Universidade Federal do Espírito Santo Núcleo de Doenças

1
Universidade Federal do Espírito Santo
Núcleo de Doenças Infecciosas
Mestrado em Doenças Infecciosas
Ronaldo Bragança Martíns Júnior
DETECÇÃO DE VÍRUS RESPIRATÓRIOS POR PCR EM TEMPO
REAL EM INFECÇÃO AGUDA DO TRATO RESPIRATÓRIO
SUPERIOR, VITÓRIA-ES
Vitória - Espírito Santo
2012
2
Ronaldo Bragança Martíns Júnior
DETECÇÃO DE VÍRUS RESPIRATÓRIOS POR PCR EM TEMPO
REAL EM INFECÇÃO AGUDA DO TRATO RESPIRATÓRIO
SUPERIOR, VITÓRIA-ES
Dissertação apresentada ao Programa Pós
Graduação em Doenças Infecciosas do
Núcleo
de
Doenças
Infecciosas
da
Universidade Federal do Espírito Santo como
requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Ciências - Patologia Geral das
Doenças Infecciosas.
Orientadora: Profa Dra Liliana Cruz Spano
Co-Orientadora: Profª Drª Rita Elizabeth
Checon da Silva
Vitória – Espírito Santo
2012
3
“Porque o Senhor é sol e escudo, Deus concede graça e glória;
O senhor não recusa nenhum bem aos que desde cedo caminham na
integridade”
Sl. 84,11.
4
Dados Internacionais de Catalogação-na-publicação (CIP)
(Biblioteca Central da Universidade Federal do Espírito Santo, ES, Brasil)
Martíns Júnior, Ronaldo Bragança, 1983M386d
Detecção por PCR em tempo real de vírus respiratórios em
infecção respiratória aguda do trato superior, Vitória-ES /
Ronaldo Bragança Martíns Júnior. – 2012.
124 f. : il.
Orientador: Liliana Cruz Spano.
Coorientador: Rita Elizabeth Checon da Silva.
Dissertação (Mestrado em Doenças Infecciosas) –
Universidade Federal do Espírito Santo, Centro de Ciências da
Saúde.
1. Infecções respiratórias. 2. Vírus. 3. Reação em cadeia de
polimerase. 4. Multiplex. 5. Influenza. I. Spano, Liliana Cruz. II.
Silva, Rita Elizabeth Checon. III. Universidade Federal do
Espírito Santo. Centro de Ciências da Saúde. IV. Título.
CDU: 61
5
6
AGRADECIMENTOS
Às minhas Orientadoras, Profª. Drª. Rita Checon e Profª. Drª. Liliana Cruz
Spano, pela dedicação e confiança depositadas em mim, e por todos os
ensinamentos e pela paciência que tornaram possível a realização desse
trabalho no Núcleo de Doenças Infecciosas.
À Drª. Marilda M. Siquieira, que gentilmente nos forneceu todas as condições
para realização deste trabalho.
Ao Daniel Cohen Goldemberg e Sharon Carney, pelo treinamento das técnicas
de biologia molecular.
A toda equipe do Laboratório de Vírus Respiratório e Sarampo do IOC-RJ, pela
receptividade e acolhida.
Ao Dr. Lucas Bonine, que gentilmente nos cedeu partes das amostras
estudadas.
Aos colegas, Lorenzzo Stringari, Camila Giuberti e Mariane Monfardini, pelo
incentivo e apoio durante a pesquisa, e em especial à Aline Lyra Pereira, pelo
entusiasmo e cumplicidade ao longo do mestrado.
Às minhas colegas do LABVIR, Luciana, Sheila e Laís, pela amizade e
companherismo.
A toda equipe de profissionais do Núcleo de Doenças Infecciosas.
A todos os professores do programa pós-graduação do Núcleo de Doenças
Infecciosas.
A todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.
A FAPES/FACITEC pelo apoio financeiro ao longo do mestrado.
Aos meus pais e meu irmão pelo total apoio ao longo da jornada.
7
RESUMO
Os vírus são os principais contribuintes para a morbidade e mortalidade por
infecções respiratórias agudas (IRA) do trato respiratório superior e inferior, em
todas as faixas etárias. O objetivo desse estudo foi determinar a frequência de
18 vírus respiratórios através de transcrição reversa seguida por reação em
cadeia pela polimerase em tempo real, no formato "multiplex" (RT-rtPCR
multiplex), em espécimes de indivíduos com IRA, atendidos em ProntoAtendimento e em Unidade Básica de Saúde, situados no município de Vitória,
Espírito Santo. Foram obtidos aspirados de nasofaringe de 162 indivíduos entre
os meses de agosto de 2007 a agosto de 2009. Os espécimes foram testados
inicialmente para presença de vírus sincicial respiratório (VSR), parainfluenza
1, 2, 3 (PIV-1-3), adenovírus (AdV) e vírus influenza A e B (Flu A/B) através de
reação de imunofluorescência indireta (RIFI). Ácido nucleico foi extraído das
amostras clínicas por meio do kit "MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation"
(ROCHE, versão 12.0), através de método automatizado. Com o RT-rtPCR
multiplex foram investigados os seguintes patógenos respiratórios virais e
bacterianos: (i) Flu A, (ii) Flu A H1N1 (pdn09) ; (iii) Flu B; (iv) rinovírus (HRV);
(v) coronavírus NL63 (HCoV63), 229E (HCoV229), OC43 (HCoV43) e HKU1
(HCoVHKU); (vi) PIV1-4; (vii) metapneumovírus humano A e B (hMPV A/B);
(viii) VSR A/B; (ix) AdV; (x) enterovírus (EV); (xi) parechovírus humano (HPeV);
(xii) bocavírus humano (HBoV); (xiii) Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila
pneumoniae, Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus e Streptococcus
pneumoniae. Foram encontrados, através de RIFI, 32 (19,7%) amostras
positivas para os seguintes vírus: 13 Flu A (8.1%), 9 Flu B (5.6%), 2 PIV-1
(1.2%), 2 PIV-3 (1.2%) e 6 VSR (3.7%). Não houve amostras positivas para
AdV e PIV-2. Através de RT-rtPCR foram detectadas 71 (43,8%) amostras
positivas, com os seguintes resultados: 2 Flu A H1N1 (pdn09) (1.2%), 6 Flu A
(3.7%), 10 Flu B (6.2%), 13 HRV (8%), 3 HCoV-43 (1.9%), 1 HCoV-63 (0.6%),
1 HCoV-HKU (0.6%), 3 PIV-1 (1.9%), 1 PIV-2 (0.6%), 4 PIV-3 (2.5%), 2 PIV-4
(1.2%), 5 HBoV (3.1%), 5 hMPV (3.1%), 1 AdV (0.6%), 2 EV (1.2%) e 12 VSR
(7.4%). Não houve amostras positivas para HCoV229 e HPeV. Foram
observados seis casos de infecção mista viral (VSR/Flu A, VSR/HBoV,
VSR/HCoV-63, HRV/HBoV, HRV/PIV-3, HCoV-43/hMPV). O uso da técnica de
RT-rtPCR multiplex aumentou a detecção viral em 22,6% e permitiu evidenciar
a circulação de todos os vírus respiratórios de importância médica nos casos
de IRA estudados. O vírus mais prevalente foi o Flu, seguido por HRV, em
todas as faixas etárias, e por VSR nas crianças de zero a dois anos. Os vírus
respiratórios mais recentes (HBoV, hMPV, Flu A H1N1 (pdn09), HCoV-63 e
HCoV-HKU) foram encontrados com freqüência de 8,6%. Estudos posteriores
esclarecerão o perfil epidemiológico das viroses respiratórias na região
metropolitana de Vitória.
