DESENVOLVIMENTO DE TÉCNICA DE RT-PCR - PPGBAIP
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS DESENVOLVIMENTO DE TÉCNICA DE RT-PCR EM TEMPO REAL PARA DETECÇÃO DO VIRUS MAYARO (Togaviridae: Alphavirus) ALUÍSIO FERREIRA CELESTINO JÚNIOR Belém-Pará 2013 ALUÍSIO FERREIRA CELESTINO JÚNIOR DESENVOLVIMENTO DE TÉCNICA DE RT-PCR EM TEMPO REAL PARA DETECÇÃO DO VIRUS MAYARO (Togaviridae: Alphavirus) Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários. Orientadora: Profa. Dra. Ana Cecília Ribeiro Cruz Belém-Pará 2013 C392d Celestino Júnior, Aluísio Ferreira Desenvolvimento de técnica de RT-PCR em tempo real para detecção do vírus Mayaro (Togaviridae: Alphavirus) / Aluísio Ferreira Celestino Júnior; orientadora Ana Cecília Ribeiro Cruz, 2013. Tese (Doutorado em Biologia de Agentes infecciosos e parasitários) – Universidade Federal do Pará, Área de Ciências Biológicas, Belém, 2013. 1. Biologia molecular 2. Arbovirus. 3. Teste RT-qPCR. I. Celestino Júnior, Aluísio Ferreira. II. Título. CDD. 20º ed. 595.71 ALUÍSIO FERREIRA CELESTINO JÚNIOR DESENVOLVIMENTO DE TÉCNICA DE RT-PCR EM TEMPO REAL PARA DETECÇÃO DO VIRUS MAYARO (Togaviridae: Alphavirus) Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários. Orientadora: Profa. Dra. Ana Cecília Ribeiro Cruz Laboratório de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas, Instituto Evandro Chagas, MS. Banca Examinadora : Prof. Dr. Ricardo Ishak Laboratório de Virologia, ICB –UFPa Dra. Danielle Barbosa de Almeida Medeiros Laboratório de Arbovirologia do Instituto Evandro Chagas Prof. Dra. Edna Cristina Santos Franco Laboratório de Arbovirologia do Instituto Evandro Chagas Prof. Dr. Nelson Antônio Bailão Ribeiro Laboratório de Biologia Celular, CCBS - UEPA Belém, 10 de outubro de 2013. DEDICATÓRIA A Deus que nos oferece a cada momento seus dons e que nos convida a partilhar. A Léa e Lucas que são sempre motivação para viver com alegria e superar as adversidades com serenidade. ―Ainda que eu fale as línguas dos homens e dos anjos, se não tiver caridade sou apenas um bronze que soa, um címbalo que tange‖ S. Paulo (1Cor, 13, 1) AGRADECIMENTOS Ao Programa de Pós-graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários-BAIP da Universidade Federal do Pará que, em convênio interinstitucional, favoreceu a formação de vários profissionais da Universidade do Estado do Pará, grupo que fizemos parte. Ao Prof. Dr. Ricardo Ishak que esteve à frente do Programa Interinstitucional do BAIP junto a Universidade do Estado do Pará. Profissional de extrema competência técnica e sempre atento à qualidade científica de seus alunos. Incansável estimulador da formação de novos cientistas na Amazônia. A minha orientadora, Dra. Ana Cecília Ribeiro Cruz, exemplo de competência técnica e dignidade humana construídas com sua invejável dedicação e que servem para mim como exemplo de seriedade com os grandes projetos e cuidado com as pequenas coisas. Ao Dr. Pedro Fernando Vasconcelos responsável pelo laboratório de Febres Hemorrágicas do Instituto Evandro Chagas e que permitiu o desenvolvimento deste estudo na SAARB-IEC. Ao MSc. Samir Casseb, profissional de alto gabarito técnico que esteve em vários momentos apontando caminhos metodológicos para o desenvolvimento deste estudo. Profissional que une competência técnica apurada com simplicidade e bom humor raros. A colega Natália do Vale um agradecimento muito especial, uma profissional de alto nível, sempre pronta a contribuir com todos que dela se aproximam o que se repetiu neste trabalho. A MSc. Alessandra Miranda que além de contribuir com parte do produto de sua pesquisa (amostras biológicas originadas de sua pesquisa) mostrou-se sempre muito solícita em contribuir em vários momentos deste trabalho. Aos profissionais pesquisadores do Instituto Evandro Chagas que contribuíram em diferentes fases desta pesquisa, MSc Bruno Tardelli, Dra Edna Cristina Franco, MSc. Gregório Dias, MSc Eliana Silva. A todos colegas do Laboratório de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas do Instituto Evandro Chagas, Alice, Letícia, Jaíne, Tadeu, Natividade e Mari pela convivência, no apoio material ou disponibilidade de espaço físico para realização do estudo. A Sandra Araújo, pelas orientações acerca da estatística deste trabalho. A Universidade do Estado do Pará que propiciou esta oportunidade de crescimento profissional. SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO......................................................................................... 01 1.1- CONSIDERAÇÕES SOBRE ARBOVIROSES............................... 01 1.2- CONSIDERAÇÕES SOBRE O VMAY .......................................... 02 1.3- BIOLOGIA DO VMAY .................................................................... 04 1.4- ECOEPIDEMIOLOGIA ................................................................... 06 1.5- MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS ....................................................... 11 1.6- DIAGNÓSTICO ................................................................................. 15 1.7- PREVENÇÃO .................................................................................... 18 1.8- TRATAMENTO ................................................................................. 18 1.9- OBJETIVOS ...................................................................................... 19 1.9.1 – Objetivo geral..................................................................................... 19 1.9.2 – Objetivos específicos.......................................................................... 19 2. MATERIAL E MÉTODOS...................................................................... 20 2.1- LOCAL DA PESQUISA....................................................................... 20 2.2- SELEÇÃO E PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS...................... 21 2.2.1- Critérios de Inclusão............................................................................. 25 2.2.2- Critérios de Exclusão............................................................................. 25 2.2.3- Seleção de dos Oligonucleotídeos Iniciadores ...................................... 26 2.2.4- Fase Experimental ................................................................................ 27 2.3 - ASPECTOS ÉTICOS ............................................................................. 31 3- RESULTADOS ..................................................................................... ...... 32 4- DISCUSSÃO ................................................................................................ 38 5- CONCLUSÕES ..................................................................................... ...... 43 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................... 44 ANEXOS .......................................................................................................... 50 LISTA DE FIGURAS, QUADROS E TABELAS Pá g Figura 1 - Morfologica do VMAY .............................................................................. 04 Figura 2 – Esquema dos principais componentes do VMAY ...................................... 05 Figura 3 – Representação esquemática da estrutura genômica do VMAY.................. 05 Figura 4 – Distribuição geográfica do VMAY na América Central e do Sul............... 07 Figura 5 - Haemagogus janthinomys............................................................................. 08 Figura 6 - Modelo esquemático da transmissão do VMAY.................................... ..... 09 Figura 7 – Esquema da história natural da doença do VMAY .............................. ..... 13 Quadro 1 - Controles Positivos para VMAY – vísceras de camundongos..................... 21 Quadro 2- Protótipos Positivos do VMAY.................................................................... 22 Quadro 3- Composição do painel de outros arbovírus .................................................... 23 Quadro 4- Amostras de diferentes vísceras de camundongos ...................................... 24 Quandro 5- Amostras de VMAY segundo o município de procedência....................... 26 Quadro 6- Iniciadores e sonda utilizados na RT-qPCR-TaqMan.................................... 28 Quadro 7- Reagentes que constituíram a MIX para RT-qPCR-TaqMan............................ 29 Figura 8 – Curva de Eficiência da RT-qPCR-TaqMan.................................................... 30 Tabela 1 – Cepas de VMAY testados ......................................................................... 32 Tabela 2 – Desempenho da RT-qPCR- TaqMan com outros vírus ................................. 33 Tabela 3 - Desempenho da RT-qPCR- TaqMan com amostras sanguíneas .................... 34 Tabela 4 – Sensibilidade e especificidade do protocolo para VMAY ............................. 35 Tabela 5 – Desempenho do RT-qPCR- TaqMan wm camundongos infectados experimentalmente ........................................................................................................... 36 LISTA DE SIGLAS APC – Célula apresentadora de antígenos AR - Artrópode BEL –Amostras de VMAY coletadas de pacientes na cidade de Belém BNV – Benevides- Pará CAR - Conceição do Araguaia - Pará CC – Cultura Celular CD – Células dendríticas CEP – Comitê de Ética em Pesquisa CONEP – Comissão Nacional de Ética em Pesquisa DNA - Ácido desoxirribonucleico FC – Fixação do complemento IBGE –Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística ICTV - Internacional Committee on Taxonomy of Viruses IEC – Instituto Evandro Chagas IF - Imunofluorescência IFN – Interferon IH- Inibição da hemaglutinação IL- Interleucina MS - Ministério da Saúde MHC – Complexo de Histocompatibilidade Principal NK – Célula Natural Killer NSP – Non strutural protein – proteína não estrutural NTR - Regiões não traduzidas OMS - Organização Mundial da Saúde PCR – Reação em cadeia mediada pela polimerase PFU – Unidade Formadora de Placa PI – Pós inoculação PPS – Parauapebas - Pará qPCR – Reação em cadeia mediada pela polimerase quantitativa RNA - Ácido Ribonucléico RNT – Região não traduzida rpm – rotações por minuto RT – Transcriptase reversa SAAERB – Seção de Arbovirologia e febres hemorrágicas do Instituto Evandro Chagas SBA – Santa Bárbara - Pará STM - Santarém –Pará SVS – Secretaria de VigiLãncia Sanitária TLRs - receptores Toll-like TN – Teste de Neutralização TNF – Fator de necrose tumoral UEPA – Universidade do Estado do Pará UFPA – Univesidade Federal do Pará UFC – Universidade Federal do Pará UI – Unidades internacionais VCHIK – Vírus chikungunia VDEN – Vírus dengue VEEE – Vírus da encefalite equina do leste VEEW - Vírus da encefalite equina do leste VFA – Vírus da febre amarela VMAY – Vírus Mayaro VMUC – Vírus Mucambo VORO – vírus Oropouche VPIX – Vírus Pixuna VROC – Vírus Rocio VRUB – Vírus da Rubéola VSF – Vírus Semliki Forest VUNA – Vírus Una WHO - World Health Organization (Organização Mundial da Saúde) RESUMO O Vírus Mayaro (Togaviridae: Alphavirus) é um agente infeccioso endêmico na Amazônia, causa de surtos esporádicos em diversas áreas da América Central e, mais frequentemente, da América do Sul, onde é mais distribuído. É um vírus que, até a presente data, não foi relacionado com letalidade e geralmente cursa com doença febril