizada nos últimos anos, estendendo sua aplicação na indústria farmacêutica, terapia gênica,
vacina, transgeneses, entre outras. Entretanto, a aplicação mais frequente envolve o desenvolvimento de enzimas
com cinética e especificidade melhoradas. A técnica vem sendo aplicada diretamente aos problemas da
agricultura, com recentes aplicações na geração de novos carotenóides, aumento da detoxificação por herbicida e
o melhoramento de genes envolvidos na resistência a insetos (LASSNER & BEDBROOCK, 2001).
A técnica de DNA shuffling desenvolvida por STEMMER (1994) simula a recombinação natural de genes
através da recombinação homóloga in vitro de DNA, associada a introdução de mutações pontuais controladas e
seleção com o objetivo de obter genes melhorados a uma determinada característica de interesse.
Várias modificações foram introduzidas, cuja recombinação in vitro de genes homólogos pode ser obtido por
diferentes métodos (STEMMER, 1994; ZHAO et al., 1998; VOLKOV et al., 2000; COCO et al., 2001). O
produto final é uma biblioteca de genes quiméricos, que contém informações de sequências de um ou mais genes
parentais. Essa família de genes recombinados representa, assim, uma poderosa ferramenta na geração de novas
sequências que codificam proteínas com potencial e características de interesse.
Phage display
A habilidade em se construir bibliotecas de proteínas e peptídeos com grande diversidade
molecular e selecionar novas moléculas com propriedades desejadas, fez do phage display uma tecnologia
aplicável na solução de vários problemas biológicos. Atualmente, foram expostas muitas proteínas tais como
peptídeos e domínios de proteínas sucesso em partículas de fagos M13 para uma variedade de propósitos (KAY
et al., 1996; LIU et al., 2003). As bibliotecas do tipo phage display são utilizadas, em grande escala, na
descoberta de novas drogas na indústria farmacêutica, criação de anticorpos catalíticos, no isolamento de ligantes
receptor-específico, na identificação de determinantes antigênicos e em estudos de interação proteína-DNA
(WONG & ROBERTSON, 1998; GAO et al., 2003; LIU et al., 2003). Outra possibilidade do uso das bibliotecas
foi descrita por HARPER et al. (1999), os quais desenvolveram livrarias semi-sintéticas servindo como fonte de
reagentes no diagnóstico de doenças de plantas causadas por vírus. A utilização de bibliotecas do tipo phage
display como ferramenta para redesenhar proteínas, consiste na fusão de uma proteína de interesse com a
proteína da capa do fago (proteínas pIII ou pVIII), permitindo o estudo físico-químico e bioquímico da proteína
quimera resultante. Vários exemplos podem ser citados, entre eles, proteinases de insetos foram exploradas
inicialmente fusionando tripsina a proteínas da capa do fago (proteinas pIII ou pVIII), o que permitiu o estudo de
estabilidade, eficiência e propriedade catalítica da tripsina quimera resultante (COREY et al., 1993). O inibidor
de proteinase serínico de batata foi exibido funcionalmente na superfície de partículas de fagos e a seleção por
“biopanning” enriqueceu uma população de fagos com domínios funcionais II de uma população misturada com
domínios variantes não-funcionais transformados (JONSGMA et al., 1995). A cistatina de clara de ovo, um
inibidor de proteinase cisteínica de baixo peso molecular, foi exibida funcionalmente, permanecendo ativa no
sistema de fagos recombinantes (TANAKA et al., 1995). Similarmente, foram exibidas duas isoformas de
cistatinas de soja em partículas de fagos. Estas cistatinas, denominadas scN e scL, contém 70% de identidade, no
entanto a scN é o inibidor mais potente da papaina, peptidoidrolase, vicilina e de proteinases intestinal de inseto,
em comparação à scL (ZHAO et al., 1996). Quando estas cistatinas foram exibidas em partículas de fagos, a
afinidade de ligação da scN à papaína foi substancialmente maior que a da scL. Além disso, scN inibiu
substancialmente o crescimento e o desenvolvimento do caruncho do feijão-de-corda (Callosobruchus
maculatus) em ensaios com alimentação artificial, enquanto que scL foi essencialmente inativa como inseticida.
