Michele de Souza Bastos Barrionuevo

i
UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS
FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
DOUTORADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
DIAGNÓSTICO DE VÍRUS CAUSADORES DE INFECÇÃO NO SISTEMA
NERVOSO CENTRAL EM UMA UNIDADE TERCIÁRIA DE SAÚDE NO ESTADO
DO AMAZONAS
MICHELE DE SOUZA BASTOS BARRIONUEVO
Manaus
2012
ii
MICHELE DE SOUZA BASTOS BARRIONUEVO
DIAGNÓSTICO DE VÍRUS CAUSADORES DE INFECÇÃO NO SISTEMA
NERVOSO CENTRAL EM UMA UNIDADE TERCIÁRIA DE SAÚDE NO ESTADO
DO AMAZONAS
Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Medicina Tropical da
Universidade do Estado do Amazonas em
convênio com a Fundação de Medicina
Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para
obtenção do grau de doutor em Doenças
Tropicais e Infecciosas
Orientador (a): Profa Dra. Maria Paula Gomes Mourão
MANAUS
2012
iii
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Central da Universidade do Amazonas
B276d
Barrionuevo, Michele de Souza Bastos.
Diagnóstico de vírus causadores de infecção no sistema
nervoso central em uma Unidade Terciária de Saúde no Estado
do Amazonas /Michele de Souza Bastos Barrionuevo: UEA,
2012.
104 p.: il.; 30 cm
Orientador: Maria Paula Gomes Mourão
Tese (Doutorado em Doenças Tropicais e Infecciosas)
Universidade do Estado do Amazonas, Manaus, 2012.
Inclui bibliografia
1. Meningoencefalite. 2. Infecções agudas – Sistema Nervoso. 3.
Herpesvírus. 4. Arbovírus. 5. Enterovírus I. Mourão, Maria Paula
Gomes. II. Universidade do Estado do Amazonas. III. Título
iv
FOLHA DE JULGAMENTO
DIAGNÓSTICO DE VÍRUS CAUSADORES DE INFECÇÃO NO SISTEMA
NERVOSO CENTRAL EM UMA UNIDADE TERCIÁRIA DE SAÚDE NO ESTADO
DO AMAZONAS
MICHELE DE SOUZA BASTOS BARRIONUEVO
“Esta Tese foi julgada adequada para obtenção do Título de Doutor em Doenças
Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de PósGraduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em
convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado”
Banca Julgadora:
____________________________________________
Profa Maria Paula Gomes Mourão, Dra.
Presidente
________________________________________
Prof. Luiz Tadeu Moraes de Figueiredo, Dr.
Membro
_______________________________________
Prof. Marcelo Cordeiro dos Santos, Dr.
Membro
_____________________________________
Prof. Maurício Lacerda Nogueira, Dr.
Membro
______________________________________
Prof. Wornei Silva Miranda Braga, Dr.
Membro
v
Dedicatória
“A minha mãe, Maria José de S. Bastos; a minha avó,
Francisca P. de Souza, pelos melhores conselhos
pelos bons exemplos e incentivos sempre.”
vi
Agradecimentos
Em primeiro lugar aos meus meninos, por todos os momentos em que estiveram ao
meu lado, pela paciência, pelo incentivo e por toda alegria que trouxeram e trazem a
minha vida: Cesar Leiva, meu marido; Caio Cesar e Enzo, meus filhos.
Aos meus irmãos, Ritta Bastos e Alessandro Bastos; à minha cunhada Lourdes
Colares e a minha sobrinha, Salomé Bastos, por serem sempre carinhosos,
incentivadores e solidários.
Às minhas amigas Roselene Martins, Lauramares Aranha, Hildes Delduque e
Regismeire Viana, pela amizade constante desde o mestrado, pelo incentivo, pela
presença e pelo apoio nos momentos de difícil decisão.
Aos meus professores orientadores da iniciação científica, Dra. Regina Luizão, Dra.
Ângela Líbia e Dr. Adalberto Val que, pela dedicação e ensinamentos, despertaram
em mim o interesse pela pesquisa.
À minha orientadora, Dra. Maria Paula Gomes Mourão, não somente pela idéia
central deste tema, mas também por ter acreditado, incentivado e orientado de modo
preciso, este trabalho.
À Rossicléia Lins Monte, por ter acreditado, incentivado, e pela primorosa triagem
das amostras.
À Dra. Regina Figueiredo, pela amizade, pelo incentivo constante e pela doação dos
primeiros recursos, para que este trabalho fosse adiante.
Ao amigo, Dr. Felipe Naveca, pela paciência, pelas minuciosas orientações
metodológicas e pela amizade que se solidificou ao logo deste trabalho.
Ao professor Luiz Tadeu Figueiredo pelos ensinamentos preciosos e pelas
experiências compartilhadas e, sobretudo, pelo carinho e incentivo constante.
Ao Dr. Rajendranath Ramasawmy, pelas orientações metodológicas e correções dos
textos em inglês e, especialmente, pelo incentivo, tolerância e amizade.
Ao Dr. Milton Moraes, pela orientação e ensinamentos de biologia molecular básica.
Aos professores doutores, Edson Elias da Silva e Eliane Veiga da Costa,
responsáveis pelo laboratório Referência Nacional de Enteroviroses, por terem me
recebido com todo carinho e pelo treinamento em cultivo celular de enterovirus.
À minha querida amiga Valquíria do Carmo Rodrigues Alves, pela presença
constante em minha vida, pela participação e apoio e por ter sido uma grande
companheira durante minha jornada academia.
vii
Às minhas preciosas alunas Natália Lessa e Valéria Kramer, não apenas pela
dedicação, participação ativa nos experimentos deste estudo mas, sobretudo, pelo
carinho e amizade.
À minha amiga, Jainara Cristina Alves, pelo apoio e carinho sempre.
Ao Dr. Sérgio Nozawa, por ter cedido gentilmente seu laboratório para o
sequenciamento das amostras.
A todos os professores do Curso de Pós-Graduação em Medicina Tropical, pelos
preciosos ensinamentos.
À Conceição Tufic e Altariza Freitas (Iza), secretárias do PPGMT, pela colaboração
e apoio sempre.
À Universidade do Estado do Amazonas e ao Programa de Pós-Graduação em
Medicina Tropical, por terem me acolhido e dado suporte para que este trabalho
fosse realizado.
Aos colegas da Gerência de Virologia da FMT-HVD, Dr. Wornei Braga, Dra. Cintia
Mara Oliveira, Dra. Márcia Castilho, Elisabeth Galusso, Evaulino Itapirema, Liane
Calado e alunos de graduação e pós-graduação Carol, Marcela, Sérgio e Renata,
pelo apoio constante e convívio agradável.
À Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, por permitir a realização
deste estudo.
À Dra. Leni Marreiros, Marlise Santana e Roosevelt Oliveira, pela pronta e eficiente
colaboração sempre que foi necessária.
À todos os colegas da pós-graduação, pela convivência agradável, pelo crescimento
e amadurecimento conjuntos.
À FAPEAM, que oportunamente financiou este projeto de pesquisa e concedeu a
bolsa de estudo.
À SUFRAMA, CAPES E FMURAKI, agências financiadoras e colaboradoras do
PPGMT.
viii
“A coisa mais importante na vida é ter uma grande meta
e possuir aptidão e perseverança para atingi-la”.
Goethe
ix
Resumo
As infecções agudas do sistema nervoso central são uma emergência médica e a
maioria é causada por vírus. Dentre estes, os mais importantes são os herpesvírus
humano os enterovírus e os arbovírus. A situação epidemiológica observada nos
últimos quatro anos na cidade de Manaus revelou uma incidência de 21% de casos
de meningites de provável etiologia viral, sem identificação do agente etiológico.
Sendo assim, o objetivo principal deste estudo foi identificar agentes virais que
causam infecção no sistema nervoso central em pacientes atendidos em uma
Unidade Terciária de Saúde no Amazonas, a Fundação de Medicina Tropical Dr.
Heitor Vieira Dourado, no período entre janeiro de 2010 a agosto de 2012. Durante a
etapa deste estudo um total de 165 amostras de LCR foram testadas por métodos
de diagnóstico molecular, tais como PCR e RT-PCR para identificação dos agentes
virais. A média de idade destes pacientes foi de 27,2 anos; 91 (55,1%) eram do sexo
masculino; 41 (24,8%) eram menores de 15 anos. O genoma de um ou mais
agentes virais foi detectado em 49 (29,7%) das 165 amostras de LCR coletadas. Os
enterovirus foram os mais prevalentes, sendo detectados em 16 (32,6%) das
amostras positivas, seguido pelos EBV em 11 (22,4%), VZV em 10 (20,4%), CMV
em 9 (18,4%), HSV-1 e HSV-2 em 2 (4,1%) cada, e pelos arbovirus em sete (14,3%);
quatro vírus dengue (DENV); e três vírus Oropouche (OROV). A detecção de
infecção simultânea por dois diferentes vírus, causando meningoencefalite, foi
identificada em 8 (16,4%) dos pacientes analisados, sendo mais frequente a
associação de CMV/VZV e EVs/EBV. Trata-se do primeiro estudo, na Amazônia
Ocidental Brasileira, para detecção e monitoramento de infeções virais no sistema
nervoso central que revela a importância desta abordagem para o manejo
apropriado dos pacientes afetados pela doença e para o planejamento das políticas
públicas de saúde.
Palavras chave: Meningoencefalite, arbovírus, enterovírus, herpesvírus, diagnóstico
molecular.
x
Summary
Acute infections of the central nervous system (CNS) are an important cause of
medical emergency. Most are due to viruses, especially the human herpesvirus,
enteroviruses and arboviruses. Epidemiology surveillance during the recent four
years in the city of Manaus revealed an incidence of 21% of meningitis of probable
viral etiology. However, the viral agents were not identified. The main aim of this
study was to identify the viruses that caused infections of the CNS in patients
enrolled in a Tertiary Health Unit of the state of Amazonas, the Fundação de
Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, from January 2010 through August
2012. A total of 165 samples of cerebrospinal fluid (CSF) was submitted for viral
molecular diagnostic by Polymerase Chain Reaction and Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction. The mean age of the patients was 27.2 years. Of the
165 patients, 41 (24.8%) were below 15 years and 91 (55.1%) were male. In 49
samples (29.7%), the viral agents’ genomes were identified. Among these patients,
11 were >15 years, 9, 6 and 5 suffered from encephalitis, meningitis and
meningoencephalitis respectively. Co-infections (CMV/VZV; VZV/EBV; CMV/EVs and
EBV/EVs) were detected in 16,4%. Enteroviruses (16/49; 32.6%) were the most
prevalent, followed by EBV (11/49;22.4%), VZV (10/49;20.4%) CMV (9/49; 18.4%),
HSV-1 (2/49; 4.1%), HSV-2 ((2/49; 4.1%), and the arbovíruses (7/49;14.3%). Of the
arboviruses, 4 were of dengue virus (3 DENV-2 and 1 DENV-1) and 3 of the
oropouche virus (OROV). This is the first time such a study has been undertaken for
the identification of viral agents causing infections of the CNS in the Brazilian
Occidental Amazon. The detection of different viruses in the CNS of patients with
meningitis or encephalitis highlights the importance of maintaining a system of active
laboratorial monitoring diagnostics with rapid methodology of high sensitivity in areas
of viral hyperendemicity such as Manaus.
Keywords: Meningoencephalitis, arbovirus, enterovírus, herpesvírus, molecular
diagnostic.
xi
Lista de Abreviaturas
AIDS
CMV
cDNA
DNA
DENV
DENV-1
DENV-2
DENV-3
DENV-4
EBV
EEEV
EV
FMT-HVD
HEV
HSV
HSV-1
HSV-2
JEV
LCR
LACV
MHC
MAC-ELISA
NHE
OROV
PCR
PV
RNA
RT-PCR
ROCV
SLEV
SMV
SNC
TBEV
VZV
VEEV
WNV
WEEV
Síndrome da imunodeficiência adquirida
Citomegalovírus
DNA Complementar
Ácido Desoxirribonucléico
Vírus Dengue
Vírus dengue sorotipo 1
Vírus dengue sorotipo 2
Vírus dengue sorotipo 3
Vírus dengue sorotipo 4
Vírus Epstein-Barr
Vírus da Encefalite Equina do Leste
Enterovírus
Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado
Enterovírus Humano
Vírus herpes simples
Vírus herpes simples tipo 1
Vírus herpes simples tipo 2
Vírus da Encefalite Japonesa
Líquido Cefalorraquidiano
Vírus Lacross
Complexo de Histocompatibilidade Principal
Ensaio imunoenzimático para captura de IgM
Núcleo Hospitalar de Epidemiologia
Vírus Oropouche
Reação em Cadeia da Polimerase
Poliovírus
Ácido Ribonucléico
Transcrição Reversa – Reação em Cadeia da Polimerase
Vírus Rocio
Vírus da Encefalite de Saint Louis
Síndrome da Meningoencefalite Viral
Sistema Nervoso Central
Tick-borne encephalitis vírus
Vírus Varicela Zoster
Vírus da Encefalite Equina Venezuelana
Vírus do Oeste do Nilo
Vírus da Encefalite Equina do Oeste
xii
Lista de Figuras
Figura 1:
Figura 2:
Figura 3:
Distribuição dos casos de meningites, por etiologia, atendidos em uma
unidade terciária de saúde do Estado do Amazonas, a Fundação de
Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, entre 2007 e
2010................................................................................................................
03
Representação
esquemática
do
ciclo
de
vida
dos
arbovírus.........................................................................................................
14
Algoritmo de processamento das amostras de LCR para identificação
viral.................................................................................................................
44
xiii
Lista de Tabelas
Tabela 1:
Agentes causadores de doença neurológica, distribuídos de acordo com o
material genético, DNA e RNA ..............................................................
05
Distribuição dos Herpesvirus de acordo com a doença, epidemiologia,
transmissão e rotas de acesso ao sistema nervoso central ........................
06
Classificação dos vírus da família Herpesviridae em subfamília, gênero,
nome popular e latência ..............................................................................
07
Tabela 4:
Propriedades biológicas das subfamílias dos Herpesviridae .......................
08
Tabela 5:
Distribuição dos vírus RNA, de acordo com a doença, epidemiológia,
vetor e rotas de acesso ao sistema nervoso central ...............................
15
Características do líquido cefalorraquidiano nas infecções bacterianas e
virais ...................................................................................................
25
Tabela 7:
Relação dos vírus investigados na pesquisa.................................................
32
Tabela 8:
Relação dos iniciadores utilizados para detectar os vírus da família
Herpesviridae................................................................................................
34
Tabela 9:
Relação das cepas virais utilizadas como controle.......................................
36
Tabela 10:
Relação dos iniciadores utilizados para detecção dos gêneros Alphavirus,
Flavivirus e Orthobunyavirus........................................................................
38
Relação dos iniciadores espécie-específicos utilizados no utilizados no
estudo para identificação dos Alphavirus, Flavivirus e Orthobunyavirus ....
40
Relação
dos
iniciadores
utilizados
para
detecção
dos
Enterovirus...................................................................................................
43
Tabela 2:
Tabela 3:
Tabela 6:
Tabela 11:
Tabela 12:
xiv
Sumário
1 INTRODUÇÃO
1.1 Apresentação do problema..........................................................................
1.2 A doença......................................................................................................
1.3 Etiologia das meningoencefalites virais.......................................................
1.3.1 A família Herpesviridae.............................................................................
1.3.2 Estrutura viral............................................................................................
1.3.3 Replicação viral.........................................................................................
1.3.4 Vírus herpes simples.................................................................................
1.3.5 Vírus varicela zoster..................................................................................
1.3.6 Vírus epstain-barr......................................................................................
1.3.7 Citomegalovirus.........................................................................................
1.4 Arbovírus......................................................................................................
1.4.1 Família Flaviviridae...................................................................................
1.4.2 Família Togaviridae...................................................................................
1.4.3 Família Bunyaviridae.................................................................................
1.4.4 Família Picornaviridae...............................................................................
1.5 Diagnóstico Laboratorial..............................................................................
02
04
06
06
07
09
09
11
11
12
13
15
19
20
22
24
2 OBJETIVOS
2.1 Geral.............................................................................................................
2.2 Específicos...................................................................................................
28
28
3 MATERIAL E METÓDOS
3.1 Tipo de Estudo.............................................................................................
3.1.1 Participantes do Estudo............................................................................
3.1.2 Critérios de Inclusão..................................................................................
3.1.3 Critérios de Exclusão................................................................................
3.1.4 Critério de Exclusão a posteriori...............................................................
3.1.5 Aspectos éticos.........................................................................................
3.2 Seleção dos pacientes e coleta do material biológico.................................
3.3 Algoritmo de investigação e diagnóstico......................................................
3.4 Diagnóstico Molecular................................................................................
3.4.1 Metodologia para identificação dos vírus DNA.........................................
3.4.1.1 Extração do DNA da amostra ...............................................................
3.4.1.2 PCR para identificação dos vírus da família Herpesviridae...................
30
30
30
30
30
31
31
31
33
33
33
33
xv
3.4.2 Metodologia para identificação dos Arbovírus..........................................
3.4.2.1 Cepas virais controle..............................................................................
3.4.2.2 Produção dos Estoque virais utilizados como controles........................
3.4.2.3 Isolamento viral em culturas celulares de mosquito A. albopictus.........
3.4.2.4 Extração do RNA viral............................................................................
3.4.2.5 Reação de Transcrição Reversa RT......................................................
3.4.2.6 Reação em Cadeia da Polimerase........................................................
3.4.2.7 Detecção dos gêneros Alphavirus, Flavivirus e Orthobunyavirus.........
3.4.2.8 Semi-Nested-PCR para identificação de Alphavirus e Flavivirus..........
3.4.2.9 Nested-PCR para identificação do vírus Oropouche.............................
3.4.3 Detecção do genoma viral dos Enterovirus..............................................
3.4.3.1 Tentativas de isolamento viral em culturas celulares...........................
3.4.3.2 Detecção do gênero Enterovirus por RT-PCR.......................................
3.5 Visualização dos produtos amplificados......................................................
3.6 Fluxograma simplificado da metodologia.....................................................
3.7 Sequenciamento Nucleotídeo......................................................................
34
34
35
35
36
36
37
37
39
39
41
41
41
43
44
45
4 RESULTADOS
Resultados estão apresentados na forma de artigo........................................
Artigo publicado..................................................................................................
Artigo enviado para publicação.........................................................................
46
47
52
5 CONCLUSÃO
5.1 Conclusão....................................................................................................
5.2 Considerações Finais..................................................................................
75
77
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................
78
ANEXOS
Anexo 1: Protocolo de aprovação do projeto no Comitê de Ética em
Pesquisa da FMT-HVD......................................................................................
Anexo 2: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido pós-informado............
Anexo 3: Protocolo de seguimento hospitalar dos pacientes com suspeita de
infecção viral no sistema nervoso central..........................................................
Anexo 4: Fluxograma para coleta e separação das amostras de LCR..............
96
98
102
105
1
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
1. Introdução
2
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
1.1 APRESENTAÇÃO DO PROBLEMA
As infecções do sistema nervoso central (SNC) atingem anualmente milhões
de pessoas em todo o mundo. Podem ser causadas por vírus DNA e RNA e são
responsáveis por um grande numero de doenças neurológicas (1). Dentre elas, as
mais frequentes são as meningites, encefalites e meningoencefalites (2), infecções de
grande importância, devido ao grande potencial em causar danos neurológicos e
morte(3).