exantemática, podendo apresentar artralgia que perdura até por seis meses, sendo assim razão de limitação às atividades diárias do indivíduo. É um vírus transmitido por artrópodes hematófagos a hospedeiros vertebrados como o homem, incluindo primatas não-humanos, marsuapiais, roedores e aves. Seu principal artrópode transmissor é um mosquito da espécie Haemagogus janthinomys, encontrado, principalmente, nas copas das árvores na floresta e considerada como vetor natural do VMAY. Entretanto, a potencialidade de disseminação para áreas urbanas está presente, pois este vírus mostrou-se adaptável laboratorialmente a mosquitos Aedes aegypti, mais antropofílico e presente em várias áreas urbanas e não urbanas do país. Assim sendo, é necessário que dentre as medidas de controle desta infecção haja um suporte diagnóstico seguro e rápido que responda às necessidades de vigilância em saúde. Nesta direção, foi objetivo deste estudo desenvolver uma técnica da biologia molecular para diagnóstico deste vírus em vista de sua potencialidade em disseminar-se. Baseou-se, esta proposta, na reação em cadeia mediada pela enzima polimerase em Tempo Real (RT-qPCR), por ser um recurso mais rápido que o método de referência de identificação desse vírus. Utilizando-se deste método através do sistema TaqMan foi criada uma alternativa que se mostrou sensível, específica e rápida, a qual estará assim respondendo adequadamente às demandas de suporte diagnóstico em situações onde requisitos como rapidez, precisão e relação custo-benefício sejam bastante favoráveis para o diagnóstico de uma infecção que desde já é de grande preocupação no meio científico e em saúde pública. Palavra-Chave: arbovírus, Mayaro, diagnóstico, RT-qPCR ABSTRACT Mayaro virus is an infectious agent endemic in the Amazon with sporadic outbreaks in several areas of Central and South America where it is distributed. It is a virus that has not been associated with mortality and generally presents with febrile rash and may present with arthralgia that lasts for up to six months, thus the reason for limiting the individual's daily activities. It is a virus transmitted by arthropod vectors to hosts vertebrates, including human and nonhuman primates, rodents and birds. Its main transmitter arthropod is a mosquito species Haemagogus janthinomys, found mainly in the forest areas and considered the vetor main of VMAY. However, the potential to spread to urban areas is present, since this virus proved to be adaptable to laboratory mosquitoes Aedes aegypti, more anthropophilic and present in various urban and non-urban areas of the country. Therefore, it is necessary that among the measures to control this infection there is a diagnosis support safe and quick to respond to the needs of health surveillance. In this direction, purpose of this study was to develop a technique in molecular biology for diagnosis of this virus in view of its potential to spread. Was based on this proposal, the quantitative transcription reverse followed, (RT-qPCR) to be a resource faster than the reference method for the identification of this virus. Using this methodology with TaqMan sistem was created an alternative that is sensitive, specific, and which is so fast responding properly support the demands of diagnostics in situations where conditions such as speed and accuracy are required for an infection from is already of great concern in the scientific and public health. Keyword : arboviruses, Mayaro, diagnosis, RT - PCR Real-Time 1. INTRODUÇÃO 1.10- CONSIDERAÇÕES SOBRE OS ARBOVIRUS As arboviroses são enfermidades de grande importância em patologia humana e animal, distribuindo-se em várias regiões do mundo. Estas infecções têm etiologia relacionada a um grupo bastante diversificado de vírus que receberam a denominação de arbovírus, termo oriundo das duas primeiras letras que compõem as palavras inglesas arthopod-borne acrescidos da palavra vírus. Este grupo de vírus é mantido em natureza por transmissão entre hospedeiros vertebrados suscetíveis por artrópodes hematófagos ou de hospedeiro artrópode para hospedeiro artrópode através da via transovariana ou da via sexual. A transmissão aos vertebrados dá-se por picada do inseto hematófago portador do vírus (WHO, 1985; Weaver & Reisen, 2010). Os arbovírus constituem o maior grupo de vírus conhecido, com 537 espécies distribuídas em 63 grupos antigênicos, sendo 139 conhecidos por infectar humanos e pelo menos 18 associados com doenças epidêmicas. Entre os arbovírus conhecidos no Brasil, 37 têm sido relacionados à etiologia de doença humana, dentre estes, alguns se destacam por estarem associados a epidemias, tais como o Vírus dengue (VDEN), Vírus da febre amarela (VFA), Vírus oropouche (VORO), Vírus Rocio (VROC) e Vírus Mayaro (VMAY) (Vasconcelos et al., 1992). Grande parte dos arbovírus tem RNA como seu material genético. Tais vírus estão distribuídos em cinco famílias, quais sejam: Bunyaviridae, Flaviviridae, Reoviridae, Rhabdoviridae e Togaviridae, entretanto nem todos os vírus destas famílias são arbovírus. É importante ressaltar ainda que há vírus considerados deste grupo (arbovírus) que não pertencem a estas famílias supramencionadas. Por outro lado, há arbovírus cujo material genético é o ácido desoxirribonucleico como é o caso do Vírus da peste suína africana, um vírus do gênero Asfarvirus (Weaver & Reisen, 2010). Doenças causadas por arbovírus têm manifestações clínicas bastante diversificadas e podem variar também em termos de gravidade em relação ao hospedeiro humano. Há, entretanto, arboviroses causadas por agentes virais distintos e que desenvolvem quadros clínicos bastante similares, por vezes idênticos. Esses casos requerem atenção especial no diagnóstico diferencial. Algumas destas arboviroses podem cursar com sintomatologia estritamente inespecífica e de curta duração, ou seja, de pequeno impacto patológico e autolimitada, havendo casos, entretanto, que podem evoluir para quadros extremamente graves, algumas vezes conduzindo ao óbito (Chia et al., 2010). Entre as arboviroses podem ser observadas quatro formas clínicas principais, quais sejam: doença febril; doença febril exantemática; febre hemorrágica; e as encefalites (Pinheiro et al., 1997). Em geral, as formas de doença febril evoluem com um período de incubação variando de três a oito dias. A sintomatologia se desenvolve com febre, calafrios, cefaleia, mialgia, artralgia, tonturas, fotofobia, dor retro orbitária, náuseas, vômitos e astenia. Estas são as manifestações clínicas mais frequentes (Vasconcelos et al., 2009). A forma febril exantemática, apresenta as manifestações sistêmicas mencionadas na forma febril, além de exantema macular, papular ou maculopapular na maioria dos pacientes que apresentam o quadro sintomático. Este sinal é, geralmente, observado após a fase virêmica da infecção. Em algumas destas infecções se observa ainda o surgimento de artralgias que podem ser severas e prolongadas. Estes são achados clínicos comuns em infecções pelo VCHIK que têm maior prevalência no continente asiático e africano, além de VORO, VDEN e VMAY observados nas Américas do Sul e Central (Azevedo et al., 2009). As formas hemorrágicas destas arboviroses são originadas de vírus que pertencem às famílias Togaviridae, Flaviviridae e Bunyaviridae. No Brasil, os flavivírus VFA e VDEN são os principais representantes deste grupo já identificados (Pinheiro et al., 1997). As encefalites por arbovírus são as manifestações clínicas mais graves das arboviroses em hospedeiros humanos. Estão relacionadas a alguns membros das famílias Togaviridae, Flaviviridae e Bunyaviridae. Não raramente, estas infecções levam ao óbito ou a sequelas neurológicas incapacitantes (Weaver & Reisen, 2010). 1.11- CONSIDERAÇÕES SOBRE O VMAY O Vírus Mayaro é um membro da família Togaviridae. Esta família compreende dois gêneros: Alphavirus e Rubivirus, no entanto, este último não pertence ao grupo de arbovírus. Segundo o Comitê Internacional de Taxonomia dos Vírus (ICTV, 2013) as seguintes espécies constituem o gênero de Alphavirus: Vírus Aura, Vírus Barmah forest, Vírus bebaru, Vírus cabassou, Vírus chikungunya, Vírus da encefalite equina do leste, Vírus da encefalite equina venezuelana, Vírus da encefalite equina do oeste, Vírus everglades,Vírus Fort Morgan, Vírus getah, Vírus Highlands J, Vírus madariaga, Vírus Mayaro, Vírus Middelburg, Vírus Mosso das Pedras, Vírus mucambo, Virus ndumu, Vírus O'nyong-nyong, Vírus Pixuna ,Vírus rio Negro,Virus Ross river, Vírus salmon pancreas disease, Vírus semliki forest, Vírus sindbis, Vírus southern elephant seal, Vírus tonate, Vírus trocara, Vírus Una, e Vírus Whataroa (ICTV, 2013). Como observado acima, o gênero Alphavirus, inclui trinta espécies e deste grupo, seis delas podem causar distúrbios nas articulações, são eles: Vírus chikungunya, Virus O’nyong-nyong, Vírus ross river, Vírus Barmah Forest, Vírus sindbis e o Vírus Mayaro (ICTV, 2013; Vasconcelos et al., 1992; Griffin, 2007; PiaLoux et al., 2007). Sorologicamente, os Alphavirus são classificados em sete complexos antigênicos, estando o VMAY relacionado ao grupo A com base no teste sorológico de neutralização (TN), fixação do complemento (FC) e inibição da hemaglutinação (IH). O VMAY está relacionado ao complexo antigênico Semliki Forest, sendo primeiramente relacionado ao vírus Semliki Forest (VSF), porém semelhanças antigênicas com o VCHIK também já foram relatadas (Casals & Whitman, 1957; Lavergne et al., 2005; Griffin, 2007; PiaLoux et al., 2007). A infecção pelo VMAY cursa como doença aguda febril exantemática, geralmente associada a cefaleia, calafrios, mialgia, dor retro orbital, vômito, diarreia, além de artralgia intensa e prolongada. Trata-se de uma arbovirose não letal, cujos hospedeiros invertebrados hematófagos encontram-se em áreas de floresta ou próximo a elas e que têm o ser humano como hospedeiro acidental. Devido a ação antrópica cada vez maior em áreas em que se encontram os vetores, os riscos de surtos são importantes. Em áreas em que a presença destes vírus já foi confirmada anteriormente como algumas áreas do norte das Américas do Sul e Central essa possibilidade torna-se maior (Tesh, 1982). Assim como os demais arbovírus, o VMAY é transmitido por artrópodes hematófagos a hospedeiros vertebrados silvestres, incluindo primatas não humanos, roedores, marsupiais e aves, sendo este último considerado como hospedeiro secundário, porém importantes para a disseminação do vírus (Vasconcelos et al., 1992). Alguns estudos, dentre eles os de Smith & Francy (1991) demonstraram que vários mosquitos poderiam servir de vetores para o VMAY. Este estudo demonstrou também que diferentes espécies de vertebrados analisados apresentavam anticorpos específicos contra o VMAY, portanto, servindo como reservatório. 