8
ABSTRACT
Viruses are the major contributors to morbidity and mortality of upper and lower
acute respiratory infections (ARI), in all age groups. The aim of this study was to
determine the frequency of 18 respiratory viruses by polymerase chain reaction,
in the real-time reverse transcription-multiplex PCR (multiplex RT-rtPCR) in
specimens of patients with ARI treated in emergency care and basic health unit,
located in Vitória, Espírito Santo. Nasopharyngeal aspirates were obtained from
162 individuals between August 2007 and August 2009. The specimens were
tested for the presence of respiratory syncytial virus (RSV), parainfluenza 1, 2,
3 (PIV-1-3), adenovirus (AdV) and A and B influenza virus (Flu A / B) by indirect
immunofluorescence (IFA). Nucleic acid was extracted from clinical samples
using the kit "Pure Magna Nucleic Acid Isolation Total LC" (Roche, 12.0) by
means of automated method. By multiplex RT-rtPCR the following respiratory
viral and bacterial pathogens were investigated: (i) Flu A, (ii) Flu A H1N1
(pdn09), (iii) Flu B (iv) rhinovirus (HRV), (v) NL63 coronavirus (HCoV-63 ), 229E
(HCoV-229), OC43 (HCoV-43) and HKU1 (HCoV-HKU), (vi) PIV1-4 (vii) A and
B human metapneumovirus (hMPV A / B), (viii) RSV / B, (ix) AdV, (x)
enterovirus (EV), (xi) human parechovirus (HPeV), (xii) human bocavirus
(HBoV), (xiii) Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae,
Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus and Streptococcus
pneumoniae. IFA revealed 32 (21,2%) positive samples for the following
viruses: 13 Flu A (8.1%), 9 Flu B (5.6%), 2 PIV-1 (1.2%), 2 PIV-3 (1.2 %) and 6
RSV (3.7%). There was no positive sample for AdV and PIV-2. Multiplex RTrtPCR detected 71 (43,8%) positive samples, with the following results: Flu A
H1N1 (pdn09) (1.2%), 6 Flu A (3.7%), 10 Flu B (6.2%), 13 HRV (8%), 3 HCoV43 (1.9%), 1 HCoV-63 (0.6%), 1 HCoV-HKU (0.6%), 3 PIV-1 (1.9%), 1 PIV-2
(0.6%), 4 PIV-3 (2.5%), 2 PIV-4 (1.2%), 5 HBoV (3.1%), 5 hMPV (3.1%), 1 AdV
(0.6%), 2 EV (1.2%) and 12 RSV (7.4%). There was no positive sample for Cor229 and HPeV. We observed six cases of mixed viruses infections (RSV/Flu A,
RSV/HBoV, RSV/HCoV-63, HRV/HBoV, HRV/PIV-3, HCoV-43/hMPV). The use
of multiplex RT-rtPCR increased by 22,6% the viral detection and revealed all
respiratory viruses of medical importance in cases of ARI studied. The most
prevalent virus was the Flu. Then came the HRV in all age groups, and also
RSV in children 0-2 years.The recent respiratory viruses (HBoV, HMPV, Flu A
H1N1 (pdn09), HCoV-63 e HCoV-HKU) were found in frequency of 8.6%. Further
studies will clarify the epidemiology of respiratory viruses in Victoria
metropolitan region.
9
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
A549
Linhagem celular de adenocarcinoma pulmonar
AdV
Adenovírus
BGMK
Buffalo Green Monkey Kidney (Linhagem celular de rim de
macaco-verde búfalo)
BMV
Bromo Mosaic Virus (Vírus do mosaico do capim bromo)
BVA
Bronquiolite viral aguda
CPE
Citopatic Effect (Efeito citopático)
ELISA/EIA
Enzyme-Linked
Immunoabsorbent
Assay
(Ensaio
Imunoenzimático)
EPI
Equipamento de proteção individual
EV
Enterovírus
FC
Fixação de complemento
Flu
Vírus influenza
HA
Hemaglutinina
HBoV
Human bocavirus (Bocavírus humano)
HCoV
Human coronavirus (Coronavírus humano)
Hd
Hemoadsorção
HeLa
Henrietta Lacks cell lines - Cervical Adenocarcinoma (Cultura de
célula de carcinoma uterino humano)
HEP-2
Epidermoid carcinoma cell line (Cultura de célula de carcinoma da
laringe humano)
HI
Hemaglutination inhibition (Inibição de hemaglutinação)
10
HiB
Haemophilus influenzae tipo b
hMPV
Human metapneumovirus (metapenumovírus humano)
HPeV
Human parechovirus (Parechovírus humano)
HRV
Human rinovirus (Rinovírus humano)
IF
Imunofluorescência
IRA
Infecção respiratória aguda
KB
KERATIN-forming tumor cell line HeLa (Linhagem celular de
carcinoma de uterino humano)
LAMP
Loop-Mediated Isotermal Amplification (Amplificação circular
isotérmica)
LLC-MK2
Rhesus Monkey Kidney Epithelial Cells (Linhagem celular de rim
de macaco Rhesus)
MDCK
Mardin-Darby canine kidney (Célula de linhagem de rim de cão
Mardin-Darby)
MEM
Minimal essential Medium (Meio mínimo essencial)
MGP
Magnetics Glass Paticles (Partículas magnéticas de sílica)
MRC-5
Normal Human Fetal Lung Fibroblast (Linhagem celular de
pulmão de embrião humano)
NA
Neuroaminidase
NASBA
Nucleic acid sequence based amplification
NDI
Núcleo de Doenças Infecciosas
ORF
Open Reading Frame (Quadro de leitura aberta)
PBS
Phosphate buffer saline (tampão salina-fosfato)
PCR
Polymerase chain reaction (Reação em cadeia pela polimerase)
11
PIV
Parainfluenzavirus (Vírus parainfluenza humano)
RFLP
Restriction Fragment Lenght Polimorphism (Polimorfismo de
tamanho de fragmentos de restrição)
RIFD
Reação de imunofluorescência direta
RIFI
Reação de imunofluorescência indireta
RNP
Ribonucleoproteina
RT-PCR
Reverse Transcription-PCR (PCR precedida por transcrição
reversa)
RT-rtPCR
Real time RT-PCR (Reação em cadeia pela polimerase em tempo
real precedida por transcrição reversa)
SARS
Severe acute respiratory syndrome (Síndrome respiratória aguda
grave)
SFB
Soro fetal bovino
SIVEP
Sistema de Informação da Vigilância Epidemiológica da Influenza
SNF
Secreção de nasofaringe
SUS
Sistema Único de Saúde
TN
Teste de neutralização
Vero
Linhagem celular de rim de macaco-verde africano
VSR
WI-38
Vírus sincicial respiratório
Embryonic Lung cell line (Linhagem celular de fibroblasto de
embrião humano)
12
Lista de figuras, gráficos e tabelas
Figuras
Página
Figura 1: Diagrama estruturas dos picornavírus
24
Figura 2: Estrutura genômica dos picornavírus
25
Figura 3: Diagrama esquemático da estrutura dos HCoV
27
Figura 4: Estruturas genômicas entre os grupos de
coronavírus
Figura 5: Divisão taxonômica da família Paramyxoviridae
Figura
6:
Representação
da
estrutura
do
vírus
parainfluenza
Figura
7:
Diagramação
do
vírion
da
subfamília
Pneumovirinae
29
30
31
34
Figura 8: Genoma dos paramixovírus
35
Figura 9: Estrutura do virion do AdV
37
Figura 10: Organização do DNA do HBoV
39
Figura 11: Representação da estrutura do vírus da
influenza A
Figura 12: Princípio do funcionamento da sonda TaqMan
Figura 13: Diagramação das etapas de extração dos
espécimes
Figura 14: MagNA Pure LC 2.0 Instrument (ROCHE)
Figura 15: Câmera interna do “MagNA Pure LC 2.0
Instrument”
Figura 16: Gráfico ilustrativo do ponto de corte e Ct dos
testes
Figura 17: Mapa da Região Metropolitana de Vitória
Gráficos
Gráfico 1: Distribuição dos pacientes de acordo com a
faixa etária
Gráfico 2: Prevalência dos vírus respiratórios detectados
por meio de RIFI
42
46
58
58
59
63
67
Página
68
68
13
Gráfico 3: Prevalência viral por rRT-PCR
69
Gráfico 4: Distribuição das viroses respiratórias por faixa
etária
Gráfico 5: Distribuição da coleta de amostras e de
agentes virais no ano de 2008
Gráfico 6: Freqüências de bactérias pesquisadas nas
amostras clínicas
Tabelas
amplificados
Tabela 2: Infecção mista de vírus respiratórios
Representação
72
60
71
Fluxogramas
1:
71
Página
Tabela 1: Sequências alvos dos patógenos respiratórios
Fluxograma
70
Página
esquemática
processamento das amostras
Anexo
Anexo 1: Ficha de informações clínica e laboratorial
do
56
Página
124
14
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 18