Estas infecções manifestam-se, geralmente, por um quadro clínico de início
súbito, agudo e com alta gravidade por sua localização, dependendo do agente
etiológico. Por outro lado, os sinais e sintomas apresentados por estes pacientes
estão relacionados à irritação meníngea e/ou ao acometimento encefálico, com
cefaleia, alterações da consciência e crises convulsivas e, na maioria dos casos, não
permitem chegar, pelo quadro clínico, à etiologia. Também, deve-se ressaltar que
existe tratamento antiviral efetivo para o caso de algumas meningoencefalites por
vírus, como é o caso da herpética e da citomegalovirótica quando utilizado,
idealmente com precocidade, pode melhorar significantemente a evolução desses
quadros(4). Ainda, para outras meningoencefalites, como as por arbovírus e
enterovírus, o conhecimento etiológico pode gerar medidas epidemiológicas visando
ao controle de surtos(5). Neste contexto, deve-se ressaltar que o diagnóstico
laboratorial rotineiro destas infecções não costuma ocorrer na maior parte do Brasil,
apesar da sua enorme importância.
A identificação de agentes virais causadores de meningites no Brasil só tem
sido possível em algumas situações, como nos surtos, nas quais existe um esforço
conjunto para o esclarecimento do agente etiológico. Sendo assim, o sistema de
vigilância epidemiológica de meningites virais dispõe de poucos dados sobre os
principais agentes(6).
A Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD),
localizada na cidade de Manaus, estado do Amazonas, é um centro de referência
para doenças tropicais. O seu Núcleo Hospitalar de Epidemiologia (NHE) é
responsável por aproximadamente 80 a 90% das notificações de casos de
meningites conhecidos no município de Manaus. As meningites virais são
3
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
diagnosticadas neste hospital, como na maior parte do país, através da clínica,
citologia, bioquímica liquórica, e epidemiologia. No período entre 2007 a 2010 o NHE
da FMT-HDV, notificou, entre todos os casos de meningites, 21% de meningite com
suposta etiologia viral, porém sem diagnóstico etiológico definido (Figura 1).
Essa situação epidemiológica vivida no Brasil e mais especificamente no
Amazonas, demonstra a necessidade de desenvolver e padronizar metodologias
que possibilitem o diagnóstico confiável de agentes causadores da infecção no
sistema nervoso central.
M.Outras Etiologias
4%
M. Viral
21%
M. Não Especificada
6%
M. Bacteriana
66%
M. Tuberculose
3%
Fonte: SINAN/FMT-HVD
Figura 1: Distribuição dos casos de meningites, por etiologia, atendidos em uma
unidade terciária de saúde do Estado do Amazonas, a Fundação de Medicina
Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, entre 2007 e 2010.
4
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
1.2 A DOENÇA
As doenças infecciosas estão continuamente emergindo nas populações
humanas. Muitas destas infecções são reconhecidas como causa de doença
neurológica e 39% evoluem para quadros grave causando encefalite(7).
As infecções do sistema nervoso central podem ser classificadas segundo a
forma de apresentação, evolução clínica e região afetada do SNC. Neste aspecto,
as infecções são classificadas em meningites, encefalites e mielites.
Meningites são mais comuns na população pediátrica, cursando de forma
aguda com sinais meníngeos, cefaleia, fotofobia e febre. Geralmente é benigna, com
duração de, no máximo, duas semanas. Os enterovírus são os principais
responsáveis por casos de meningites virais em crianças(8).
Encefalite é um processo agudo, geralmente difuso, que acomete o encéfalo,
determinando alterações no nível de consciência, febre, convulsões e sinais
neurológicos focais. Dentre as causas estão os vírus, agentes etiológicos mais
importantes, destacando-se nos hospedeiros imunocompetentes os vírus do grupo
herpesvirus, arbovirus e enterovírus(9-11).
Mielite é a inflamação da medula espinhal e pode ser causada por vários
agentes incluindo os vírus e pode apresentar-se como paralisia flácida aguda ou
disfunção neurológica devido ao envolvimento da substancia branca. A infecção
mais proeminente da medula espinhal pode resultar na síndrome da mielite
transversa aguda, quando os indivíduos afetados exibem fraqueza, perda sensorial,
e comprometimento da bexiga urinária(12).
As infecções virais do sistema nervoso são quase sempre parte de uma
doença infecciosa sistêmica e generalizada. Assim, outros órgãos podem estar
envolvidos antes ou em associação com as manifestações clínicas do SNC, e as
evidências devem ser investigadas a partir da história ou durante o exame clínico do
paciente. Erupções cutâneas, por exemplo, são pouco frequentes em infecções
virais do sistema nervoso central, no entanto, podem estar relacionadas às infecções
por herpesvirus; sinais de doença gastrointestinal podem estar relacionadas à
enterovírus, também achados de infecção respiratória, como a gripe, podem
acompanhar infecções como encefalite pelo HSV-1(13).
5
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
Há uma variedade de vírus que podem invadir e causar doença no sistema
nervoso central, como observado na Tabela 1. Estes vírus estão agrupados de
acordo com o seu material genético, que é constituído por ácido ribonucleico (RNA)
ou ácido desoxirribonucleico (DNA)(14).
Tabela 1. Agentes causadores de doença neurológica, distribuídos de acordo com
material genético, DNA e RNA.
Doença neurológica
RNA vírus
DNA vírus
Meningites
Coxsackievirus
HSV-2 (associado com
herpes genital primária),
VZV
Echovirus
Caxumba (raro)
Encefalites
JE vírus
HSV-1 (adultos)
Coxsackievirus
HSV-2 (recém-nascidos)
Echovirus
Adenovirus, VZV, CMV
* Artropod-borne
EBV
WNV, EEEV, WEEV, VEEV
SLEV
Mielites
WNV
HSV-1, VZV, EBV
Poliovirus
Abreviaturas: CMV, citomegalovirus; EBV, vírus epstein-barr; EEEV, vírus da encefalite equina do
leste; HSV, vírus do herpes simples; JEV, vírus da encefalite japonesa; VZV, vírus varicela zoster;
VEEV, vírus da encefalite eqüina venezuelana; WEEV, vírus da encefalite eqüina do oeste; WNV,
vírus do oeste do Nilo (14).
6
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
1.3 ETIOLOGIAS DA MENINGOENCEFALITE VIRAL
1.3.1 A Família Herpesviridae
A família Herpesviridae pertence à ordem Herpesvirales e possui mais de 200
espécies já identificadas(15); cinco delas são descritas como patógenos humanos
causadores de infecção no SNC. (Tabela 2).
Os herpesvírus são amplamente distribuídos na natureza. A maioria das
espécies animais hospeda algum destes vírus, os quais são uma das principais
causas de doenças virais humanas, perdendo apenas para o vírus da gripe. Eles
são capazes de estabelecer infecção latente em tecidos específicos(14).
Tabela 2. Distribuição dos herpesvirus de acordo com a doença, epidemiologia,
transmissão e rotas de acesso ao sistema nervoso central.
Vírus
Doença no SNC
Curso da doença
Transmissão
Rotas ao SNC
Humana
Neuronal, sangue
Humana
Neuronal, sangue
Humana
Sangue
Humana
Sangue
Humana
Sangue, neuronal
Aguda (congênita)
HSV tipo 1
Encefalite
Esporádica (reativação)
HSV tipo 2
Meningite e
encefalite
Aguda (congênita)
CMV
Encefalite
(imunossuprimidos e
neonatos)
Aguda e
EBV
Encefalite, meningite,
mielites, GuillainBerré síndrome
Primária ou recorrente
VZV
Encefalite, meningite,
mielite e cerebelite
Subaguda
Aguda
Aguda pós-infecciosa,
Reativação latente
Abreviaturas: HSV, vírus do herpes simples; CMV, citomegalovírus; EBV, vírus epstein-barr;
VZV, vírus varicela zoster.
7
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
O termo herpes é derivado do grego herpes, etos e do latim herpes, etis, que
significa doença da pele(16).
O Comitê Internacional de Taxonomia dos Vírus(17) classificou a família
Herpesviridae
em
três subfamílias:
alphaherpesvirinae,
betaherpesvirinae
e
gammaherpesvirinae, de acordo com suas propriedades biológicas, sua localização
e estado de latência (Tabela 3 e Tabela 4).
Tabela 3. Classificação da família Herpesviridae em subfamília, gênero, nome
popular e latência.
Nome Oficial
Subfamília
Gênero
Nome Popular
Latência
Human
herpesvirus 1
Human
herpesvirus 2
Human
herpesvirus 3
Human
herpesvirus 4
Human
herpesvirus 5
Human
herpesvirus 6
Human
herpesvirus 7
Human
herpesvirus 8
Alphaherpesvirinae
Simplexvirus
Neurônio
Alphaherpesvirinae
Simplexvirus
Alphaherpesvirinae
Varicellovirus
Gammaherpesvirinae
Lymphocryptovirus
Betaherpesvirinae
Cytomegalovirus
Betaherpesvirinae
Roseolovirus
Betaherpesvirinae
Roseolovirus
Gamaherpesvirinae
Rhadinovirus
Herpes simples
tipo 1 (HSV-1)
Herpes simples
tipo 2 (HSV-2)
Varicela zoster
(VZV)
Epstein-Barr
(EBV)
Citomegalovirus
(CMV)
Herpes vírus
linfotrópico (HHV-6)
Vírus herpes
humano 8 (HHV-8)
Sarcoma de
Kaposi (KSHV)
Neurônio
Neurônio
Linfócito B
Monócitos,
linfócito
Linfócito T
Linfócito T
Desconhecido
Fonte: www.ictvonline.org (2012)
1.3.2 Estrutura viral
O genoma dos herpesvirus é constituído de filamento linear de DNA fita dupla,
circundado pelo capsídeo icosaédrico contendo 162 capsômeros. Os herpesvirus
são dotados de envelope derivado de membrana nuclear, com capsídeo variando de
120 a 300nm. Esta variação está relacionada à espessura do tegumento e às
características do envelope. Envelopes intactos são impermeáveis e geralmente
mantêm o formato esférico do vírion(18).
8
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
Tabela 4. Propriedades biológicas das subfamílias dos vírus da família
Herpesviridae
Propriedades comuns
- O genoma é de DNA dupla fita, linear e grande.
- A síntese de DNA e montagem de capsídeo ocorre dentro do núcleo, adquire
envelope por brotamento através da membrana nuclear.
- Apresenta uma grande variedade de enzimas envolvidas no metabolismo e
síntese do ácido nucléico.
- Produção da progênie viral resulta na destruição da célula hospedeira.
- Estabelece latência em seus hospedeiros naturais.
Alphaherpesvirinae
- Gama de hospedeiros variáveis
- Ciclo reprodutivo curto.
- Rápida propagação em cultura de células.
- Destruição eficiente de células infectadas.
- Estabelece latência, principalmente, mas não com exclusividade nos gânglios
sensoriais.
Betaherpesvirinae
- Gama de hospedeiros restritos (propriedade não exclusiva desta subfamília)
- Ciclo reprodutivo longo.
- Propagação lenta em cultura.
- Latência nas glândulas secretoras, células linforeticulares, rins e outros
tecidos.
Gammaherpesvirinae
- Gama de hospedeiros experimentais limitados à família ou à ordem do
hospedeiro natural.
- Replicação in vitro em células linfoblastóides.
- Na replicação in vivo e latência em ambos os linfócitos T ou B.
Adaptado de (CLEATOR & KLAPPER, 2005)
(15)
9
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
1.3.3 Replicação viral
O ciclo replicativo inicia-se com a ligação do vírus aos receptores de
superfície celular, através das glicoproteínas do envelope externo. O nucleocapsídeo
é liberado no citoplasma através da fusão do envoltório com a membrana
plasmática. Após penetrar no núcleo celular a proteína regulatória viral é ativada e
leva a tradução dos genes alfa e beta. Assim, ocorre a produção de múltiplas cópias
do DNA de novos vírions do herpes vírus(18).
O genoma viral é transcrito por uma RNA polimerase DNA dependente, e
regulados por fatores nucleares da célula hospedeira. A inter-relação destes fatores
determina se a infecção será lítica, persistente ou latente.
Após a infecção no hospedeiro natural, o vírus estabelece uma infecção
latente que persiste durante toda a vida. No estado latente apenas um pequeno
subconjunto dos genes virais são expressos. A reativação, com expressão de
proteínas virais e produção de progênie viral, pode ocorrer em intervalos e produzir
infecção recorrente.
1.3.4 Vírus herpes simples
Os vírus do herpes simples (HSV) foram os primeiros vírus humanos a serem
descobertos e estão entre os mais intensamente estudados. Com base em
similaridades do genoma, tipagem sorológica e sintomas clínicos, foram separados
em dois tipos: herpes simples tipo 1 (HSV-1) e herpes simples tipo 2 (HSV-2)(19).
O homem é o único hospedeiro natural. Durante a infecção, estes vírus
estabelecem latência, sempre nos sítio da infecção primária que, para o HSV-1 é o
gânglio trigêmeo; e para o HSV-2, o gânglio sacral. Outros sítios, como a raiz do
gânglio dorsal, incluindo o cervical superior, vagal e gânglio genicular também
podem abrigá-los(15).
As infecções mais severas causadas por estes vírus ocorrem no sistema
nervoso central são as encefalite e as meningites asséptica.
10
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
A encefalite por herpes simples produz uma infecção nos neurônios têmporomediais com intenso fenômeno inflamatório local. A doença é progressiva e a
gravidade dos sintomas aumenta; leva a uma redução da consciência, podendo
evoluir para casos graves como o coma e ou a morte. A encefalite herpética ocorre
em todas as idades e gêneros com a mesma frequência(15).
Os HSV são os agentes mais comuns em casos de encefalite esporádica fatal
(20)
. O HSV-1 é responsável por 90% dos casos de encefalite focal em adolescentes
e adultos imunocompetentes. O HSV-2 está associado à encefalite em pacientes
imunocomprometidos(21). A encefalite por herpesvírus não tratada tem uma taxa de
70% de letalidade; em pacientes tratados, diminui para 19%, no entanto 50% destes
pacientes apresentam sequelas neurológicas que vão de moderada a grave.
A incidência desta doença, só nos EUA, é de aproximadamente 2000 casos
por ano, sendo o HSV-1 responsável por mais de 90% das encefalite na infância e
nos adultos
(22)
. É preciso ressaltar que um terço dos casos de encefalite HSV-1
ocorre em menores de 20 anos, em consequência de uma infecção primária,
enquanto o restante dos casos é decorrente da reativação viral. Em contraste, o
HSV-2 é responsável por 80% dos casos no período neonatal, em consequência da
passagem por um canal de parto infectado(23).
Outras complicações observadas em associação com o HSV-2 são as
doenças neurológicas, incluindo meningite asséptica, radiculopatia recorrente e
mielite, em pacientes imunocomprometidos. Os sintomas observados são dores de
cabeça, febre, rigidez de nuca e pleocitose linfomonocitária no LCR(24).
A meningite causada pelo HSV-2 ocorre entre 4-8% dos casos de herpes
genital primário. As mulheres parecem ser mais afetadas que os homens, apesar de
o HSV-2 ser a causa mais comum. Ocasionalmente, o HSV-1 também pode causar
meningite após infecção genital primária(15).
A patogênese de encefalite por herpes ainda não é muito bem compreendida.
A estrutura da vasculatura dentro do cérebro, juntamente com as meninges que o
envolvem, representam, no hospedeiro fisiologicamente normal, uma barreira
significativa à entrada de vírus para o parênquima cerebral. A disseminação viral
através da via hematogênea para o cérebro é normalmente evitada pelas barreiras
sangue-cérebro e sangue-líquido cefalorraquidiano. Para ter acesso ao órgão, o
11
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
vírus deve contornar as barreiras anatomo-fisiológicas. O vírus pode conseguir este
trânsito a partir da periferia dentro das células nervosas. Várias vias têm sido
propostas, mas, embora com toda a probabilidade, não há ainda, uma rota que
explique todos os casos de encefalite por herpes(15). Acredita-se que os lobos
frontais e temporais, associados à estrutura límbica do cérebro, parecem ser os
alvos principais do processo infeccioso(25).
1.3.5 Vírus varicela zoster
O vírus varicela-zoster (VZV), outro membro dos herpesvirus, causa encefalite
que segue três diferentes padrões clínicos, dependendo da localização do vírus
durante a reativação e de como ele foi transportado para o sistema nervoso central.
A disseminação por via hematogênea leva à vasculite de grandes vasos (infartos
isquêmicos ou hemorrágicos) e à vasculite de pequenos vasos (pequenas lesões
isquêmicas ou hemorrágicas nas zonas de substância cinza e branca); e a
disseminação ventricular leva à encefalite, que se apresenta em forma de
periventriculite. Essa gravidade na infecção por VZV é mais observada em pacientes
imunocomprometidos(23).
A infecção por VZV ocorre em mais de 90% da população antes da
adolescência e, aproximadamente, 20-30% irão desenvolver herpes zoster na vida
adulta(26). A incidência na população, em geral, é de aproximadamente 2,9-3,3 por
1000 pessoas/ano e aumenta para 10,2 ou 11,6 em pacientes com idade acima dos
80 anos(27).
1.3.6 Vírus epstein-barr
A infecção pelo vírus Epstein-Barr (EBV) está associada a várias doenças do
sistema
nervoso
central
(SNC),
em
hospedeiros
imunocomprometidos
e
imunocompetentes. Essas doenças podem ser meningite, encefalite e linfoma do
sistema nervoso central, em pacientes com AIDS. O EBV também esta associado à
síndrome de Guillain-Barré, mielorradiculite e encefalomieloradiculite(28).
12
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
EBV infecta os linfócitos B e T de mais de 90% da população, em geral, antes
da idade adulta. EBV replica na orofaringe e é transmitido através de secreções
orais. Infecção primárias por EBV, frequentemente, resulta em mononucleose
infecciosa(29). Encefalite e meningite são as complicações neurológicas mais
comumente observadas em associação com a mononucleose infecciosa. A
síndrome Guillain-Barré também está a ela relacionada. Estima-se que as
complicações neurológicas ocorrem em 1-5% de indivíduos com mononucleose
infecciosa(28).
1.3.7
Citomegalovirus
Citomegalovírus é o herpesvirus que mais causa manifestações clinicas,
variando desde uma infecção inaparente até casos fatais. Normalmente, a infecção
ocorre na infância e permanece latente em indivíduos imunocompetentes. No
entanto, pacientes imunocomprometidos, principalmente os transplantados de
órgãos e os HIV, podem desenvolver uma doença clínica grave, a partir de uma
infecção primária ou após reativação viral(30).
A maioria das infecções são primárias é assintomática em 60% dos adultos
nos países desenvolvidos e, praticamente, 100%, em países em desenvolvimento,
apresentam anticorpos contra CMV. Normalmente a encefalite por CMV é
autolimitada, apresentando episódios febris com manifestações clínicas de
meningoencefalite não específicas, com dor de cabeça, confusão e raramente,
convulsões e coma.
O líquido cefalorraquidiano apresenta pleocitose, proteína
levemente aumentada, níveis normais de glicose(31).
