Vírus entéricos como indicadores de qualidade da água e de

Cátedra Unesco Memorial da América
Latina
Gerenciamento Integrado de Recursos
Hídricos para a América Latina
São Paulo, 9 de abril de 2012
Vírus entéricos como indicadores de
qualidade da água e de impacto
ambiental:
possíveis contribuições ao gerenciamento de Recursos
hídricos
Fernando Rosado Spilki
Laboratório de Microbiologia Molecular,
PPG em Qualidade Ambiental, Universidade Feevale,
Novo Hamburgo, RS
[email protected]
Histórico dos problemas de qualidade
da água
Contaminação microbiológica da
água
 Porque diagnosticar/ monitorar?
 Risco do consumo/ banho em águas contaminadas > transmissão de
doenças veiculadas pela água
 Indicadores
 Fidedignos em atestar a Contaminação fecal da água
 Crescimento no trato digestivo do hospedeito, sem crescimento no
ambiente
 O que fazemos hoje? Coliformes
 Totais
 Fecais (Escherichia coli)
Coliformes
 Aeróbicos estritos ou facultativos, gram-negativos, nãoformadores de esporos fermentadores de lactose a 35°C
Monitoramento microbiológico
clássico da água
 Organismos indicadores
 Contaminação fecal
 Coliformes termotolerantes > Escherichia coli
 Enterococcus
 NMP:
 Número mais provável/ 100 mL de água
Detecção de coliformes X risco à
saúde humana
 Técnicas desenvolvidas no tempo em Salmonella typhi (febre
tifóide) era um problema > doença banida do ocidente (Gleeson
C, Gray N. The coliform index and waterborne disease.London: E
and FN Spon, 1996);
 Enterococcus e a contagem exclusiva de coliformes fecais têm, no
hemisfério norte, uma melhor (não perfeita) relação com risco e
doença
Coliformes fecais como
marcadores
 Falham especialmente:
 Em áreas tropicais: crescimento for a do hospedeiro > disponibilidade
de matéria orgânica e temperatura elevada
 Em indicar a presença de outros patógenos
 Parasitos: Cryptosporidium, Entamoeba, Naegleria e ovos de helmintos
 Vírus entéricos
 Outras bactérias: Campylobacter, Vibrio, Helicobacter,
Estrutura de vírus entéricos

Nãoenvelopados
(nus)
Vírus no ambiente
Bacteriófagos
 Papel na natureza: controle das populações bacterianas
 108 partículas/mL em águas doces superficiais
 1029 partículas na água do mundo
Vírus e ecossistemas
 Bacteriophage
 Regulação da população microbiana e transferência horizontal de genes
 3.5% do DNA total diluído na água do mundo
 Flutuações na DBO doce/marinha
Vírus nos solos
Sulfolobus spindleshaped viruses
Capsidprotein
coat
Wiedenheft et al.,
J. Virology (2004) 78:1954
Vírus no ambiente
 Partículas
carregadas
negativament
e em pH
neutro
 Interações
com outras
partículas e
sólidos
 Agregação
em biosólidos
Adenovírus
Enterovírus
*DNA de fita
dupla
*RNA fita simples
*Causador de
diarréias,
pneumonias e
conjuntivites
*Causador de
diarréias
e conjuntivites
Torque teno
vírus
*DNA circular
fita simples
*Provável
causador de
hepatites
Norovírus
Rotavírus
*RNA fita simples
*RNA dupla fita
*Causa surtos de
diarréia e
vômitos
*Principal
responsável por
gastroenterites
em crianças
Vírus não-envelopados e icosaédricos
Trato gastrointestinal
Transmissão
fecal-oral
Contaminação do
solo, alimentos e
água
Resistência desinfetantes e
intempéries
 E. coli = baixa
 Vírus entéricos = muito alta
Permanência no ambiente
• E. coli ~3 semanas
• Enterovírus 120 dias
• Adenovírus (?)
• DISSEMINAÇÃO NO AMBIENTE
• Filtração por processos naturais
• Transporte
Movimentos de vírus entéricos no
subsolo
Gastroenterites virais
Transmissão fecal-oral;
2a. Causa de morbidade por doenças
infecciosas no mundo (até 80% dos
atendimentos nos países em
desenvolvimento);
2 milhões de óbitos em crianças por ano no
mundo (mesmo número de óbitos por HIVAIDS)
450 milhões de reais /ano/Brasil, apenas em
faltas parciais ao trabalho!