2. REVISÃO DE LITERATURA ....................................................................... 21
2.1. Doenças Respiratórias............................................................................ 21
2.2. Etiologia Viral das Infecções Respiratórias aguda .............................. 22
2.3. Rinovírus, Enterovírus e Parechovírus ................................................. 22
2.3.1 Classificação e aspectos gerais ........................................................... 22
2. 3. 2 Caracteristicas morfológicas e estruturais ......................................... 24
2. 3. 3. Manifestações clínicas ...................................................................... 25
2.4. Coronavírus ............................................................................................. 26
2.4.1 Classificação e aspectos gerais ........................................................... 26
2. 4. 2. Características morfológicas e estruturais ........................................ 27
2. 4. 4. Manifestações clínicas ...................................................................... 29
2. 5. Paramyxoviridae ..................................................................................... 29
2.5.1 Classificação e aspectos gerais ........................................................... 29
2. 5. 2. Vírus parainfluenza ........................................................................... 30
2. 5. 2. 1. Características morfológicas e estruturais ................................. 30
2. 5. 2. 2. Manifestações clínicas ............................................................... 32
2. 5. 2. Vírus Respiratório Sincicial e Metapneumovírus humano ................. 32
2. 5. 2. 1. Características morfológicas e estruturais ................................. 33
2. 5. 2. 2. Manifestações clínicas ............................................................... 35
2. 6. Adenovírus .............................................................................................. 36
2.6.1 Classificação e aspectos gerais ........................................................... 36
2. 6. 2. Características morfológicas e estruturais ........................................ 36
2. 6. 3. Manifestações clínicas ...................................................................... 38
2. 7. Bocavírus ................................................................................................ 38
2.7.1 Classificação e aspectos gerais ........................................................... 38
2. 7. 2. Características morfológicas e estruturais ........................................ 39
15
2. 7. 3. Manifestações clínicas ...................................................................... 39
2. 8. Influenza vírus A e B .............................................................................. 40
2.8.1 Classificação e aspectos gerais ........................................................... 40
2. 8. 1. Características morfológicas e estruturais ........................................ 42
2. 8. 3. Manifestações clínicas ...................................................................... 43
2. 9. Diagnóstico laboratorial das infecções pelos vírus respiratórios ..... 43
2.9.1 Breve histórico ..................................................................................... 43
2.9.2. PCR em tempo real (rtPCR)................................................................ 45
3. OBJETIVOS ................................................................................................. 52
3.1. Objetivo Geral .......................................................................................... 52
3.2. Objetivos Específicos ............................................................................. 52
4. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................... 54
4.1. Descrição do estudo ............................................................................... 54
4.2. Coletas de dados ..................................................................................... 54
4.3. Métodos Laboratoriais ........................................................................... 55
4.3.1. Processamento das amostras ............................................................ 55
4.3.2. Reação de imunofluorescência indireta ............................................. 56
4.3.3. Interpretação dos resultados de RIFI ................................................. 57
4.3.4. Diagnóstico virológico por Real Time PCR ......................................... 57
4.3.4.1. Extração do Ácido Nucléico .......................................................... 57
4.3.4.2. Reação de transcrição reversa, seguida de PCR em tempo real
(RT-rtPCR)................................................................................................. 59
4.4. Análise Estatística .................................................................................. 63
4.5. Aspectos Éticos da Pesquisa................................................................. 63
4.6. Soluções e reagentes.............................................................................. 63
4.6.1. Tampão fosfato: .................................................................................. 63
16
4.6.2. Solução de antimicrobianos: ............................................................... 64
4.6.2.1. Antibiótico liofilizado Penicilina/Estreptomicina: ............................ 64
4.6.2.2. Antimicótico liofilizado Anfotericina B ( Cfinal : 500µg/ml):.............. 64
4.6.3. Soluções para armazenagem dos espécimes..................................... 64
4.6.3.1. Meio mínimo essencial (MEM) com glutamina e sem bicarbonato 64
4.6.3.2. Soro albumina bovina (BSA) ......................................................... 65
5. RESULTADOS ............................................................................................. 67
6. DISCUSSÃO ................................................................................................ 74
6.1. Aspectos Gerais do Estudo.................................................................... 74
6.2. Características Demográficas ................................................................ 75
6.3. Prevalência viral ...................................................................................... 76
6.4. Sazonalidade ........................................................................................... 87
6.5. Infecções virais mistas ........................................................................... 89
7. CONCLUSÕES ............................................................................................ 92
9. REFERÊNCIAS ............................................................................................ 94
10. ANEXOS .................................................................................................. 124
17
1. INTRODUÇÃO
18
1. INTRODUÇÃO
As infecções do trato respiratório representam uma das principais causas de
morbidade e mortalidade no mundo e a principal causa de hospitalização de
crianças e recém-nascidos, bem como de morte desses mesmos grupos em
países em desenvolvimento (Pollard et al., 2000; Osterhaus, 2008).