A seleção destas cistatinas de soja através de “biopanning” contra papaína resultou no aumento de 200-1000
vezes a afinidade da scN em relação à scL., sugerindo que a ligação dessas cistatinas selecionadas em bibliotecas
do tipo phage display pode ser usada para selecionar variantes com maior atividade inseticida (HISASHI et al.,
1998).
Transformação de Plantas
As técnicas avançadas em biologia molecular, visando a prospecção de genes e a obtenção de
resistência de plantas de interesse contra pragas, têm o potencial de superar muitas das limitações típicas dos
métodos de controle atuais, além das limitações dos métodos clássicos de melhoramento. Diferentes estratégias
vêm sendo utilizadas para desenvolver plantas transgênicas resistentes ao ataque de insetos-praga. Entre essas
estratégias, estão o uso de toxinas Bt, de inibidores de enzimas hidrolíticas digestivas (α-amilases e proteinases),
de lectinas, de proteínas para genes de resistência (genes R), Colesterol oxidase,entre outras (PURCELL et al.,
1993, CORDEIRO AND GROSSI DE SÁ, 1999, CARLINI & GROSSI DE SA, 20012. Além do uso dessas
proteínas, outras estratégias estão sendo desenvolvidas e permitindo selecionar genes mutantes dessas proteínas,
18
mais ativos e específicos para as pragas de interesse, bem como para quaisquer outras pragas. Essas estratégias
envolvem o uso de bibliotecas combinatória de proteínas (inibidores e/ou toxinas) do tipo phage display, as quais
são construídas visando a geração de milhões de variantes de uma proteína que poderão, então, ser selecionadas
para ligantes alvo. Outra estratégia é o uso da pro-região das proteinases como inibidores de sua enzima cognata
matura (TAYLOR & LEE,1997). Nos últimos anos, as proteinases digestivas dos insetos têm sido forte
candidatos alvo para o controle de pragas porque são facilmente acessiveis ao material da planta ingerido.
Plantas de interesse expressando proteínas que podem seletivamente inibir as enzimas digestivas do instestino de
uma praga particular, mas não de outros artropodos ou dos consumidores (homem/mamíferos), poderiam
proporcionar um caminho para a redução no uso de pesticidas químicos em plantações de culturas e/ou em
sistemas de estocagem.
A transformação de plantas, com genes de defesa, codificantes para tais proteínas, visando a obtenção
de variedades resistentes a pragas tem sido alvo de muitos estudos nos últimos anos (BRASILEIRO, 2001).
Genes para diferentes proteínas foram introduzidos em plantas e, diferentes plantas transgênicas resistentes a
insetos foram geradas (GATEHOUSE & GATEHOUSE,1998). Como mencionado previamente, os primeiros
resultados de transferência de genes de Bt em planta foram realizados em plantas defumo e tomate em 1987
(VAECK et al., 1987; BARTON et al., 1987; FISCHHOFF et al., 1987). Desde então, vários genes cry têm sido
introduzidos em diversas espécies de plantas como algodão, arroz, milho, batata, soja, canola e outras. Os
primeiros trabalhos relatam níveis muito baixos de expressão dos genes cry (menos que 0,001% de proteínas
solúveis da folha), entretanto, com a adoção de novas técnicas de biologia molecular, como construção e
expressão de genes parcial ou totalmente sintéticos, níveis mais altos de expressão (0,02-1%) foram obtidos
(JOUANIN et al., 1998). Em 1995, foram aprovadas para venda nos EUA as primeiras plantas transgênicas:
Milho expressando a toxina Cry1Ab (MximizerTM da Novartis), para o controle de Ostrinia nubilalis; algodão
expressando a toxina Cry1Ac (BollgardTM da Monsanto), para o controle de Helicoverpa spp.; e batata
expressando Cry3A (NewleafTM da Monsanto) para o controle de Leptinotarsa decemlineata. Em 1996, estas
primeiras variedades foram comercializadas (JOUANIN et al., 1998). Entretanto, a existência de um método
eficiente e reprodutível de transformação é uma necessidade "sine qua non" para a introdução e monitoramento
da expressão de um gene em plantas. Uma das limitações para a transformação do algodoeiro reside no fato de
que há pouco conhecimento na cultura de células e tecidos destas plantas. Plantas transgênicas de algodão foram
obtidas utilizando-se o sistema de Agrobacterium (UMBECK et al., 1987). Entretanto essa metodologia, além de
ser restrita a poucas variedades (McCABE & MARTINELL, 1993), não é uma técnica ainda bem eficiente..