13
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
1.4 Arbovírus
O termo “arbovírus” origina-se das duas primeiras letras das palavras que
compõem a expressão inglesa arthopod-borne, acrescida da palavra vírus. Significa
vírus transmitidos por artrópodes (mosquitos e carrapatos) para primatas humanos e
não humanos, aves, répteis, marsupiais, entre outros. Eles constituem o maior grupo
conhecido, com 537 membros registrados no Catálogo Internacional dos Arbovírus
distribuídos em 63 grupos antigênicos(32).
Com base em suas propriedades físico-químicas, a maioria dos arbovírus se
distribui por 5 famílias: Bunyaviridae, Flaviviridae, Reoviridae, Rhabdoviridae e
Togaviridae(32,
33)
. Os arbovírus são vírus mantidos na natureza, mediante
transmissão biológica entre hospedeiros vertebrados suscetíveis e artrópodes
hematófagos ou entre hospedeiros artrópodes, por meio da via transovariana e,
possivelmente, da via venérea; multiplicam-se e produzem viremia nos vertebrados,
assim como nos tecidos dos artrópodes. São transmitidos a novos vertebrados
suscetíveis através da picada do inseto, após um período de incubação extrínseca,
vide ciclo Figura 2(34).
As infecções por arbovírus, pertencentes aos gêneros Flavivirus, Alphavirus e
Bunyavirus, podem levar a uma síndrome clínica conhecida como doença aguda do
sistema nervoso central, que se manifesta na forma de meningite e encefalite
conforme observado na tabela 5(35).
Os Arbovírus, amplamente distribuídos em todo o mundo, representam quase
30% de todas as doenças infecciosas emergentes da última década (36). Embora as
variáveis que contribuem para a epidemiologia de todos os vírus sejam únicas,
alguns outros fatores como os sócio-econômicos, os ambientais e os ecológicos têm
papel relevante para a emergência destas arboviroses(37). O comportamento humano
tem desempenhado um papel significativo na emergência e reemergência de
doenças por arbovírus, sugerindo que o aumento da exposição humana aos
mosquitos e a outros artrópodes vetores é um importante fator no surgimento da
doença(36). A encefalite por arbovírus é causa importante de mortalidade e
morbidade em muitas regiões tropicais do mundo onde estes vírus causam
epidemias.
14
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
As viagens modernas e o comércio entre países facilitaram a propagação dos
arbovírus de forma altamente eficiente. Vários exemplos comprovam isso, como a
introdução do tigre asiático, o mosquito Aedes albopictus na América do Norte e
Europa(38), a introdução do Vírus Oeste do Nilo (WNV), em 1999, na América do
Norte, a partir do Oriente Médio(39); a propagação do vírus da encefalite japonesa
(JEV) na Índia, Nepal e norte da Austrália(40, 41); e os surtos explosivos de 2005-2007
da infecção pelo vírus Chikungunya, no Oceano Índico e na Índia(42, 43).
Figura 2. Representação esquemática do ciclo de vida dos arbovírus. (Ciclo adaptado de Hollidge, B.S.
e col)(34). Os vetores são representados pelos mosquitos nesta figura. Para muitos arbovírus, a
transmissão vertical de mosquito fêmea infectado para sua progênie ocorre por via transovariana,
exemplo LACV [vermelho] e WNV [verde]. Mosquitos infectados do sexo masculino podem infectar
mosquitos fêmeas virgens por transmissão venérea. No ciclo enzoótico, os arbovírus usam a
transmissão silvestre (linhas em vermelho e verde) (por exemplo, LACV, pequenos roedores e WNV e
SLEV, aves). Na maioria dos casos, humanos servem como hospedeiro final e não desempenham um
papel importante na manutenção do ciclo dos arbovírus. No entanto, alguns arbovírus (por exemplo,
VEEV, cavalos e JEV, porcos) estabeleceram ciclos de amplificação epizoótica em animais domésticos
(cinza). Uma preocupação crescente é que alguns arbovírus (por exemplo, DENV) pode manter
amplificação em humano (azul) em um cenário urbano.
15
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
Tabela 5. Distribuição dos vírus RNA de acordo com a doença, epidemiologia, vetor
e rotas de acesso ao sistema nervoso central.
RNA vírus
Doença no SNC
Alphavírus
Meningites e
Casos Fatais
(%)
Vetor
Rotas SNC
WEEV 3-10
Mosquitos
EEEV >30
(WEEV, EEEV, VEEV)
Sangue
Encefalites
VEEV <1
JEV – 25
Flavivírus
Meningites e
(JEV, SLEV, WNV, TBEV)
Encefalites
SLEV – 7
Mosquitos
WNV – 11 a
33
Carrapatos
Sangue
TBEV – 20
Bunyavírus
Meningites e
Sangue
<1%
Vírus encefalite Califórnia
Mosquitos
Encefalites
Abreviaturas: WEEV, vírus da encefalite equina do oeste; EEEV, vírus da encefalite equina do leste; VEEV, vírus
da encefalite equina venezuelana; JEV, vírus da encefalite japonesa; SLEV, vírus da encefalite de Saint louis;
WNV, vírus oeste do Nilo; TBEV, Tick-borne encephalitis vírus.
1.4.1 Família Flaviviridae
Os Flavivírus, mesmo tirando a participação dos vírus do dengue, são
importante causa de doença em todo mundo, destacando-se um complexo
identificado filogeneticamente por vírus zoonóticos de aves, transmitido por
mosquitos
culicídeos
e
que
ao
infectarem
o
homem
podem
causar
meningoencefalites(44). Membros importantes do complexo encefalite japonesa são
os vírus da Encefalite de Saint Louis (SLEV), Rocio (ROCV), e vírus Oeste do Nilo
(WNV). Cada um desses causa doença similar em humanos, variando de
assintomática ou de uma doença de média gravidade gripe-símile a uma encefalite
(45)
.
O vírus da encefalite Saint Louis está amplamente distribuído em todo o
hemisfério ocidental do Canadá à Argentina. O SLEV foi isolado pela primeira vez
16
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
em 1933, durante uma grande epidemia que ocorreu em Saint Louis (Missouri,
EUA), com relato de aproximadamente 1000 casos de encefalite(46).
Foram descritos nos Estados Unidos, no período entre 1999 a 2007, 188
casos de doença neuroinvasiva, ocasionada pelo vírus da encefalite de Saint Louis dados provenientes de 19 estados - sendo Louisiana, Texas, Arizona, Michigan e
Mississipi responsáveis por 87% de todos os casos(11).
No Brasil, o SLEV foi isolado pela primeira vez na 1960 de um pool de
mosquitos na Bacia Amazônica. Posteriormente, o vírus foi repetidamente isolado de
animais e artrópodes na região Amazônica e estado de São Paulo(47). No entanto, o
isolamento do SLEV, a partir de soros humanos, ficou restrito a apenas dois,
isolados na região amazônica, na decada de setenta. Em ambos os casos, o quadro
clinico foi de uma doença febril com icterícia, sem envolvimento do sistema nervoso
central(47-49).
Mais recentemente, o SLEV foi isolado de um paciente com doença febril,
suspeito de dengue, em 2005, na cidade de São Pedro(50). No ano seguinte, foi
detectado em quatro pacientes com sintomas clínicos semelhantes aos observados
nos casos de dengue, assim como em dois outros pacientes, clinicamente
diagnosticados com meningoencefalite viral, em São José do Rio Preto, São Paulo
(51)
. Além disso, um inquérito sorológico, realizado em equinos do Pantanal, revelou
uma alta prevalência de anticorpos neutralizantes (50,9%) para SLEV (52).
O WNV foi Isolado pela primeira vez em 1937 no distrito de West Nile,
Uganda. Este vírus não tinha sido encontrado no hemisfério ocidental até 1999,
quando foi detectado em um surto na cidade de Nova York, o que resultou em 62
casos de encefalite com sete mortes(39, 53, 54). Após a introdução de WNV em Nova
York, o vírus se expandiu pelos 48 estados americanos e também para o Canadá,
México, Caribe e Colômbia(55,
56)
. Entre 2002 e 2003, a doença se expandiu de tal
modo que houve confirmação de cerca de 3000 casos de doença neuroinvasiva
(encefalite, meningite, paralisia flácida aguda)(57). WNV é agora a principal causa de
encefalite por arbovírus nos Estados Unidos da América(55, 58).
WNV tem a mais ampla distribuição geográfica de todos os flavivírus.
Estende-se na América (do Norte à do Sul), Europa, Oriente Médio, África, Ásia
Ocidental e Austrália(39).
17
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
Estudos recentes notificaram a presença de anticorpos neutralizantes para
WNV em equinos na Colômbia(59). Em 2007, o vírus foi isolado de equinos na
Argentina(60). No Brasil, o WNV ainda não foi isolado, mas anticorpos neutralizantes
foram recentemente relatados em cavalos no Pantanal(61). Mais recentemente foi
verificada evidência sorológica de que o WNV tem circulado não apenas em cavalos,
mas também em aves(62). Até o momento a presença deste vírus ainda não foi
detectada em humanos(63).
O vírus Rocio (ROCV) foi originalmente isolado do tecido nervoso de um caso
de encefalite fatal na década de 70 e, posteriormente, foi responsável por uma
epidemia de encefalite, em humanos, no Vale do Ribeira, sudeste do Estado de São
Paulo, entre 1973 e 1980. Neste período foram notificados 1021 casos de encefalite,
onde foi observado quadro clinico agudo de febre, dor de cabeça. Os pacientes
evoluíram com convulsão e, ou alteração da consciência, resultando em 10% de
letalidade(64). Além disso, cerca de 20% dos sobreviventes desenvolveram sequelas,
tais como alterações motoras (49,65%), especialmente da marcha e equilíbrio(65).
O vírus foi isolado de ave da espécie Zenothrichia capensis e estudos
sorológicos sugerem que as aves selvagens podem ser seus reservatórios, como
também, de pool de mosquitos do gênero Psorophora e Aedes(64,
66)
. Apesar de a
epidemia de ROCV ter sido um episódio isolado, ocorrido há mais de três décadas,
inquéritos sorológicos em moradores do interior do Estado de São Paulo (5, 67) e do
Estado da Bahia(68) mostraram evidência de anticorpos neutralizantes para ROCV.
Recentemente, inquérito sorológico realizado em equinos dos estados de São Paulo,
Mato Grosso do Sul, Rio de Janeiro e Paraíba revelou soro positividade do tipo
monotípica para o vírus Rocio em 6% dos animais testados (69), isso indica a
dispersão deste vírus pelo país, especialmente em áreas rurais e mantém um risco
permanente de reemergência do ROCV, podendo vir a causar novas epidemias(5).
O dengue é a arbovirose mais importante em todo o mundo e está
amplamente distribuída. Cerca de 2,5 bilhões de pessoas que vivem em áreas
tropicais e subtropicais estão em risco de infecção por esse vírus(70).
A infecção por dengue é causada por quatro sorotipos diferentes (DENV-1,2,3
e 4) e é transmitida principalmente pelo mosquito Aedes aegypti. Pode causar
infecção assintomática ou dois diferentes quadros clínicos: a febre do dengue (DF) e
18
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
/ ou febre hemorrágica do dengue / síndrome do choque por dengue (FHD / SCD)
(71)
.
Nos últimos anos, manifestações incomuns da infecção por dengue, como a
síndrome neurológica, têm sido descritas(72-75), incluindo encefalite, encefalomielite
aguda disseminada, mielite transversa e síndrome de Guillain Barré(75-78). Estes
achados corroboraram com o aumento das evidências clínicas e laboratoriais, dando
suporte à hipótese de neurotropismo pelo vírus dengue (79).
Manaus, capital do estado do Amazonas, com quase 2 milhões de habitantes,
sofre com surtos de dengue desde 1998, a partir da introdução do DENV-1(80). Em
2001, com a introdução do DENV-2 e a segunda epidemia(81). O DENV-3 foi
detectado em 2002; desde então, observa-se um número crescente de casos graves
da doença, principalmente em crianças(82). Até 2008 no Brasil, circulavam apenas
três sorotipos do vírus, quando o DENV-4 foi detectado em três pacientes em
Manaus(83), após 26 anos de seu primeiro relato na cidade de Boa Vista, estado de
Roraima. Estes dados indicaram a circulação dos quatro sorotipos em momentos
deferentes. No entanto, seguindo uma tendência de aumento da dengue no Brasil,
nos primeiros meses de 2011, Manaus começou com um novo surto, com quase
40.000 casos, que afetou pacientes de todas as regiões da cidade e causou
doenças de gravidades distintas. Durante este surto foi detectada a circulação
simultânea
dos
quatro
sorotipos
do
vírus
dengue,
evidência
clara
de
hiperendemicidade o que poderá resultar em aumento da morbidade, formas graves
da doença e mortes(84).
Essa situação epidemiológica, observada em Manaus, deve ser vista como
um alerta, principalmente, em relação ao surgimento de casos neurológicos em
pacientes com síndrome febril, pois estudos realizados no Rio de Janeiro
demonstraram que meningite e encefalite foram as manifestações neurológicas mais
comuns entre os pacientes com dengue em área endêmica(85,
86)
. Outro estudo,
realizado pelos mesmos pesquisadores, também mostrou que o dengue é o agente
mais
comum
de
encefalite
imunocompetentes(86).
viral
em
pacientes
adolescentes
e
adultos
19
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
1.4.2 Família Togaviridae
O gênero Alphavirus compreende 29 espécies virais, agrupados em, pelo
menos, sete complexos antigênicos(87).
Estes vírus são esféricos, envelopados, medem entre 60 a 70 nm de
diâmetro, têm o genoma composto por RNA linear de fita simples, com polaridade
positiva. As proteínas são codificadas por sete genes, sendo quatro não estruturais
(NSP1, NSP2, NSP3 e NSP4) e as proteínas estruturais (glicoproteínas E1, E2 e E3,
glicoproteínas do envelope e a proteína C do capsídeo)(88).
Pertencentes a este gênero têm-se os vírus da Encefalite Equina
Venezuelana (VEEV), Encefalite Equina do Leste (EEEV) e Encefalite Equina do
Oeste (WEEV). São vírus do Novo Mundo e, como o nome sugere, causam
encefalite em cavalos e em seres humanos. No entanto, os três vírus apresentam
virulência e incidência variável(89).
O VEEV foi detectado na década de 90 no México (7) e, posteriormente, no
Peru, mas as maiores epidemia e epizootia ocorreram em 1995, quando este vírus
infectou aproximadamente 100 mil pessoas e milhares de equinos na Venezuela e
na Colômbia(90,
91)
. O WEEV, em 2009, foi responsável por um caso fatal de
encefalite no Uruguai(92).
O EEEV, endêmico nas regiões das Américas, é encontrado desde o sudeste
do Canadá. Atinge a costa leste e golfo dos Estados Unidos e Caribe e da América
Central se estendeu para Trinidad, Brasil, Guiana e Argentina(93). Este vírus
apresenta duas distintas variantes antigênicas: cepas da América do Norte e
América do Sul(94). A primeira causa surtos periódicos de encefalite em humanos e
equinos(95, 96); é altamente neurovirulenta e, em comparação com o VEEV e WEEV,
causa encefalite em humanos de maior gravidade. Considerando que VEEV e
WEEV normalmente causam doença febril mas raramente progride para a encefalite
(97)
, adultos infectados com cepas de EEEV americano, ao contrário, desenvolvem
doença com evolução rápida, cujos sintomas iniciais são febre, calafrios, mialgia,
artralgia, dor retro-ocular, dor de cabeça e redução dos níveis de consciência(95). Os
indivíduos mais jovens, muitas vezes, experimentam, ainda, sintomas neurológicos
20
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
sem pródromos. A doença neurológica resulta em paralisia, convulsões, coma e
morte em 30-80% dos pacientes. Estima-se, também que ocorram déficits
neurológicos em 35% dos sobreviventes(97).
Quando os Alphavirus causadores de encefalite infectam os neurônios, ocorre
rapidamente alterações no SNC para iniciar uma resposta protetora (98). Os neurônios
podem responder à infecção através da produção de Interferon β e γ, IL-6 e
quimiocinas, como CXCL10, CCL21 e CX3CL1(99, 100). Macrófagos e células da glia
são ativados nas fases iniciais da resposta e produzem rapidamente uma variedade
de citocinas (IL-1, TNF-α, IL-6) e quimiocinas (CXCL10, CCL2, CCL5)(101,
102)
os
quais rapidamente regulam o complexo principal de histocompatibilidade (MHC) em
células da micróglia, para melhorar a entrada de células ativas no SNC. Esta
atividade imunológica pode contribuir para ambos os mecanismos de proteção ou
patogênicos(103).
Dentre os Alphavirus de importância no Brasil, tem-se descrito os vírus das
Encefalites Equina Venezuelana (VEEV), Equina do Leste (EEEV) e Equina do
Oeste (WEEV), como os agentes responsáveis por epizootias em equinos
domésticos e surtos de doença febril aguda ou meningoencefalites em humanos (47).
1.4.3 Família Bunyaviridae
Os vírus da família Bunyaviridae são esféricos, medem entre 80 a 120 nm e
são envelopados. O genoma é constituído por três segmentos de RNA fita simples,
denominados (S) pequeno, (M) médio e (L) grande(104).
O segmento S codifica duas proteínas, a nucleoproteína estrutural N e uma
outra, pequena, não estrutural NSs em sobreposição de fase de leitura. O segmento
M codifica uma poliproteína precursora que, após clivagem, dá origem as proteínas
estruturais G1 e G2 do envelope e a proteína NSm, presente apenas entre os
Orthobunyavirus. A proteína L codifica uma grande proteína que contem atividade de
RNA
polimerase,
genômicos(105).
importante
na
replicação
e
transcrição
dos
segmentos
21
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
Entre os membros da família Bunyaviridae, destacam-se os Hantavírus,
causadores de doença pulmonar, e o vírus Oropouche (OROV), importante causa de
doença febril no Brasil(106).
O OROV é o arbovírus que, depois do dengue, causa mais epidemias de
doença febril na Amazônia e é a segunda causa mais comum de arbovirose urbana
no Brasil. Estima-se que nos últimos 30 anos tenham ocorridos mais de meio milhão
de casos no Brasil(107). O vírus foi isolado, pela primeira vez, a partir do sangue de
um trabalhador florestal em Trinidad, 1955. O primeiro isolamento no Brasil foi em
1960, a partir do sangue de uma preguiça (Bradypus tridactylus). O potencial da
epidemia de OROV foi reconhecido durante um surto em Belém, Pará, em 1961,
onde aproximadamente 11.000 pessoas foram infectadas(108). Nos últimos 40 anos,
a febre do Oropouche tem emergido como um problema de saúde pública em áreas
tropicais da América Central e do Sul(109). Além do Brasil, o OROV também foi
isolado em Trinidad, Panamá e Peru(110).
De 1960 a 1980, surtos de febre por Oropouche foram detectados apenas no
Estado do Pará, principalmente em Belém e áreas vizinhas, onde milhares de
pessoas foram infectadas(108, 109).
As primeiras epidemias de OROV registradas, fora do estado do Pará
ocorreram na década de 80 no Amazonas - nas cidades de Manaus e Barcelos(111);
na cidade de Mazagão no Amapá; em outros estados amazônicos, incluindo Acre e
Rondônia; e fora da Amazônia, no Maranhão e em Tocantins(107,
recentemente, o OROV foi detectado nas cidades de Minas Gerais
112)
. Mais
(113)
, Acre(114) e
em Manaus(115). Um grande número de casos e surtos de febre por Oropouche têm
sido relatados em áreas da Amazônia brasileira, o que sugere a circulação endêmica
deste vírus(116).
