Joana_Espricigo_Conte (resumo expandido) BIOLOGICAS

ANÁLISE GENÉTICA PRELIMINAR DE SETE POPULAÇÕES DE Astyanax altiparanae
COLETADAS NA BACIA DO RIO DAS CINZAS-PR, UTILIZANDO PCR-RAPD.
1**
Joana Espricigo Conte; 1*Gabriela Bueno Franco;1Isabella Maria Dias payão Ortiz; 2Sandremir de Carvalho.
1
Alunos da Universidade Estadual do Norte do Paraná, Curso de Ciências Biológicas, Caixa Postal 261, CEP 86360000, Bandeirantes, PR, Brasil,** Bolsista Fundação Araucária, * Bolsista CNPq ;2Docentes da Universidade Estadual
Norte do Paraná. **Autor para correspondência: [email protected]
INTRODUÇÃO
Astyanax altiparanae pertence à Família Characidae e é classificada como insetívora,
apresentando elevada sobreposição alimentar (CASATTI, 2003). O gênero Astyanax é
considerado um importante elemento para a manutenção do equilíbrio ecológico dos ambientes
onde se encontra (GODOY, 1959).
Segundo Leuzzi (2003) A. Altiparanae é comumente encontrada na bacia do Alto Paraná.
Nesta região encontra-se o Rio Laranjinha, que possui uma PCH (pequena central hidrelétrica) e é
um importante afluente do Rio das Cinzas. Este por sua vez compõe a Bacia do Rio Paranapanema
e é considerado um dos tributários de maior porte do Rio das Cinzas (HOFFMANN, 2003).
A hidrografia da região também é caracterizada pela presença de Ribeirões, que segundo
Luiz et al. (1988) são considerados como um ecossistema frágil e muito sensível às ações
antropogênicas que interferem no ambiente.
A fragmentação das populações e a redução do fluxo gênico são alguns dos principais
fatores analisados dentro da genética de conservação (FRANKHAM et al., 2008). O conhecimento
da diversidade genética em espécies de peixes é importante para a compreensão de como são
distribuídas as populações e o seu potencial evolutivo (CARVALHO, 1993).
Entre as técnicas moleculares utilizadas nos estudos de estruturas populacionais, o RAPD
(Random Amplification of Polymorphic DNA) baseado em PCR (polymerase chain reaction), têm
se mostrado eficientes nas avaliações.
Como a espécie A. Altiparanae é presente em abundância nas bacias do Paraná e pela
constantes fragmentação e interferências antropogênicas nos ecossistemas aquáticos da região,
este trabalho propõe realizar a analise preliminar de estruturação gênica de sete populações de A.
altiparanae coletadas na Bacia do Rio das Cinzas, utilizando-se marcadores moleculares PCRRAPD.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados em média 22 indivíduos de cada população capturados em sete locais
diferentes da bacia do Rio das Cinza: Dois Locais nas proximidades da Cidade de BandeirantesPR, um tanque de criação de peixes abastecido por uma mina interna e um no Ribeirão das Antas,
afluente do Rio das Cinzas. Dois pontos na calha do Rio das Cinzas, dois pontos no Rio
Laranjinha, montante e jusante da escada de transposição de peixes e indivíduos capturados em
diferentes pontos do Ribeirão do Penacho, afluente do Rio Laranjinha, Ribeirão do Pinhal (PR).
De cada exemplar capturado foi retirado um pedaço de músculo e conservado em álcool
70% a -20ºC. A extração do DNA foi realizada de acordo com o protocolo de Povh, et. al (2005).
A quantificação foi realizada em gel de agarose a 1,0%, 3V/cm, corado com brometo de etídio, e
para estimativa do DNA genômico foi utilizado o software 1Kds da Kodak com base no marcador
Lambda cortado Hind III na concentração de 100 ɳg/µl. Foi realizada uma seleção com vinte
primers para verificar quais apresentam um melhor perfil eletroforético.