Os vírus respiratórios são os principais agentes etiológicos de episódios de
infecção respiratória aguda (IRA), principalmente em certos grupos de risco tais
como crianças, idosos e pacientes imunodeprimidos (Osterhaus et al., 2008;
Nair et al., 2011). Apesar da maioria das viroses respiratórias ser limitada ao
trato respiratório superior, estas podem evoluir para quadros de infecções do
trato respiratório inferior, como bronquiolite viral aguda (BVA), bronquite, crupe
e pneumonia, bem como agravarem o quadro com infecções bacterianas como
otite média aguda e sinusite ou desencadearem crises asmáticas (Nair et al.,
2011).
Os principais vírus associados às IRA são o vírus sincicial respiratório (VSR),
vírus da influenza A e B (Flu A e Flu B), vírus parainfluenza 1, 2, 3 e 4 (PIV 14), adenovírus (AdV), rinovírus humano (HRV) e coronavírus humano (HCoV).
A partir de 2001, novos vírus relacionados às IRA foram descritos, tais como o
metapneumovírus humano (hMPV) (Hoogen et al., 2001), dois novos tipos de
coronavírus humano – HKU1 e NL63 (Woo et al., 2005; Hoek et al., 2004), e
bocavírus humano (HBoV) (Allander et al., 2005).
O método convencional para diagnóstico dessas infecções é o isolamento em
cultura celular, considerado o padrão ouro, em associação com técnicas de
detecção de antígenos (Gardner et al., 1968 ; Bellau-Pujol et al., 2005).
Entretanto, várias desvantagens são apontadas a cerca dos métodos
convencionais, pois se sabe que a cultura celular é limitada em alguns grupos
de vírus respiratórios e demanda vários dias para a obtenção do resultado, fato
este que inviabiliza sua utilização na condução clínica do paciente. A detecção
de antígenos, por outro lado, apesar de disponibilizar o resultado mais
rapidamente, é menos sensível que a cultura celular (Van de Pol et al., 2006).
19
As técnicas moleculares de diagnóstico, sejam "in-house" ou comerciais,
representam alternativas de se alcançar um resultado mais rápido e com
elevada
sensibilidade
e
especificidade,
e
dessa
forma
reduzir
significativamente o tempo de hospitalização, os custos com tratamentos
desnecessários, além de contribuir com os programas de controle de infecção
nosocomial e guiar a terapia antiviral específica (Barenfanger et al., 2000;
Mahony et al., 2008).
Este estudo teve por objetivo a utilização de uma técnica de biologia molecular,
por meio de reação em cadeia pela polimerase em formato “multiplex”, em
tempo real, precedida por transcrição reversa (RT-rtPCR multiplex), para a
detecção de vírus respiratórios, também detectados por imunofluorescência
indireta, em casos IRA em indivíduos atendidos em um Pronto-Atendimento e
uma Unidade Básica de Saúde, situados no município de Vitória, Espírito
Santo.
20
2. REVISÃO DE LITERATURA
21
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Doenças Respiratórias
As doenças respiratórias agudas são responsáveis por 75% de todas as
morbidades agudas em países desenvolvidos, sendo que a maior parte dessas
infecções (aproximadamente 80%) é de etiologia viral (Mahony et al., 2008).
No Brasil, as doenças respiratórias agudas também ocupam uma posição de
destaque na saúde pública. De acordo com os dados oriundos do Sistema de
Informação da Vigilância Epidemiológica da Influenza (Sivep-Gripe) para o ano
2008, constatou-se um total de 438.732 atendimentos de pacientes com
síndrome gripal. A maior concentração dos casos ocorreu em crianças, na faixa
etária de 0 a 4 anos (43,3%), seguida da faixa de 5 a 14 anos (22,9%) e de 15
a 24 anos (10,9%). As demais faixas contribuíram com 22,8% (MS, 2009).
Os vírus Flu, HRV, PIV, HCoV, VSR, AdV, EV e HPeV contribuem
regularmente para essas estatísticas, além dos recentes patógenos virais
identificados: hMPV, dois novos tipos de HCoV – HKU1 e NL63 e o HBoV
(Fouchier et al., 2005; Osterhaus et al., 2008; Allander et al., 2005).
Essas viroses respiratórias são responsáveis por diferentes síndromes clínicas,
desde quadros brandos auto-limitados até quadros fatais, de acordo com a
idade e as condições imunológicas do hospedeiro. Dessa forma temos casos
de infecções no trato respiratório superior como gripe, resfriado comum, rinite,
faringite e laringite, enquanto que as infecções mais comuns no trato
respiratório inferior são a bronquiolite, bronquite e pneumonia, além de quadros
de exacerbação de crises asmáticas, otite média aguda e sinusite. Entretanto,
todas essas doenças e suas manifestações clínicas não são patognomônicas
para os seus respectivos agentes etiológicos. Considerando a variedade de
agentes virais respiratórios e a ausência de sinais e sintomas específicos para
definir o patógeno por meio da sintomatologia, o diagnostico laboratorial é
preponderante para a identificação desses agentes (Mahony et al., 2008) (Item
2.9).