 (FGV, Trata Brasil)
Gatroenterite por Rotavirus A em
seres humanos
Transmissão fecal-oral
Crianças entre 6 meses de
idade e idade pré-escolar (5
anos)
Diarréia, vômito,
desidratação
Quadro leve ou inaparente
em adultos
Prevenção: Vacinação
 saneamento básico tem
impacto limitado

Rotavírus
Charles A. (Chuck) Mebus
1969
C Mebus, N Underdahl, M Rhodes,
M Twiehaus
discovery of bovine rotavirus (the first rotavirus)
Ruth Bishop
Ian Hamilton Holmes
Thomas Flewett (1922-200
Estimated global distribution of the 800,000 annual
deaths caused by rotavirus diarrhea
1973
R Bishop, G Davidson, I Holmes, T Flewett,
A Kapikian, others
discovery of human rotaviruses
Review Article
Global distribution of rotavirus serotypes/genotypes and its implication for the
development and implementation of an effective rotavirus vaccine
1.Norma Santos1,*,
2.Yasutaka Hoshino2
Reviews in Medical Virology
Volume 15, Issue 1, pages 29–56, January/February 2005
The temporal and geographical distribution of human rotavirus G and P types was reviewed by
analysing a total of 45571 strains collected globally from 124 studies reported from 52 countries
on five continents published between 1989 and 2004.
Four common G types (G1, G2, G3 and G4) in conjunction with P[8] or P[4] represented over
88% of the strains analysed worldwide. In addition, serotype G9 viruses associated with P[8] or
P[6] were shown to have emerged as the fourth globally important G type with the relative
frequency of 4.1%.
the P[8]G1 represented over 70% of rotavirus infections in North America, Europe and Australia,
but only about 30% of the infections in South America and Asia, and 23% in Africa.
in Africa
(i) the relative frequency of G8 was as high as that of the globally common G3 or G4,
(ii) P[6] represented almost one-third of all P types identified and
(iii) 27% of the infections were associated with rotavirus strains bearing unusual
combinations such as P[6]G8 or P[4]G8
In South America, uncommon G5 virus appeared to increase its epidemiological
importance among children with diarrhea. Such findings have
(i) confirmed the importance of continued active rotavirus strain surveillance in a
variety of geographical settings and
(ii) provided important considerations for the development and implementation of an
effective rotavirus vaccine (e.g. a geographical P-G type adjustment in the formulation
of next generation multivalent vaccines)
Sazonalidade:
diarreia de outono e inverno
Journal of Virology, January 2002, p. 41-57, Vol. 76, No. 1
0022-538X/01/$04.00+0 DOI: 10.1128/JVI.76.1.41-57.2002
Copyright © 2002, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.
Group A Rotavirus Infection and Age-Dependent Diarrheal Disease in Rats: a New Animal Model To Study the
Pathophysiology of Rotavirus Infection
Max Ciarlet,1 Margaret E. Conner,1,2 Milton J. Finegold,3 and Mary K. Estes1*
FIG. 6. Electron micrographs of ultrastructural appearance of the ileum of PBS-inoculated (A) or RRVinoculated (B) 5-day-old rats at 48 hpi. Extensive cytoplasmic vacuolization occurred after RRV infection (B),
including relocation of the nucleus. Vacuoles are devoid of virus particles, and the brush border system
appears intact. Original magnification, x2,400.
Vacinas comercialmente
disponíveis
a | Rotarix is an attenuated human rotavirus vaccine made of a tissue-culture-adapted human P1A[8]G1,
VP6 subgroup II and NSP4 geno-group B strain.
b | RotaTeq is a bovine (WC3)–human reassortant vaccine composed of the five strains shown, each
containing a human rotavirus gene encoding the VP7 neutralizing protein from different serotypes.
Notably, in the WI79-9 and SC2-9 viruses (the last was used to create the first), genes 3 (VP3) and 9
(VP7) are of human origin. Although VP6 and NSP4 can potentially be the targets of protective antibodies
(Fig. 2), their role in immunity against disease in humans is unknown.