Outra possibilidade é a transformação do meristema apical e indução de multibrotação, desencadeada pelo
cultivo dos embriões em altas doses de citocinina, num sistema de transformação similar ao de feijão (ARAGÃO
et al., 1996). Esse sistema é extremamente laborioso e com eficiência ainda aquém do aceitável, além de exigir
um conhecimento prévio de cada cultivar, tanto a nível morfológico quanto de cultura de tecidos. Um dos
principais problemas no emprego de meristemas apicais com tecidos alvo para os sistemas de biobalísticas é a
dificuldade de seleção das células transformadas na região meristemática apical (McCABE & MARTINELL,
1993). Recentemente foi desenvolvido pelo grupo do Dr. Ni Wanchao do Institute of Agrobiological Genetics &
Physiology em Nanjing, China, um sistema que possibilita a transformação do algodoeiro com bastante
eficiência permitindo a obtenção de plantas de algodoeiro transgênicos, com uma freqüência já aceitável para o
desenvolvimento de novas variedades. Neste sentido e com o intuíto de trazer está tecnologia um membro do
nosso grupo encontra-se atualmente realizando um estágio Pré-doutoral, sob orientação do Dr. Ni Wanchao.
19
MATERIAL E MÉTODOS
Criação Massal de Anthonomus grandis
A metodologia de criação massal do inseto, foi desenvolvida por pesquisadores do Centro de
Cooperation Internationale en Recherche Agronomique pour le Development-Montpellier (CIRAD) e
modificada na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, que atualmente conta com a criação massal
estabelecida.
Os ovos serão espalhados em dieta artificial à base de extrato de algodão e ao eclodir, as larvas
desenvolver-se-ão até a emergência de adultos. Estes serão coletados e transferidos em gaiolas para copulação e
oviposição, sendo que durante esta fase os insetos adultos serão alimentados com a mesma dieta e os ovos
coletados, esterilizados e espalhados novamente na dieta (MONNERAT et al., 2000).
Criação da lagarta do cartucho do milho (Spodoptera frugiperda)
A criação da lagarta do cartucho do milho está estabelecida desde 1989 no laboratório de
Bioecologia e Semioquímicos. Estas lagartas são criadas em dita artificial. Os ovos são depositados em papel de
filtro, esterilizados e colocados em dieta artificial. Após a eclosão, as larvas se alimentam da dieta e após
completarem o ciclo larval, as pupas são coletadas e colocadas em gaiolas onde copulam e ovipositam no papel.
Isolamento de Estirpes de B. thuringiensis
Coletar-se larvas ou insetos doentes de de bicudo do algodoeiro em campo, que serão
homogeneizados assepticamente em Triptona 0,1% estéril e plaqueados em meio de cultivo específico para o
crescimento de B. thuringiensis. As colônias serão isoladas e submetidas a bioensaios contra o bicudo. As
estirpes de B. thuringiensis eficazes contra o bicudo e lagarta do cartucho do milho terão seus genes clonados
através de técnicas de PCR (RT-PCR, TAIL-PCR) e serão expressos em sistema homólogo ou heterólogo para
utilização em bioensaios e confirmação da toxicidade.