1.3 - BIOLOGIA DO VMAY O VMAY possui diâmetro de aproximadamente 70 nm, seu capsídeo é icosaédrico com 32 capsômeros circundado por envoltório lipoproteico (envelope) constituído de espículas em sua superfície (Figura 1 e Figura 2). A presença deste envoltório é responsável pela acentuada sensibilidade aos solventes lipídicos e a detergentes. Os Alphavírus são lábeis em pH ácido e estáveis em pH alcalino, podendo ser facilmente inativados a 56 ºC ou em temperaturas superiores, porém são bem preservados quando mantidos à temperatura de –70 ºC ou se liofilizados e mantidos à temperatura de – 20º C (Pinheiro et al., 1997). Figura 1: Figura do VMAY destacando as espículas em seu envoltório (Liga de Microbiologia Médica -UFC, 2013) Seu genoma é constituído de RNA de fita única, linear, de polaridade positiva com aproximadamente 11.700 nucleotídeos distribuídos por oito genes, os quais codificam proteínas não estruturais (nsP1 a nsP4) que estão envolvidas na replicação viral; sua superfície é circundada por envoltório lipoproteico com dupla camada, onde se observa 80 trímeros de espículas, projeções que variam de 6,5 a 10 nm de comprimento e possuem os heterodímeros E1 e E2 (glicoproteínas) e proteínas do capsídeo, além de pequenos polipeptídios E3 e 6Ks como pode ser observado na figura 2 (Casals & Whitman 1957; Vasconcelos et al., 1992; Azevedo et al., 2007; Vasconcelos et al., 2009). Figura 2: Figura esquemática dos principais componentes morfológicos dos Alphavirus (SIB, 2010) Análises filogenéticas desse vírus demonstraram a existência de dois genótipos: um genótipo D, que contêm isolados altamente conservados, com divergência de nucleotídeos menor do que 6% que foram isolados de Trinidad e da América do Sul (Peru, Guiana Francesa, Suriname, Brasil e Bolívia), e um genótipo L, com isolados apenas do Brasil, também altamente conservados, com divergência de nucleotídeos menor que 4%, porém bastante distinto do genótipo D, de 15-19% de divergência (Powers et al., 2006). Figura 3 – Representação esquemática da estrutura genômica dos Alphavírus. Adaptado a partir de SIB (2010). A ligação do vírus a célula hospedeira é realizada pela glicoproteína E1 aos receptores de endocitose celular. Depois da penetração viral na célula hospedeira, dá-se o desnudamento do RNA viral que ocorre diretamente no citoplasma celular. A fita simples, positiva do RNA viral é transcrita para a síntese posterior do RNA genômico como também traduzida em uma poliproteína que será clivada na poliproteína não estrutural necessária a transcrição e tradução. A transcrição ocorre sobre a superfície dos endossomos, local onde será sintetizado o dsRNA a partir do ssRNA. O dsRNA é então transcrito e replicado, resultando em novos genomas ssRNA. A maturação ou montagem (junção do capsídeo ao RNA) ocorre no retículo endoplasmático de onde por canais de secreção serão liberados gradualmente da célula hospedeira para infectarem novas células. 1.4- EPIDEMIOLOGIA As arboviroses, majoritariamente, são mantidas em ambiente silvestre. Consequentemente, pessoas que mantêm contato com os focos enzoóticos são as que correm maior risco de adquirir estes tipos de infecção. Portanto, áreas de florestas e próximo a elas como as comumente encontradas no norte das Américas do Sul e Central apresentam, ambientes favoráveis à manutenção deste vírus (Neumayr et al., 2012) O VMAY foi, primeiramente, identificado a partir de um surto em Trinidad na região denominada de Mayaro, nas Antilhas, em 1954. A partir de então, foram identificados vários surtos em alguns países da América Central como também da América do Sul, principalmente, na Amazônia (Mourão et al., 2012). No Brasil, o VMAY é endêmico na região norte onde já foram detectadas várias epidemias no Estado do Pará. A primeira delas em uma fazenda situada às margens do rio Guamá, em 1955. Em uma localidade do município de Belterra no Estado do Pará em 1978, ocorreu um surto que envolvia uma comunidade rural de plantação de seringueiras, na qual foram infectados, aproximadamente, cem indivíduos. Deste surto isolou-se o VMAY de seis pacientes (Causey et al., 1957; Coimbra et al., 2007). Até então, o quadro clínico não havia sido adequadamente descrito, entretanto, o surto no município de Belterra permitiu observar e descrever melhor a tríade clássica de sintomas, caracterizada por febre, artralgia e exantema, além de outros sintomas, sendo a artralgia nas articulações de extremidades dado clínico destacado e que caracterizou, inicialmente, esta arbovirose. Além disso, este surto permitiu realizar uma melhor descrição do ciclo do VMAY e sua epidemiologia (Causey; Maroja, 1957). Estudos de Neel et al. (1968), demonstraram que índios da etnia Xavante residentes em área do norte do Mato Grosso (Amazônia Legal) também apresentaram sorologia positiva para VMAY. Outros surtos ocorreram no Estado do Pará: em Santarém, em 1978, Conceição do Araguaia, 1981 e dez anos depois (1991) ocorreu um surto na cidade de Benevides. Já no Estado de Goiás, em 1987, verificou-se a ocorrência de um pequeno surto no município de Itarumã. No vizinho Estado do Tocantins, o surto ocorreu na cidade de Peixe, em 1991 (Pinheiro et al., 1981; Powers et al., 2006; Coimbra et al., 2007). A circulação deste vírus na Amazônia pôde mais uma vez ser confirmada, em 2008, com a emergência de um surto no município de Santa Bárbara, vizinho ao município de Benevides onde ocorrera surto em 1991 (Vasconcelos et al., 2013) Em inquérito epidemiológico com amostras sorológicas para detecção de anticorpos contra arbovírus, realizado em 1597 indivíduos, Cruz et al. (2009) confirmaram 20 casos que apresentaram anticorpos contra VMAY. Este estudo de soroprevalência ocorreu entre 2007 e 2008, demonstrando a circulação deste vírus também nesta região. A seguir, a figura 4 apresenta as principais localizações de casos reportados de VMAY em humanos e outros animais, além de evidências sorológicas até o ano de 2009 em áreas que envolvem a América Central e América do Sul. Figura 4. Distribuição do VMAY (em amarelo) nas Américas Central e América do Sul (casos reportados em humanos e outros animais, além de evidências sorológicas). Adaptado a partir de Azevedo et al. (2009). A infecção pelo VMAY tem como principal vetor artrópode um mosquito do gênero Haemagogus, particularmente a espécie Haemagogus janthinomys (figura 5) um inseto que costuma habitar a copa das árvores em florestas. Devido às condições ambientais favoráveis, tanto o hospedeiro vertebrado como o artrópode podem coexistir em áreas silvestres ou periurbanas destas regiões tropicais como a floresta Amazônica onde estão as principais áreas enzoóticas (Azevedo et al., 2009). Figura 5: Haemagogus janthinomys (Fiocruz, 2013) Vários estudos já descritos acima apontam a América do Sul como principal área de surtos desta infecção. A ação antrópica como a que resulta do próprio crescimento da população, aumento da fronteira agrícola e pecuária, urbanização sem planejamento, derrubada de florestas por diversos propósitos, construção de estradas e ferrovias na floresta, construção de hidrelétricas, uso do subsolo para extração de minerais, turismo de aventura surgem frequentemente como as mais importantes epidemiologicamente para o acometimento da doença em seres humanos. Há uma tendência de aumento destas ações antrópicas nestas áreas e consequentemente os surtos em humanos poderão emergir (Figueiredo, 2007). O Brasil, segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística-IBGE, em agosto de 2012, possuía uma população de 193.946.886 habitantes, sendo 84% vivendo na área urbana e 16% em área rural (Brasil, 2012), porém permanece se expandindo para áreas mais interiorizadas como a Amazônia, principalmente, em decorrência do aumento da fronteira agrícola. Esta é a maior região brasileira do ponto de vista territorial, porém com a menor densidade demográfica, entretanto, é o local onde foi encontrada a maioria dos surtos de VMAY. Isso decorre das condições apropriadas para a manutenção do VMAY que têm no ambiente silvestre, condições ideais para vetores e vírus. Em que pese já ser promissora a conjunção dos fatores bióticos (Figura 6) e abióticos para a manutenção do vírus, este espaço geográfico tem sido progressivamente invadido pela ação de seres humanos potencializando novos surtos. Figura 6: Modelo esquemático da transmissão do VMAY. Adaptado de Azevedo et al. (2009). Assim ocorre também em outros países da América do Sul. Durante o período de abril de 1995 a 1998 um total de 27 casos de infecção pelo VMAY foi identificado em pessoas que viviam ou trabalhavam no Peru (Tesh et al., 1999). Neste mesmo país, Neumayr et al. (2012) descreveram o caso de um turista suíço de 27 anos de idade que permaneceu no Peru por três semanas e meia (de 6 a 30 de Julho de 2011) em férias em uma área próxima a Tarapoto, uma pequena cidade localizada na área de influência da floresta Amazônica peruana. É importante ressaltar que apesar do principal vetor conhecido deste vírus, o mosquito da espécie Haemagogus janthinomys ser típico de florestas tropicais ou de áreas próximo a elas, a possibilidade do vírus ser transmitido por outros vetores como o Aedes aegypti já foi comprovada em laboratório (Long et al., 2011). Este vetor, por sua vez, é altamente antropofílico e sua distribuição em área urbana é um risco presente que poderia culminar com epidemias potencialmente bastante significativas a considerar o impacto sobre a saúde das pessoas e custos no setor saúde (Figueiredo, 2007). Mourão et al. (2012) a partir do estudo laboratorial de inoculação do VMAY em Aedes aegypt realizado por Long et al. (2011), comprovando a competência deste artrópode como potencial vetor do VMAY, destacam a grande preocupação que representa a possibilidade de disseminação deste vírus nas áreas urbanas de diversos países a partir dos focos endêmicos já existentes. Desta forma é possível vislumbrar o risco de uma maior disseminação através da possível transmissão mediada por aves migratórias, viajantes, trabalhadores, turistas, desportistas como os três casos de viajantes descritos na cidade de São Paulo, o Estado de maior densidade demográfica do país (Coimbra et al., 2000; Long et al., 2011). Mourão et al. (2012), no mesmo estudo acima mencionado, ponderam esta possibilidade ao relatar o surto de febre de Mayaro ocorrido na cidade de Manaus no Estado do Amazonas, a cidade mais populosa da Amazônia brasileira e que atingiu pelo menos 33 pessoas. Por outro lado, apesar da possibilidade confirmada laboratorialmente por estes autores, o vírus em seres humanos tem um período de viremia curto o que limitaria a disseminação aos mosquitos e consequentemente a seres humanos, entretanto isto representaria um risco, certamente, maior diante de uma população mais concentrada no espaço geográfico de risco (Long et al., 2011). Thoyse et al. (2003), em pesquisa sorológica de VMAY realizada em mamíferos na Guiana Francesa, demonstraram a vasta disponibilidade de hospedeiros vertebrados suscetíveis a infecção e proliferação do vírus, destacando assim o risco presente nestas áreas onde são encontradas as condições ideais de manutenção do vírus. Em inquérito epidemiológico realizado em área do Projeto de Exploração Mineral em Juruti, no Estado do Pará, Cruz et al. (2009) demostraram que houve circulação ativa dos VMAY, VORO e VDEN em humanos como também em animais silvestres. Concluem, estes autores, que é possível, no futuro, que venham a ocorrer surtos dessa arbovirose em Juruti, uma vez que todos os componentes do ciclo de manutenção viral estão presentes na área (VMAY, hospedeiros silvestres e humanos suscetíveis). Por outro lado, a atenção com outras doenças exantemáticas febris na região deve ser preocupação constante da vigilância epidemiológica, pois as condições ambientais favorecem a manutenção deste e de outros arbovírus que comumente desafiam o diagnóstico clínico. Para isto, o suporte do diagnóstico laboratorial, prático e seguro se faz necessário (Tesh et al., 1999). 