Efeitos sobre epidemiologia
Efeitos da vacinação
Norovírus
 Família Caliciviridae
 RNA fita simples, polaridade +, não-envelopado
 Norovirus
 gastroenterite
 Principal causa de diarreia viral em seres humanos
 Sintomas e epidemiologia semelhantes aos descritos hoje desde 1929 na
literatura
 Norwalk/Ohio/USA > Kapikian, 1958
 ‘‘small round structured viruses’’ (SRSV)
 Sapovirus
 gastroenterite
 Sapporo, Japão, 1977 (Chiba, 1978)
Norovírus
 Doença em adultos

“diarreia dos cruzeiros”, surtos
em escolas e locais de trabalho
 Gastroenterite aguda
 normalmente moderada
 (raramente grave)
 Perda de fluidos
 Lesões do epitélio
intestinal
Distribuição sazonal
Explicação para a correlação entre
os norovírus e os navios de cruzeiro
(CDC)
 As doenças ocorridas em navios de cruzeiro contam
com acompanhamento por organizações oficiais de
saúde. Portanto, surtos são descobertos e relatados
mais rapidamente num navio de cruzeiro do que em
terra firme.
 Camarotes e instalações apertadas podem aumentar o
contato entre grupos humanos.
 Passageiros recém-chegados podem trazer o vírus
para os outros passageiros e para a tripulação.
Adenovírus
 Família Adenoviridae
 DNA fita dupla
 50 sorotipos em seres humanos
 AdV F - G> entéricos
 AdV-40 e -41
 Excreção também de AdV respiratório AdV-2 e -5
Robert Green was born in 1895 in Wadena,
Minnesota. He earned four degrees from the
University of Minnesota, including an MD in
1922. He joined the staff at the University of
Minnesota in 1918 and became professor of
bacteriology and immunology in 1929. Green
was world renowned for his research on diseases
in animals caused by viruses. From 1932-1940,
he directed the Minnesota wildlife disease
research program. During his tenure, he
developed a vaccine to prevent encephalitis in
foxes (infectious canine hepatitis virus) and a
vaccine against canine distemper (the first canine
distemper virus vaccine), thereby saving
Minnesota’s fur industry. Photo courtesy of University
of Minnesota Archives.
Robert Gladding Green (1895-1947)
1930
R Green, N Ziegler, others
discovery of infectious canine hepatitis virus (the first adenovirus)
Wallace Rowe (1926-1983)
Human adenovirus 5, cell culture,
thin section EM
1953
W Rowe
discovery of human adenoviruses
Manifestações clínicas
Manifestações clínicas
 Gastroenterite
 Na maioria auto-limitantes
 Desidratação
Enterovírus
Atenção
- Nem todo vírus entérico é um
enterovirus!
Enterovírus
 Família Picornaviridae
 RNA fita simples, polaridade +, não-envelopado
 Gênero Enterovirus (2008)
 Antigo Enterovirus + Rhinovirus
Friedrich A. J. Loeffler
(1852-1915)
Paul Frosch (1860-1928)
Friedrich Loeffler (left)
and P. Frosch, both
veterinarians,
in 1898, working with
Robert Koch (right),
discovered the
first virus, foot-and-mouth
disease virus
Loeffler, F. and P. Frosch.
1898. Berichte der
Kommission zur
Erforschung der Maulund Klauenseuche bei
dem Institut fur
Infektionskrankheiten.
Part I, 23: 371-391.In
Milestones in
Microbiology: 1556 to
1940, translated and
edited by Thomas D.
Brock, ASM Press. 1998,
p149.
Friedrich Loeffler (1852–1915)
1898
F Loeffler, P Frosch
Robert Koch (1843-1910)
discovery of foot-and-mouth disease virus (the first
virus,* the first vertebrate virus, the first
picornavirus)
Karl Landsteiner (1868-1943)
First electron micrograph of poliovirus,
shadow-cast technique, 1953
RCA Laboratories, details unknown,
from David Sarnoff Library
1909
K Landsteiner, E Popper
discovery of polioviruses (the first enteroviruses)