A infecção por Oropouche manifesta-se na forma de episódios febris agudos.
Os primeiros sintomas são febre, dor de cabeça, calafrios, dor muscular, artralgia e
fotofobia.
Podem
ocorrer,
também,
dor
retro-ocular
e,
ocasionalmente,
manifestações neurológicas, relatadas durante um surto de febre, no estado do
Pará, em 1980. A maioria dos pacientes apresentou manifestações neurológicas
típicas relacionadas à meningite assépticas no inicio da fase aguda e,
aproximadamente, um terço deles apresentou náuseas e vômitos. Alguns evoluíram
com letargia(117).
22
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
Recentemente, em um estudo realizado com 110 amostras de LCR de
pacientes com meningoencefalite, foi detectada a presença do OROV em três
(2,7%) casos. Dois pacientes, entre estes, tinham outra doença afetando o SNC
(AIDS e Neurocisticercose), evidenciando que a ocorrência de infecção no SNC
causada por OROV, pode ser subestimada, especialmente em pacientes
imunocomprometidos(118).
Pouco se conhece sobre a patogênese da febre do Oropouche. O agente
produz uma infecção sistêmica em humanos com fase virêmica, onde os títulos virais
são geralmente altos nos dois primeiros dias da doença (119). O fato de que o OROV
foi capaz de causar meningite asséptica - combinada com o isolamento do vírus no
LCR - sugere que este vírus tem habilidade para atravessar a barreira
hematoencefálica(120).
Estudo realizado por Rodrigues e Col. 2011, utilizando hamsters como
modelo experimental, para tentar simular a infecção natural, demonstrou que o vírus
Oropouche causa viremia e possui marcante tropismo para fígado e cérebro. A
invasão do SNC pelo OROV foi bastante evidente, com sinais de danos neurológicos
graves, incluindo deficiência motora, paralisia dos membros posteriores. Os autores
ainda sugerem as hipóteses de que o OROV pode chegar ao SNC via barreira
hematoencefálica e ou por rotas de invasão neuronal(121).
1.4.4 Família Picornaviridae
A família Picornaviridae (“pico”= pequeno, “RNA”= ácido ribonucléico) é
composta por nove gêneros: Enterovirus, Aphthovirus, Cardiovirus, Hepatovirus,
Parechovirus, Rhinovirus, Erbovirus, Kobovirus e Teschovirus. Somente os seis
primeiros gêneros infectam humanos(122).
Os Enterovírus (EVs) são assim designados devido a sua replicação ocorrer
no trato gastrointestinal humano. Este gênero possui 10 espécies e sete são
capazes de causar doença em humanos. De acordo com a ultima atualização do
ICTV, os enterovirus estão classificados em 4 espécies: enterovirus humano grupo
A, enterovirus humano grupo B, enterovirus humano grupo C e enterovirus humano
23
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
grupo D. Estes vírus são esféricos, não envelopados e medem 27nm de diâmetro
(123)
.
A estrutura genômica dos enterovírus consiste em RNA de fita simples de
polaridade positiva, com aproximadamente 7500 nucleotídeos e peso molecular de
2,6X106 D. A região 5’ NTR (não traduzida) do genoma está ligada covalentemente a
uma pequena proteína viral, VPg (Virion Protein genome), que é codificada por um
único gene em todos os picornavírus. Devido sua presença se dá no início da
replicação do RNA, estudos sugerem que ela possa ter a função de um iniciador
para esta síntese(122).
A região 3' NTR (não traduzida) é menor e tem cerca de 47 nucleotídeos,
contém uma estrutura secundária que está relacionada ao controle da síntese do
RNA viral. Ambas as moléculas de RNA e mRNA possuem uma cauda poli (A) que
varia de 35 a 100 nucleotídeos (Figura 4). Estudos mostram que sua função pode
estar relacionada à infecciosidade viral(124).
Os Enterovírus (EV) são uma importante causa de morbidade e mortalidade
em todo o mundo. Embora muitas infecções por enterovírus não pólio sejam
assintomáticas, estima-se que eles causam entre 10-15 milhões ou mais de
infecções sintomáticas só nos EUA(125). Muitas infecções por enterovírus não
causam
doença
expressiva,
mas,
especialmente
em
crianças
e
em
imunocomprometidos, podem levar a casos graves. Este grupo de vírus são a causa
mais comum de meningite asséptica, uma das infecções mais frequentes no sistema
nervoso central(122).
A replicação dos picornavírus ocorre no citoplasma das células-alvo.
Primeiramente, a partícula viral liga-se a receptores celulares específicos, presente
na membrana plasmática; em seguida, ocorre a adsorção, e o vírus é internalizado
por endocitose e tem seu capsídeo fragmentado. O RNA viral é, então, exposto,
através de um processo que envolve mudanças estruturais no capsídeo. Uma vez
dentro do citoplasma, a fita positiva de RNA viral é transcrita em proteínas
essenciais para a replicação de novas partículas. O ciclo de replicação de uma única
partícula viral pode levar de 5 a 10 horas, no entanto, muitas variáveis estão
envolvidas, tais como: particularidades da cepa, temperatura, pH. Muitos
picornavírus são liberados das células através da lise levando-as a morte(122).
24
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
Com a introdução da vacina da poliomielite, o nicho ecológico dos poliovírus
tem se tornado extremamente restrito. Contudo, observa-se um aumento
significativo na circulação, detecção, identificação e evolução dos enterovírus nãopolio e o surgimento de surtos provocados por cepas epidêmicas e emergentes (126).
Os enterovírus humanos são responsáveis por uma variedade de doenças e
manifestações clínicas, tais como: miocardite, exantema, conjuntivite hemorrágica,
meningite, encefalite, diabetes, dentre outras(127).
As meningites virais, causadas por Enterovírus, são relatadas com grande
frequência em diversos países do mundo, atingindo principalmente a faixa etária
mais jovem e de classe socioeconômica baixa. Estão diretamente relacionadas às
condições sanitárias precárias e às grandes aglomerações populacionais, que
favorecem a transmissão por via fecal-oral. Dados epidemiológicos mostram que os
Enterovirus são responsáveis por cerca de 85% de todos os casos de meningite nos
quais um agente etiológico é identificado(128-132).
Muitos sorotipos de enterovírus têm sido descritos como responsáveis por
surtos ou casos esporádicos de meningite asséptica. Estudos epidemiológicos
realizados no Brasil, sobre esses casos, têm identificado o Echovírus 30 nos estados
do Paraná, Pernambuco, São Paulo, Rio de Janeiro e Belém, como o agente mais
frequente(132-136), seguido pelo Enterovírus 71(137-140). Outras cepas de Enterovírus
ainda foram identificadas (E-6, E-4), Coxsakievírus B (cepas 2, 3, 5, 6 e 9)(141, 142).
1.5 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
O diagnóstico laboratorial das meningites é realizado através do estudo do
líquido cefalorraquidiano. Os principais exames para o esclarecimento diagnóstico
de casos suspeitos são: quimiocitológico, bacterioscopia direta e culturas.
A obtenção do LCR para análise é um dos passos mais importantes para o
diagnóstico. Sua análise é de grande importância, devendo ser considerada um
conjunto de testes que expressem o estado do fluido e que possa caracterizá-lo
dentro dos limites de normalidade ou não. Na Tabela 6, podem ser observadas
algumas características do líquido cefalorraquidiano em infecções bacteriana e viral.
25
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
O LCR é um fluido corporal, livre de sangue, oligocelular e oligoprotéico
intimamente relacionado com o SNC e seus envoltórios. Está presente nas
cavidades ventriculares e no espaço subaracnóideo, envolvendo a medula espinhal
e o encéfalo. Este fluido, em condições normais, contém concentração reduzida de
proteínas, glicose, potássio e magnésio e relativamente elevada de cloreto de sódio.
Valores normais de celularidade no LCR variam de 1 a 5 células por milímetro
cúbico (mm3). E por apresentar aspecto límpido, incolor e translúcido recebe muitas
vezes a denominação de “água de rocha”(143).
Tabela 6. Características do líquido cefalorraquidiano nas infecções bacterianas e
virais.
Parâmetros do LCR
Infecção bacteriana
Infecção viral
Glóbulos brancos
Contagem total
( <5 céls/mm3)
1000-5000 céls/mm3
Tipicamente
<500 céls/mm3
Predomínio de Neutrófilos, mas
linfócitos podem estar
presentes no início da doença.
Predomínio de linfócitos, mas
neutrófilos podem estar presente.
Baixo
Normal
Elevada
Normal/ levemente aumentada
Diferencial
(normalmente linfócitos,
sem neutrófilos ou
células vermelhas).
LCR: Concentração de
Glicose sérica
(40 a 80mg/dl)
Concentração de
Proteínas
(15 a 50mg/dl)
Adaptado de
(143)
As infecções agudas do SNC, como encefalite e ou meningites, normalmente
não sugerem um agente etiológico específico. Por isso, faz-se necessário o uso de
métodos de diagnóstico específicos, sensíveis e rápidos, para que se faça a
vigilância e a detecção precoce destes agentes.
A maioria dos vírus não são facilmente detectados no LCR e pode não estar
presente no sangue. Assim, o diagnóstico sorológico é difícil em áreas tropicais,
onde alguns vírus são endêmicos, pois reações cruzadas podem ocorrer entre
diferentes vírus, tornando difícil a interpretação dos resultados.
26
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
A pesquisa de anticorpos é um método muito utilizado para a identificação do
agente etiológico no soro e pouco utilizado no LCR. No entanto, este teste tem
certas limitações. A reação cruzada entre anticorpos, por exemplo, é um problema
no ensaio de captura de IgM, também a neutralização por redução de placa é
demorada(144-146). O método tradicional para identificação de arbovirus, o isolamento
viral em cultura de células de mamíferos ou de insetos, é o método clássico de
escolha para o diagnóstico, mas também tem suas limitações, pois o período de
viremia é geralmente de curta duração e a probabilidade de obtenção de um isolado
é baixa no soro e principalmente no líquor(144).
Nos últimos anos, as técnicas baseadas na amplificação do ácido nucléico,
principalmente a reação em cadeia da polimerase (PCR), têm revolucionado o
diagnóstico de infecções no sistema nervoso central, especialmente aquelas
causadas por vírus(147), sobretudo, por serem rápidas, sensíveis, específicas,
reprodutíveis e passíveis de automação. As vantagens dessas técnicas foram
observadas pelo sucesso no diagnóstico neurovirológico a partir da amplificação de
qualquer ácido nucleico viral presente no LCR de pacientes com poucos dias de
infecção(129,
148)
. Atualmente são os métodos de escolha para detecção de herpes
vírus e enterovírus(128).
Nos últimos quatro anos, os dados epidemiológicos revelaram 21% de casos
de meningite de provável etiologia viral na cidade de Manaus. Essa situação
epidemiológica evidencia a necessidade de desenvolver e padronizar metodologias
que possibilitem um diagnóstico rápido e confiável de agentes que causadores da
infecção no sistema nervoso central. A escolha da RT-PCR e PCR justifica-se por
seu uso bem sucedido no diagnóstico em todo o mundo, visto ser considerada de
alta sensibilidade e especificidade e a confirmação laboratorial da etiologia é
fundamental para a vigilância epidemiológica das meningites, assim como para o
adequado tratamento dos casos.
27
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
2. Objetivos
28
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
2.1 GERAL
Identificar agentes virais que causam infecção no Sistema Nervoso Central
em pacientes de uma Unidade Terciária de Saúde no Amazonas.
2.2 Específicos
1. Detectar os Arbovírus que causam infecção no sistema nervoso central
pertencente às famílias:
- Flaviviridae (DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4, ROCV, SLEV, WNEV);
- Togaviridae (WEE, VEE, EEE e MAYV);
- Bunyaviridae (OROV);
2.
Detectar os vírus da família Picornaviridae que causam infecção no sistema
nervoso central, principalmente os enterovírus não pólio;
3. Detectar os vírus da família Herpesviridae (HSV1, HSV2, EBV, CMV E VZV), que
causam infecção no sistema nervoso central;
4. Descrever os aspectos epidemiológicos, clínicos e achados liquóricos dos
pacientes com infecção viral detectada;
29
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
3. Material e Métodos
30
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
3.1 Tipo de Estudo
Descritivo prospectivo, do tipo série de casos, utilizando amostra de líquor de
pacientes com suspeita clínica de Síndrome de Meningoencefalite Viral (SMV).
3.1.1 Participantes e amostras do Estudo
Pacientes em qualquer idade com suspeita clínica de Síndrome de
Meningoencefalite Viral (SMV), captados a partir da demanda das unidades de
pronto atendimento da FMT-HVD, do Hospital 28 de Agosto, do Hospital Dr. João
Lúcio Pereira Machado, dos Hospitais Infantil Zona Leste, Zona Oeste e Sul no
período de janeiro de 2010 a dezembro de 2012.
3.1.2 Critérios de Inclusão
Pacientes que concordarem em participar do estudo, com quadro agudo,
apresentando qualquer alteração neurológica. Líquor com exame direto negativo
para Gram e tinta da china, compatível com infecção viral.
3.1.3 Critérios de Exclusão
Amostras de LCRs recebidas pelo laboratório em quantidades insuficientes
para uma extração do material genético (volume < 200 µl) não foram utilizadas no
estudo, uma vez que não foi possível a estocagem de material clínico remanescente,
para uma posterior repetição, caso necessário.
3.1.4 Critérios de Exclusão a posteriori
Cultura
do
LCR
tuberculosis ou fungos.
positiva
para
bactérias
piogênicas,
Micobacterium
31
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
3.1.5 Aspectos éticos
Este projeto foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em
Seres Humanos (CEP) da FMT-HVD (Processo Nº 2891, de 5 de dezembro de
2007), e está de acordo com as normas previstas na resolução Nº196/96, do
Conselho Nacional de Saúde (Anexo 1).
Todo Individuo que aceitou participar do estudo assinou o Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido.
3.2 Seleção dos pacientes e coleta do material biológico
Pacientes com suspeita da Síndrome de Meningoencefalite Viral foram
convidados a participar do estudo, assinaram o Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido Pós-Informação (Anexo 2). Quando houve concordância em participar
da pesquisa, foi preenchida a ficha clinica (Anexo 3), coletou-se os dados de
identificação do prontuário do paciente, histórico de deslocamentos recentes e
principais sinais e sintomas. O líquor foi coletado pelo médico do pronto
atendimento, conforme o Fluxograma de coleta (Anexo 4). As amostras que
apresentaram padrão viral após os testes bioquímicos e citológicos foram
encaminhadas para o Laboratório de Virologia. Este material foi separado em três
alíquotas. Alíquotas: 1 (extração do DNA viral), 2 (extração do RNA viral) e 3
(Isolamento viral). Após separação das alíquotas, estas foram armazenadas a -700C,
compondo o banco de líquor da Gerência de Virologia.
3.3 Algoritmos de Investigação e Diagnóstico
Os vírus avaliados nesta pesquisa foram os arbovírus, herpesvírus e
enterovírus, responsáveis por casos de meningoencefalite viral, listados na tabela 7.
As atividades de investigação laboratorial em todas as fases do estudo
aconteceram na Gerência de Virologia da FMT-HVD.
32
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
Tabela 7: Relação de vírus investigados na pesquisa.
Família
Togaviridae
Gênero
Vírus (Abreviação)
Alphavirus
Encefalite equina do leste
(EEEV); Encefalite equina do
oeste (WEEV); Encefalite equina
venezuelana (VEEV) e Mayaro
(MAYV)
Dengue 1-4 (DENV)
Flaviviridae
Flavivírus
Saint Louis encefalite (SLEV)
Rocio (ROCV)
Ilhéus (ILHV)
Bunyaviridae
Orthobunyavirus
Oropouche (OROV)
Herpes Simples tipo 1 e 2 (HSV-1
e HSV-2)
Herpesviridae
Herpesvirus
Citomegalovírus (CMV)
Varicela-Zoster vírus (VZV)
Epstein-Barr vírus (EBV)
Picornaviridae
Enterovírus
Enterovirus não-polio
O processamento das amostras seguiu o fluxo estabelecido dentro do
Laboratório de Virologia. Primeiramente, foi realizada a extração do DNA viral e em
seguida a PCR, para identificar os vírus da família Herpesviridae. Após esta etapa,
as amostras, recebidas em volume suficiente, foram submetidas à extração do RNA
viral e RT-PCR, para identificação dos arbovírus e enterovírus. A terceira alíquota foi
encaminhada para tentativa de isolamento viral em culturas celulares específicas,
para isolamento de arbovírus e enterovírus. Todas as amostras ficaram
armazenadas a -70°C, em caixas específicas (criobox), etiquetadas e numeradas,
seguindo a ordem de numeração gerada no ato de entrada da amostra.
33
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
3.4 Diagnóstico molecular
3.4.1 Metodologia para identificação dos vírus DNA
Visando à detecção dos cinco herpesvírus (HSV-1 e 2; CMV, VZV, EBV) em
amostras de LCR, foi selecionado na literatura um protocolo (Multiplex PCR) descrito
por Markoulatos, et al. (2001)(149) já estabelecido e validado, que permite a
identificação dos cinco herpesvírus de maior interesse, utilizando apenas um tubo de
reação para cada amostra clínica, sendo possível, ainda, usar um controle interno na
reação, que é a amplificação do gene β-actina humano para validação da extração
do ácido nucléico.
3.4.1.1 Extração do DNA amostra
O DNA da amostra foi extraído a partir de 200l de líquido cefalorraquidiano,
utilizando QIAamp Viral DNA Mini Kit (QIAGEN, Inc., USA), seguindo-se as
instruções do fabricante. O volume final obtido foi de 40l.
3.4.1.2 PCR para identificação dos vírus da família Herpesviridae.
A amplificação gênica foi realizada pela técnica da PCR multiplex descritos
por Markoulatos, et al. (2001)(149), utilizando os primers H1P32, H1M32, EP5, EM3,
H2M40, CP15CM3, VP32, VM20. Tabela 8.
A mistura de PCR consistiu de 5l do extrato de DNA, 1U da enzima
polimerase (Platinum Taq DNA polymerase-Invitrogen, USA), 2,5 µl da solução
tampão 10 vezes concentrada (20mM Tris-HCl, (pH 8,0) 500mM KCl, 1µl de MgCl2 a
50mM, 4µl do pool de primer descrito na Tabela 9 a 100M, 1µl da mistura contendo
100M de cada dNTP e água suficiente para completar 25l.
A mistura foi submetida a 30 ciclos de 95oC por 30 segundos (seg), 60oC por
30 seg. e 72oC por 30 seg., finalizando com um ciclo de 72oC por 10 min. As
reações de PCR foram realizadas em termociclador marca Eppendorf.
34
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
A detecção do produto da PCR foi visualizado através de eletroforese em gel
de agarose corado com brometo de etídio, sendo registrado em sistema de foto
documentação digital.
Tabela 8. Relação dos iniciadores utilizados para detectar os vírus da família
Herpesviridae.