1.5 - MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS Até o presente estudo, não foi demonstrado que a infecção pelo VMAY possa estar associada a eventos fatais. Embora muitos casos possam ser completamente assintomáticos ou oligossintomáticos, seus achados clínicos caracterizam-se por ser uma doença aguda febril que se desenvolve por uma ou duas semanas após um período de incubação de 14 a 20 dias, com tríade clássica de sintomatologia de alguns arbovírus: febre, artralgia e exantema cutâneo (Chia et al., 2010). O mecanismo que dá origem ao quadro clínico e patológico das arboviroses ainda não é completamente conhecido. Alguns estudos descrevem que após a picada do inseto hematófago, os vírus se multiplicam, inicialmente, no próprio local da inoculação (tecido subcutâneo), são em seguida transportados aos linfonodos satélites onde proliferam quando encontram vários grupos celulares permissíveis à infecção como as células de Langehans, células dendríticas e macrófagos, a partir de então, pelos vasos eferentes dos linfonodos chegam ao duto correspondente ao canal de drenagem por onde o vírus se dissemina pelo organismo em viremia febril, atingindo outros órgãos e favorecendo a disseminação para o vetor artrópode durante a picada por este inseto (Torres et al., 2004; Byrnes et al., 2000). Na maioria dos Alphavírus, observa-se que a fase aguda febril dura em torno de três a cinco dias e termina com o surgimento de exantema cutâneo (Pinheiro et al., 1981). Outros achados clínicos envolvem calafrios, cefaleia geralmente frontal, anorexia, indisposição, vômitos, dor retro orbital, linfadenopatia principalmente cervical e inguinal dolorosa que dura sete a dez dias, mialgia generalizada, exantema cutâneo (macular ou papular ou máculo-papular) e dor intensa e prolongada nas articulações (Neumayr et al., 2012). Após esta fase inicial, o indivíduo em convalescência pode apresentar por duas semanas um estado geral de fraqueza e artralgia (Pinheiro et al. 1981). A artralgia, entretanto, pode perdurar por algumas semanas ou meses (Taylor et al., 2005). Estudo realizado por Azevedo et al. (2009) com 36 pessoas que foram infectadas pelo VMAY em um surto que ocorreu em 2008 na comunidade de Pau d’Arco no município de Santa Bárbara no Estado do Pará, a doença foi caracterizada por apresentar um quadro clínico assim distribuído entre os indivíduos sintomáticos: febre (100% dos pacientes), artralgia (89%), mialgia (75%), cefaleia (64%), edema articular(58%), exantema cutâneo (49%), dor retro ocular (44%). Os outros sintomas encontrados em menor proporção foram prurido (33%), tontura (25%), anorexia (22%), linfadenopatia (17%) e vômito (4%). Por outro lado, o estudo realizado por Mourão et al. (2012) avaliando sintomatologia de 33 pacientes no surto da febre do Mayaro, na cidade de Manaus, no Estado do Amazonas, entre os anos de 2007 e 2008, encontraram a seguinte distribuição percentual de sinais e sintomas desta doença: febre (100%), cefaleia (57,6), artralgia (54,5%), mialgia(48,5%), dor retroorbitária(39,4%), exantema cutâneo (24,2%), hemorragia (12,1%), vômito (9,1), fotofobia(3,0%), icterícia(3,0%). Suhrbier et al. (2012) apontam em seu estudo de revisão que os pacientes com VMAY apresentam aproximadamente os seguintes percentuais dos principais sintomas desta infecção: Febre (100%), exantema (30-50%), mialgia (75%) artralgia (50-90%). Taylor et al. (2005) em relato de caso de um paciente que trabalhou no serviço militar americano na Bolívia, destacam além destes sintomas a presença de dor epigástrica e fotofobia. Neste mesmo estudo descreve a recorrência da artralgia após seis meses do início da doença. A maioria dos sintomas desaparece ao final de dez dias, porém a artralgia severa, em alguns pacientes, persiste por um período mais prolongado, redundando em limitação às atividades de rotina do indivíduo (Taylor et al., 2005). A figura 7 apresenta de maneira simplificada o esquema da história natural da doença pelo VMAY em adultos, destacando o quadro sorológico observado na infecção e outros achados clínicos. Figura 07: Esquema da história natural da doença pelo VMAY em adultos. Adaptado a partir de Suhrbier et al. (2012) de história da infecção humana por VCHIK. A patogênese da infecção pelo VMAY ainda não está completamente esclarecida, acredita-se que algumas citocinas tenham papel importante, porém ainda permanecem pouco estudadas. Fazendo um paralelo com estudos já realizados em outros Alphavirus, Suhrbier et al. (2012) relatam em seus estudos com os Alphavirus que a resposta do hospedeiro a infecção se dá inicialmente por IFN-α/β e anticorpos. Segundo estudos de Her (2010), Krejbich-Trotot (2011), Helse et al. (2000) e Ryman et al. (2008) um grupo de células e tecidos, incluindo monócitos, macrófagos, células dendríticas, fibroblastos da derme e sinoviais, células endoteliais, fibra muscular esquelética são as principais células alvo dos Alphavirus. A resposta imune contra a infecção pelo VMAY é, geralmente, eficiente e composta da integração dos mecanismos da imunidade inata e da imunidade adquirida. A resposta inata é dada, inicialmente, pela ação de interferons tipo I: interferon alfa (IFN-α) e interferon beta (IFN-β) que são citocinas produzidas por fagócitos mononucleares e fibroblastos respectivamente. A seguir, o sistema imune desencadeia a resposta adquirida, iniciada após o intervalo de tempo necessário para a ativação, proliferação e diferenciação dos linfócitos reconhecedores dos epítopos virais nas células apresentadoras de antígenos (APC) pelos linfócitos T. Há ainda produção de anticorpos específicos, pelos linfócitos B e de outras citocinas, além de ativação das moléculas de classe I e II do complexo de histocompatibilidade principal-MHC (Azevedo et al., 2007). Modelos experimentais mostram receptores Toll-like (TLRs) como sendo críticos para a geração tanto da imunidade inata como adaptativa. A resposta imune inata através de TLRs em células dendríticas e macrófagos resulta na produção de citocinas próinflamatórias, incluindo o fator de necrose tumoral (TNF-α) e interleucina 2 (IL-2) (Huang et al., 2007). Na fase febril da infecção, o título viral no sangue é elevado, principalmente nas primeiras 24 horas, porém decrescem rapidamente, sendo rara a detecção do vírus após as 72 horas, uma vez que após o período virêmico, o paciente apresenta elevados títulos de anticorpos neutralizantes (IgM) que na maioria dos casos até aqui descritos, resultam em controle da infecção (Vasconcelos et al., 2009). Alguns estudos com outros Alphavirus utilizando roedores como modelo experimental e Vírus rio Ross (VRR) como indutor da doença, demonstraram o papel dos macrófagos como a principal causa imunopatológica para o desenvolvimento da doença, sendo encontrado princinpalmente nos músculos relacionados a sintomatologia. Alguns destes estudos com primatas não humanos suscetíveis a infecção pelo VCHIK também apontaram os monócitos intersticiais como as principais células envolvidas na infecção (Herrero et al., 2011). Outros animais também serviram de modelo experimental para a infecção pelo VMAY, dentre eles estão roedores recém-nascidos que se constituem como os mais vulneráveis. Animais jovens e adultos, muitas vezes respondem bem imunologicamente e no confronto com o vírus se mantem eficazes (Taylor et al., 2005). Nos casos de pacientes com artralgia severa e prolongada, aspectos patológicos similares às doenças reumáticas permitem inferir sobre um conjunto de citocinas inflamatórias que poderiam ter expressão maior à semelhança do que acontece no VCHIK, que é um vírus filogeneticamente muito próximo ao VMAY. Dentre as citocinas com expressão neste vírus (VCHIK) destacam-se a interleucina 1 beta (IL-1β), interleucina 6 (IL-6) e Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α) (Her, 2010). Isto poderá sugerir o potencial uso destes biomarcadores para o prognóstico da doença nos pacientes que desenvolvem a artralgia severa prolongada (Chia et al., 2010). Estudos realizados em modelos animais (roedores) têm demonstrado necrose de músculo esquelético, periósteo e pericôndrio. Nestes mesmos modelos foi evidenciado casos de meningite e encefalite (Taylor et al., 2005). Achados semelhantes foram evidenciados em estudo realizado por Helse et al. (2000) com camundongos adultos infectados com Alphavirus. Neste estudo verificou-se franca replicação viral em periósteo e na própria matriz de ossos longos destes roedores. Os resultados de hemogramas realizados em pacientes com infecção por Alphavirus apresentam, segundo manual de orientação da Organização Mundial de Saúde (WHO, 2008), leucopenia com predominância de linfócitos, trombocitopenia ocasional, além de alta sedimentação leucocitária e níveis elevados da proteína C-reativa. 1.6 – DIAGNÓSTICO LABORATORIAL O diagnóstico clínico da infecção pelo VMAY é muito difícil devido seus sinais e sintomas inespecíficos, sobretudo quando identificados em áreas onde circulam outros vírus com sintomatologia similar, principalmente, as arboviroses com quadro febril exantemático (Wang, 2006). Quando mais de um desses vírus circulam pela mesma área e o quadro clínico guarda similaridade, são fundamentais a especificidade e a sensibilidade do método de diagnóstico laboratorial, além da rapidez em realizá-lo. Portanto, todos os casos suspeitos nessas regiões (áreas favoráveis a manutenção do vírus), deverão ser confirmados laboratorialmente. Além de servir para monitorar a evolução clínica do paciente e identificação correta da infecção, o diagnóstico rápido e preciso favorece a aplicação das medidas de controle, minimizando o alcance do vírus em disseminação em humanos (Pinheiro et al., 1981). Para detecção viral, o método clássico utilizado é o isolamento em cultivos celulares e/ou camundongos recém-nascidos. Estes métodos são altamente sensíveis e identificam a presença do VMAY no início dos sintomas. Porém seus resultados demoram aproximadamente de 14 a 21 dias para serem apresentados. Esta demora resulta em limitação importante nas ações de vigilância epidemiológica e atenção à saúde (Azevedo et al., 2007). Para o isolamento e identificação do vírus, a coleta de material biológico, em geral, se dá no próprio campo onde ocorre o surto. A coleta é feita a partir de amostras de sangue coagulado ou não, plasma ou soro do indivíduo que se encontra na fase aguda da doença, ou seja, durante a viremia que acompanha o período febril inicial da enfermidade, geralmente, nos primeiros cinco dias após se iniciarem os sinais e sintomas da doença. As amostras devem ser transportadas até o laboratório onde deverão ser conservadas em baixa temperatura (inferiores -60°C) caso não sejam imediatamente processadas. No transporte desse material até o laboratório poderá se utilizar o gelo seco ou nitrogênio líquido, sendo este o mais utilizado em trabalhos de campo (Vasconcelos et al., 2013). Para o isolamento em roedores o animal de escolha é o camundongo albino suíço lactente (Mus musculus) de um a dois dias de idade. Segundo Karabatsos (1985), hamsters