22
2.2. Etiologia Viral das Infecções Respiratórias aguda
Para uma melhor compreensão do estudo dividiremos as viroses de interesse
em agentes respiratórios clássicos (Flu, PIV, VSR, AdV, HCoV, HRV, EV e
HPeV) e agentes respiratórios recentes, sendo que este segundo grupo pode
ser dividido em duas categorias: re-emergentes e emergentes. A primeira
categoria está representada por vírus resultantes de “reassortment” de gene
em casos de co-infecção de subtipos distintos [Flu A H1N1 (pdn09)], enquanto
que a segunda trata de vírus que há muito coexistem com os seres humanos,
porém só recentemente foi possível descobrir seu agente etiológico por meio
dos avanços da biologia molecular, como o hMPV, HCoV-NL63, HCoV-HKU1 e
o HBoV (Osterhaus et al., 2008). A apresentação destes agentes será de
acordo com a semelhança das suas características morfológicas ou
taxonômicas.
2.3. Rinovírus, Enterovírus e Parechovírus
2.3.1 Classificação e aspectos gerais
A família Picornaviridae contém 12 gêneros, sendo que dois desses merecem
destaque considerando sua capacidade de causar lesões no sistema
respiratório: Enterovirus e Parechovirus (Woo, et al., 2012). O nome
picornavírus faz uma referência ao tamanho diminuto dos vírus (30 nm) e ao
tipo de ácido nucléico que constitui o genoma (RNA). (Whitton et al., 2005)
O HRV, integrante do gênero Enterovirus, é o agente etiológico da virose mais
comum do trato respiratorio superior, o resfriado comum (cerca de 50% dos
casos) e tem também sido associado como um mediador de infecções mais
graves no trato respiratório inferior, tais como pneumonia, bronquite,
bronquiolite e fibrose cística (Papadopoulos et al., 2000).
Foram isolados pela primeira vez em 1956 (Price et al., 1956) através de
culturas celulares utilizando tecido hepático de macaco Rhesus inoculadas com
lavado de nasofaríge de indivíduos com resfriado. Em 1963, uma descrição do
grupo foi proposta por Tyrrell e Chanock e o nome "Rhinovirus" foi sugerido
originalmente por Andrews ao fazer uma alusão ao sítio primário de infecção
desse agente (Turner, 2007).
23
O gênero Enterovirus é dividido em 10 espécies distintas, sendo que somente
sete são classificados como enterovírus humanos (Enterovirus humano A, B, C
e D; Rinovirus humano A, B e C), somando mais de 300 sorotipos distintos
(Stanway, 1990).
As infecções pelos EV geralmente se localizam no trato gastrointestinal e
podem se disseminar para outros sítios, causando doenças graves, como
encefalite, miocardite e meningite asséptica. Certos sorotipos possuem
tropismo pelo trato respiratório, causando infecções no trato respiratório
superior e inferior tanto em crianças quanto em adultos (Chonmaitree et al.,
1988).
Em 1958, teve-se a primeira descrição de um enterovírus associado a doenças
respiratórias (Lennette et al., 1958). No ano de 1962, na California, o
enterovírus 68 foi isolado pela primeira vez de crianças com bronquiolite e
pneumonia (Chonmaitree et al., 1988).
O gênero Parechovirus compreende seis sorotipos humanos, porém com
algumas
particularidades.
Inicialmente
os
HPeV-1
e
HPeV-2
foram
classificados como enterovírus (EV-22 e EV-23, respectivamente). Em função
das distintas propriedades moleculares e biológicas esses vírus foram
reclassificados em um novo gênero denominado Parechovirus (Oberste et al.,
1998).
Os HPeV-1 e HPeV-2 foram isolados pela primeira vez em 1956, no Japão, em
amostras fecais de crianças com diarréia (Joki-Korpel & Hyypia, 2001 ). Em
2004 um novo sorotipo de parechovírus (HPeV-3), associado a doenças mais
graves, foi identificado no Japão (Boivin et al., 2005). Em 2006, foi isolado um
quarto sorotipo, que não era neutralizado pelos anticorpos contra os sorotipos
HPeV-1, 2 e 3 (Benscho et al., 2006). Concomitantemente, uma cepa de HPeV2, que mostrava elevada divergência genética com outras cepas do seu
sorotipo, foi reclassificada como o quinto sorotipo HPeV-5 (Al-Sunaidi et al.,
2007). O sexto e último sorotipo (HPeV-6) foi descrito em 2007, o qual
apresentava resistência à neutralização com os anticorpos para os sorotipos 1,
2 e 3 e ainda exibia uma sequência de aminoácido bastante distinta em
comparação com os sorotipos restantes (Watanab et al., 2007).
24
2. 3. 2 Caracteristicas morfológicas e estruturais
Os picornavírus são partículas virais esféricas, não envelopadas, com diâmetro
variando de 25 a 30 nm (Turner, 2007). Apresentam um capsídeo com simetria
icosaédrica com 60 capsômeros por meio das suas subunidades protéicas.
Cada capsômero tem em sua constituição as proteínas VP1, VP2, VP3 e
VP4(Figura 1). Os três primeiros são mais externos, com destaque para o VP1
no qual se supõe estar o sítio de reconhecimento do receptor celular. O VP4 é
mais interno, exercendo o papel de ancoragem entre o RNA genômico e o
capsídeo viral. Os HPeV possuem apenas três polipepitídeos estruturais na
constituição dos seus capsômeros: VP0, VP1 e VP3 (Stanway et al., 1990).
Figura
1:
Diagrama
estruturas
dos
picornavírus.
Adaptado
de
viralzone.expasy.
org/all_by_species/33.html. Acesso em 28 de janeiro de 2012.
O genoma dos picornavírus (Figura 2) é constituído por uma fita linear de
cadeia simples de RNA, com polaridade positiva e não-segmentado, com
aproximadamente 7,2 Kb de nucleotídeos. A extremidade 5’ faz ligação a uma
proteína VPg (proteína do viron de ligação ao genoma); a extremidade 3’
possui uma poliadenilação terminal [cauda poli(A)], cuja remoção torna a
partícula viral não infecciosa (Stanway et al., 1990). O genoma é constituído
por três regiões codificadoras, P1 (proteínas estruturais), P2 e P3 (proteínas
não-estruturais). Portanto, a P1 vai codificar proteínas do capsídeo (VP4, VP2,
VP3 e VP1), enquanto que a P2 e P3 vão codificar enzimas envolvidas no
processamento das proteínas (2Apro, 3Cpro, 3CDpro) e na replicação do genoma
(2B, 2C, 3AB, 3BVPg, 3CDpro e 3Dpol) (Stanway et al., 1990).
25
Região estrutural
Região não-estrutural
Figura 2: Estrutura genômica dos picornavírus e poliproteínas. Molécula de RNA simples-fita
com polaridade positiva, com destaque para a região não-transcrita 5' (5' NTR), que encontrase ligada covalentemente ao VPg, apresenta dois domínios funcionais: o trevo final 5'
(cloverleaf), o sítio interno para entrada ribossomal (IRES) e a região não-transcrita 3' (3' NTR),
que encontra-se poliadenilada [cauda poly(A)]. Adaptado de De Jesus et al., (2007).