Taxonomia
Gênero Enterovirus
Type:
Poliovirus (Human enterovirus C serotypes (PV-1, PV-2, PV-3)
Main:
Human enterovirus A (HEV-A)
Ex: Human coxsackievirus A2 (CV-A2)
Human enterovirus B (HEV-B)
Ex: Human coxsackievirus B1 (CV-B1)
Human enterovirus C (HEV-C)
Ex: Human coxsackievirus A1 (CV-A1)
Human enterovirus D (HEV-D)
Ex: Human enterovirus 70 (EV-70)
Human rhinovirus A
Morfologia
Patogênese e doenças causadas
por Enterovirus
 Infecções
assintomáticas
 Crianças
 Imunossuprimidos
Syndromes Caused by Enteroviruses
Syndrome
Serotypes Most Often Implicated
Aseptic meningitis
Coxsackieviruses A2, 4, 7, 9, and others and B2–5
Poliovirus types 1–3
Echoviruses 4, 6, 7, 9, 11, and others
Human parechoviruses 1 and 2
Aseptic meningitis with rash
Coxsackieviruses A9 and B4
Echoviruses 4 and 16
Enterovirus 71
Conjunctivitis (hemorrhagic)
Enterovirus 70
Coxsackievirus A24
Epidemic pleurodynia (Bornholm disease)
Coxsackieviruses B1–6
Hand-foot-and-mouth disease
Coxsackievirus A9, 16, and others
Coxsackieviruses B2–5
Enterovirus 71
Herpangina
Coxsackieviruses A2, 4–6, 8, and 10
Probably coxsackievirus B3 and others
Myopericarditis
Coxsackieviruses A4 and 16 and B1–5
Echoviruses 9 and 22
Paralysis
Polioviruses 1–3
Coxsackieviruses A7 and others
Echoviruses 4, 6, 9, and others
Enterovirus 71
Rash
Coxsackieviruses A9 and B1, 3, 4, and 5 (also implicated, A4–6 and 16)
Echovirus 9 and 16 (also implicated 2, 4, 11, 14, 19, and 25)
Respiratory disease
Echoviruses 4, 8, 9, 11, 20, and others
Coxsackieviruses A21 and 24 and B1 and 3–5
Enterovirus 71
53
Doença dos pés mãos e boca (Coxsackievirus)
Poliomielite
Enterovirus e DM1
Astrovírus
 Família Astroviridae
 Gêneros:
 Mamastrovirus
 Avastrovirus
 RNA fita simples, polaridade +
 Não-envelopados
Human astrovirus 1
C. R. (Dick) Madeley
1975
C Madeley, B Cosgrove, T Lee, J Kurtz
Madeley CR, Cosgrove BP. Letter: Viruses in infantile
gastroenteritis. Lancet 19;2:124-125, 1975.
discovery of human astrovirus 1 (the first astrovirus)
Estrutura
Apresentação clínica e
epidemiologia
Diarreia aguda de moderada a grave em
crianças, adultos e idosos
 Quadro grave em imunossuprimidos
Sazonalidade: controversa
Surtos (similar NoV):
 Escolas, creches, hospitais geriátricos e
pediátricos
 Asilos
 Quarteis
 Zonas rurais
HEPATITES VIRAIS
CARACT.
HEPATITE A
HEPATITE B
HEPATITE C
HEPATITE D
HEPATITE E
TRANSMISSSÃO
FECAL-ORAL
PARENTERAL
PARENTERAL
PARENTERAL
FECAL-ORAL
PERÍODO DE
INCUBAÇÃO
2 – 6 SEMANAS
4 – 26 SEMANAS
2 – 22 SEMANAS
6 – 26 SEMANAS
2 – 6 SEMANAS
Maior parte das
infeções subclínicas
Infecções agudas:
febre, mal estar e
icterícia
Frequentem.
subclinica. Pode
cronificar em 510% dos casos
Semelhante ao
HBV mas tende
mais para a
cronificação
Danos severos ao
fígado, e
apresenta alta
taxa de
mortalidade
Similar ao HAV,
mortalidade em
mulheres grávidas
Não
Sim
Sim
Sim
Não
IMUNIDADE A
REINFECÇÃO
Imunidade a agentes
homólogos, mas não
a heterólogos
É rara a reinfecção
com agente
homólogo, sem
imunidade para
heterólogos
Possível reinfecção
Não é citada
reinfecção em
humanos
A reinfecção é
possível
VACINA
Vacina Inativada
Ig promove proteção
temporária
Vacinas DND
recombinante
Não existe vacina
A vacinação contra
HBV promove
proteção
Em
desenvolvimento
SINTOMAS
CRONIFICAÇÃO
HEPÁTICA
Potabilidade da água
 Portaria MS Nº 2914 DE
12/12/2011 (Federal)
 Dispõe sobre os procedimentos
de controle e de vigilância da
qualidade da água para
consumo humano e seu padrão
de potabilidade.