lactentes (Mesocricetus auratus) possuem sensibilidade semelhante aos camundongos. De posse do material biológico do indivíduo infectado, prepara-se uma suspensão a 10% de solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,2 contendo albumina bovina a 0,75%, penicilina (100 UI/mL) e estreptomicina (100 g/mL). Agrega-se esta suspensão a uma alíquota do espécime colhido do indivíduo (1µL) e homogeneíza-se. Em seguida, inoculase por via intracerebral uma alíquota de 0,02 µL no camundongo. O quadro infeccioso, geralmente, conduz ao óbito até o 5° dia de observação. A partir de então se obtém uma suspensão do cérebro destes camundongos infectados e então se inocula na cultura celular de escolha como as células VERO, C6/36 ou outras apropriadas e em seguida incubada a 28ºC por nove dias. A partir de então são examinadas por imunofluorescência indireta (IF) com anticorpos policlonais para Alphavirus (Suhrbier., et al). O método de isolamento em cultura celular serve para avaliar a multiplicação viral mediante a evidência de efeito citopático ou de formação de placas sob camada de ágar. Para o processo de isolamento em cultura celular, as amostras deverão ser diluídas (1:5) em meio de cultura essencial contendo 2% de soro fetal bovino e antibióticos. Em seguida, as amostras diluídas (200 µL) são inoculadas em garrafas com cultivo de células. Dentre as linhagens celulares contínuas que apresentam mais permissividade para os arbovírus destacam-se as células VERO (rim de macaco verde africano, Cercopithecus aethiops), as células AP61 (de artrópodes Aedes pseudoscutellaris) e clone C6/36 (Aedes albopictus), células BHK-21 (rim de hamster recém nascido), LLC-MK2 (rim de macaco Rhesus) (Vasconcelos et al., 2009). A confirmação do isolamento viral é dada por teste de fixação do complemento e teste de imunofluorescência indireta (Travassos da Rosa et al., 1998). O isolamento viral feito através da inoculação do vírus em culturas celulares ou camundongos recém-nascidos é considerado como padrão ouro (Azevedo et al., 2007). Em relação aos métodos sorológicos, os testes IH e teste imuno enzimático (ELISA) são os mais frequentemente utilizados. Na rotina laboratorial a IH é uma das primeiras opções por ser uma técnica sensível, rápida e de fácil execução. O teste ELISA, utilizado para detecção de IgM específica, tem a vantagem de identificar infecção recente. É uma técnica de alta sensibilidade, rápida e de fácil execução, porém, segundo Wang et al. (2006) deve ser apenas utilizada em amostras de soro obtidas a partir do 5º dia de doença. Um teste molecular também bastante conhecido é a reação em cadeira mediada pela enzima polimerase (RT-PCR convencional e RT-qPCR) técnicas da biologia molecular que se baseiam na identificação de um fragmento de RNA do agente infeccioso, utilizando a polimerase. Esta enzima é responsável pela síntese de uma sequência complementar do ácido nucleico desejado a partir de um oliognucleotídeo iniciador específico que corresponde a parte da sequência a ser replicada. A partir deste iniciador, a técnica prevê replicação de uma única sequencia de ácido nucleico em bilhões de cópias idênticas desta molécula (Mullis, 1990). Entretanto, somente pode ser utilizada a estrutura do ácido nucleico que estiver preservada. No indivíduo que foi infectado com VMAY este período compreende a fase virêmica, ou seja, quando a partícula viral preservada ainda está presente no hospedeiro. Após este período, o próprio sistema imunológico do indivíduo tende a degradar esta molécula. Obviamente, amostras de cultura de células (VERO ou C6/36, por exemplo) originadas deste período virêmico poderão ser utilizadas, mas a demora do cultivo e realização da RT-PCR convencional somados tornam ainda mais demorado o diagnóstico. A RT-qPCR, entretanto, oferece vantagens como a alta sensibilidade e especificidade, rapidez e quantificação do ácido nucleico viral. 1.7 - PREVENÇÃO Com relação às medidas de controle da doença, a infecção causada pelo VMAY não dispõe ainda de vacina. Assim sendo, medidas de controle individuais devem ser direcionadas a procedimentos que possam impedir a picada do vetor infectado. Tais medidas envolvem o uso de repelentes, uso de mosquiteiros e roupas adequadas (Azevedo et al., 2007). Por outro lado, a redução da densidade populacional do vetor é uma medida de impacto importante a ser direcionada por medidas como a limitação de criadouros do mosquito. O saneamento básico é uma dessas medidas de impacto e que certamente seriam importantes, principalmente em áreas onde a densidade populacional humana também é maior (Vasconcelos et al., 2009). 1.8 - TRATAMENTO Ainda não existe uma terapia antiviral específica resolutiva para o controle da infecção pelo VMAY. O tratamento é estritamente sintomático e dentre os fármacos correntes mais utilizados tem-se paracetamol e antiinflamatórios não esteroidais para controle dos sintomas. No caso dos sintomas mais severos que envolvem a artralgia prolongada, doses pequenas podem ser administradas, sempre monitorando o risco de trombocitopenia, irritação gástrica, hemorragia digestiva, náusea e vômito (Taylor, 2005). A infecção pelo VMAY embora não seja letal, pode evoluir com complicações, dentre as quais se observam dores articulares intensas que podem perdurar por até seis meses. A partir de 2011, o Ministério da Saúde do Brasil, reconhecendo sua importância como doença emergente, classificou a infeccção pelo VMAY como de notificação compulsória (Brasil, 2011). Entretanto, o diagnóstico clínico da infecção pelo VMAY é difícil de ser estabelecido com segurança devido a natureza não específica da doença e a presença de outros vírus circulantes, como o VDEN, que comumente produzem manifestações clínicas similares e que estão distribuídos especialmente nos trópicos. Aliado a este fator, a ausência de um método diagnóstico simples para a detecção rápida das infecções agudas durante os estágios iniciais da doença, dificulta a avaliação do potencial de uma epidemia e consequentemente a implementação de medidas de controle adequadas (Azevedo et al., 2009). Diante disso, este estudo propõe o desenvolvimento de um protocolo de diagnóstico que venha atender às necessidades de suporte de identificação laboratorial para o VMAY de forma segura e rápida. Trata-se de estratégia que se mostra relevante em áreas onde o diagnóstico diferencial com outras enfermidades é crítico, sobretudo em áreas tropicais como na Amazônia. Para este fim, foram utilizadas técnicas moleculares de transcrição reversa (RT) seguida da reação em cadeia mediada pela polimerase em tempo real (RTqPCR) através do sistema TaqMan em amostras isoladas no Instituto Evandro Chagas para a detecção do VMAY. A técnica adotada buscou resultados com reprodutibilidade e com perspectivas de viabilidade no suporte diagnóstico para este vírus, ou seja, um método sensível e especifico para o diagnóstico de VMAY com resultados em um curto período de tempo, contribuindo para as ações de vigilância epidemiológica de modo a prevenir expansão de surtos da infecção, além de possibilitar melhor planejamento de ações de controle. 1.9 – OBJETIVOS 1.9. 1 - Objetivo Geral Desenvolver um método de diagnóstico utilizando a técnica de transcrição reversa seguida de reação em cadeia mediada pela enzima polimerase em tempo real (RT-qPCR) para detecção do VMAY. 1.9. 1 - Objetivos Específicos: Desenvolver um método de diagnóstico virológico para detecção do VMAY utilizando a técnica de RT-qPCR utilizando o sistema TaqMan; Avaliar o desempenho do teste de RT-qPCR - TaqMan para a detecção do VMAY; Avaliar a sensibilidade do método para a detecção do VMAY em vísceras de camundongos infectados experimentalmente; 2 – MATERIAL E MÉTODOS 2.1. LOCAL DA PESQUISA O processamento das amostras foi realizado no laboratório de biologia molecular da Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas do Instituto Evandro Chagas (SAARB/IEC/SVS/MS) na cidade de Ananindeua-Pará com o material biológico armazenado nesta instituição. Todo material biológico, incluindo culturas celulares, estoques virais, sangue, soro e vísceras de camundongos infectados ou não infectados já faziam parte deste acervo que teve seu acesso devidamente autorizado pela direção da SAARB. Todas as amostras de camundongos recém-nascidos experimentalmente infectados estavam preservadas em temperatura de -70°C e haviam sido inoculados com VMAY com o título viral de 109,5 DL50/0,02 mL. A data de óbito foi 120 horas pós inoculação (PI). Um grupo de vísceras foi selecionado para constituir material de análise dos testes. Tal grupo foi constituído dos seguintes órgãos: fígado, baço, coração, cérebro, rins e músculo esquelético. Esta seleção foi baseada no estudo de Morrinson et al. (2006) quando avaliaram tropismo de outro arbovirus (VRR) a estes órgãos e de Miranda (2013) que avaliou as mesmas vísceras frente ao VMAY, detectando RNA viral em todas elas no intervalo de 24h, 48 e 72 horas. 2.2. SELEÇÃO E PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS Para o presente estudo foram selecionadas cepas de VMAY do acervo da SAARB. Para realização dos testes foi selecionada cepa H743921 de caso confirmado do VMAY do surto da infecção por este vírus no município de Santa Bárbara, no Estado do Pará, coletada em 13 de março de 2008 de paciente de 52 anos, gênero feminino que apresentava quadro de febre elevada, cefaleia, artralgia, mialgia, dor retro ocular, calafrios e edema em extremidade de membros inferiores e superiores, além de joelhos. Esta cepa havia sido inoculada em abril de 2013 pela via intracerebral em camundongos albinos suíços recémnascidos para re-isolamento viral e preparação de estoque que durante o experimento serviriam de controle positivo para os testes de RT-qPCR. Quadro 1: Controle Positivo para VMAY – Amostras isoladas a partir de camundongos infectados com cepa H743921 do surto do Município de Santa Bárbara - Pará. TIPO DE FONTE Evidência diagnóstica AMOSTRA Cérebro de Camundongo camundongo Coração Camundongo Camundongo Camundongo infectado com cepa Isolamento viral infectado com cepa Isolamento viral infectado com cepa Isolamento viral infectado com cepa Isolamento viral infectado com cepa Isolamento viral H743921 de Camundongo Camundongo H743921 Músculo Camundongo Esquelético Isolamento viral H743921 de Camundongo Baço cepa H743921 de Camundongo Rim com H743921 de Camundongo Fígado infectado de H743921 Camundongo Sobrenadante cultura de Cepa H743921 Isolamento viral celular (células VERO) Este conjunto de RNAs obtidos foi testado e constituiu o controle positivo (pool) para as RT-qPCR sistema TaqMan. O controle negativo dos testes foi constituído de RNA viral obtido a partir de amostras de vísceras de camundongos não infectados por VMAY. Em ambos os casos as vísceras de camundongo utilizadas para este fim foram cérebro, coração, fígado, baço, rins e músculo esquelético. De forma idêntica ao controle positivo, o controle negativo utilizado foi constituído de suspensão dos RNAs das diferentes vísceras não infectadas (pool). Além disso, treze cepas VMAY oriundos de diferentes municípios do Estado do Pará com diagnóstico viral confirmado por isolamento do vírus também foram testados no IEC conforme relacionado no quadro 2. Quadro 2: Cepas Positivas para VMAY (casos confirmados laboratorialmente) – Amostras isoladas a partir de surtos ocorridos em diferentes municípios do Estado do Pará. Tipo de Amostrta Sobrenadante de FONTE Evidência diagnóstica Amostra de soro humano H342906 (Santarém- Isolamento viral cultura de céls. VERO PA) Sobrenadante Amostra de soro humano de Isolamento viral cultura de céls VERO Amostra H505372 (Benevides-PA) Sobrenadante Amostra de soro humano Amostra H394874 de cultura de céls VERO (Conceição do Araguaia-PA) Sobrenadante Amostra de soro humano H342915 (Conceição do de cultura de céls VERO Araguaia-PA) Sobrenadante Amostra de soro humano Amostra H744141 de Isolamento viral Isolamento viral Isolamento viral cultura de céls VERO (Belém-PA) Sobrenadante Amostra de soro humano H505465 (Belém-PA) Isolamento viral Amostra de soro humano H744173 (Santa Isolamento viral de cultura de céls VERO Sobrenadante de cultura de céls VERO Bárbara-PA) Sobrenadante Amostra de soro humano H745587 (Santa de cultura de céls VERO Bárbara-PA) Sobrenadante Amostra de soro humano H758762 (Parauapebas- de cultura de céls VERO Pa) Sobrenadante Animal coletado em Parauapebas-Pa /Amostra: de cultura de céls VERO AN731607 Sobrenadante Amostra de soro humano H 742831 (Santa de cultura de céls VERO Bárbara-PA) Sobrenadante Animal coletado em Santa Bárbara Amostra AN de cultura de céls VERO 344910 Sobrenadante Artrópode de cultura de céls VERO coletado em Santa Bárbara-Pa/ Isolamento viral Isolamento viral Isolamento viral Isolamento viral Isolamento viral Isolamento viral Amostra AR344910 Além das cepas de VMAY, foram incluídos outros vírus circulantes da região Amazônica conforme quadro 3. Estes vírus foram selecionados em decorrência de circularem pela região e apresentarem quadro clínico com alguma similaridade com a infecção pelo VMAY. Quadro 3: Amostras utilizadas para a composição do painel formada por vírus com sintomatologia similar a da infecção por VMAY e circulantes em regiões apropriadas a manutenção deste vírus. Vírus Família Gênero Espécie Evidência diagnóstica Togaviridae Alphavírus VMUC Isolamento viral Togaviridae Alphavírus VAUR Isolamento viral Togaviridae Alphavírus VEEW Isolamento viral Togaviridae Alphavírus VEEE Isolamento viral Togaviridae Alphavírus VPIX Isolamento viral Togaviridae Rubivirus VRUB Isolamento viral Bunyaviridae Bunyavirus) VORO Isolamento viral Flaviviridae Flavivirus VDEN-1 Isolamento viral Flaviviridae Flavivirus VDEN-2 Isolamento viral Flaviviridae Flavivirus VDEN-3 Isolamento viral Flaviviridae Flavivirus VDEN-4 Isolamento viral Flaviviridae Flavivirus VFA Isolamento viral A composição do painel dos vírus acima mencionados teve a finalidade de avaliar a possibilidade de reações cruzadas entre distintos vírus cujo diagnóstico diferencial requer atenção clínica maior e exame laboratorial com especificidade segura. Para este fim, foram levadas em consideração as manifestações clínicas em seres humanos decorrentes das infecções pelos diferentes vírus, principalmente arboviroses que em sua sintomatologia podem ser reunidas em quatro categorias: doença febril (VMUC, VPIX, VORO), doença febril exantemática (VDEN, VRUB e VMAY), febre hemorrágica (VFA e VDEN) e encefalites (VEEE e VEEW). Outro critério utilizado foi a distribuição dos surtos destes vírus que guarda semelhança epidemiológica com outros arbovírus. É importante destacar que nem todos os quadros clínicos destas enfermidades cursam com seus sintomas clássicos, ou seja, alguns deles apresentam-se subclinicamente ou de maneira assintomática, podendo assim dificultar o diagnóstico clínico diferencial. Foi acrescentado também a este painel o VRUB que apesar de não ser um arbovírus, cursa com febre exantemática. Outro teste realizado levou em consideração a possibilidade de identificação do RNA viral em amostras de vísceras de camundongos do primeiro ao quinto dia PI. A cepa selecionada foi a H743921 e realizada com pool das vísceras conforme o quadro 4. Quadro 4: Amostras isoladas a partir de vísceras de camundongos experimentalmente infectados com cepa H743921 em diferentes dias (1° ao 5°). Cepa H743921 1º dia 2º dia 3º dia 4º dia 5º dia Cérebro Cérebro Cérebro Cérebro Cérebro Rim Rim Rim Rim Rim Musc. Esq. Musc. Esq. Musc. Esq. Musc. Esq. Musc. Esq. Fígado Fígado Fígado Fígado Fígado Coração Coração Coração Coração Coração Baço Baço Baço Baço Baço Os RNAs extraídos foram testados em pool de vísceras, ou seja, apenas as suspensões de todos os RNAs obtidos a partir das vísceras foram testados em RT-qPCR. Cada víscera selecionada tinha o peso de 100mg. Amostras sanguíneas testadas: Além dos testes supramencionados, foram realizados testes em 81 amostras sanguíneas de pacientes que apresentaram quadro clínico compatível com infecção pelo VMAY. Todas estas amostras haviam sido testadas pelo padrão ouro (isolamento viral) de diagnóstico para Dengue, Febre Amarela e Mayaro com resultado negativo. Para estes testes foram aleatoriamente selecionadas amostras de sangue humano do ano de 2011 preservados a -70°C que estariam balizadas pelos critérios abaixo. 2.2.1. - Critérios de Inclusão: As amostras testadas deveriam: a. Originar-se de pacientes sintomáticos que apresentassem quadro clínico compatível com fase aguda da doença; b. As amostras obrigatoriamente teriam sido testadas para VMAY, VDEN e VFA com resultado laboratorial confirmado como negativo (isolamento viral). c. Amostra de pacientes do Estado do Pará. d. Amostras colhidas no período sintomático e. Material coletado no ano de 2011 originado de municípios cuja parte importante da população resida em áreas compatíveis com a circulação do vírus. 2.2.2 - Critérios de Exclusão: a. Diagnóstico laboratorial confirmado para outras infecções sejam arboviroses ou não no período de coleta; b. Material biológico inadequadamente preservado; c. Amostras de pacientes residentes nos municípios de Belém e Ananindeua. Obs. Embora estes dois municípios possuam áreas de florestas, sua população é predominantemente residente em área urbanizada. Belém possui apenas 0,86% de sua população residente em área rural, enquanto que o município de Ananindeua que também compõe a região metropolitana de Belém possui um percentual de 0,25% de população rural (IBGE, 2013). Tomando-se como base os critérios de inclusão e exclusão acima mencionados, o banco de dados relativo ao material biológico da SAARB disponibilizou um total de 351 amostras dos quais foram selecionadas randomicamente 81 amostras sanguíneas representando 23,07% deste total. Todas as amostras coletadas obedeceram rigorosamente os critérios supramencionados. As amostras tiveram procedência nos municípios descritos no Quadro 05. Quadro 5: Amostras testadas para VMAY através do método de referência (isolamento viral) e testadas pelo protocolo proposto segundo o município de procedência. Procedência N° de amostras Abaetetuba – PA 04 Altamira – PA 12 Barcarena-PA 04 Benevides-PA 02 Cametá – PA 01 Marabá – PA 08 Paragominas – PA 01 Parauapebas – PA 32 Rurópolis – PA 01 Salinópolis – PA 03 São Caetano de Odivelas – PA 01 Santarém – PA 11 Tailândia – PA 01 TOTAL 81 Todas estas amostras tinham sido testadas no método padrão-ouro de identificação do VMAY (isolamento viral e inoculação em cultura de células) tendo-se obtido em todas as amostras resultado negativo. Como controle endógeno das reações foram utilizados a RNAse P e a β-Actina para amostras de material biológico humano e de camundongo, respectivamente. 2.2.3 - Seleção dos Oligonucleotídeos Iniciadores Os iniciadores foram desenhados com base nas múltiplas sequências disponíveis do VMAY no GenBank. Foi utilizada a região de NsP2 que é uma das regiões mais preservadas do genoma (NCBI, 2012). O desenho dos oligonucleotídeos e sonda foram feitos utilizando o Primer Seq software (Lasergene DNA Star Package, Madison, WI, USA). 2.2.4 - Fase Experimental: Todas as vísceras selecionadas (cérebro, fígado, rim, baço, coração e músculo esquelético) dos camundongos suíços recém-nascidos infectados e controles negativos (vísceras de camundongos não infectados) foram maceradas com auxílio de grau e pistilo adicionando-se 1 mL de solução de penicilina (100 UI/mL) e estreptomicina (100 μg/mL). A partir desta suspensão obtida, procedeu-se a extração do ácido nucleico viral e em seguida as amostras foram submetidas à técnica de RT-qPCR (Transcrição Reversa e Reação em cadeia mediada pela polimerase em tempo real). Extração de RNA Para todas as amostras, foi primeiramente realizada a extração do RNA viral, utilizando a técnica do Trizol-LS (Plus) (Invitrogen Carlsbad, EUA), seguindo as orientações do fabricante: em um tubo (1,5ml), adicionou-se 125 µL da amostra a 125 µL de água livre de RNAse. A seguir foram adicionados 750µl de TRIzol-LS. Cada amostra recebeu então 200 µL de clorofórmio, sendo em seguida, homogeneizada em aparelho vórtex por 1 minuto invertendo-se o tubo três vezes durante este período. Depois de incubar esta suspensão por cinco minutos em temperatura ambiente, cada amostra foi centrifugada durante 15 minutos a 4°C em ciclo de 12.000 rpm. Obteve-se, a partir de então, amostras com conteúdo trifásico em cada tubo. No fundo do tubo a fase orgânica representada por fragmentos celulares e proteínas de maior peso molecular. Na fase intermediária denominada de fase leitosa são encontradas moléculas de DNA e outras proteínas de menor peso molecular. Na fase superior dos tubos (fase aquosa) o RNA viral permanece no sobrenadante de onde foram coletados cuidadosamente com micropipeta para as etapas subsequentes da extração do material genético. Este sobrenadante foi então depositado em um novo tubo de 1 ml onde se acrescentou álcool etílico a 70% na mesma proporção (1:1) e homogeneizou-se em vórtex por cinco segundos. Todo este conteúdo foi então transferido para a coluna e em seguida centrifugado por 15 segundos em temperatura ambiente em ciclo de 12.000 rpm. Ao centrifugar, a suspensão atravessa a coluna que tem a propriedade de reter o RNA. O tubo coletor da coluna foi então desprezado, sendo substituído por um novo. A coluna então recebeu 700 µL de tampão de lavagem I. Uma nova centrifugação foi realizada por 15 segundos a temperatura ambiente em 12.000 rpm. O tubo coletor foi desprezado e substituído por um novo. Em seguida, foram acrescentados à coluna 500µL do Tampão de Lavagem II. Este conjunto foi então centrifugado por 15 segundos a temperatura ambiente em 12.000 rpm. O tubo coletor foi desprezado e substituído por um novo. Este procedimento de lavagem do tampão II foi repetido de maneira idêntica. Um novo tubo coletor foi colocado sob a coluna para secagem que foi feita ao se centrifugar por dois minutos a amostra a temperatura ambiente em 12.000 rpm. Desprezou-se mais uma vez o tubo coletor, substituindo-o por um tubo de 1,5ml que serviu para coletar o RNA ao ser eluído através da coluna. A eluição foi feita colocando-se 50µL de água livre de RNAse na coluna e centrifugando o conjunto por 1 minuto a temperatura ambiente em 12.000 rpm. Desprezou-se então a coluna e, no tubo de 1,5mL, obteve-se 50 µL de solução contendo RNA viral extraído que foi identificado e estocado à –70°C até o momento do uso. No caso de amostras sanguíneas ou de víscera, na etapa após o Trizol-LS, foi realizada centrifugação por 10min a 4°C antes de