2. 3. 3. Manifestações clínicas
A doença mais frequente que acompanha a infecção por HRV é o resfriado
comum, que surge em torno de um a dois dias após a infecção. Inicialmente, o
indivíduo pode apresentar congestão nasal, coriza intensa, dor de garganta,
tosse e rouquidão, apresentando febre variável e menos freqüentemente malestar, mialgia e cefaléia. A média de duração da doença é em torno de sete
dias, com sintomas persistindo entre 12 a 14 dias em 25% dos indivíduos
doentes (Stanway et al., 1990).
Podem surgir quadros secundários de sinusite, otite média e são os agentes
virais mais prevalentes no desencadeamento de quadros de doença pulmonar
obstrutiva crônica e asma em crianças, com exacerbação de quadros de
bronquite crônica e fibrose cística, principalmente em paciente transplantados
imunocomprometidos e portadores de hipogamaglobulinemia (Arola et al.,
1990; Gwaltney et al., 1994, Kaiser et al., 2006; Kainulainen et al., 2010).
Os EV com tropismo pelo sistema respiratório geralmente causam infecções no
trato respiratório superior, freqüentemente subclínicas, ou com quadros
autolimitados, com um período curto de incubação em torno de um a três dias.
Os
quadros
clínicos
mais
encontrados
são
o
resfriado
comum,
laringotraqueobronquite e epligotite no trato respiratório superior, e pneumonia
26
viral e crises asmáticas no trato respiratório inferior. Doenças mais graves do
trato respiratório inferior podem ocorrer (Palacios et al., 2005).
Autores indicam que 29% das parechoviroses são infecções respiratórias,
podendo ocorrer quadros de gripe e pneumonia viral (Ehrnst et al., 1993).
2.4. Coronavírus
2.4.1 Classificação e aspectos gerais
Os HCoV são classificados na ordem Nidovirales, cujos membros incluem duas
famílias: Coronaviridae e Arterividae. A família Coronaviridae é dividida em dois
gêneros: Torovirus e Coronavirus (Spaan et al., 1988).
Os HCoV podem ser divididos em três grupos sorologicamente diferentes: (i)
no grupo I encontra-se os HCoV-229E e HCoV-NL63, além vários outros
coronavírus de animais, (ii) no grupo II, o HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARSHCoV e também vários coronavírus de animais (Gorbalenya et al., 2004); no
grupo III encontra-se HCoV que infectam aves. Foram as características
morfológicas desses vírus que levaram a designação de coronavírus, pois a
microscopia eletrônica revelava uma estrutura semelhante a uma coroa
(McIntosh et al., 1974).
O primeiro HCoV descrito (B814) foi isolado de crianças inglesas com resfriado
em 1965 (Tyrrel et al., 1965). A partir daí as coronaviroses foram divididas em
dois grandes grupos: Grupo I, o qual era biologicamente e antigenicamente
semelhante à cepa HCoV-229E (Hamre et al., 1966); e grupo II, relacionado à
cepa HCoV-OC43 (McIntosh et al., 1967).
Os HCoVs ganharam maior importância após a descrição do primeiro surto da
Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS) em 2002, na província de
Guangdong, China. A doença foi descrita como uma “pneumonia infecciosa
atípica”, por causa da sua propensão para causar doença em grupos familiares
e profissionais de saúde (Zhong et al., 2003; Xu et al., 2004). Em 2003, um
médico oriundo da província de Guangdong passou apenas uma noite em um
hotel em Honk Kong, período suficiente para ele transmitir SARS para outros
16 hóspedes. A partir daí, surtos da doença foram detectados em Hong Kong,
27
Toronto, Singapura e Vietnã, e em questão de semanas a doença infectou mais
de 8.000 indivíduos em 25 países, totalizando 774 óbitos ao final da pandemia
em julho de 2003 (Peiris et al., 2004).
O agente etiológico da SARS foi identificado como um HCoV (SARS-HCoV), e
este era filogeneticamente distinto de todos os HCoV humanos e animais já
conhecidos (Marra et al., 2003). Devido à maior atenção dada aos HCoV após
os surtos de SARS em 2003, as pesquisas sobre as coronaviroses se
intensificaram, e, consequentemente, dois novos HCoV foram descritos: (i)
HCoV-NL63, a partir de aspirado de nasofaringe de crianças hospitalizadas
com bronquiolite, conjutivite e febre na Holanda (Hoek et al., 2004); (ii) HCoVHKU1, a partir de pacientes internados com pneumonia em Hong Kong (Woo et
al., 2005).
2. 4. 2. Características morfológicas e estruturais
Os HCoV são os maiores vírus de RNA na natureza. São partículas esféricas
envelopadas de 100 a 160 nm de diâmetro. No interior do virion há uma fita
simples de RNA com polaridade positiva, de 27 a 32 Kb de tamanho (Lai et al.,
1997). A fita de RNA faz uma ligação com uma fosfoproteína N a fim de formar
um nucleocapsídeo longo, flexível e helicoidal (Figura 3). O core viral é envolto
por um envelope lipoprotéico que é formado durante o brotamento. Dois tipos
de espículas estão presentes na superfície do virion: (i) glicoproteínas S,
espículas longas com aproximadamente 20 nm, presentes em todos os
coronavírus e (ii) HE (hemaglutinina-esterase), que são espículas curtas,
presentes apenas em alguns HCoV grupo II e um HCoV do grupo III (Yokumori
et al., 1991). O envelope ainda possui a proteína M e a proteína E, ambas
transmembranosas (Spaan et al., 1988).
28
Proteína
nucleocapsídica (N)
Membrana
Glicoproteína (M)
Espículas
Proteína
(S)
Envelope
Proteína (E)
Figura 3: Diagrama esquemático da estrutura dos HCoV. Adaptado de Peiris et al. (2004).
O genoma dos HCoV é o maior entre os vírus de RNA, contituído por uma
molécula de RNA de fita simples, de polaridade positiva, não-segmentado, de
27 a 32 Kb de tamanho (Figura 4). O genoma é organizado em sete a quatorze
seqüências de ORFs, os quais são separados por junções que contém sinais
para a transcrição de várias cópias de RNAm subgenômico (Spaan et al.,
1988).
O RNA genômico é capeado e poliadenilado. Na extremidade 5' está uma
proteína denominada sequência líder ("leader" RNA), que precede uma região
não-transcrita (NTR 5') com 200 a 400 nucleotídeos. Já na extremidade 3'
observa-se uma região não-transcrita (NTR 3') com 200 a 500 nucleotídeo, que
faz ligação com uma cauda poly(A). Ambas as NTR são fundamentais para a
replicação e transcrição do RNA. Genes codificadores de proteínas nãoestruturais (S, E, M e N) estão presentes em todos os HCoV, sendo que em
alguns casos há também o gene da proteína HE, localizado entre a ORF1b e o
gene S. As sequência de leitura das ORF1a e ORF1b são denominadas
polimerase (Pol), que junto com os genes estruturais se repetem em todos os
coronavírus da seguinte forma: 5’-Pol-S-E-M-N-3’ (Lai et al., 1997).