As reações de amplificação foram realizadas em um mix com volume de 15L contendo
15 ng do DNA genômico, 250M de dNTP, 0,33 M de primer, 3,3 mM de MgCl2, 1U de Taq,
tampão de reação 10x (10mM Tris-HCl pH 8,0 50mM KCl) e completado o volume com água
estéril. A amplificação do DNA foi programada da seguinte forma: desnaturação inicial de 4
minutos a 92C, 40 ciclo constituído de três fases, sendo elas: 92ºC por 40 segundos, 40ºC por 1
minuto e 72ºC por 2 minutos. E para finalizar uma fase de extensão com temperatura mantida em
72ºC durante 5 minutos. Os géis foram analisados observando-se presença e ausência de bandas e
obtida uma matriz binária que foi analisada pelos programas computacionais TFPGA 1.3 e
NTSYS-PC.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram utilizados quatro primers, sendo eles: OPP-6, OPP-7, OPP-08, OPP-12 que
resultaram em um total de 74 locos. A porcentagem de loci polimórficos (P) e heterozigozidade
média (He) variaram respectivamente entre 75,67% e 90,54% e 0,320 e 0,392, sendo os menores
valores observados pertencentes à população à montante da barragem do Rio Laranjinha e os
maiores para os espécimes coletadas no Ribeirão do Penacho. Menores valores de (P) já haviam
sido encontrados para a mesma população coletada à montante da barragem utilizando-se outros
primers (CONTE, 2010).
A distância genética se apresentou maior (Tabela I) e o Nm (Número de migrantes por
geração) mostrou-se menor nas comparações envolvendo a população à montante do Rio
Laranjinha (camparações de número 6, 11, 15, 18 e 20 da TabelaI). Ferreira (2009) realizando
análise genética em Geophagus brasiliensis coletados no Ribeirão do Penacho e no Rio Laranjinha
também encontrou valor de distância genética alta entre as populações analisadas (0,054).
Segundo Jager et al. (2001) a fragmentação de rios por barragens altera os padrões de migração
entre populações de peixes, pois converte rios de fluxo livre em reservatórios. Buscando diminuir
os impactos causados por tal fragmentação, as escadas de transposição de peixes visam interligar
as populações sujeitas à barragens. Agostinho et al. (2002) analisando a eficiência das escadas de
transposição concluem que em muitos casos é possível que as mesmas possam ter sidos
responsáveis por mais impactos aos estoques de peixes.
Os valores de Theta não foram significativos nos cruzamentos 1 e 7 indicando ausência de
estruturação entre as populações (Tabela I) . Os resultados demonstram que a população a
montante da escada de transposição apresenta uma estruturação de moderada a grande quando
comparada as demais populações. Isto é indicativo de que a barragem que foi construída na década
de 60 vem interferindo no fluxo gênico.
Alguns Resultados inesperados foram encontrados na comparação de número 7 entre as
populações dos dois ribeirões (tabela I), pois foram as que apresentaram um maior valor de
similaridade e maior número de migrantes por geração (Nm) entre as populações. Isto passa a ser
intrigante, pois os dois ribeirões não apresentam nenhuma ligação física direta entre si. Desta
maneira podemos atribuir a semelhança entre as duas populações à manutenção de determinados
alelos para adaptação em ambientes que são fortemente influenciados pela ação antrópica.
Também deve- se ressaltar a importância dos pequenos ribeiros na manutenção da variabilidade
genética para determinadas espécies. Segundo Esteves & Aranha (1999) não se pode aplicar aos
pequenos tributários os conhecimentos adquiridos sobre os rios maiores, pois esses possuem
características exclusivas. Rios de pequena ordem exibem naturalmente baixa riqueza específica
sendo altamente suscetíveis a perda de espécies e redução da diversidade por mudanças induzidas
pela urbanização na qualidade da água, regime hidrológico ou ambos. (CUNICO, 2006).
O dendrograma, construído através do coeficiente de Jaccard e método UPGMA, mostrou
a tendência em agrupar os indivíduos das mesmas populações, principalmente da montante e
jusante do Rio Laranjinha e indivíduos do Rio das Cinzas.
Tabela I: Resultados encontrados nas comparações entre pares das populações analisadas. No quadro encontra-se
os resultados do quiquadrado( 2), número de migrantes por geração (Nm) distância e identidade de Nei´s (1978).e
estruturação das populações ( θ).