se acrescentar o clorofórmio. Reação em cadeia mediada pela polimerase em tempo real (RT-qPCR). Para realização da técnica da RT-qPCR foi utilizado o Kit comercial TacMan onestep RT-PCR Master Mix reagents (Applied Biosystem, EUA). A reação foi realizada em um equipamento ViiATM Real Time PCR System (Applied Biosystem, Carlsbad, CA, EUA). A técnica foi adaptada para o protocolo, usando os iniciadores específicos selecionados conforme quadro a seguir. Quadro 6 – Iniciadores usados na reação de RT – qPCR. Oligonucleotídeos iniciadores e Sonda Sequência (3’ – 5’) MAYqPCR – 1Foward CGCGTGCCATGCGGGGA MAYqPCR – 1Reverse GGCGGTGATCGGCAGCGT MAYqPCR SONDA [FAM] CGCCACGGTACGACCACGCA[BHQ1] Tamanho 200 pb As reações foram definidas para um volume final de 10 µL contendo os reagentes do quadro a seguir: Quadro 7: Reagentes e respectivos volumes e concentrações que constituem a solução Mix para realização do protocolo RT-qPCR para VMAY. Reagentes Volume para uma reação Hot Start Master Mix 5 µL H 20 1,84 µL M-MLV 0,08 µL RNAse inibitor 0,08 µL Primer F (10 µM) 0,5 µL Primer R (10 µM) 0,5µL Sonda (5 µM) 0,5µL ROX (1:10) 0,5µL Amostra viral (RNA) 2 µL Volume total 10 µL O protocolo foi desenvolvido conforme a sequencia abaixo: RT= 48°C por 30 min; PCR=95°C por 5 min; 95°C por 15 segundos, e 60° C por 45 segundos. O protocolo foi ajustado para 35 ciclos. A técnica proposta neste estudo utiliza o sistema TaqMan que se baseia no uso de uma sonda dirigida para uma região interna da sequência que se deseja amplificar. Esta sonda possui um fluoróforo ligado covalentemente na extremidade 5’ e um quencher localizado na extremidade 3’. O quencher tem a função de captar a fluorescência emitida pelo fluoróforo, arrefecendo-a. Entretanto, isto ocorre somente quando o quencher está próximo ao fluoróforo. Portanto, a fluorescência emitida pelo fluoróforo é inibida pelo quencher. Porém, quando o fluoróforo e o quencher estão distantes, a fluorescência não é inibida pelo quencher e poderá ser então captada pelo termociclador quantitativo. No experimento, o fluoróforo usado foi a carboxifluoresceína (FAM) e como quencher foi utilizado o MGB (Minor Groove Binder). O sistema TaqMan se baseia na ação de exonuclease da polimerase. Primeiramente, a sonda hibridiza de maneira complementar, pareando-se a molécula do DNA. Depois disso um dos iniciadores hibridiza na região 5´ e avança, sintetizando e estendendo a nova fita complementar de DNA. Quando isto ocorre, a polimerase vai degradando a sonda à sua frente, liberando o fluoróforo da sonda e afastando-o do quencher, permitindo assim que o fluoróforo emita fluorescência que não poderá ser arrefecida pelo quencher. A fluorescência gerada será, então, captada pelo aparelho. Cada fluorescência é diretamente proporcional a uma nova fita. Na etapa preliminar dos testes do novo protocolo foi realizada a curva padrão de diluições seriais para confirmação de eficiência da reação a ser realizada nas etapas posteriores. Para este teste (validação dos oligonucleotídeos iniciadores e sonda), foram realizadas sete diluições seriadas em triplicata, a partir de amostra de pool de RNA extraído de vísceras de camundongo infectado com a cepa H743921 (cérebro, músculo esquelético, coração, fígado, rins e baço), tendo como controle negativo a extração de RNA oriunda de camundongo não infectado com o VMAY, além de água livre de RNAse como NTC. 2.3. ASPECTOS ÉTICOS A pesquisa foi realizada segundo os preceitos da Declaração de Helsinque e do código de Nuremberg, respeitadas as normas de pesquisa envolvendo seres humanos descritos na resolução CNS 196/96 e complementares vigentes quando da submissão do protocolo de pesquisa ao Comitê de Ética em Pesquisa – CEP. Foram utilizadas como amostras, alíquotas sorológicas armazenadas no laboratório de biologia molecular da SAARB. Assim sendo, não houve necessidade de contato com os pacientes, mas com seu material biológico previamente colhido e armazenado no IEC. Amostras de material obtida a partir de camundongos também faziam parte deste acervo. Todos estavam conservados a 70°C. O acesso e processamento das amostras somente foram realizados após a autorização formal do IEC, requisito necessário a aprovação do protocolo de pesquisa pelo CEP do mesmo Instituto, tendo sido aprovado através de parecer consubstanciado do referido comitê sob o protocolo de número de 0006/2012 em reunião realizada no dia 29 de março de 2012 cujo Certificado de Apresentação para Apreciação Ética-CAAE foi registrado sob o número 0049.o.072.00-12 (anexo 1). 3- RESULTADOS: Avaliando a sensibilidade do teste, verificou-se eficiência de 103,%, R²: 0,92 e inclinação da curva padrão (Slope) de -3,252 conforme observado na Figura 8. Figura 8: Curva padrão com diluições seriais de 1:1 de RNA positivo para VMAY, sendo a concentração inicial de 50 ng, demonstrando a eficiência da reação. Todas as 13 cepas de VMAY que haviam sido isoladas e confirmadas como positivas pelo método padrão ouro de diagnóstico (isolamento viral) foram detectados pelo teste ora proposto, ou seja, o protocolo foi capaz de detectar 100% das cepas previamente confirmadas pelo teste de referência conforme pode ser observado na tabela 01. Tabela 01: Cepas de VMAY testadas através do protocolo de RT-qPCR para identificação de VMAY em amostras isoladas a partir de surtos ocorridos em diferentes municípios do Estado do Pará confirmados por isolamento viral. Protótipo Amostras Positivas STM H342906 BNV H505372 CAR H394874 CAR H342915 BEL H744141 BEL H505465 SBA H744173 SBA H745587 PPS H758762 PPS H731607 SBA H742831 SBA AR344910 SBA AN345007 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 TOTAL 13 (100%) Amostras Negativas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 (0%) Figura 09: Cepas de VMAY testadas através do protocolo de RT-qPCR para identificação de VMAY em amostras isoladas a partir de surtos ocorridos em diferentes municípios do Estado do Pará confirmados por isolamento viral. Ao se avaliar possíveis cruzamentos com outros vírus circulantes na região e importantes no diagnóstico diferencial com VMAY (sintomatologia similar e circulação em área favorável a presença do vírus Mayaro), verificou-se que nenhuma das amostras apresentou reação cruzada utilizando-se o método deste protocolo conforme é possível observar na tabela 02. Tabela 02: Desempenho do RT-qPCR-TaqMan com outros vírus circulantes na região analisada e com sintomatologia similar ao VMAY. Vírus Amostras Positivas Amostras Negativas VAUR 0 1 VMUC 0 1 VPIX 0 1 VORO 0 1 VEEE 0 1 VWEE 0 1 VFA 0 1 VDEN-1 0 1 VDEN-2 0 1 VDEN-3 0 1 VDEN-4 0 1 VRUB 0 1 0 (0%) 12 (100%) TOTAL Paralelamente, foi realizada testagem de 81 amostras que haviam sido confirmadas como negativas através do teste padrão-ouro (isolamaneto viral) de identificação laboratorial de VMAY. Nesta etapa todas as amostras testadas apresentavam resultados negativos diante do novo protocolo. O novo protocolo proposto, portanto, apresentou convergência de 100% com o método de referência de diagnóstico do VMAY diante de amostras negativas conforme pode ser evidenciado na tabela 03. Tabela 03: Desempenho do RT-qPCR-TaqMan em amostras sanguíneas de pacientes de diversos municípios do Estado do Pará que apresentavam sintomatologia compatível com infecção por VMAY e negativos para o isolamento viral. Amostras Testadas Número de Amostras Percentual Amostras Positivas 0 0% Amostras Negativas 81 100% 81 100% TOTAL Da tabela 01 apresentada anteriormente pode-se inferir a sensibilidade do método a qual expressa a probabilidade do teste em culminar com resultados positivos na presença do RNA viral, ou seja, avalia a capacidade da RT-qPCR-TaqMan em detectar o ácido nucleico do vírus presente nas amostras testadas. Das tabelas 02 e 03 pode-se inferir a especificidade do protocolo, qual seja, a de expressar resultados negativos na ausência do VMAY. A tabela 02 confirma o não cruzamento do teste com outros vírus, principalmente arbovírus circulantes na região permissiva ao ciclo do vírus. A tabela a seguir (tabela 04) sintetiza as informações de especificidade e sensibilidade do método, levando-se em conta os testes confirmados por isolamento viral (padrão-ouro de diagnóstico). Nesta tabela não foram incluídas as amostras que serviram para avaliar possíveis reações cruzadas de outros vírus ao teste proposto apresentadas na tabela 02. Tabela 04: Sensibilidade e Especificidade do protocolo de RT-qPCR para diagnóstico molecular do vírus Mayaro. Isolamento Viral Positivo Isolamento Viral Negativo TOTAL RT-qPCR Positivo 13 (100%) 0 (0%) 13 RT-qPCR Negativo 0 (0%) 81 (100%) 81 13 81 TOTAL 94(100%) Assim sendo, é possível observar 100% de concordância na sensibilidade entre os métodos de referência e o protocolo de RT-qPCR-TaqMan proposto. Da mesma forma, foi observado que os dois métodos apresentam 100% de especificidade a considerar a metodologia empregada. A sensibilidade (S) e a especificidade (E) do teste em estudo foram determinados utilizando a fórmula descrita abaixo conforme Ayres et al.(2005), empregando o painel de resultados descrito na tabela 4. Seguindo a orientação destes autores utilizou-se a fórmula a seguir: S = VP x 100 ( VP+FN ) E = VN x 100 (VN+FP) Onde: VP = resultados verdadeiro-positivos; FN= resultados falso - negativos; VN= resultados verdadeiro - negativos; FP= resultados falso-positivos. Aplicando-se aos valores obtidos no teste tem-se os resultados a seguir: S = 13 x 100 =100% (13+0 ) E = 81 x 100 = 100% (81+0) Outra etapa importante para a testagem do protocolo foi a possível detecção do RNA viral em amostras de vísceras de camundongos após diferentes períodos de infecção pelo vírus Mayaro. Neste protocolo optou-se em avaliar a presença (detecção) de RNA viral em amostras de vísceras de camundongos infectados a cada ciclo de 24 horas pós-infecção que envolveu o período total de cinco dias após inoculação do vírus no camundongo. Após testagem foi possível verificar que o protocolo mostrou-se sensível em detectar o ácido nucleico viral nos diferentes dias após infecção pelo vírus Mayaro conforme pode ser observado na tabela 05. Nesta etapa foram testadas suspensões de RNAs virais (pool) das seguintes vísceras: cérebro, coração, fígado, rins, baço e músculo esquelético. Foi realizada ainda testagem isolada de RNA do cérebro de camundongo infectado experimentalmente nos diferentes dias após infecção. Ambos os testes apresentaram resultados positivos diante do RT-qPCR. Tabela 05: Desempenho do RT-qPCR-TaqMan em camundongos experimentalmente. Teste realizado em diferentes dias pós inoculação do vírus. Dias pós-infecção Amostras Positivas infectados Amostras Negativas 1° dia 1 0 2° dia 1 0 3° dia 1 0 4° dia 1 0 5° dia 1 05 (100%) 0 0 (0%) TOTAL Figura 10: Desempenho do RT-qPCR-TaqMan em camundongos experimentalmente. Teste realizado em diferentes dias pós inoculação do vírus. infectados Tratamento Estatístico: Diante dos resultados obtidos (100% de convergência) nas diferentes fases do protocolo proposto não foi necessário tratamento estatístico complementar. 