Art. 11º. Compete às Secretarias de Saúde dos
Estados:
 VII - realizar, em parceria com os
Municípios em situações de surto de doença
diarréica aguda ou outro agravo de
transmissão fecal-oral, os seguintes
procedimentos:
 a) análise microbiológica completa, de modo a
apoiar a investigação epidemiológica e a
identificação, sempre que possível, do gênero
ou espécie de microorganismos;
 b) análise para pesquisa de vírus e
protozoários, no que couber, ou
encaminhamento das amostras para
laboratórios de referência nacional, quando as
amostras clínicas forem confirmadas para esses
agentes e os dados epidemiológicos apontarem
a água como via de transmissão; e
 c) envio das cepas de Escherichia coli aos
laboratórios de referência nacional para
identificação sorológica;
Portaria MS Nº 2914 DE
12/12/2011
 Art. 29º. Recomenda-se a inclusão de monitoramento de
vírus entéricos no(s) ponto(s) de captação de água
proveniente(s) de manancial(is) superficial(is) de
abastecimento, com o objetivo de subsidiar estudos de
avaliação de risco microbiológico.
 Art. 31º. , § 1º Quando for identificada média geométrica
anual maior ou igual a 1.000 Escherichia coli/100mL deve-se
realizar monitoramento de cistos de Giardia spp. e oocistos de
Cryptosporidium spp. no(s) ponto(s) de captação de água.
Desafios conceituais
Vírus infeccioso X partícula morta
 Detecção molecular X isolamento viral
 Qual seria a dose máxima permitida?
 Como controlar a contaminação?


Desafios práticos: custo da análise (?) e
treinamento de pessoal
Arroio Dilúvio, Porto Alegre, RS
Satellite view of Porto Alegre, showing the collection points along the Arroio Dilúvio from the source (Point #1,
East) to the mouth (Point #5, West) (shown as dots and pointed by white arrows). Please note the intense
urbanization from the Point #2 onwards. Figure made with the aid of Google Earth Protm.
Arroio Dilúvio, Porto Alegre, RS
Table 1. Primers and conditions used for amplification of AdV, EV, GARV andTTV in PCR.
Viruses
AdV
EV
GARV
TTV
a
Target
Gene
Primer
Position
Name
Sequence
Polarity
VTB2-HAdVCf
5’-GAGACGTACTTCAGCCTGAAT-3’
Sense
106-126a
VTB2-HAdVCr
5’-GATGAACCGCAGCGTCAA-3’
Reverse
190-207a
ENT-F1
5’-CCTCCGGCCCCTGAATG-3’
Sense
443-459b
ENT-R2
5’-ACACGGACACCCAAAGTAG-3’
Reverse
541-559c
ROTAFEEVALE -FW
5’-GATGTCCTGTACTCCTTGT-3’
Sense
7-25d
ROTAFEEVALE -REV
5’-GGTAGATTACCAATTCCTCC-3’
Reverse
148-167
F1
5’-GGGAGCTCAAGTCCTCATTTG-3’
Sense
221-241e
F2
5’-GGGCCWGAAGTCCTCATTAG-3’
Sense
170-189e
Rev
5’-GCGGCATAAACTCAGCCATTC-3’
Reverse
252-272e
Hexon
5’UTR
VP6
ORF2
Primers sequences reported by Wolf et al. (2010)
Primers sequences reported by Tsai et al. (1993)
c
This work, Genome position of primers based on GenBank accession number FJ859064
d
This work, Genome position of primers based on GenBank accession number HM348746
e
This work, Genome position of primers based on GenBank accession number FN687866
f
Initial annealing temperature, which was decreased by 0.5 °C at each of the 39 subsequent cycles (Touchdownb
PCR)
d
Annealing
Temperature
Amplicon
Length
55 °C
101 bp
56 °C
116 bp
54 °Cf
160 bp
59 °C
102 bp
Arroio Dilúvio, Porto Alegre, RS
Table 2. Detection of AdV, EV, GARV and TTV genome in wat er samples collected from the
Arroio Diluvio, Porto Alegre, Brazil.
Collection
Date
Harvesting points
Virus
January
AdV
April
September
EV
GARV
TTV
AdV
EV
GARV
TTV
AdV
EV
GARV
TTV
P#1
-
+
-
-
-
+
-
-
-
-
-
-
P#2
+
-
-
+
-
+
-
-
-
-
-
-
P#3
+
+
-
-
-
+
-
+
+
-
-
-
P#4
-
+
N/T
-
-
+
-
-
-
-
-
-
P#5
-
+
-
+
-
+
-
+
N/T
N/T
N/T
N/T
+ (Detected)
- (Not detected)
N/T (Not tested)
Assessment of enteric viruses in a sewage treatment
plant located in Porto Alegre, Southern Brazil
1
2
Table 2. Detection of HAdV, EV, GARV and TTV genomes, and coliforms quantification, in influents and effluents samples collected
from São João/Navegantes STP, Porto Alegre, Brazil.