Cruzamento
1
2
Populações
2*
Nm
Nº
TanquexCórrego
3,2472
6,53
Tanque de CriaçãoxPenacho
3
Tanque de CriaçãoxCinzas 1
4
Tanque de CriaçãoxCinzas 2
5
Tanque de CriaçãoxLaranjinha Jus
6
Tanque de CriaçãoxLaranjinha Mon
4,3472
11,035
10,393
9,8212
16,456
4,81
1,74
1,87
1,94
1,09
44
Distância
0,0246
Identidade
0,9757
Theta
0,0369
44
0,0342
0,9664
0,0494
44
0,0884
0,9154
0,1254
44
0,08
0,9231
0,1181
43
0,0813
0,9219
0,1142
44
0,1336
0,8749
0,187
0,9855
0,0223
7
CórregoxPenacho
1,9624
10,96
44
0,0146
8
CórregoxCinzas 1
9,416
2,09
44
0,0718
0,9307
0,107
44
0,0551
0,9464
0,087
43
0,0675
0,9347
0,0989
44
0,1242
0,8832
0,1801
44
0,0543
0,9472
0,0822
44
0,0305
0,9699
0,0504
43
0,0399
0,9609
0,0608
0,8813
0,1785
9
CórregoxCinzas 2
10
11
CórregoxLaranjinha Jus
CórregoxLaranjinha Mon
12
PenachoxCinzas 1
13
PenachoxCinzas 2
14
PenachoxLaranjinha Jus
7,656
8,5054
15,849
7,2336
4,4352
5,2288
2,62
2,28
1,14
2,79
4,71
3,86
15
PenachoxLaranjinha Mon
15,708
1,15
44
0,1263
16
Cinzas 1xCinzas 2
7,8584
2,55
44
0,0535
0,9479
0,0893
43
0,0648
0,9373
0,1011
44
0,14
0,8693
0,2054
43
0,0306
0,9698
0,0527
44
0,1327
0,8757
0,2013
0,107
0,8985
17
18
Cinzas 1xLaranjinha Jus
Cinzas 1xLaranjinha Mon
19
20
Cinzas 2xLaranjinha Jus
Cinzas 2xLaranjinha Mon
21
8,6946
18,075
4,5322
17,714
2,22
0,97
4,49
0,99
Laranj. JusantexLaranj. Mon
14,147
1,27
43
0,1645
* diferença significativa ao nível de 5%; 2 = 3,84; valores de : entre 0,05 a 0,15 (diferenciação moderada); : entre 0,15 - 0,25
(grande diferenciação) e entre : 0,25 – 1,0 (muito grande) segundo Wright (1978).
CONCLUSÃO
Os resultados encontrados demonstram uma estruturação moderada a grande entre as
populações analisadas. Entre o tanque e o córrego não houve diferenças na estruturação genética,
já que provavelmente a população do tanque seja proveniente de peixes do ribeirão das Antas que
migram para o tanque nos períodos de enchentes. Também podemos aferir que a barragem
construída no Rio Laranjinha interferiu no fluxo gênico, sendo que a população a montante foi a
que apresentou menor variabilidade genética e menor número de He, o que poderia ser explicado
por um aumento na endogamia nesta população. Um resultado surpreendente foi a alta
variabilidade e He encontrada nos dois ribeirões, ambos com forte influência antrópica,
demonstrando que esta espécie apresenta uma adaptação em ambientes distintos, o que também
aponta a necessidade de preservar estas fontes de pequena ordem devido a manutenção de grande
variabilidade para algumas espécies. Os valores encontrados apontam para a necessidade de
futuras ações de manejo envolvendo principalmente indivíduos pertencentes à montante da
Barragem do Rio Laranjinha, já que esta se apresentou como a população mais distante e com
menor Nm em relação às demais, demonstrando aparentemente um isolamento que pode ser
causado devido à barragem presente no Rio.
AGRADECIMENTO
À Fundação Araucária e à CNPq pelas bolsas de iniciação científica.
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Área Temática: Zoologia (Genética da conservação)