Iniciadores Seqüência (5’-3’)
H1P32
TGGGACACATGCCTTCTTGG
H1M32
ACCCTTAGTCAGACTCTGTTACTTACCC
EP5
AACATTGGCAGCAGGTAAGC
EM3
ACTTACCAAGTGTCCATAGGAGC
H2M40
GTACAGACCTTCGGAGG
H2P4
CGCTTCATCATGGGC
CP15
GTACACGCACGCTGGTTACC
CM3
GTAGAAAGCCTCGACATCGC
VP20
CACACGATAATGCCTGATCGG
VM20
TGCTGATATTTCCACGGTACAGC
B ACT
TCTACAATG AGC TGCGTGTG
B ACT
CATCTCTTGCTCGAAGTCC
Vírus
Amplicon Região do
Genoma
(pb)
RL2
HSV-1
147
EBV
182
Exon 4/5
terminal
HSV-2
227
UL28
CMV
256
IRL11
VZV
275
ORF 8
Β ACT
540
3.4.2 Metodologia para identificação dos Arbovírus
3.4.2.1 Cepas virais controle
Os arbovírus utilizados neste estudo como controles positivos - listados na
Tabela 9 -, foram gentilmente cedidos pelo Prof. Dr. Luiz Tadeu Moraes Figueiredo,
do Laboratório de Pesquisa em Virologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto-USP.
35
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
A propagação destes vírus foi realizada por inoculação intracerebral em
camundongos recém-nascidos ou em culturas celulares da linhagem C6/36 de
mosquito A. albopictus(150).
3.4.2.2 Produção dos estoques virais utilizados como controles
Suspensões dos vírus utilizados como controles foram obtidas a partir de
macerados dos cérebros de camundongos infectados. Para tanto, ninhadas de
camundongos (Mus musculus– variedade albino suíço) recém-nascidos (2 a 3 dia de
vida) foram inoculadas pela via intra-cerebral com 0,025ml de cada um dos vírus,
contidos em cérebros de camundongos previamente infectados, diluídos (1/20) em
solução salina tamponada com fosfato (PBS pH 7,4). Os animais foram mantidos em
gaiolas plásticas, juntamente com suas mães, para aleitamento. Foram observados,
diariamente, por até 10 dias. Animais moribundos - que apresentaram encefalite foram sacrificados e armazenados a -70oC até o momento do uso.
3.4.2.3 Isolamento Viral em culturas celulares do clone C6/36 de mosquito
Aedes albopictus.
O isolamento viral para arbovírus foi realizado em culturas celulares de
mosquito Aedes albopictus C6/36, a partir de amostras de LCRs, provenientes de
pacientes com suspeita clinica da SMV. Após a confluência do tapete celular, 0,2 ml
de LCR foi inoculado em tubos contendo 2 ml de suspensão viral em meio Leibowitz
L15, contendo 10% de soro fetal bovino inativado. Os tubos foram incubados a 28°C,
e diariamente, foi realizada a leitura dos tubos em microscópio investido, por sete
dias consecutivos. As amostras que apresentaram efeito citopático (ECP) ou não,
foram estocadas a -70°C para posterior identificação por RT-PCR. As amostras
negativas na primeira passagem foram submetidas a uma segunda passagem.
Também, foram mantidos frascos de células não infectadas, em todos os
experimentos, como controles negativos.
36
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
Tabela 9: Relação das cepas virais utilizadas como controle no estudo.
Família
Gênero
Vírus (abreviação)
Estirpes (abreviação)
Venezuelan Equine
BeAr 40403
Encephalitis (VEEV)
78V 3531
Eastern Equine
SpAn 14723
Alphaviridae Alphavirus
Encephalitis (EEEV)
Western Equine
Rio 1257
Encephalitis (WEEV)
BeAn 70100
Mayaro (MAYV)
BeAr 20290
Dengue (DENV)
DENV 1 RibH 830
DENV 2 Cea 24622
Flaviviridae
Flavivirus
DENV 3 Rib H1
St. Louis Encephalitis
(SLEV)
Rocio (ROCV)
Bunyaviridae Orthobunyavirus Oropouche (OROV)
BeAn 421498
SpH 34675
BeAn 19991
3.4.2.4 Extração do RNA da amostra
O RNA da amostra foi extraído a partir de 140l da amostra de LCR e de
fluído provenientes dos cultivos celulares, utilizando-se o QIAamp Viral RNA Mini
Kit (QIAGEN, Inc., USA), seguindo-se as instruções do fabricante. O volume final
obtido foi de 40l.
3.4.2.5 Reação de Transcrição reversa (RT)
Para a reação de transcrição reversa foi utilizado o AccessQuickTM RT-PCR
System kit (Promega).
37
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
A mistura de RT consistiu de 5l do extrato de RNA, 1 unidade (U) da enzima
transcriptase reversa (Promega, USA), 12,5l do Master Mix AccessQuickTM (2x),
1µl do Random primer, 20U do inibidor de ribonuclease (RNaseOUT-Invitrogen,
USA) e água suficiente para completar 20l. A mistura contendo o RNA e a enzima
foi incubada a 72oC por 5 minutos. Após a incubação foi colocada em banho de gelo
e adicionada o máster mix, seguindo para uma segunda incubação de 60 minutos a
45oC. Após obtenção do cDNA, este foi armazenado a – 20 ºC.
A utilização do Random primers, na síntese de transcrição reversa, permitiu
que o produto fosse utilizado para as reações de PCR dos diferentes grupos de vírus
RNA (Arbovírus e Enterovirus).
3.4.2.6 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Os iniciadores selecionados para detecção dos gêneros Alphavirus foram
(M2W e cM3W) se ligam a regiões do gene da proteína nsP1, e para a detecção dos
Flavivirus foram (FG1 e FG2), que se ligam a regiões do gene da proteína NS5,
descritos
por
de
Moraes
Bonzoni
(2005)(151).
Para
detecção
do
gênero
Orthobunyavírus foram selecionados os iniciadores (BUN-C e BUN-S) que se ligam
ao segmento S da Nucleoproteína do genoma viral do Oropouche, protocolo descrito
por Moreli (2002)(152). Esses protocolos baseiam-se em sistema de amplificação,
utilizando duplex, multiplex RT-PCR e Nested-PCR para detecção dos diferentes
subtipos virais.
3.4.2.7 Detecção dos gêneros Alphavírus, Flavivírus e Orthobunyavírus.
Foi realizada uma reação com os iniciadores específicos para detecção de
cada gênero separadamente. Para detecção de Alphavirus usamos os iniciadores
(M2W e cM3W), para Flavivírus (FG1 e FG2) e para Orthobunyavírus (BUN-C e
BUN-S), todos a uma contração de 10mM.
38
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
Tabela 10: Relação dos iniciadores utilizados para detecção dos gêneros
Alphavirus, Flavivirus e Orthobunyavirus.
Iniciadores
Sequência (5’-3’)
M2W (+)
YAGAGCDTTTTCGCAYSTRGCHW
CM3W
ACATRAANKGNGTNGTRTCRAANCCDAYCC
(-)
FG1 (+)
TCAAGGAACTCCACACATGAGATGTACT
FG2 (-)
GTGTCCCATCCTGCTGTGTCATCAGCATACA
BUN-S
AGTAGTGTGCTCCAC
BUN-C
AGTAGTATACTCCAC
Amplicon
Referência
434
(153)
1000
(154)
700/1000
(152)
A mistura de PCR consistiu de 5l do produto da RT, 1U da enzima (Platinum
Taq DNA polymerase – Invitrogen, USA), 2,5µl da solução tampão 10 vezes
concentrada (200mM Tris-HCl, pH 8,4, 500mM KCl), 1µl de MgCl2 a 50mM, 1µl de
cada primer específico a 10mM, 1µl da mistura contendo 0,2mM de cada dNTP e
água suficiente para completar 25l.
A mistura contendo os iniciadores (M2W e cM3W), para identificação do gênero
Alphavirus, foi submetida a 35 ciclos de 94oC por 45 seg. 45oC por 45 seg. e 72oC
por 45 seg., finalizando com um ciclo de 72oC por 7 min.
A mistura contendo os iniciadores (FG1 e FG2), para identificação do gênero
Flavivirus, foi submetida a 35 ciclos de 94oC por 1 min, 53oC por 1 min e 72oC por 2
min, finalizando com um ciclo de 72oC por 5 min.
A mistura contendo os iniciadores (BUN-C e BUN-S), para identificação do
gênero Orthobunyavirus, foi submetida a 35 ciclos de 94oC por 45 seg. 50oC por 45
seg. e 72oC por 45 seg, finalizando com um ciclo de 72oC por 7 min.
Todas as reações de PCR foram realizadas em termociclador da marca
Eppendorf.
39
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
3.4.2.8 Semi-Nested-PCR para identificação de Alphavirus e Flavivirus
Para a amplificação espécie-específica dos vírus foi utilizada a Semi Nested
PCR (S-N-PCR) com os iniciadores descritos na Tabela 11.
A mistura de S-N-PCR consistiu de 1l do produto obtido na primeira PCR, 1U
da enzima Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen, USA) e 2,5µl da solução
tampão 10 vezes concentrada (200mM Tris-HCl, pH 8,4, 500mM KCl), 2µl de MgCl2
a 50mM, 1µl de cada iniciador externo cM3W (a 10mM) ou FG1 (a 10mM), 1µl de
cada iniciador interno espécie-específico (a 10mM), 1µl da mistura contendo 0,2mM
de cada dNTP e água suficiente para completar 25l. A mistura foi submetida a 28
ciclos térmicos iguais aos descritos para a PCR (seção 5.5.7).
3.4.2.9 Nested-PCR (N-PCR) para identificação do vírus Oropouche.
A mistura da N-PCR para identificação do vírus Oropouche consistiu de 1l do
produto obtido na primeira PCR, 1U da enzima Platinum Taq DNA polymerase
(Invitrogen, USA) e 2,5µl da solução tampão 10 vezes concentrada (200mM TrisHCl, pH 8,4, 500mM KCl), 1µl de MgCl2 a 50mM, 1µl de cada primer BS-S e BS-C (a
10mM), 1µl da mistura contendo 0,2mM de cada dNTP e água suficiente para
completar 25l. A mistura foi submetida a 28 ciclos de 94oC por 60 seg.; 55oC por 60
seg.; e 72oC por 60 seg., finalizando com um ciclo de 72oC por 7 min.
40
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
Tabela 11. Relação dos iniciadores espécie-específicos utilizados no estudo para
identificação das espécies de Alphavirus, Flavivirus e Orthobunyavirus.
Iniciadores (-)
Seqüência (5’-3’)
Amplicon (pb)*
Iniciadores espécie-específicos para Flavivírus
nDEN1
CGTTTTGCTCTTGTGTGCGC
472
nDEN2
GAACCAGTTTGGTTDRTTTCATCGCTGCC
316
nDEN3
TTCCTCGTCCTCAACAGCAGCTCTCGCACT
659
nDEN4
GCAATCGCTGAAGCCTTCTCCC
222
nSLE
ATTCTTCTCTCAATCTCCGT
232
nBSQ
AAGTGACACCTGTTCAGGGTA
388
nILH
TCCACCGCTGATCTGAGCCCGTGA
474
nROC
TCACTCTTCAGCCTTTCG
230
nYF
CTGTCTCAACCCTGCGTGYC
171
Iniciadores espécie-específicos para Alphavirus
nVEE
ACGGAGGTAGACCCATCCGA
400
nEEE
CCACGGTACCGTTGCC
124
nWEE
GGCGGCAGACCTGCTGGAA
208
nMAY
GGAAGTTGGCCAAGGC
270
Iniciadores espécie-específicos para Oropouche
BS-S
GTGGGGTCCAATTTGC
300
BS-C
TGAACCCTATGCATCT
300
41
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
3.4.3 Detecção do genoma viral dos Enterovirus
3.4.3.1 Tentativas de isolamento viral em Culturas Celulares
Tentativas de isolamento viral foram realizadas a partir de LCRs provenientes
de pacientes com suspeita clinica da SMV. As amostras foram inoculadas em
culturas celulares, que permitem a replicação dos enterovírus. As linhagens
celulares utilizadas foram (RD e HEp2), gentilmente cedidas pelo Dr. Edson Elias da
Silva (Laboratório Referência para Enterovírus/IOC/FIOCRUZ).
Foram inoculados 0,2 ml de cada amostras de LCR que teve volume
suficiente,
em
tubos
contendo
1,0mL
de
suspensão
de
células
RD
(rabdomiosarcoma humano) e em tubos contendo células HEp2 (células de
carcinoma epidermóide de laringe humana). Após 30 minutos de adsorção do
inóculo, foi adicionado o meio (MEM-Earle’s), contendo 2% de soro fetal bovino. Os
tubos foram incubados a 37°C e, diariamente, foi realizada a leitura destes tubos em
microscópio investido, por sete dias consecutivos. Todas as amostras inoculadas
foram estocadas a -70°C para posterior identificação por RT-PCR. As amostras
negativas na primeira passagem foram submetidas a uma segunda passagem.
3.4.3.2 Detecção do gênero Enterovírus por RT-PCR
Foram utilizados três protocolos diferentes para a identificação molecular dos
enterovírus. A extração do RNA da amostra foi realizada conforme já descrito na
seção 3.4.2.4 e a síntese de cDNA, de acordo com a exposta na seção 3.4.2.5. O
controle utilizado foi cepa vacinal do poliovírus, gentilmente cedida pelo Dr. Felipe
Naveca, do Centro de Pesquisas Leônidas e Maria Deane (CPqL&MD/FIOCRUZ
Amazônia)
42
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
1 – Protocolo:
Para a detecção do gênero Enterovirus, primeiramente foram utilizados os
iniciadores grupo-específico EVR e EVF (tabela 12) que flanqueiam a região terminal
5’NC (não codificante) do RNA, a qual é conservada e comum ao genoma de todos
os enterovírus humanos conhecidos. Este par de iniciadores é utilizado na rotina de
diagnóstico do Laboratório de Enterovirus IOC/FIOCRUZ (dados não publicados). A
mistura foi submetida a 35 ciclos de 94oC por 30 seg. 55oC por 30 seg., e 72oC por
30 seg., finalizando com um ciclo de 72oC por 7 min.
2 – Protocolo:
Para a tipagem molecular dos enterovírus isolados, foi utilizado o protocolo
descrito por Oberste e colaboradores (155), utilizando a sequência dos iniciadores
222 e 292 (Tabela 12), que amplificam 357 pb do gene, codificadora da região da
proteína VP1. Isso permite a identificação dos sorotipos após sequenciamento.
A mistura de PCR consistiu de 3l do produto da RT, 1U da enzima Platinum
Taq DNA polymerase (Invitrogen, USA) e 2,5µl da solução tampão 10 vezes
concentrada (200mM Tris-HCl, pH 8,4, 500mM KCl), 1µl de MgCl2 a 50mM, 1µl de
cada iniciador específico a 10mM, 1µl da mistura contendo 0,2mM de cada dNTP e
água suficiente para completar 25l. A mistura foi submetida a 35 ciclos de 94oC por
30 seg., 42oC por 30 seg., e 72oC por 30 seg., finalizando com um ciclo de 72oC por
7 min.
Devido a uma positividade muito baixa, em consequência da utilização de um
protocolo de PCR com apenas uma rodada de amplificação, e o tamanho do produto
amplificado de 357 pb, foi utilizado um terceiro protocolo para detecção do gênero
enterovírus.
3 – Protocolo:
O terceiro protocolo permitiu duas rodadas de amplificação. Foram utilizados os
iniciadores grupo-específico HK2F, HK3R e HK10R, descritos na Tabela 12. Estes
iniciadores flanqueiam a região terminal 5’NC (não codificante) do RNA, região
43
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
conservada e comum ao genoma de todos os enterovírus humanos conhecidos. Foi
preparada uma mistura para a primeira amplificação com volume final de 25ul,
contendo 3 µl do DNA da amostra, 0,3 mM de MgCl2, 0,2 mM de cada iniciador
específico (HK2F e HK3R), 0,4 mM de cada dNTP, 01 U enzima Taq DNA
polimerase (Invitrogen). A PCR foi realizada sob as seguintes condições ciclagem:
30 segundos a 95°C, 1 minuto a 63°C, seguido de 10 ciclos e 30 segundos a 95°C,
30 segundos a 60°C, 30 segundos a 72°C seguidos de 30 ciclos, com um passo de
extensão final a 72°C durante 7 min. 1 µL da reação de PCR foi adicionada a uma
mistura de reamplificação com volume final de 49 µL, seguindo as mesmas
condições de ciclagem da PCR.
3.5 Visualização dos produtos amplificados
Os fragmentos detectados foram separados por eletroforese num gel de
agarose 2% e foram visualizadas em um transiluminador sob luz ultravioleta e
corado com brometo de etídio. Utilizando marcador de tamanho molecular 100 bp
A figura 3 representa de forma simplificada todos os passos realizados na
metodologia.
Tabela 12: Relação dos iniciadores utilizados para detecção dos Enterovirus.
Primers
Sequencia (5’ – 3’)
EVR
ATT GTC ACC ATA AGC AGC C
EVF
CTC CGG CCC CTG AAT GCG GCT A
222 – R
CIC CIG GIG GIA YRW ACA T
292 – F
MIG CIG YIG ARA CNG G
HK2 – F
CAA GCA CTT CTG TTT CCC CGC
HK3 – R
ATT GTC ACC ATA AGC AGC CA
HK10 – R
ACG GAC ACC CAA AGT AGT CG
Amplicon
153 pb
357 pb
398 pb
44
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
3.6 Fluxograma simplificado da metodologia
Sequenciamento
Figura 3. Algoritmo de processamento das amostras de LCR para identificação viral.
45
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
3.7 Sequenciamento nucleotídeo
Para o sequenciamento, todos os procedimentos foram executados usandose o kit de sequenciamento de DNA Big Dye terminator Cycle Sequencing kit
Version 3.1 (Applyed Biosystems), seguindo-se as instruções do fabricante e
analisando as amostras no sequenciador automático ABI 3130xl.
Para edição manual, alinhamento dos nucleotídeos e tradução da sequência
de aminoácidos, convertido em um arquivo FASTA, foi utilizado o programa BioEdit
Sequence Alignment Edit, versão 7.0.9.0(156). As sequências foram confrontadas
com outras, existentes no GeneBank, através do programa BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool). http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
46
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
4. Resultados
Os resultados estão apresentados na forma de
Artigos.
47
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
Artigo
Publicado
–
“Identification
of
Oropouche
Orthobunyavirus in the cerebrospinal fluid of three
patients in the Amazonia, Brazil”
Am. J. Trop. Med. Hyg., 86(4), 2012, pp. 732–735
doi:10.4269/ajtmh.2012.11-0485
Copyright © 2012 by The American Society of Tropical Medicine and Hygiene
Short Report: Identification of Oropouche Orthobunyavirus in the Cerebrospinal Fluid
of Three Patients in the Amazonas, Brazil
Michele de Souza Bastos,* Luiz Tadeu Moraes Figueiredo, Felipe Gomes Naveca, Rossicleia Lins Monte,
Natália Lessa, Regina Maria Pinto de Figueiredo, João Bosco de Lima Gimaque, Guilherme Pivoto João,
Rajendranath Ramasawmy, and Maria Paula Gomes Mourão
Fundação De Medicina Tropical – Dr. Heitor Vieira Dourado, University of State of Amazonas, Manaus, AM, Brazil; School of Medicine of the
University of São Paulo in Ribeirão Preto, SP, Brazil; Instituto Leônidas e Maria Deane - FIOCRUZ, Amazônia, Manaus, Brasil; Nilton Lins
University Center, Manaus, AM, Brasil; University Federal of Amazon, Manaus, AM, Brazil
Abstract. Oropouche fever is the second most frequent arboviral infection in Brazil, surpassed only by dengue.