29
HCoV-229E HCoV-NL63
HCoV-OC43 HCoV-HKU1
SARSCoV
Figura 4: Estruturas genômicas entre os grupos de coronavírus. Adaptado de Stadler et al.
(2003).
2. 4. 4. Manifestações clínicas
Os HCoV (229E, OC43, NL63 e HKU1) são importantes agentes etiológicos de
infecções no trato respiratório superior, podendo causar doença pulmonar mais
grave em pacientes idosos, prematuros e imunodeficientes (Garbino et al.,
2006). O quadro infeccioso mais freqüente é o resfriado comum, semelhante
aos HRV. Os sintomas incluem febre, dor de cabeça, mal-estar, calafrios,
rinorréia, inflamação de garganta e tosse, podendo variar de dois a quatro dias
após a infecção (Perlman et al., 2009). As infecções por HCoV são também
associadas a doença do trato respiratório inferior por desencadearem crises
asmáticas, além de agravarem quadros com infecções bacterianas como otite
média (Isaacs et al., 1983; Perlman et al., 2009).
2. 5. Vírus parainfluenza 1-4, vírus sincicial respiratório e
metapneumovírus humano
2.5.1 Classificação e aspectos gerais
A família Paramyxoviridae é dividida em duas subfamílias, Paramyxovirinae e
Pneumovirinae. Pertencentes à subfamília Paramyxovirinae encontramos os
30
vírus respiratórios PIV-1 e PIV-3 (gênero Respirovirus) e PIV-2 e PIV-4a/b
(gênero Rubulavirus). Na subfamília Pneumovirinae, é possível destacar dois
gêneros de interesse em infecções respiratórias humanas: Pneumovirus (VSR
A/B) e Metapneumovirus humano (hMPV A/B) (Figura 5).
Figura 5: Divisão taxonômica da família Paramyxoviridae. Adaptado de McIntosh et al., (2004).
2. 5. 2. Vírus parainfluenza
Os PIV são representados por cinco sorotipos que causam infecção humana –
PIV-1, PIV-2, PIV-3 e PIV-4a e 4b (Henrickison, 2003). Antes da sua primeira
descrição, o PIV foi recuperado de camundongos inoculados com espécime de
necrose de recém nascidos com doença respiratória (Kuroya et al., 1953). O
primeiro isolamento de humanos ocorreu em 1956, através de material de
necropsia de recém-nascido com doença respiratória (Chanock et al., 1958). O
termo “parainfluenza” foi sugerido em 1959, com base na natureza da infecção
respiratória e nas propriedades morfológicas das partículas virais, que
apresentava forte relação com o vírus influenza (Andrewes et al., 1959).
2. 5. 2. 1. Características morfológicas e estruturais
Trata-se de partículas esféricas, com diâmetro variando de 150 a 200 nm
(Figura
6).
O
virion
é
composto por um
nucleocapsídeo
helicoidal
31
(ribonucleoproteína- RPN) envolvido por um envelope lipídico (Morgan et al.,
1968). O vírus pode codificar duas glicopreteínas: uma de fusão (F) e outra de
adsorção (HN, H ou G).
RPN
HN
Figura 6: Representação da estrutura do vírus parainfluenza. Destacando as proteínas M da
camada interna do envelope, o nucleocapsídeo formado pelas proteínas R, P e N e as
espículas virais de adsorção (HN) e de fusão (F). Adpatado de Harrison et al., (2010).
De acordo com a figura 8, o genoma é constituído por RNA de fita simples nãosegmentado, com 15 a 19 Kb de extensão e de polaridade negativa (Storey et
al., 1984). O genoma apresenta-se totalmente ligado à proteína N, formadora
do capsídeo helicoidal. Para os sorotipos com tropismo pelo sistema
respiratório humano, o genoma viral vai codificar seis proteínas em comum (3’N-P-M-F-HN-L-5’) (Harrison et al., 2010).
Pesquisas indicam forte semelhança entre as proteínas codificadas pelos
quatro sorotipos, com exceção da fosfoproteína P (Cowley et al., 1984). A
maior proteína codificada pelo genoma é a proteína L RNA-polimerase RNAdependente (PM de 175.000 a 251.000), seguida da proteína P, um co-fator da
polimerase viral e da proteína N (PM de 66.000 a 70.000), principal proteína
constituinte do núcleocapsídeo. Essas três proteínas estão diretamente
associadas ao RNA viral. A proteína N liga-se ao RNA (uma proteína N para
cada seis nucleotídeos), a fim de formar um complexo que permite a ação das
proteínas L e P, e conseqüentemente transcrição e replicação do genoma viral
(Henrickson et al., 2003).
32
Estão presentes no envelope viral duas glicoproteínas que são encontradas em
todos os HPIV: (i) proteína F (PM 69.000 a 82.000), com atividade fusogênica,
e (ii) proteína HN (60.000 a 66.000), uma hemaglutinina-neuroaminidase com
atividade de adsorção. Localizada na superfície interna do envelope encontrase a proteína M (PM 28.000 a 40.000) e envolvida nos processos de montagem
e brotamento (Henrickson et al., 2003).
2. 5. 2. 2. Manifestações clínicas
Os PIV-1, PIV-2, PIV-3, PIV-4a/b possuem uma ampla distribuição global e
cada um desses cinco sorotipos podem causar doença respiratória aguda em
humanos (Chanock et al., 1963).
Os PIV estão relacionados com todos os tipos de doenças do trato respiratório
inferior e superior, sendo que a maioria das doenças sintomáticas é causada
por PIV-1 e 3, e em menores taxas pelo PIV-2. O PIV-4 é mais raro, causando
infecções brandas no trato respiratório superior de crianças (Weinberg, 2006).
No trato respiratório superior, podem ocorrer quadros de resfriado com
congestão nasal, coriza, dor de garganta, tosse e rouquidão, apresentando
febre variável e, em menor freqüência, mal-estar, mialgia e cefaléia. A infecção
pode alcançar o trato respiratório inferior, podendo causar crupe, bronquiolite,
traqueobronquite e pneumonia. A doença aguda pode durar até três semanas,
sendo que geralmente persiste em torno de sete a dez dias (Henrickson et al.,
2003).