Collection Date
Microbiological Parameters
3
AdV
EV
GARV
TTV
Total coliform counting
(MPN/100 mL)
Fecal coliform counting
(MPN/100 mL)
Mar/09
-/-
-/+
NT / -
-/-
4.2 x 107 / 6.1 x 105
1.7 x 107 / 1.2 x 105
Apr/09
-/-
-/-
-/-
-/-
4.4 x 107 / 4.4 x 104
8.7 x 106 / 1.1 x 104
May/09
-/+
-/+
-/-
-/-
1.3 x 107 / 1.1 x 105
3.1 x 106 / 1.8 x 104
Jun/09
-/+
-/+
- / NT
-/-
2.0 x 107 / 5.2 x 105
6.5 x 106 / 5.8 x 104
July/09
+/-
-/-
-/-
-/-
1.6 x 107 / 1.2 x 105
1.6 x 107 / 6.1 x 104
Ago/09
-/+
-/-
+/-
-/-
1.7 x 107 / 1.2 x 105
3.1 x 106 / 2.5 x 104
Sep/09
-/+
-/-
-/-
-/+
9.9 x 106 / 3.6 x 104
1.6 x 106 / 2.5 x 104
Out/09
+/-
-/-
+/-
-/-
1.4 x 107 / 5.1 x 104
2.4 x 106 / 2.9 x 103
Results are showed as influent/effluent; + and -, detected and not detected, respectively; N/T, not tested
Presence of Enterovirus in water samples collected from
state and municipal schools of Rio Grande do Sul, Brazil
Enterovírus em escolas
Análise filogenética molecular
Água mineral
Comparação dos resultados positivos para água mineral de 500mL e 1,5L em
relação aos métodos utilizados, PCR e qPCR.
Amostras Água
Mineral
EV PCR
Positivos
EV qPCR
Positivos
AdV PCR
Positivos
AdV qPCR
Positivos
Marca A (n = 10)
0 (0%)
4 (50%) b
1 (10%)
9 (90%)
Marca B (n = 10)
0 (0%)
0 (0%) c
2 (40%) ª
8 (80%)
Marca C (n = 5)
1 (20%)
4 (100%)d
2 (40%)
5 (100%)
Marca D (n = 5)
2 (40%)
1 (50%)e
4 (80%)
5 (100%)
Marca E (n = 5)
4 (80%)
2 (50%)f
1 (20%)
5 (100%)
Marca F (n = 4)
0 (0%)
NA
3 (75%)
4 (100%)
ª Somente foram analisadas 5 amostras; b Somente foram analisadas 8 amostras; c Somente foram
analisadas 1 amostra; d Somente foram analisadas 4 amostras; e Somente foram analisadas 2 amostras; f
Somente foram analisadas 4 amostras
NA não analisada
Enteric viruses in water samples
from Brazilian dairy farms
Paranhana
River
Dos Sinos
River
6.5
Km
Da Ilha
River
Propriedades leiteiras, Tenente
Portela, Noroeste RS
Detection of HAdV, EV and RV genomes, and coliforms quantification, in water
samples collected from springs, creeks, ponds and artesian wells on dairy farms at the
municipality of Tenente Portela, Rio Grande do Sul, Brazil.