Oropouche virus (OROV) causes large and explosive outbreaks of acute febrile illness in cities and villages in the
Amazon and Central-Plateau regions. Cerebrospinal fluid (CSF) samples from 110 meningoencephalitis patients were
analyzed. The RNA extracted from fluid was submitted to reverse transcription-polymerase chain reaction and sequencing to identify OROV. Three CSF samples showed the presence of OROV causing infection in the central nervous
system (CNS). These patients are adults. Two of the patients had other diseases affecting CNS and immune systems:
neurocysticercosis and acquired immunodeficiency syndrome, respectively. Nucleotide sequence analysis showed that
the OROV from the CSF of these patients belonged to genotype I. We show here that severe Oropouche disease is
occurring during outbreaks of this virus in Brazil
INTRODUCTION
In Brazil, many CNS infections seemed to be caused by
viruses such as enterovirus, cytomegalovirus, herpes simplex
virus type 1, varicella-zoster virus or Epstein-Barr virus.6 In
addition to OROV, another Orthobunyavirus, the Tucunduba
virus has been reported to cause meningoencephalitis in
Brazil.7 However, identification of the virus causing CNS
infection is uncommon. We report here three cases of CNS
infection by OROV diagnosed using reverse transcription
(RT) followed by polymerase chain reaction (PCR) and
nucleotide sequencing from RNA extracted from cerebrospinal fluid (CSF).
Oropouche virus (OROV) is an Orthobunyavirus in the
Bunyaviridae family. These viruses are negative polarity trisegmented single-stranded RNA viruses. The RNA segments,
known as large (L), medium (M), and small (S), encode an
RNA-dependent RNA polymerase, envelope surface glycoproteins (Gn and Gc), and a nucleocapsid protein, respectively. The virus replicates in the cytoplasm, buds into the
Golgi apparatus, and is excreted by the cell.1
Oropouche virus is an arbovirus, transmitted to sloths, marsupials, primates, and birds by Aedes serratus and Culex
quinquefasciatus mosquitoes. Notably, this virus has adapted
to an urban cycle involving man, with midges (Culicoides
paraensis) as the primary vector.2 Oropouche fever is the
second most frequent arboviral infection in Brazil, surpassed
only by dengue. Oropouche virus causes large and explosive
outbreaks of acute febrile illness in cities and villages in the
Amazon and Central-Plateau regions of Brazil. An estimated
500,000 cases of OROV infection have occurred in Brazil in
the past 48 years. In addition to outbreaks, OROV can also
cause sporadic human infections.3 We have recently reported
an outbreak of OROV, occurring from 2007 through 2008, in
Manaus, the capital of Amazonas State, a large city with
2 million inhabitants.4 In that report, 128 OROV serologically confirmed patients, 2–81 years of age, were identified. In
addition to fever, the patients had headache (72.7%), myalgias (70.3%), and arthralgias (57.8%). Rash was observed in
42.2%, and hemorrhagic phenomena (petechiae, epistaxis,
and gingival bleeding) were observed in 15.5%. All patients
recovered without sequelae and were not hospitalized.
Despite reference of sporadic cases of symptoms of involvement of the central nervous system (CNS) in OROV outbreaks, data concerning CNS symptoms were not given.4,5
MATERIALS AND METHODS
Cerebrospinal fluid samples from 110 meningoencephalitis
patients were analyzed. All study patients provided an
informed consent and authorized in a signed document
divulgation of results obtained as part of this work. This study
was approved (nr.0048.0.114.000-07) by the Ethics Review
Board of the Tropical Medicine Foundation of Amazonas
(FMTAM), Manaus, Amazonas, Brazil.
These patients were hospitalized and treated, from 2005
to 2010, in the Hospital of the Institute of Tropical Medicine
of Amazonas State (TMF-AM), a tertiary care center specializing in tropical and infectious diseases located in the
city of Manaus. The analysis of viruses in the CSFs attended
to the best interest of the patients as part of the routine
diagnostic procedures.
Detection of virus genomes. Nucleic acids were extracted
from the CSF of the patients by using the QIAmp viral RNA
Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA), following the manufacturer’s specifications. For the RT-PCR, the reverse transcription was conducted in 5 mL of the RNA extracts with random
primers (AccessQuick RT-PCR System, Promega, Madison,
WI). The RT-PCR was followed by a nested-PCR, with specific
Simbu serogroup primers selected on the basis of the nucleotide sequence of OROV TrVL9760 strain S segment, producing 300 base pair amplicons, as previously reported.8 The
samples were also tested by PCR for herpesvirus (herpes simplex virus types 1 and 2, varicella zoster virus, cytomegalovirus,
and Epstein-Barr virus),9 and by RT-PCR for enterovirus.10
*Address correspondence to Michele de Souza Bastos, Fundação de
Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, Av. Pedro Teixeira,
25 – Dom Pedro Manaus-Am, Brazil, CEP: 69040-000. E-mails:
[email protected] or [email protected]
732
733
OROPOUCHE ORTHOBUNYAVIRUS
+
The amplicons were directly sequenced after purification.
Aliquots of 40 mL of each amplicon were purified with the
QIAmp PCR purification kit (QIAGEN) and sequenced
in both directions by using the Simbu serogroup primers
and the BigDye Terminator Cycle Sequence Kit v3.1 in
an ABI3130 l automated sequencer (Applied Biosystems,
Foster City, CA). Nucleotide sequences were subjected to the
basic local alignment search tool (BLAST) (www.ncbi.nlm.nih
.gov/blast) analysis using the megablast algorithm for highly
similar sequences.11
Detection of IgM antibodies to OROV. Immunoglobulin M
(IgM) and IgG antibodies to OROV were analyzed in the
CSF of the patients by an in-house enzyme immunoassay that
uses virus-infected cultured cells as antigen (EIA-ICC).12
RESULTS
Detection of virus genomes was performed in CSF samples
by PCR for herpesvirus, RT-PCR for enterovirus, and RTnested-PCR for OROV. The CSF samples having OROV
genome detected by RT-PCR were also tested for IgM- and
IgG-specific antibodies to OROV in the CSF of the patients
by an in-house EIA.
All of the 110 CSFs samples were negative in the RT-PCR
for enterovirus and in the PCR for herpesvirus. Three patients
(2.7%) were positive for OROV by RT-nested-PCR. The CSF
of the three patients positive for OROV was searched for
antibodies to OROV by the EIA-ICC assay. All three patients
showed IgG antibodies to OROV in the CSF and one of these
patients (patient 2) showed also specific IgM to OROV. These
three patients had fever and symptoms of CNS involvement suggesting meningoencephalitis. Cerebrospinal fluid of
these patients showed a predominantly lympho-monocytic pattern, suggestive of viral infection, as shown in Table 1. The
amplicons obtained from CSFs of the three patients by RTnested-PCR for OROV were directly sequenced. All three
sequences AMLq13 (Gene Bank accession HM107840),
AMLq14 (HM107841), and AMLq16 (HM107842), showed
100%, 99%, and 100% similarity, respectively, to the provisional reference sequence of OROV TRVL9760 (AF64531)
and to the strain BeAn19991 (AF164532), isolated in Brazil
50 years ago.13
To genotype the three OROV detected in this study, their
sequences were aligned with a dataset of Oropouche
sequences TRVL9760 (AF164531), BeH505663 (AF164543),
BeH505442 (AF164542), DEI209 (AF164551), BeH544552
(AF164546), BeAn19991 (AF164532), BeH475248 (AF164540),
GML444477 (AF164555), GML445252 (AF164557), and
GML444911 (AF164556) and Aino virus (M22011) as an
outgroup, using the ClustalX software.14 Phylogenetic analysis was conducted with the neighbor-joining method and the
Kimura 2-parameter nucleotide substitution model using
MEGA 4 software (Figure 1).15
DISCUSSION
Oropouche virus, present only in South America, is one of
the most important arbovirus that infects humans in the
Brazilian Amazon. In this study, OROV was found to cause
CNS infection in three patients. Clinical presentation of
OROV infection was first reported by Pinheiro and others2
and since then, < 10 sporadic cases have been reported. In this
study, the three patients with meningoencephalitis presented
a clear lympho-monocytic cellular pattern in CSF, high protein, and normal to slightly decreased glucose levels. This is
strongly suggestive of a viral infection. Of note, two of these
patients presented with underlying infections that may affect
the CNS and immune systems. One patient had neurocysticercosis whose diagnosis was based on magnetic resonance
suggestive image and the other patient had human immunodeficiency virus (HIV)/acquired immunodeficiency syndrome
(AIDS) and herpes zoster. As not all patients infected with
neurocysticercosis and HIV/AIDS and herpes zoster developed meningitis, it is probable that the two patients coinfected with OROV progressed to meningitis because of
being immunocompromised. The third patient developed
meningitis probably because of OROV as no other infections
were observed. This infection was also confirmed by the presence of IgM- and IgG-specific antibodies to OROV in the
CSF. Thus, it is possible that the invasion of CNS by OROV
has been facilitated by previous blood-brain barrier damage.
All three patients survived despite a long hospitalization.
Saeed13 and others8 reported the first molecular epidemiology analysis of OROV, suggesting the existence of at least
three genotypes (I, II, and III) of the virus in the Americas.
In this study, OROV from the three patients belonged to
genotype I, grouping with the first isolated OROV, from
Trinidad TRVL9760, 1955 (AF64531), and the first Brazilian
isolate of OROV BeAn19991, 1960 (AF164532). In Brazil,
the genotype I was originally isolated in Santa Maria County,
Table 1
Clinical and laboratory data of the 3 patients having infection by OROV in CSF*
Patient
1
OROV sequence
Genera/age (years)
Profession/county of
origin/year
Signs and symptoms
AMLq13
Male/54
Fisherman/Uricurituba/
September 2006
Headache, dizziness, cloud vision,
and Romberg sign
Neurocysticercosis (diagnosed by a
magnetic resonance image)
6 monocytes/mL, glucose: 59 mg/dL,
protein: 40 mg/dL
Associated diseases
CSF analysis
Outcome
Survived after 4 days
hospitalization
2
AMLq14
Male/20
Agriculture worker/Manacapuru/
February 2007
Headache, fever, chills and malaise
3
No reference
AMLq16
Female/37
Domestic worker/ Manaus/
June 2007
Headache, nausea, vomiting,
and paraplegia
HIV/AIDS Herpes zoster
134 cells/mL (100% lympho-monocytic
cells), glucose: 50 mg/dL, protein:
107 mg/dL
Survived after 24 days
hospitalization
533 cells/mL (100% lymphomonocytic
cells), glucose: 107 mg/dL, protein:
136 mg/dL
Survived after 32 days
hospitalization
*OROV = oropouche virus; CSF = cerebrospinal fluid; HIV = human immunodeficiency virus; AIDS = acquired immunodeficiency syndrome.
734
BASTOS AND OTHERS
Figure 1. Phylogenetic analysis showing Oropouche virus (OROV) genotypes detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) in cerebrospinal fluids of three patients having meningoencephalitis (bold-italics). This neighbor-joining consensus tree was
inferred from 1,000 bootstrap replicates. The percentage of replicate trees, which clustered together in the bootstrap testing, is shown next to the
branches. Kimura 2-parameter nucleotide substitution model was chosen as the best-fit after a run on FindModel using all 28 models implemented.
(http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/findmodel/findmodel.html). Country and year of isolation is referred between brackets.
at the State of Para, and in the following years, it has been
reported in outbreaks of acute febrile illness in the State of
Amazonas and other western Brazilian States.3,16 Therefore,
the high similarity of the short nucleotide sequences of the
conserved N gene of OROV, with old OROV isolates
reported in this study, could be similar or bears little difference if other parts of the viral genome were analyzed.
Though we only identified three patients here, the occurrence of CNS involvement in OROV infections may be vastly
underestimated, especially in patients immunocompromised
and those with previous blood-brain barrier disruption.
Finally, these cases of severe Oropouche disease show that
OROV should be investigated in cases of meningoencephalitis of unknown etiology.
Received July 26, 2011. Accepted for publication January 23, 2012.
Financial support: This research was supported by the Amazonas
Research Supporting Foundation (FAPEAM grant 871/10) to
Michele de Souza Bastos and (FAPEAM grant 887/10) to Maria
Paula Gomes Mourão.
Authors’ addresses: Michele de Souza Bastos and João Bosco de
Lima Gimaque, Fundação De Medicina Tropical – Dr. Heitor Vieira
Dourado, Manaus, AM, Brasil; University of State of Amazonas,
Manaus, AM, Brazil, E-mails: [email protected] and gimaque@
ig.com.br. Rossicleia Lins Monte, Regina Maria Pinto de Figueiredo,
and Guilherme Pivoto João, Fundação De Medicina Tropical –
Dr. Heitor Vieira Dourado, Manaus, AM, Brasil, E-mails: [email protected]
.gov.br, [email protected], and guilhermepivoto@hotmail
.com. Rajendranath Ramasawmy, Fundação De Medicina Tropical –
Dr. Heitor Vieira Dourado, Manaus, AM, Brasil; Nilton Lins
University Center, Manaus, AM, Brasil, E-mail: ramasawm@gmail
.com. Luiz Tadeu Moraes Figueiredo, School of Medicine of the
University of São Paulo in Ribeirão Preto, SP, Brazil, E-mail:
[email protected]. Felipe Gomes Naveca, Instituto Leônidas e
Maria Deane - FIOCRUZ, Amazônia, Manaus, Brasil, E-mail:
[email protected]. Natália Lessa, Fundação De Medicina
Tropical – Dr. Heitor Vieira Dourado, Manaus, AM, Brasil;
University Federal of Amazon, Manaus, AM, Brazil, E-mail:
[email protected]. Maria Paula Gomes Mourão, Fundação De
Medicina Tropical – Dr. Heitor Vieira Dourado, Manaus, AM, Brasil;
University of State of Amazonas, Manaus, AM, Brazil; Nilton
Lins University Center, Manaus, AM, Brasil, E-mail: mariapaula
[email protected].
REFERENCES
1. Elliot RM, Bouloy M, Calisher CH, Goldbach R, Moyer JT,
Nichol ST, Pettersson R, Plyusnin A, Schmaljohn CS, 2000.
Bunyaviridae. Van Regenmortel MH, Fauquet CM, Bishop
DH, Carstens EB, Estes MK, Lemon SM, Maniloff J, Mayo
MA, McGeoch DJ, Pringle CR, Wickner RB, eds. Virus Taxonomy: Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. San Diego, CA: Academic Press, 599–621.
2. Pinheiro FP, Hoch AL, Gomes ML, Roberts DR, 1981.
Oropouche virus. IV. Laboratory transmission by Culicoides
paraensis. Am J Trop Med Hyg 30: 172–176.
3. Bernardes-Terzian AC, de Moraes-Bronzoni RV, Drumond BP,
Da Silva-Nunes M, da-Silva NS, Urbano-Ferreira M, Sperança
MA, Nogueira ML, 2009. Sporadic oropouche virus infection,
acre, Brazil. Emerg Infect Dis 15: 348–350.
4. Mourão MP, Bastos MS, Gimaque JB, Mota BR, Souza GS,
Grimmer GH, Galusso ES, Arruda E, Figueiredo LT, 2009.
Oropouche fever outbreak, Manaus, Brazil, 2007–2008. Emerg
Infect Dis 15: 2063–2064.
5. Pinheiro FP, Rocha AG, Freitas RB, Ohana BA, Travassos da
Rosa AP, Rogério JS, Linhares AC, 1982. Meningitis associated with Oropouche virus infections. Rev Inst Med Trop Sao
Paulo 24: 246–251.
6. Mendoza LP, Bronzoni RV, Takayanagui OM, Aquino VH,
Figueiredo LT, 2007. Viral infections of the central nervous
system in Brazil. J Infect 54: 589–596.
7. Shope RE, Woodall JP, Travassos da Rosa AP, 1998. The epidemiology of diseases caused by viruses in Groups C and Guama
(Bunyaviridae). Monath TP, ed. The Arboviruses: Epidemiology
and Ecology. Fifth edition. Boca Raton, FL: CRC Press, 37–52.
8. Moreli ML, Aquino VH, Cruz AC, Figueiredo LT, 2002. Diagnosis of Oropouche virus infection by RT-nested-PCR. J Med
Virol 66: 139–142.
OROPOUCHE ORTHOBUNYAVIRUS
9. Markoulatos P, Georgopoulou A, Siafakas N, Plakokefalos E,
Tzanakaki G, Kourea-Kremastinou J, 2001. Laboratory diagnosis of common herpesvirus infections of the central nervous system by a multiplex PCR assay. J Clin Microbiol 39: 4426–4432.
10. Dos Santos GP, Skraba I, Oliveira D, Lima AA, de Melo MM,
Kmetzsch CI, da Costa EV, da Silva EE, 2006. Enterovirus
meningitis in Brazil, 1998–2003. J Med Virol 78: 98–104.
11. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ, 1990.
Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215: 403–410.
12. Figueiredo LT, Shope RE, 1987. An enzyme immunoassay for
dengue antibody using infected cultured mosquito cells as antigen. J Virol Methods 17: 191–198.
13. Saeed MF, Wang H, Nunes M, Vasconcelos PF, Weaver SC,
Shope RE, Watts DM, Tesh RB, Barrett AD, 2000. Nucleo-
735
tide sequences and phylogeny of the nucleocapsid gene of
Oropouche virus. J Gen Virol 81: 743–748.
14. Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan
PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R,
Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG, 2007. Clustal W and
Clustal X version 2.0. Bioinformatics 23: 2947–2948.
15. Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S, 2007. MEGA4: Molecular
Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0.
Mol Biol Evol 24: 1596–1599.
16. Vasconcelos HB, Azevedo RS, Casseb SM, Nunes-Neto JP, Chiang
JO, Canturia PC, Segura MN, Martins LC, Monteiro HA,
Rodrigues SG, Nunes MR, Vasconcelos PF, 2009. Oropouche
fever epidemic in northern Brazil: epidemiology and molecular
characterization of isolates. J Clin Virol 44: 129–133.
52
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
Artigo
enviado
para
publicação
–
“Detection
of
Herpesvirus, Enterovirus and Arbovirus infection in
patients with suspected central nervous system viral
infection in the Western Brazilian Amazon”
Journal of Medical Virology
Detection of Herpesvirus, Enterovirus and Arbovirus
infection in patients with suspected central nervous system
viral infection in the Western Brazilian Amazon
r
Fo
Journal:
Manuscript ID:
Wiley - Manuscript type:
Date Submitted by the Author:
Draft
Research Article
n/a
Pe
Complete List of Authors:
Journal of Medical Virology
er
Bastos, Michele; Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado,
Virologia; Universidade Federal do Amazonas,
Lessa, Natalia; Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado,
Virologia
Naveca, Felipe; Centro de Pesquisa Leonidas & Maria Deane, Virologia
Martins, Valquiria; Universidade Federal do Amazonas,
Figueiredo, Regina; Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira
Dourado, Virologia
Gimaque, Joao Bosco; Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira
Dourado, Virologia
Kramer, Valeria; Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado,
Virologia
Monte, Rossicleia; Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira
Dourado, Bacteriologia
Fragoso, Silvio; Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado,
Virologia
Lacerda, Mauiricio; Famerp, Virology;
Braga, Wornei; Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado,
Virologia
Figueiredo, Luiz Tadeu; University of São Paulo at Ribeirão Preto, Virus
Research Unit
Ramasawmy, Rajendranath; Universidade do Estado do Amazonas, ;
Universidade Nilton Lins, ; Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira
Dourado, Virologia
Mourao, M.; Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado,
Virologia; Universidade do Estado do Amazonas, ; Universidade Nilton Lins,
ew
vi
Re
Keywords:
Encephalitis , Herpesvirus, Enterovirus, Arbovirus, Meningitis
John Wiley & Sons
Page 1 of 20
Detection of Herpesvirus, Enterovirus and Arbovirus infection in patients with
suspected central nervous system viral infection in the Western Brazilian Amazon
Michele S Bastos1,2, Natália Lessa1,3, Felipe G Naveca4, Valquíria RA Martins2, Regina MP
Figueiredo1, João Bosco L Gimaque1,2, Valéria Munique Kramer1, Rossicléia L Monte1, Silvio
Fragoso1, Maurício L Nogueira7, Wornei S Braga1, Luiz Tadeu M Figueiredo6, Rajendranath
Ramasawmy1,5, Maria Paula G Mourão1,2,5.
1. Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, Manaus, Amazonas,
Brazil.
r
Fo
2. Universidade do Estado do Amazonas, Manaus, Amazonas, Brazil.
3. Universidade Federal do Amazonas, Manaus, Amazonas, Brazil.
Pe
4. Centro de Pesquisa Leonidas & Maria Deane, FIOCRUZ, Manaus, Amazonas, Brazil.
5. Universidade Nilton Lins, Manaus, Amazonas, Brazil.
er
6. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil.
7. Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto, São Paulo, Brasil.
vi
Re
Keywords: Encephalitis, Meningitis, Arbovirus, Enterovirus, Herpesvirus
ew
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
Journal of Medical Virology
Running Title: Viral Infection in Central Nervous System, Amazon, Brazil
Corresponding Author
Michele de Souza Bastos
Laboratório de Virologia (FMT-HVD)
Av. Pedro Teixeira, 25. Bairro: Dom Pedro Manaus-Am. Brazil
CEP: 69040-000
Tel: 55 92 21273447 email: [email protected]
1
John Wiley & Sons
Journal of Medical Virology
Abstract
Acute infections of the central nervous system (CNS) are commonly caused by
emerging pathogens. In this study, we investigated the presence of herpesviruses
(HHV), enteroviruses (EVs) and arboviruses in CSF samples from 165 patients with
suspected CNS viral infection through polymerase chain reaction (PCR) and reverse
transcriptase PCR. The genome of one or more viral agents was detected in 29.7%
(49/165) of the CSF samples. EVs were predominant (16/49; 32.6%) followed by
r
Fo
Epstein-Barr virus (EBV) (22.4%), Varicella Zoster virus (VZV) (20.4%),
Cytomegalovirus (CMV) (18.4%), herpes simplex virus (HSV-1) (4,1%), (HSV-2)
(4.1%) and the arboviruses (14.3%). Of the arboviruses, 4 were of dengue virus
Pe
(DENV) and 3 of oropouche virus (OROV). The detection of different viruses in the
CNS of patients with meningitis or encephalitis highlights the importance of
er
maintaining an active laboratory monitoring diagnostics with rapid methodology of high
sensitivity in areas of viral hyperendemicity for tailoring treatment.
ew
vi
Re
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
Page 2 of 20
2
John Wiley & Sons
Page 3 of 20
Introduction
Acute infections of the CNS remain a medical emergency. Many are caused by
viruses besides bacteria and fungi. Among the viruses, the most important are the
human herpesviruses (HHVs), enteroviruses (EVs) and arboviruses [Reimann et al.,
2008; Dupuis et al., 2011]. Several arboviruses, especially from the genus Flavivirus,
are associated with encephalitis. In Brazil, three important flaviviruses and one
Orthobunyavirus among the arboviruses causing infection in the CNS are Rocio
r
Fo
(ROCV) [de Souza Lopes et al., 1978], St. Louis encephalitis virus (SLEV) [Mondini et
al., 2007], dengue (DENV) [Soares et al., 2011] and Oropouche (OROV) [Bastos et al.,
2012].
Pe
Manaus, the capital City of the Amazonas state with almost 2 million
er
inhabitants, is located in the middle of Amazon rain forest. In Manaus, during a fouryear period from 2006 to 2009, 585 cases of meningitis were reported. Of these, 109
Re
(18.6%) were suspected to be of viral etiology. These preliminary data highlights the
importance in identifying the viral etiological agents responsible for infections of the
vi
CNS and hereby, offering an adequate antiviral treatment. In this study, we investigated
ew
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
Journal of Medical Virology
the presence of HHVs, EVs, flaviviruses, alphaviruses and orthobunyavirus that may
cause infections of the CNS through molecular techniques.
Methods
Patients and CSF samples
A total of 165 patients with suspected CNS infection other than bacterial or
fungal enrolled at the Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMTHVD), a tertiary public health for Infectious Diseases from January 2010 through
August 2012 were included in this study. The FMT-HVD is a pioneer on investigation
3
John Wiley & Sons
Journal of Medical Virology
of acute febrile syndrome, including hemorrhagic fevers, in the Amazon region since
1998. Recently, from 2009 the monitoring of viral agents in CSF of patients with
suspected CNS viral infection is investigated. The hospital receives about 90% of all the
CSF of patients of the state.
The case definition of a CNS viral infection was the presence of acute
neurological signs and symptoms such as headache, fever, focal neurologic findings,
altered consciousness and laboratory findings such as total CSF cell count >5 cells/
r
Fo
mm3, predominantly by mononuclear cells and negative for fungal and bacterial
infections. This study was approved by the Ethics Committee of the FMT-HVD.
Written informed consent was obtained from all the patients included in the study or
their responsible party.
er
Pe
Lumbar puncture was performed in all patients on the day of hospital admission.
An aliquot of the CSF was submitted for routine analysis: total and differential cells
Re
count; determination of protein, lactate and glucose, and microbiological tests for
bacteria and fungi.
Purification of Nucleic acids
ew
vi
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
Page 4 of 20
Both DNA and RNA were extracted from 200µl and 140 µl of CSF samples
respectively using the QIAamp Viral DNA and RNA Mini Kit (QIAGEN, Inc., USA),
following the manufacturer's instructions. The DNA and RNA were stored at -80°C
before use.
After purification of RNA from the CSF, cDNA was synthesized by reverse
transcription with AccessQuickTM RT-PCR System kit (Promega, USA). The RT
mixture consisted of 5 µl of RNA, 1 unit of the enzyme reverse transcriptase, 12.5µl of
AccessQuickTM Master Mix (2x), 1µl of Random primer and 20U of RNase inhibitor
4
John Wiley & Sons
Page 5 of 20
(RNaseOUT -Invitrogen, USA) in a final volume of 20µl completed with RNase free
water. The mixture was incubated at 72 °C for 5 minutes (min) and at 45oC for 60 min.
and stored at - 20 °C until use.
Diagnostic testing
Specific viruses were determined according to the following:
- For the detection of five herpesvirus: herpes simplex virus type 1and 2 (HSV-1
and HSV-2), Cytomegalovirus (CMV), varicella zoster virus (VZV), Epstein-Barr virus
r
Fo
(EBV) in CSF samples, the protocol (multiplex PCR) described elsewhere was applied
[Markoulatos et al., 2001].
Pe
- For detection of flaviviruses (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4, yellow
fever virus (YFV), ROCV, Ilheus virus (ILHV) and SLEV) and alphaviruses (Western
er
equine encephalitis virus (WEEV), Eastern equine encephalitis (EEEV), Venezuelan
equine encephalitis virus (VEEV) and Mayaro (MAYV)), the methods described by
Re
Bronzoni et al. were used [de Morais Bronzoni et al., 2005; Bronzoni et al., 2004].
vi
- The detection of Orthobunyavirus Oropouche was performed as described
elsewhere [Moreli et al., 2002].
ew
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
Journal of Medical Virology
- For the detection of the genus EV was performed as described elsewhere [Zoll
et al., 1992].
Statistical methods
The Epi Info version 3.3.2 software was used for data handling. Statistical
analyses were performed using SPSS version 17. P values < 0.05 were considered
significant. ANOVA and chi-square tests with Yates correction were used for statistical
comparisons.
Results
5
John Wiley & Sons
Journal of Medical Virology
Patient characteristics, clinical manifestation and incidence
During the study period, 165 patients with suspected CNS viral infection were
enrolled and CSF sample from all of them were submitted to molecular identification of
the viral agent. Baseline characteristics as well as laboratory findings and clinical
symptoms are shown in Table 1. The mean age of the patients was 27.2 years old
(ranging from 1 to 70 years) and 91 (55.1%) were male. Of the 165 patients, 41 (24.8%)
were under 15 years old.
r
Fo
The genome of one or more viral agents was detected in the CSF samples of 49
(29.7%) patients in total (11 were below 15 years). The viruses detected are listed in
Table 2. Viral monoinfection was detected in 41 patients (83.7%) while co-infection in
Pe
eight (3 with CMV / VZV; 1 with VZV / EBV, 1 with CMV / EVs and 3 with EV/
er
EBV). Screening of Alphaviruses (EEEV, WEEV, VEEV and MAYV) as well as other
Flaviviruses (SLEV, ILHV, ROCV) were also performed. However, none of these
viruses were detected.
Re
Clinical diagnosis was available for only 54 patients of whom 23, 21, 8 and 2
vi
had encephalitis, meningitis, meningoencephalitis and myelitis respectively. The viral
ew
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
Page 6 of 20
agent was detected in 37% (20/54) of the patients. Of the 20 patients with known viral
agents, 9, 6 and 5 had encephalitis, meningitis and meningoencephalitis respectively.
The most common symptoms were: headache, neck stiffness, fever, altered level of
consciousness and vomiting in 61%, 37%, 35.2%, 24.1% and 22.2% of the patients
respectively.
Laboratory findings of the 49 patients, including the 20 patients with known
clinical diagnosis and with viral genome detected in the CSF are shown in Table 3.
6
John Wiley & Sons
Page 7 of 20
CSF cell count displayed a mean of 271.6cells/mm3 (range 6 to1976 cells). High
protein level with a mean of 144.5 mg/dl (47-544) was observed in 41 patients. Glucose
level in the CSF samples was below reference value in one patient 19 mg/dl, as shown
in Table 3. The leukocyte counts in CSF of patients infected with EV varied from 15 to
1976 cells/mm3 (mean 360.9) compared to 6 to 1130 cells/mm3 (mean 178.6) in EV
negative sample (p = 0.01) as shown Table 4. The protein level in CSF of patients with
HHV varied from 21.6 to 544 mg/dl (mean 155.8) compared to 9.8 to 857 mg/dl (mean
105.6) in HHV negative sample (p = 0.02).
r
Fo
Of the 49 CSF samples in which the viral agents were detected, HHV was the
most common (34/49; 69.4%) as follows: EBV and VZV present in 11 and 10 patients
Pe
respectively, CMV in 9, HSV-1 and HSV-2 in two each. HSV-2 was detected in a
patient with a clinical diagnosis of meningitis. EV was identified in 16 (32.6%) of the
er
49 samples. The mean age of these patients was 25.6 years old (≤ 4 - 59) and 10 were
female. Of those positive for EV, one had encephalitis while another one meningitis.
Re
Infection with arbovirus was observed in 14.2% (7/49) of the samples. Only two
vi
genera, Flavivirus and Orthobunyavirus, were observed. Of the genus Flavivirus, only
ew
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
Journal of Medical Virology
dengue virus was detected, one DENV-1 and 2 DENV-2. OROV was identified in three
CSF samples. This group of viruses (DENV and OROV) was associated with 4, 2 and 1
cases of meningoencephalitis, meningitis and encephalitis respectively.
Discussion
Our study prospectively investigated the common viruses circulating in the
Amazonas from CSF of patients with suspected CNS viral infection through PCR and
RT-PCR technology to provide a rapid diagnosis for improving management of patients
as the identification of the etiologic agent is extremely important for establishing the
7
John Wiley & Sons
Journal of Medical Virology
prognosis of patients and for epidemiological studies as well as for tailoring treatment
accordingly.
With the combinations of different molecular tests: PCR, RT-PCR and SemiNested PCR for the detection of the genome of HHV, EVs, flaviviruses, alphaviruses
and OROV, it was possible to perform the first survey of viral CNS infections in the
Amazonas state. The abovementioned viruses were responsible for at least 29.7% of
suspected viral infection of the CNS suggesting that the remaining 70.3 % may be either
r
Fo
of non-viral or of other viral agents. Low detection rate has also been observed
worldwide as the causative agent of a substantial number of CNS infections remains
unknown [Huppatz et al., 2009; Tan et al., 2010].
Pe
The HHV (HSV-1, HSV-2, VZV, EBV and CMV) can cause a variety of acute
er
infections of the CNS from either a primary infection or reactivation of latent virus, and
are often associated with encephalitis and meningitis [Kupila et al., 2004; Frantzidou et
Re
al., 2008]. In this study, the genome of herpesvirus has been detected in more than half
of the patients who were PCR positive. The HSV-2 was associated with a female patient
vi
with meningitis. Of note, high prevalence of herpes meningitis has been reported in
ew
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
Page 8 of 20
women [Kupila et al., 2004 ].
CNS infections associated with VZV is very well known [Persson et al., 2009].
The VZV was present in 10 patients. Four of them had co-infections, three with CMV
and one with EBV. Among the six VZV-mono-infected patients, one patient was below
15 years with previous diagnosis of encephalitis while another one was a 54-year old
female patient with human immunodeficiency virus (HIV) and scalp skin lesions of
herpes zoster that had altered level of consciousness and respiratory distress syndrome.
Severe neurological complications have been suggested to be more frequent in patients
8
John Wiley & Sons
Page 9 of 20
with HIV [Meyding-Lamade et al., 2012]. All the other patients, positive for VZV,
showed no skin symptoms and were immunocompetent. Of note, it is well-established
that VZV can cause CNS disease and other neuropathies in the absence of rash illness
[Mendoza et al., 2007; Echevarria et al., 1997].
The high number of EBV infections observed is surprising. However, in
immunocompromised individuals, reactivation of latent EBV infection is known. Of
note, although EBV was associated with other viruses that cause CNS disease, it cannot
r
Fo
be excluded that EBV is not involved in the development of encephalitis. For the time
being, the clinical significance of EBV DNA in CSF of patients with suspected
infection of the CNS is still poorly understood as this virus remains latent in B
Pe
lymphocytes after primary infection and can be detected even in the absence of
symptoms [Maurmann et al., 2003]. Here, EBV was detected in 11 patients, of whom 7
er
had concomitant co-infections: 3 with HIV, 3 with EV and 1 with VZV. EBV has been
reported to be often associated with other agents in the CNS infection [Martelius et al.,
Re
2011]. Co-infections between EBV and EV have been cited [Dupuis et al., 2011]. The
vi
presence of mRNA of EBV in CSF of patients co-infected with other virus highlights
that this virus is able to replicate in the presence of another virus [Weinberg et al.,
ew
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
Journal of Medical Virology
2011].
CMV was detected in 9 CSF samples. Four of these patients were HIV positive
and the remaining five were immunocompetent patients. The presence of CMV in the
CSF immunocompetent individuals with neurological manifestation suggests that CMV
may play a role in meningoencephalitis. In Brazil, nearly 90% of individual are CMV
seropositive by child-bearing age. Infection with CMV usually occurs during childhood
and remains latent in immunocompetent individuals [Taylor-Wiedeman et al., 1991].
However, it has also been demonstrated that detection of CMV DNA in CSF samples
9
John Wiley & Sons
Journal of Medical Virology
were not necessarily correlated with a latent CMV infection [Studahl et al., 1995]. Here,
CMV was detected in 5 CSF samples of immunocompetent patients, a result similar to
that observed by two recent studies [Mendoza et al., 2007; Nahdi et al., 2012]. These
findings also underline an important role of CMV in acute CNS infection in
immunocompetent individuals.
Here, EVs were the most detected as in other studies in Brazil [ Mendonza et al.,
2007; Vidal et al., 2011] and elsewhere [Dupuis et al., 2011] suggesting EVs are the
r
Fo
most common cause of infection in the CNS. Over 50% of infections were detected in
adults. A similar study in England showed that EVs are common causes of infection of
the CNS in immunocompetent adults [Ihekwaba et al., 2008].
Pe
We also observed two different arboviruses in 7 patients. The OROV, present
er
only in South America, is one of the most important arboviruses that infect humans in
the Brazilian Amazon. OROV was detected in the CNS of three patients with
Re
meningoencephalitis recently [Bastos et al., 2012]. Neurologic manifestations
associated with OROV are not very common. However, in the Amazon during an
vi
outbreak of Oropouche fever were reported neurological manifestations typical of
ew
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
Page 10 of 20
aseptic meningitis early in the acute phase [Pinheiro et al., 1982]. The invasion of the
CNS by OROV was described in an animal model, showing signs of serious
neurological damage, including motor impairment and paralysis of the hind limbs
[Rodrigues et al., 2011]. DENV was the only flavivirus detected in 4 patients. Those
patients had signs and symptoms consistent with classic dengue (fever, headache and
myoartralgia) in the acute phase of infection but evolved with presentation of
neurological neck stiffness and impaired consciousness. The DENV-2 was detected in
the CSF of three patients, a 9-year-old boy who had a clinical diagnosis consistent with
encephalitis, a 32 years old woman with signs and symptoms of classical dengue
10
John Wiley & Sons
Page 11 of 20
(thrombocytopenia 17,000) who developed neurological signs, with neck stiffness and
altered level of consciousness suggestive of meningoencephalitis, and one patient with
meningitis. The DENV-1 was detected in the patient with meningitis. None of these
patients evolved to severe disease or death.
Unusual manifestations of dengue infection, such as neurological syndrome,
have been increasingly reported and among these are encephalitis, transverse myelitis
and Guillain Barré syndrome [Borawake et al., 2011]. However, several studies have
r
Fo
also shown that dengue can cause meningitis. Studies in Jamaica and Vietnam showed
13.5% and 4.2% respectively of the CNS infection are caused by dengue virus and the
most common manifestation was meningitis [Solomon et al., 2000; Jackson et al.,
2008].
er
Pe
Although alphaviruses were not detected, the presence of DENV and OROV
infections together with the other viruses highlights the need for increased surveillance
Re
in CNS infection, especially in patients with neurological manifestations in areas of
viral hyperendemicity such as Manaus with a simultaneous circulation of four DENV
vi
serotypes [Bastos et al., 2012], OROV [Mourão et al., 2009] and MAYV [Mourão et al.,
ew
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
Journal of Medical Virology
2012].
The leukocyte count and biochemical analysis of the CSF samples infected by
viruses showed pleocytosis. Protein level was high in 78% of virus positive samples
suggesting alteration in the blood-CSF barrier and is consistent with an infectious
process in the CNS [Dimas et al., 2008]. Concerning glucose level which depends on
the correlation with blood glucose levels, we are unable to say if the increase or
decrease in glucose levels were related to infection in the CNS as we did not measure
11
John Wiley & Sons
Journal of Medical Virology
blood glucose level. However, the leukocyte count and biochemical analysis of the CSF
samples showed classical parameters of virus infection.