Bioensaios
Bioensaios para avaliar o impacto das estirpes de B. thuringiensis e de genes previamente selecionados e
expressos, sobre a biologia do bicudo e das lagartas (lagarta do cartucho do milho, lagarta desfoleadoras) serão
conduzidos. As toxinas Bt serão incorporados à dieta artificial para criação massal do bicudo do algodoeiro. O
desenvolvimento e mortalidade das larvas serão acompanhados durante todo o ciclo de cada inseto.
Construção de Biblioteca Combinatória de Toxinas Bt
Dois (2 ) genes codificadores para proteínas Cry, sendo uma proteína Cry3Aa e outro, denominado
cry8Bc, isolado no nosso Laboratório de Interação Molecular Planta-Praga (EMBRAPA-Cenargen) foram
utilizados para construÇão da biblioteca recombinatória de toxinas Bt..

DNA shuffling
A metodologia consiste na recombinação in vitro de genes homólogos, realizada através de diferentes
métodos (STEMMER 1994; ZHAO et al., 1998; VOLKOV et al., 2000; COCO et al., 2001). O produto é uma
biblioteca de genes quiméricos, que contém informação de sequências de um ou mais dos genes parentais,
representando uma poderosa ferramenta na geração de novas sequências. A metodologia a ser utilizada foi
descrita por PATTEN et al. (1997) e LUTZ et al. (2001), em que fragmentos randômicos de genes relacionados
serão gerados com a enzima DNAse I. Após desnaturação, os fragmentos de diferentes tamanhos hibridizarão
para formar misturas de diferentes genes e amplificados através da técnica de PCR. Os milhares de genes
gerados serão clonados em bacteriófagos e, através da técnica de phage display construir-se-á uma biblioteca
combinatória e disponibilizada para seleção da proteína alvo.

Phage display
Phage-display é uma tecnologia que surgiu em 1985 para estudar interações macromoleculares e a
exposição de proteínas e peptídeos na superfície de fagos filamentosos (SMITH, 1985). O kit "Recombinant
Phage/Antibody System" será empregado para a expressão das toxinas Bt como proteínas de fusão na superfície
de fagos filamentosos. As partículas do fago serão multiplicadas em bactérias E. coli TG1 e o empacotamento
dos fagomídeos será obtido empregando-se o bacteriófago M13K07. Os fagos de fusão serão recuperados do
meio de cultivo da bactéria e empregados nas análises de interação com receptores para a toxina Bt presente em
cultivo de células intestinais do bicudo do algodoeiro (KAY et al., 1996).
20
Sequenciamento dos Genes Selecionados
O sequenciamento dos fragmentos de DNA de interesse ou dos genes selecionados serão
realizados em sequenciador automático. As sequências de interesse serão comparadas com as já existentes em
base de dados disponíveis, para estudos de homologia. Com estes resultados será determinado a provável
sequência de aminoácidos das proteínas codificadas pelo gene obtido, seguindo-se com a modelagem molecular
da proteína.
Expressão dos Genes Selecionados em Sistemas de Células (E. coli).
Os genes selecionados de toxinas Bt melhoradas serão expressos em E. coli utilizando vetor de expressão
pALTER®-Ex1 (PROMEGA), Fig 3.
Fig 3: Mapa detalhado do vetor de expressão pALTER®-Ex1 (PROMEGA).
Construção de Vetores e Transformação de Plantas de Algodão
Os genes selecionados de toxinas Bt melhoradas serão inseridos em vetores de expressão em
plantas contendo contendo um promotor específico para botão floral e a transformação de algodão cultivar cedro
será conduzida por Agrobacterium e via tubo poliníco (CHEN et al., 1998).