Farm
Sample
Artesian well #1
Artesian well #2
Spring
Artesian well
#329
Creek
Pond
Spring
Tap
(milking
parlor)
#330
Creek
Pond
Spring
#343
Creek
Pond
Creek
#344
Pond
● = positive; ○ = negative
#326
AdV
EV
RV
●
●
●
●
○
○
●
●
○
○
●
●
●
●
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
●
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
●
○
Vírus entéricos em água subterrânea,
Riozinho e Rolante, 2011
Código de identificação
Descrição
Data da coleta
pH
inicial
pH
após
MgCl
2
pH final
Rotavírus
Adenovíru
s
LMM/FEEVALE/285
Vertente P6 (Riozinho)
22/03/2011
6.74
6.75
5.05
negativo
positivo
LMM/FEEVALE/286
Torneira P1(Riozinho)
22/03/2011
6.90
7.12
4.60
negativo
positivo
LMM/FEEVALE/287
Torneira P5 (Riozinho)
22/03/2011
7.04
6.52
5.33
negativo
positivo
LMM/FEEVALE/288
Vertente P2 Torneira (Riozinho)
22/03/2011
6,4
5,09
negativo
positivo
LMM/FEEVALE/290
Vertente P1 (Riozinho)
22/03/2011
6,38
5,26
5,26
negativo
positivo
LMM/FEEVALE/291
Vertente P2 (Riozinho)
22/03/2011
6,48
5,03
5,03
negativo
positivo
LMM/FEEVALE/292
Torneira P4 (Riozinho)
22/03/2011
6.26
5,83
5,36
positivo
positivo
LMM/FEEVALE/293
Vertente P5 (Riozinho)
22/03/2011
6,69
6,5
5,13
negativo
positivo
LMM/FEEVALE/294
Vertente P3 (Riozinho)
22/03/2011
5,92
6,13
5,29
positivo
positivo
LMM/FEEVALE/295
Torneira P3 (Riozinho)
22/03/2011
6,05
6,3
5,31
positivo
positivo
LMM/FEEVALE/296
Vertente P7 (Riozinho)
22/03/2011
6,76
6,16
4,67
positivo
positivo
LMM/FEEVALE/298
Vertente P4 (Rolante)
15/03/2011
6,98
7,02
5,49
negativo
positivo
LMM/FEEVALE/300
Vertente P13 (Rolante)
15/03/2011
7,74
6,69
5,07
positivo
positivo
LMM/FEEVALE/302
Vertente P12 (Rolante)
15/03/2011
7,77
6,71
5,29
positivo
positivo
LMM/FEEVALE/306
Vertente P8 (Rolante)
15/03/2011
7,12
6,92
5,22
negativo
positivo
LMM/FEEVALE/307
Vertente 2 P1 (Rolante)
15/03/2011
7,07
6,94
5,41
positivo
positivo
6,03
Origem da contaminação
• E. coli = difícil determinar
•Genes de virulência;
•Genes de resistência a ATB
• Vírus entéricos = sequenciamento e análise
filogenética, corte com enzimas de restrição,
PCRs diferenciais, anticorpos monoclonais, etc
• Bacteroides sp.
?
MST may be a
very usefull tool,
specially for risk
analysis and
decision making
Fluxos e impactos em Bacias
hidrográficas
Usos múltiplos da água e Poluição
visão de bacia
Manchas urbanas na BHRS
Rio dos Sinos e afluentes
Detecção de genomas de Adenovírus:
PCR em tempo-real com curva de dissociação de
alta resolução (qPCR-SYBR-HRM)
HumanAdV
CanineAdV
BovineAdV
AvianAdV
Rio dos Sinos, 2011
Molecular detection of canine and human adenoviruses in stool
samples from free-living pampas foxes (Lycalopex
gymnocercus and Cerdocyon thous) in southern Brazil
Figura 1 - Localização de São Francisco de
Paula no Rio Grande do Sul – Fonte: Plano
Ambiental Municipal de São Francisco de
Paula, 2008.
Figura 2 - Mapa da localização das principais Unidades de Conservação
da região oeste de Santa Ctaraina e Rio Grande do Sul, com destaque ao
PNMR. – Fonte: Site Gestao Participativa, 2011.
Cerdocyon thous (Linnaeus, 1766)
Material: fezes
Fonte: Google, 2010.
Fonte: Google, 2010.
POPULAÇÃO E AMOSTRA
Pseudalopex gymnocercus (Fischer, 1814)
•Maior resistência a agentes físico-químicos;
•Eliminação: 105-1011/g de fezes;
•Não causa estresse adicional ao animal
COLETA DE DADOS
 Expedição à campo – abril e setembro/2011
 17 amostras
 Reconhecimento do material
-80 C
ANÁLISE DOS DADOS
Laboratório de Microbiologia Molecular da Universidade Feevale
Reações de qPCR: utilizadas para amplificação de genomas de Adenovírus do
grupo C, com oligonucleotídos que amplificam uma enorme gama de vírus deste
genogrupo (VTB2-HAdVCf, Wolf et al., 2010) com vistas a detectar possíveis
agentes de origem antrópica e uma outra reação com os oligonucleotídeos
específicos, para amplificação apenas de adenovírus de caninos.
Termociclador iQ5 Bio-Rad, utilizando o kit comercial
Platinun® SYBR® Green qPCRSupermix-UDG (Invitrogen,
EUA) de acordo com instruções do fabricante.
Results for the detection of enterovirus (EV), rotavirus (RV), canine adenovirus (CAV) and human
adenovirus (HAdV) on pampas foxes stool samples collected at the Parque Natural Municipal da
Ronda (PNMR), Brazil.