4- DISCUSSÃO As arboviroses ainda são causa de preocupação em várias regiões do mundo, com impactos importantes para o indivíduo e a coletividade. Em que pese características epidemiológicas e clínicas não serem tão exuberantes como as da Dengue e Febre Amarela, a possibilidade da infecção pelo VMAY tornar-se um transtorno mais sério é tema de discussão científica pertinente. A necessidade de um teste diagnóstico mais rápido, sensível e com especificidade satisfatória, representa uma estratégia de antecipação às possíveis mudanças no comportamento epidemiológico deste vírus diante das evidências de potencial disseminação deste agente para áreas de grande densidade populacional. É uma patologia que até então se apresenta com surtos que em geral não ultrapassam 100 indivíduos e que tem no ambiente de florestas de regiões tropicais as condições mais favoráveis à sua circulação e manutenção. Nestas áreas a densidade populacional também é menor, fator que representa condicional limitante a uma maior expansão humana do vírus. Em inquérito soroepidemiológico (Cruz et al, 2009) realizado por pesquisadores do IEC na área de influência do Projeto Juruti, Estado do Pará-Brasil foram avaliados 1.597 soros humanos que ainda não significam um achado definitivo em relação a sua expressiva disseminação, mas este estudo aponta para a preocupação de vigilância antes de intensas ações antrópica nestas áreas que posteriormente teriam maior presença humana como a do referido projeto. Os trinta e três casos confirmados de infecção por Mayaro na cidade de Manaus representam um alerta nada desprezível para a vigilância epidemiológica. Esta é maior cidade da Amazônia brasileira em termos populacionais com mais de um milhão e oitocentos mil habitantes, sendo a sétima mais populosa do país. Autores como Mourão et al (2012) considerando todo o contexto epidemiológico afirmam que estes casos representam a ponta de um iceberg e que, provavelmente, um número muito mais expressivo de casos ocorreram neste mesmo período do estudo. Em 2006, no município de São José do Rio Preto no Estado de São Paulo, um surto de Encefalite de Saint Louis teria sido perdido, pois coincidiu com um grande surto de Dengue na região. Isto teria acontecido se não houvesse um laboratório ativo de vigilância de vírus emergentes (Mondini et al., 2007). A possibilidade de episódios semelhantes terem acontecido em relação ao VMAY na Amazônia não seria algo a se desconsiderar, principalmente, levando-se em conta a biodiversidade viral encontrada na região. Pesquisas são necessárias para entender o potencial dessas e de outras arboviroses a surgirem no futuro. É importante ter disponíveis as estratégias de controle e exames diagnósticos eficientes que façam parte destas medidas, pois ao invadir novas áreas geográficas este vírus certamente irá se tornar um problema muito maior de saúde pública (Weaver & Reisen, 2010). O estudo de Lanciotti et al. (2007), avaliando amostras sorológicas de cidadãos que viajaram para áreas endêmicas de VCHIK (Índia e África) confirmaram a necessidade de um método diagnóstico com alta especificidade, sensibilidade e rápido. Ratificam em seu estudo realizado no CDC (Centers for Disease Controle and Prevention-EUA) que pessoas que viajaram para estas áreas e apresentaram quadro infeccioso dentro da fase virêmica deveriam ter seu diagnóstico realizado por um método rápido e seguro como a RT-qPCR. Desta forma limitariam a possível transmissão deste vírus em solo americano, haja vista possuir este país os vetores necessários a sua disseminação. Embora o estudo supramencionado esteja relacionado ao VCHIK, devemos também toma-lo como referência, pois se enquadra em um perfil endêmico-epidêmico, além das características da infecção que se assemelha muito a infecção pelo vírus Mayaro. Nesta perspectiva, o protocolo aqui proposto demonstrou qualidade necessária para detecção do VMAY precocemente quando diante de suspeita clínica ou quando tratar-se de estudos investigativos. Com alta especificidade e sensibilidade configura-se como uma destas ferramentas importantes para a identificação de surtos de infecção por arbovírus, neste caso de VMAY. Em relação ao método de detecção deste vírus, é importante destacar que no estudo de Mácola (2012) utilizando RT-qPCR através de técnica de SYBR Green para detecção de VMAY observou-se que esta técnica não seria recomendada, devido a formação de dímeros de oligonucleotídeos, dificultando a diferenciação das amostras positivas e negativas (especificidade). Por seu turno, o protocolo de RT-qPCR desenvolvido em nosso estudo utilizando a técnica TaqMan, respondeu adequadamente tanto em termos de especificidade como de sensibilidade diante de amostras previamente testadas pelo padrão de referência para o diagnóstico laboratorial de VMAY. Ho et al. (2013) propuseram um método de detecção e validação de RT-qPCR para o Vírus chikungunya, utilizando a técnica de SYBR Green. Este protocolo mostrou-se apropriado para detecção do ácido nucleico viral do VCHIK. Embora se utilizando de técnica diferente e vírus diferente, suas conclusões corroboram com os resultados obtidos em nosso estudo. Afirmam estes autores que o método de RT-qPCR garante vantagens importantes para as condições de correta indicação da técnica, tais como, a rapidez, a análise quantitativa, baixa taxa de contaminação, alta sensibilidade, alta especificidade e fácil padronização. O sistema TaqMan tem vantagens muito importantes em termos laboratoriais, pois além do par de oligonucleotídeos iniciadores, possui uma sonda que em seu conjunto garantem uma grande especificidade. Ao considerar o tempo para a realização da técnica, se pode estimar que da extração de RNA viral da amostra ao processamento final no equipamento, o método dispende aproximadamente de quatro a cinco horas, o que garante uma vantagem bastante superior aos outros métodos em termos de eficiência. Ao se avaliar possíveis reações cruzadas diante de vírus circulantes na região verificou-se que o método também demonstrou especificidade satisfatória. É importante lembrar que neste grupo de vírus testados foram incluídos aqueles mais frequentes e que tinham sintomatologia similar a da infecção pelo VMAY. Como pôde ser observado, o estudo testou amostras de vísceras de camundongos do primeiro ao quinto dia após infecção e detectou o ácido nucleico do VMAY em todos os intervalos. Este período corresponde a fase aguda da infecção nos camundongos, entretanto, há necessidade de aprofundar esta importante etapa de diagnóstico estendendo este período até o momento em que não seria possível detectar o RNA viral, ou seja, testar amostras além do quinto dia. Todas as amostras de vísceras testadas, entretanto, tiveram como limite o quinto dia após a infecção, pois os camundongos inoculados haviam ido a óbito após este quinto dia. Achados de Miranda (2013) em relação a detecção de RNA viral de VMAY são coincidentes em se apresentarem positivos para RT-PCR até o terceiro dia. Neste estudo a autora avaliou amostras virais de origem humana e de artrópode, porém não foram realizadas análise após o terceiro dia. Vasconcelos et al., (2009) avaliaram que a fase virêmica da doença é de aproximadamente sete dias e que após 72 horas a produção de anticorpos neutralizantes é capaz de reduzir drasticamente os vírus circulantes no organismo humano. Embora o modelo adotado no experimento seja importante (camundongos), a coleta de amostras em humanos num intervalo maior, certamente traria respostas mais consistentes a responder esta questão. O modelo animal adotado (camundongos suíço recém-nascidos) também oferece uma condição muito favorável ao vírus, aquela relacionada a imaturidade do sistema imunológico desses animais o que garantiria uma preservação do vírus circulantes por um período mais prolongado. Este fenômeno teria maior restrição em organismo humano imunocompetente, o que provavelmente está na relação direta da curta viremia do Mayaro em humanos. Nossos resultados apontam ainda para uma precoce detecção de RNA viral, qual seja aquela após 24 horas de inoculação no camundongo. Estes achados são coincidentes com Miranda (2013) ao tomar como modelo o mesmo hospedeiro. Autores como Brown et al., em 1996 já destacavam esta possibilidade diante de vírus da Dengue utilizando-se de protocolo de RT-qPCR com a técnica TacMan em amostras sorológicas. Em estudo apresentado na 28ª Reunião Anual da Federação de Sociedades de Biologia Experimental, Carvalho (2013) utilizando marcadores fluorescentes no vírus e inoculando em cultura de células VERO demonstrou que da adsorção do vírus na célula alvo ao desnudamento do capsídeo no citoplasma desta célula, este vírus leva apenas três minutos em média. Este fato pode representar uma estratégia de invasão mais eficiente e que poderia redundar em um ciclo também mais curto que importaria em replicação e viremia mais precoces também, portanto passíveis de detecção mais precoce. Sobre este aspecto levantado, é importante ainda destacar outro aspecto de algumas arboviroses: vírus como VCHIK poderiam ter um período de permanência circulante mais longo no organismo. Labadie (2010) inoculou experimentalmente este vírus (VCHIK) em macacos e em seu estudo pôde verificar que o RNA viral podia ser detectado em até 55 dias após a infecção. De maneira semelhante, Suhrbier & Linn (2004) inocularam o VROC (um flavivirus) em primatas não humanos e constataram a presença de RNA viral em histiócitos sinoviais até cinco semanas após o período sintomático da doença. A permanência prolongada destes dois vírus (VCHK e VROC) nestes modelos animais, entretanto, ainda não foi observada na infecção pelo vírus Mayaro. Segundo Ho et al.(2013), a aplicação de RT-PCR no diagnóstico molecular tem gradualmente substituído o tradicional método de cultivo celular como padrão ouro de detecção viral. Ressalte-se, entretanto, a correta indicação do método para sua aplicação adequada, considerando o curto período de viremia. O mais importante, no entanto, diante de situações mais críticas de controle da infecção na população, é ter disponíveis ferramentas adequadas ao seguro e rápido diagnóstico, minimizando as consequências negativas para o indivíduo e coletividade. Posto o método desenvolvido, propõe-se sua validação. 5- CONCLUSÕES - O protocolo proposto no estudo mostrou-se capaz de detectar através da RT-PCR em Tempo Real em termos de eficiência, sensibilidade e especificidade para os oligonucleotídeos iniciadores e sonda avaliados frente a amostras testadas. A sensibilidade e especificidade da técnica de RT-qPCR através do sistema TaqMan foi concordante àquela apresentada pelo método de referência (isolamento viral em cultura de células) usada no diagnóstico laboratorial do VMAY. - A técnica de RT-qPCR através do sistema TaqMan desenvolvida e aplicada neste estudo, mostrou-se satisfatória na detecção específica do VMAY nos cinco primeiros dias pósinfecção em camundongos infectados experimentalmente. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: ANDERSON, C. R., DOWNS, W.G., WATTLEY, G.H, AHIN, N.W., REESE, A.A., Mayaro virus: a new human disease agent. II. Isolation from blood of patients in Trinidad. American Journal Tropical Medicine and Hygiene., v.6, n.6, Nov, p.1012-6, 1957. AYRES, M., AYRES JR, M., AYRES, D.L., SANTOS, A.S.S. Bioestat 4.0: aplicações estatísticas nas áreas das ciências biológicas e médicas. Belém: Sociedade Civil Mamirauá; Brasília CNPq, 2005. 290p. 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