RECURSOS FÍSICO
O projeto aqui proposto é de natureza multidisciplinar e envolve a utilização de conceitos e técnicas de
diversas áreas: Biologia molecular (clonagem, caracterização e expressão de genes), bioquímica (purificação e
caracterização de proteínas), Biologia celular (cultura de tecidos e transformação de plantas) e Bacteriologia
(manipulação e caracterização de microorganismos). Desta forma o projeto envolve vários laboratórios de
diferentes áreas da Embrapa-Recursos Genéticos e Biotecnologia, que são: (1) O “Laboratório de Interação
Molecular Planta-Pragas”, da área de biotecnologia e coordenado pela Dra. Fátima Grossi (coordenadora geral
do projeto), que ficara a cargo da clonagem, caracterização e expressão de genes; (2) O “Laboratório de
Bacteriologia”, da área de controle biológico e coordenado pela Dra. Rose Monnerat, que será responsável pelo
fornecimento das estirpes de Bt e execução dos bioensaios; (3) E o “Laboratório de Transferência e Expressão de
Genes” .
De uma maneira geral a estrutura física e operacional dos laboratórios envolvidos é de excelente
qualidade, não sendo necessário para o desenvolvimento do projeto a aquisição imediata de equipamentos. A
seguir são listados alguns equipamentos disponíveis (contrapartida), imprescindíveis ao desenvolvimento do
projeto, e o(s) seu(s) respectivo(s) uso(s):
1-Termociclador para PCR – Clonagem de genes; análise das plantas transformadas.
2-Fonte de eletroforese (alta voltagem) - Análise de proteínas e DNA.
3-Sistema de eletroforese horizontal – Análise de DNA.
4-Sistema de eletroforese vertical – Análise de proteínas e DNA.
21
5-Transiluminador UV – Análise de DNA.
6-Incubadora orbital tipo “shaker” – Crescimento de microorganismos.
7-Incubadora estática – Crescimento de microorganismos.
8-Microcentrífuga – centrifugação (sedimentação) de amostras em pequeno volume.
9-Centrifuga refrigerada Sorval– centrifugação (sedimentação) de amostras em grande volume.
10-Freezer - 80oC – Estocagem de reagentes e material biológico em longo prazo.
11-Spectrofotometro – Quantificação de DNA e proteínas.
12-Balança analítica – Pesagem de reagentes e materiais; preparo de soluções.
13-Microscópio ótico binocular – Análise e contagem de culturas celulares.
14-Microscópio estereoscópico (Lupa) – Manipulação e dissecção de insetos.
15-Banho de temperatura regulável – Realização de reações químicas diversas.
16-Medidor de pH – Preparo de soluções.
17-Agitador magnético – Preparo de soluções.
18-Forno de hibridização – Análise de DNA através de hibridização radioativa; caracterização dos genes
clonados e da organização dos transgenes nas plantas transformadas.
19-Cintilador (Contador de Radioatividade) – Contagem de radioatividade; Análise de DNA através de
hibridização radioativa.
20-Eletroporador – Introdução de DNA exógeno em culturas de células; transformação de microorganismos.
21-Seqüenciador automático de DNA – Análise de DNA.
22-Secador a vácuo “Speed Vac” – Manipulação de amostras e soluções.
23-Ultra-sonicador – Preparo de amostras; lise da parede celular de microorganismos.
24-Sistema com transiluminador p/ análise de imagens – Análise de DNA e proteínas.
25-Microcomputador e impressora – Armazenamento e processamento de dados; acesso à internet; análise de
DNA e proteínas.
26-Câmara de fluxo laminar (capela) – Manipulação de microorganismos.
27-Geladeiras – Estocagem de reagente e material biológico em curto prazo.
28-“Frezers” – Estocagem de reagente e material biológico em curto prazo.
29-Autoclave vertical – Esterilização de reagentes e materiais.
30-Forno de Microondas – Preparo de soluções.
31-Sequenciuador de DNA
32- Sequenciador de proteinas.