Conclusions
Laboratory identification of the agent responsible for CNS infections is needed
since clinical manifestations do not indicate the specific etiologic agent. Hence, the use
of diagnostic methods that is specific, sensitive and fast is needed in order to provide an
adequate antiviral therapy besides suggesting suitable epidemiological measures to
r
Fo
control these diseases. Altogether, the detection of different viruses in the CNS of
patients with meningitis or encephalitis highlights the importance of maintaining a
system of active laboratory monitoring diagnostics with rapid methodology of high
Pe
sensitivity in areas of viral hyperendemicity.
Funding
er
Re
This work was supported by the Fundação de Apoio à Pesquisa no Estado do Amazonas
(FAPEAM) to Dr. MS Bastos [grant 871/2010 and grant 437/2012].
Conflicts of Interest
ew
vi
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
Page 12 of 20
All authors: no conflicts.
Acknowledgments
We thank all members of the clinical staff of the Fundação de Medicina Tropical Dr.
Heitor Vieira Dourado, Hospital Universitário Getúlio Vargas and Hospital Pronto
Socorro Dr. João Lucio Machado and the patients for willing to participate in this study.
A special thank to Elizabeth dos Santos Galusso and Marcia Castilho for managing the
samples.
12
John Wiley & Sons
Page 13 of 20
References
Bastos Mde S, Figueiredo LT, Naveca FG, Monte RL, Lessa N, Figueiredo RMP,
Gimaque JBL, Pivoto G, Ramasawmy R, Mourão MP. 2012. Identification of
Oropouche Orthobunyavirus in the cerebrospinal fluid of three patients in the
Amazonas, Brazil. Am J Trop Med and Hyg 86:732-735.
Bastos MS, de Figueiredo RM, Ramasawmy R, Itapirema E, Gimaque JB, Santos LO,
Figueiredo LT, Mourao MP. 2012. Simultaneous circulation of all four dengue
serotypes in Manaus, State of Amazonas, Brazil in 2011. Rev Soc Bras Med Trop
45:393-394.
Borawake K, Prayag P, Wagh A, Dole S. 2011. Dengue encephalitis. Ind J Crit Care
Med 15:190-193.
r
Fo
Bronzoni RV, Moreli ML, Cruz AC, Figueiredo LT. 2004. Multiplex nested PCR for
Brazilian Alphavirus diagnosis. Trans Royal Soc Trop Med and Hyg 98:456-461.
de Morais Bronzoni RV, Baleotti FG, Ribeiro Nogueira RM, Nunes M, Moraes
Figueiredo LT. 2005. Duplex reverse transcription-PCR followed by nested PCR
assays for detection and identification of Brazilian alphaviruses and flaviviruses. J
Clin Microbiol 43:696-702.
er
Pe
de Souza Lopes O, Coimbra TL, de Abreu Sacchetta L, Calisher CH. 1978. Emergence
of a new arbovirus disease in Brazil. I. Isolation and characterization of the
etiologic agent, Rocio virus. Am J Epidemiol 107:444-449.
Re
Dimas LF, Puccioni-Sohler M. 2008. Cerebrospinal fluid exam: influence of sample
preparation, temperature and time on analytical stability. Bras Patol Med Lab
44:97-106.
vi
Dupuis M, Hull R, Wang H, Nattanmai S, Glasheen B, Fusco H, Dzigua L, Markey K,
Tavakoli NP. 2011. Molecular detection of viral causes of encephalitis and
meningitis in New York State. J Med Virol 83:2172-2181.
ew
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
Journal of Medical Virology
Echevarria JM, Casas I, Tenorio A, de Ory F, Martinez-Martin P. 1994. Detection of
varicella-zoster virus specific DNA sequences in cerebrospinal fluid from patients
with acute meningitis and no cutaneous lessions. J Med Virol 43:331-335.
Frantzidou F, Kamaria F, Dumaidi K, Skoura L, Antoniadis A, Papa A. 2008. Aseptic
meningitis and encephalitis because of herpesviruses and enteroviruses in an
immunocompetent adult population. Eur J Neurology 15:995-997.
Huppatz C, Durrheim DN, Levi C, Dalton C, Williams D, Clements MS, Kelly PM.
2009. Ethiology of encephalitis in Australia, 1990-2007. Emerg Infect Dis 15:13591365.
Ihekwaba UK, Kudesia G, McKendrick MW. 2008. Clinical features of viral meningitis
in adults: significant differences in cerebrospinal fluid findings among herpes
13
John Wiley & Sons
Journal of Medical Virology
simplex virus, varicella zoster virus, and enterovirus infections. Clin Infect Dis
47:783-789.
Jackson ST, Mullings A, Bennett F, Khan C, Gordon-Strachan G, Rhoden T. 2008.
Dengue infection in patients presenting with neurological manifestations in a
dengue endemic population. West Ind Med J 57:373-376.
Kupila L, Vainionpaa R, Vuorinen T, Marttila RJ, Kotilainen P. 2004. Recurrent
lymphocytic meningitis: the role of herpesviruses. Arc Neurol 61:1553-1557.
Markoulatos P, Georgopoulou A, Siafakas N, Plakokefalos E, Tzanakaki G, KoureaKremastinou J. 2001. Laboratory diagnosis of common herpesvirus infections of
the central nervous system by a multiplex PCR assay. J Clin Microbiol 39:44264432.
r
Fo
Martelius T, Lappalainen M, Palomaki M, Anttila VJ. 2011. Clinical characteristics of
patients with Epstein Barr virus in cerebrospinal fluid. BMC Infec Dis 11:281.
Maurmann S, Fricke L, Wagner HJ, Schlenke P, Hennig H, Steinhoff J, Jabs W J. 2003.
Molecular parameters for precise diagnosis of asymptomatic Epstein-Barr virus
reactivation in healthy carriers. J Clin Microbiol 41:5419-28.
Pe
Mendoza LP, Bronzoni RV, Takayanagui OM, Aquino VH, Figueiredo LT. 2007. Viral
infections of the central nervous system in Brazil. J Infec 54:589-96.
er
Meyding-Lamade U, Strank C. 2012. Herpesvirus infections of the central nervous
system in immunocompromised patients. Ther Adv Neurol Dis 5:279-296.
Mondini A, Cardeal ILS, Lazaro E, Nunes SH, Moreira CC, Rahal P, Maia IL, Franco
C, Gongora DVN, Gongora-Rubio F, Cabrera SEM, Figueiredo LTM, Fonseca FG,
Bronzoni RVM, Chiaravalloti-Neto F, Nogueira ML. 2007. Saint Louis encephalitis
virus, Brazil. E Inf Dis 13:176-178.
vi
Re
Moreli ML, Aquino VH, Cruz AC, Figueiredo LT. 2002. Diagnosis of Oropouche virus
infection by RT-nested-PCR. J Med Virol 66:139-42.
ew
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
Page 14 of 20
Mourão MP, Bastos MS, Gimaque JB, Mota BR, Souza GS, Grimmer GH, Galusso ES,
Arruda E, Figueiredo LT. 2009. Oropouche fever outbreak, Manaus, Brazil, 20072008. Emerg Infec Dis 15:2063-2064.
Mourão MP, Bastos MS, de Figueiredo RP, Gimaque JB, Galusso ES, Kramer VM,
Oliveira CM, Naveca FG, Figueiredo LT. 2012. Mayaro fever in the city of
Manaus, Brazil, 2007-2008. Vec Bor Zoonotic Dis 12:42-6.
Nahdi I, Boukoum H, Salem ANB, Romdane FB, Hammami S, Chebel S, Mahbouba F,
Guediche MN, Chakroun M, Aouni M, Imbert-Marcille B, Bressollette-Bodin C.
2012. Detection of herpes simplex virus (1 and 2), varicella-zoster virus,
cytomegalovirus, human herpesvirus 6 and enterovirus in immunocompetent
Tunisian patients with acute neuromeningeal disorder. J Med Virol 84:282-289.
14
John Wiley & Sons
Page 15 of 20
Persson A, Bergstrom T, Lindh M, Namvar L, Studahal M. 2009. Varicella-zoster virus
CNS diseases – Viral load, clinical manifestations and sequels. J Clin Virol 46:249253.
Pinheiro FP, Rocha AG, Freitas RB. 1982. Meningitis associated with Oropouche virus
infections. Rev Inst Med Trop São Paulo 24:246-251.
Reimann CA, Hayes EB, DiGuiseppi C, Hoffman R, Lehman JA, Lindsey NP,
Campbell GL, Fischer M. 2008. Epidemiology of neuroinvasive arboviral disease
in the United States, 1999-2007. Am J Trop Med and Hyg 79:974-979.
Rodrigues AH, Santos RI, Arisi GM, Bernardes ES, Silva ML, Rossi MA, Lopes MB,
Arruda E. 2011. Oropouche virus experimental infection in the golden hamster
(Mesocrisetus auratus). Virus research 155:35-41.
r
Fo
Soares CN, Cabral-Castro MJ, Peralta JM, de Freitas MR, Zalis M, Puccioni-Sohler M.
2011. Review of the etiologies of viral meningitis and encephalitis in a dengue
endemic region. J Neurol Sciences 303:75-79.
Solomon T, Dung NM, Vaughn DW, Kneen R, Thao LT, Raengsakulrach B. 2000.
Neurological manifestations of dengue infection. Lancet 355:1053-9.
Pe
Studahl M, Bergstrom T, Ekeland-Sjoberg K, Ricksten A. 1995. Detection of
cytomegalovirus DNA in cerebrospinal fluid in immunocompetent patients as a
sign of active infection. J Med Virol 46:274-280.
er
Tan LV, Qui PT, Ha DQ, Hue NB, Bao LQ, Cam BV, Khanh TH, Hien TT, Chau NVV,
Tram TT, Hien VM, Nga TVT, Schultsz C, Farrar J, van Doorn HR, de Jong MD.
2010. Viral etiology of encephalitis in children in Southern Vietnam: Results of a
encephalitis prospective descriptive study. PLoS Negl Trop Dis 4:e854.
Re
Taylor-Wiedeman J, Sissons JG, Borysiewicz LK, Sinclair JH. 1991. Monocytes are a
major site of persistence of human cytomegalovirus in peripheral blood
mononuclear cells. J Gen Virol 72:2059-2064.
ew
vi
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
Journal of Medical Virology
Vidal LR, Almeida SM, Messias-Reason IJ, Nogueira MB, Debur Mdo C, Pessa LF,
Pereira LA, Rotta I, Takahashi GR, Silveira CS, Araújo JM, Raboni SM.
Enterovirus and herpesviridae family as etiologic agents of lymphomonocytary
meningitis, Southern Brazil. Arq Neuro-psiquiatria. 2011;69(3):475-81
Weinberg A, Bloch KC, Li S, Tang YW, Palmer M, Tyler KL. 2005. Dual infections of
the central nervous system with Epstein-Barr virus. J Infec Dis 191:234-237.
Zoll GJ, Melchers WJ, Kopecka H, Jambroes G, van der Poel HJ, Galama JM. 1992.
General primer-mediated polymerase chain reaction for detection of enteroviruses:
application for diagnostic routine and persistent infections. J Clin Microbiol
30:160-165.
15
John Wiley & Sons
Journal of Medical Virology
Table 1. Patient demographic, clinical and laboratory features diagnosed with confirmed
or clinically suspected infection of CNS.
Variable
N
PCR+(%)
(95%CI)
Total sample
165
49 (29,7)
(22.7 – 36.6)
≤ 15
41
11 (26,8)
(13.3 – 40.4)
< 15
124
38 (30,6)
(22.5 – 38.7)
74
20 (27.0)
(16,9 – 37.1)
p-value
Age group
0.69
Gender
Female
0.31
29 (31.9)
(27,0 – 36.8)
129
43 (33.3)
( 25.0 – 41.4)
36
6 (16.7)
(4.6 – 28.8)
Yes
34
15 (44.1)
No
17
3 (17.6)
Yes
20
8 (40.0)
0.76
No
31
10 (32,3)
Yes
12
5 (41.7)
(13.8 – 69.6)
0.73
No
39
13 (33.3)
(18.1 – 48.4)
ew
Yes
20
4 (20.0)
(2.5 – 37.5)
0.08
No
31
14 (45.2)
(27.7 – 62.7)
Yes
13
7 (53.8)
(26.8 – 80.8)
No
38
11 (28.9)
(14.9 – 42.9)
Yes
8
4 (50.0)
( 15.4 – 84.7 )
No
43
14 (32.6)
( 18.7 – 46.5)
Procedency
FMT-HVD
Other
Signs Symptoms
Headache
Fever
(27.5 – 60.7)
0.06
0.07
(-0.5 – 35.7)
(29.1 – 50.9)
(15.9 – 48.7)
vi
Vomiting
er
Pe
91
Re
Male
r
Fo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
Page 16 of 20
Neck stiffness
Consciousness
0.17
Convulsion
0.43
16
John Wiley & Sons
Page 17 of 20
Table 2. Viruses observed in the cerebrospinal fluid of patients with suspected viral
infection of the central nervous system.
Virus
Positive PCR
CSF sample
n=49
Codetection
n= 8
<15 anos
n= 11
Clinical
Diagnosis
Evs
16 (32.6%)
3 (18.7%) 13 (81.2%) 12 (75%)
4 (25%)
Encephalitis n=1
Meningitis n=1
EBV
11 (22.4%)
2 (18.2%) 9 (81.8%)
7 (63,6%)
4 (36.7%)
Encephalitis n=1
Meningitis n=2
ME n=1
VZV
10 (20.4%)
1 (10%)
6 (60%)
4 (40%)
Encephalitis n=1
CMV
9 (18.4%)
1 (11.1%) 8 (88.8%)
5 (55,6%)
4 (44.6%)
Encephalitis n=3
Meningitis n=1
r
Fo
>15 anos
n= 38
9 (90%)
Monodetection
n= 41
HSV-1 2 (4.1%)
2 (100%) 0
2 (100%)
0
-
HSV-2 2 (4.1%)
Pe
1 (50%)
1 (50%)
2 (100%)
0
Meningitis n=1
DENV 4 (8.2%)
1 (25%)
er
4 (100%)
0
Encephalitis n=1
Meningitis n=2
ME n=1
OROV 3 (6.1%)
0
0
ME n=3
3 (75%)
Re
3 (100%)
3 (100%)
EVs, enteroviruses; EBV, Epstein-barrvirus; VZV, varicella zoster vírus; CMV, cytomegalovirus; HSV-1,
herpes simplex virus type-1;
HSV-2, herpes simplex virus type-2;
oropouche vírus; ME, meningoencephalitis.
DENV, dengue vírus; OROV,
ew
vi
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
Journal of Medical Virology
17
John Wiley & Sons
Journal of Medical Virology
Table 3. Clinical diagnosis and laboratory of the 49 patients with viral genome positive cerebrospinal
fluid (CSF) from patients with central nervous system infection in the Western Brazilian Amazon
Biochemical
parameters
Protein
(mg/dl)
42
47
57
202
196
129
168
78
457
50
44
66
76
209
120
37
67
22
96
57
427
142
313
73
83
185
324
544
84
392
138
78
168
457
41
Glucose
(mg/dl)
46
70
43
34
59
48
26
41
41
50
88
67
52
55
63
95
71
62
19↓
52
39
166
27
52
46
43
27
34
53
35
59
54
26
41
59
Clinical
diagnosis
N/A
N/A
N/A
M
N/A
N/A
E
M
E
E
N/A
N/A
N/A
N/A
N/A
N/A
N/A
N/A
E
E
N/A
N/A
M
E
N/A
E
ME
N/A
N/A
N/A
N/A
N/A
N/A
N/A
N/A
148
54
N/A
Re
Virus
HSV-1
HSV-1
HSV-2
HSV-2
CMV
CMV
CMV, EV
CMV
CMV
CMV
CMV,VZV
CMV,VZV
CMV,VZV
VZV
VZV
VZV
VZV
VZV
VZV, EBV
VZV
EBV
EBV
EBV
EBV, EV
EBV, EV
EBV
EBV
EBV
EBV, EV
EBV
EV
EV
EV
EV
EV
ew
100 -
er
N.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36 15 y/F 198
vi
Leukocyte counts
Leukocyte
/µl
L% N%
42
100 160
98 2
314
100 677
94 6
10
100 1520
100 80
100 77
100 51
100 7
100 122
100 202
99 1
11
100 126
100 426
100 25
100 12
100 18
100 31
100 44
100 256
64 36
96
100 576
60 40
139
94 6
1066
86 14
410
100 277
78 22
202
100 283
100 528
91 9
448
100 1976
95 5
80
100 51
100 90
100 -
Pe
Age/
Sex
04y/M
15 y/F
07 y/F
18 y/F
30y/M
19y/M
32y/F
23y/M
30y/M
25y/M
43y/F
09y/M
43y/M
45y/M
30y/M
40y/M
38y/M
45y/F
19y/F
13y/M
01y/M
20y/M
24y/M
30y/M
06y/M
30y/M
45y/M
30y/M
28y/M
47y/M
21y/F
25y/M
32y/F
30y/M
33y/F
r
Fo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
Page 18 of 20
Co
morbidity
HIV
HIV
Tuberculosis, HIV
Malaria
Tuberculosis, HIV
HIV, Rush
HIV
HIV
HIV
HIV
HIV
EV
18
John Wiley & Sons
Page 19 of 20
Table 3. Continuation
N.
37
Age/
Sex
30 y/M
Leukocyte counts
Leukocyte
/µl
L% N%
224
85 15
Biochemical
parameters
Protein Glucose
(mg/dl) (mg/dl)
184
24
Clinical
diagnosis
M
Virus
EV
38
11 y/F
458
98
2
146
46
N/A
EV
39
59 y/M
208
100 -
106
56
N/A
EV
40
32 y/F
163
100 -
57
91
N/A
EV
41
04 y/F
341
99
1
61
25
N/A
EV
42
21 y/F
283
100 -
41
95
N/A
EV
43
54 y/M
6
100 -
40
59
ME
OROV
44
20 y/M
134
100 -
107
50
ME
OROV
45
37 y/F
533
100 -
136
107
ME
OROV
46
09 y/M
373
91
9
76
49
E
DENV-2
47
32 y/F
112
92
8
434
73
ME
DENV-2
48
25 y/F
20
100 -
24
75
M
DENV-2
49
26 y/F
320
100 -
75
65
M
DENV-1
r
Fo
Co
morbidity
HIV
Pe
(HIV) Human immunodeficiency virus ; L, lymphocyte; N, neutrophils; M, meningitis; E, encephalitis; ME,
meningoencephalitis; EV, enterovirus; OROV, oropouche virus ; N/A: not available
er
ew
vi
Re
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
Journal of Medical Virology
19
John Wiley & Sons
Journal of Medical Virology
Table 4. Laboratory findings for patients with enterovirus, herpesvirus or arbovirus
infection.
Laboratory finding in CSF
Leukocyte count x106
Enterovirus
n= 13
360,88 (p=0,01)*
Herpesvirus
n= 23
251,48 (P=0,36)
Arbovirus
n= 7
214,00 (P=0,91)
Protein level, mg/dL
136,52 (p=0,4)
155,83 (P=0,02)*
127,37 (P= 0,77)
Glucose level, mg/dL
55,12 (p=0,86)
53,6 (p=0,86)
68,29 (P=0,10)
*Statistically significant (P>0,05)
CSF: Cerebrospinal fluid
r
Fo
er
Pe
ew
vi
Re
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
Page 20 of 20
20
John Wiley & Sons