Stool Sample
1G
2G
3G
4G
5G
6G
7G
8G
9G
10G
11G
12G
13G
14G
15G
16G
17G
-=negative; +=positive
EV
-
RV
+
+
+
+
+
+
+
-
CAV
+
+
+
+
+
HAdV
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Agentes virais encontrados:
Ações antrópicas
Hábito generalista dos graxains
Contato entre populações e
ambientes contaminados.
Favorece a exposição e transposição de agentes
infecciosos de um hospedeiro para o outro.
Desenvolvimento de estratégias
de desinfecção
-
-
Desenvolvimento e teste de novo produto para desinfecção de
vírus em água residuária de esgoto (interação UniversidadeEmpresa/ Fapergs)
Processos oxidatos avançados
Manejo de dejetos de suínos (REDE Dejsui - CNPq)
Climatic changes and human health
 Direct effects
 Heat consequences:
circulatory diseases,
respiratory disorders, skin
diseases, etc
 Indirect effects
 Increase of chemical risks
 Toxins (algeal blooms,
pesticides)
 Diseases transmitted by
arthropods
 Waterborne diseases!
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Situação no Brasil
• Figura: Correa, 2011
Situação no Brasil
• Figura: Correa, 2011
Metas para a pesquisa no assunto
nos próximos anos
 i) desenvolvimento de metodologias avançadas de
monitoramento e caracterização de agentes virais e outros
microrganismos na água, com enfoque na redução de custos, o
que possibilitaria sua adoção por órgãos públicos;
 ii) fomento à formação de grupos de pesquisa e redes
colaborativas para pesquisa e desenvolvimento na área de
análise virológica da água, com enfoque em saúde humana e
animal;
Metas para a pesquisa no assunto
nos próximos anos
 iii) projetos de caráter multidisciplinar, que incluam
ferramentas computacionais para análise longitudinal
de dados secundários dos sistemas de saúde, que
permitam avaliar ao longo do tempo o impacto das
mudanças climáticas sobre a incidência de doenças
transmitidas pela água ou ainda o cruzamento de
dados de sensoriamento remoto com a incidência de
tais enfermidades;
 iv) proposição de novas metodologias de saneamento,
para tratamento de água e esgoto, dotadas de maior
eficácia para a remoção de vírus e outros
microrganismos;
Metas para a pesquisa no assunto
nos próximos anos
 v) formação de recursos humanos capacitados à realização de
tais atividade e proposição de soluções para tais problemas com
viabilidade técnica, econômica, social e dotadas de
sustentabilidade ambiental frente às mudanças que estão por vir.
Laboratório de Microbiologia
Molecular – Feevale, NH, RS
Spilki, Esteves, Fleck, Cantarelli
Mestrado
Gabriela Saldanha Monteiro
Roger Bordin da Luz
IC


Rodrigo Staggemeier (Capes)
Aline Mara Pacheco (BIC-Feevale)
Doutorado
Joseane Silva
(PROBIC/FAPERGS/FEEVALE)
Andréia Dalla Vecchia (Capes)

Mariana Kluge (IC-CNPq-PQ*, CsF)

Luisa Balzan Schiavini ((IC-CNPq-PQ)

Mayra Soliman(IC-Dejsui-CNPq)

Rafael Fabres (PROBITI-Fapergs)

Thaís Fontana (PIBITI-CNPq-FEEVALE)
Carlos Nascimento
Patrícia Maino Wartha
Isabel Giehl (Capes)
Pós-doutorado
Larissa Heinzelmann (PNPD-Capes)
Responsável técnica LMM
Manoela Tressoldi Rodrigues (Mestranda)
Parcerias, cedência de
insumos e apoio financeiro
Embrapa - CNPSA (Esteves, Silva)
Apoio:
UCS (Paesi)
Capes
UFSM (Flores, Weiblen; Aita et al., DEJSUI)
Feevale
UFRGS (Roehe, Franco, Van der Sand, Oliveira)
UFSC (Moraes, Barardi)
Fiocruz (Pinto, Nascimento)
Unicamp (Arns, Gatti)
DMAE (Thewes, Morandi)
IIE (Tundisi & Tundisi)
FEPAGRO (Radin, Roehe, Cenci)
Emater (Escrits. Taquara, Rolante > Baldasso)
Corsan (A. Dutra)
CNPq
Fapergs
Muito obrigado!
 [email protected]