RECURSOS HUMANOS
A equipe é composta por pesquisadores da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia e EmbrapaAlgodão, alunos da pós-graduação em biologia molecular da universidade de Brasília (doutorado e mestrado, em
Biotecnologia das Faculdades integradas da Católica de Brasília (mestrado) e estudantes de graduação dos cursos
de agronomia e biologia da Universidade de Brasília.
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Nome
CPF
Formação acadêmica
Maria Fatima
Grossi de Sa
Rose Gomes
Monnerat Solon
de Pontes
Wagner Lucena
151.364.691-53
PhD-Biologia Molecular
512.803.701-06
PhD-Controle Biológico
88205479453
Francisco José
Lima Aragão
Roseane
Cavalcanti dos
Santos
João Aguiar
Nogueira Batista
Edson L. Z.
Figueira
Octávio Luiz
Franco
Osmundo
Brilhante de
Oliveira Neto
Simoni Campos
Dias
Railene de
Azevedo Pereira
Liziane Maria de
Lima
Rodrigo da
Rocha Fragoso
Mariana T.
Magalhães
EQUIPE TÉCNICA
Área de atuação
Função na
equipe
Coordenação geral do projeto. Construção das Coordenador
bibliotecas combinatórias.
Seleção e caracterização de estirpes de Bt.
Pesquisador
Bioensaios com os genes expressos.
Período
Biólogo
Biologia Molecular
Pesquisador
308.609.971-20
PhD-Biologia Molecular
Transformação de algodão.
174.693.334-87
MsC- Genética e
Bioensaios com as plantas de algodão
melhoramento de Plantas transformadas.
Pesquisador
colaborador
Pesquisador
colaborador
373.755.801-97
PhD-Biologia Molecular
Isolamento de genese Construção de vetores
169798418-58
755.234.003-78
PhD-Ciencias de
Alimentos
PhD-Bioquímica
366.091.023-68
PhD-Biologia Molecular
Seleção de genes mutante para toxinas Bt e
inibidores
Extração e caracterização de proteinases
digestivas. Bioensaios com proteínas
potencialmente entopatogênicas.
Expressão de genes
486.892.486-00
MsC – Fitopatologia
(estudante doutorado)
MsC – Bioquímica
(estudante doutorado)
MsC – Bioquímica
(estudante doutorado)
Agrônomo – Estudante
de mestrado
Agrônomo – Estudante
de graduação
736.927.434-91
737.472.114-53
669.875.631-87
905.464.151-72
Expressão de genes e construção de vetores.
Seleção de mutantes de toxinas Bt.
Seleção de mutantes de toxinas Bt.
transformação
Clonagem e expressão de genes de Bt.
11/03-10/04
%
dedicação
100
11/03-10/04
20
Extração e
caracterização de
proteinases digestivas.
11/03-10/04
30
11/03-10/04
25
Pesquisador
colaborador
Pesquisador
colaborador
Pesquisador
colaborador
11/03-10/04
50
11/03-10/04
50
Pesquisador
colaborador
11/03-10/04
100
Estudante de
doutorado
Estudante de
doutorado
Estudante de
doutorado
Estudante de
mestrado
Estudante de
graduação
11/03-10/04
100
11/03-10/04
50
11/03-10/04
50
1o-2o anos
50
1o-2o anos
100
25
11/03-10/04
23
DECLARAÇÃO
Eu, Patricia Messenberg Guimarães, abaixo assinado, pesquisador III e presidente
do Comitê interno de biossegurança (CIBio) da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
(Cenargen), declaro ao Fundo de Apoio à Cultura do Algodão que a Embrapa –Cenargen é
detentora do certificado de qualidade em biossegurança (CQB) de número 004/96, emitido
pela Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio).
A veracidade desta informação poderá ser verificada no site:
http;/ www.ctnbio.gov.br/ctnbio/defaut.htm.
Nada mais a declarar, subscrevo-me.
Patricia Messenberg Guimarães, PhD
Presidente do CIBio- Cenargen
Embrapa recursos Genéticos e Biotecnologia
[email protected]
Brasília, 09 de setembro de 2003
24
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