2. 5. 2. Vírus Sincicial Respiratório e Metapneumovírus humano
O VSR e o hMPV estão classificados na subfamília Pneumovirinae e gêneros
Pneumovirus e Metapneumovirus, respectivamente (Figura 6). A primeira
descrição do VSR data de 1956 nos EUA, quando o então novo agente
citopático foi isolado de uma colônia de chimpanzés com quadro clínico
semelhante ao do resfriado comum. Também foi constatado que os indivíduos
que tiveram contato com os primatas infectados apresentaram um quadro
brando de doença do trato respiratório superior (Collins, 2007). Duas novas
variantes do agente isolado dos chimpanzés foram descritas, e com base no
efeito citopático desses vírus (formação de sincícios), foi denominado “vírus
33
sincicial respiratório” (Chanock et al., 1961). Verifica-se a existência de dois
subtipos, VSR A e VSR B (Hierholzer & Hirsch, 1979).
O hMPV foi identificado na Holanda, em 2001, a partir de espécimes de
aspirado de nasofarínge coletados de crianças que apresentavam um quadro
clínico semelhante à infecção por VSR, porém sem agente etiológivo definido
(van den Hoogen et al., 2001). Novos estudos comprovaram evidências
sorológicas da sua existência por mais de quatro décadas, fato que coloca em
cheque a sua classificação como vírus emergente (van den Hoogen et al.,
2001). Em seguida, através do sequenciamento dos genes P, M e N foi
possível dividir o hMPV em dois grupos, hMPV-A e hMPV-B, sendo que estes
se subdividiam em hMPV-A1, hMPV-A2 e hMPV-B1 e hMPV-B2 (Mackay et al.,
2004).
2. 5. 2. 1. Características morfológicas e estruturais
As partículas virais são envelopadas e pleomórficas, sendo que o tamanho
apresentado pelo VSR é em torno de 110 a 350 nm de diâmetro, enquanto que
o hMPV, cerca de 150 a 60 nm (Bachi et al., 1973; van den Hoogen et al.,
2001). O envelope contém três glicoproteínas transmembrana: G, F e SH. A
face interna do envelope está associada à proteína M. Seu nucleocapsídeo é
formado pelo RNA associado a outras quatro proteínas: proteínas: N, P, M2-1 e
L (Figura 7). Não possui hemaglutinina e neuraminidase (Collins, 2007).
34
Figura 7: Diagramação do vírion da subfamília Pneumovirinae. Na face externa do envelope é
possível identificar as proteínas G, F e SH. Na face interna do envelope temos a proteína da
matriz e no core viral, o nucleocapsídeo formado pelo genoma mais as proteínas L, N, P e M21, sendo que esta última não foi ilustrada pelo esquema. Adaptado de Hall, (2001).
O VSR e o hMPV possuem um genoma de RNA de fita simples, linear, de
polaridade negativa e não segmentado, com aproximadamente 15 kb e 13 kb,
respectivamente, (Figura 8). O genoma do VSR codifica 11 proteínas (duas
não-estruturais e nove estruturais), enquanto que o hMPV, apenas nove
proteínas. As duas proteínas não-estruturais são a NS-1 e NS-2, exclusivas do
gênero Pneumovirus, cuja função é inibir a indução de interferon α e β durante
a resposta à infecção viral (Spann et al., 2004). São então nove as proteínas
estruturais presentes em ambos os vírus: (i) nucleoproteína N, que faz ligação
com o RNA, sendo a principal proteína do nucleocapsídeo; (ii) fosfoproteína P,
associada ao nucleocapsídeo, com função de co-fator da polimerase; (iii)
proteína M2-1, associada ao nucleocapsídeo, cuja função é promover a
transcrição gênica; (iv) proteína L, também associada ao nucleocapsídeo,
representando a polimerase viral; (v) proteína M da matriz, localizada na face
interna do envelope viral, e importante durante a montagem do vírus; (vi)
proteína F, localizada na superfície externa do envelope, essencial para a
35
fusão vírus-célula e na formação de sincícios; (vii) glicoproteína G, importante
mediador da adsorção viral à célula alvo; (viii) glicoproteína SH, também na
face externa do envelope, porém com função indeterminada; (ix) proteína M2-2,
envolvida na regulação do processo de transcrição/replicação do RNA (Collins,
2007).
PIV-1/ PIV-3
PIV-2/ PIV-4
VSR
hMPV
Figura 8: Genoma dos paramixovírus. Adaptado de http://www.realmagick.com/paramyxovirusgenome-structure/. Acesso em 15 de janeiro de 2012.
2. 5. 2. 2. Manifestações clínicas
Um amplo espectro de manifestações clínicas (tosse, rinorréia, sibilância,
dispnéia e otite média) têm sido descritas nas infecções pelo VSR e hMPV,
variando desde quadros brandos do trato respiratório superior, como um
resfriado comum, até doenças mais graves que requer hospitalização do
paciente, como BVA e pneumonia (Konig et al., 2004; Mahony et al., 2008). Em
adultos imunocompetentes, a infecção pode gerar sintomas brandos de
resfriados, com tosse, rinorréia, rouquidão, dor de garganta, e mais raramente,
febre (Falsey et al., 2003). Em crianças e neonatos, a principal apresentação
clínica é a BVA, com importante sibilância, dificuldade respiratória, congestão
nasal, sendo que 90% dos casos são acompanhados por tosse, 75% por
rinorréia e mais de 50% por febre (Heikkinen et al., 1995; Falsey et al., 2003).
36
2. 6. Adenovírus
2.6.1 Classificação e aspectos gerais
Os AdV foram isolados e caracterizados em 1953, quando pesquisadores
pesquisavam o agente etiológico de infecções respiratórias agudas (Rowe et
al., 1953; Hilleman et al., 1954). Os novos vírus foram denominados adenovírus
tendo em visto o seu isolamento, que foi obtido a partir de glândulas adenóides
humanas (Enders et al., 1956). Existem, hoje, 51 sorotipos diferentes de AdV
humanos (Brandt et al., 1972), os quais são agrupados em sete espécies:
Espécies A (AdV-12, 18, 31), espécie B que pode ser dividida em B1 (AdV-3, 7,
11, 21, 51) e B2 (AdV-11, 14, 34, 35), espécie C (AdV-1, 2, 5, 6), espécie D
(AdV 8-10, 13, 15, 17, 19, 20, 22-30, 32, 33, 36-39, 42-49, 51), espécie E (AdV4), espécie F (AdV-40 e 41) e espécie G (AdV-51). A definição do sorotipo é
baseada na neutralização via anticorpo específico (Wold, 2007).
2. 6. 2. Características morfológicas e estruturais
Os AdV são vírus não-envelopados, com capsídeo icosaédrico que envolve o
genoma de DNA dupla-fita, de aproximadamente 34-48 Kb, além dos outros
componentes
do
core
viral
(Russell,
2000).
As
partículas
possuem
aproximadamente 90 nm de diâmetro, com fibras projetadas dos vértices do
icosaédrico (Figura 9). O capsídeo do vírus é composto por pelo menos nove
proteínas: (i) proteína formadora do hexon (proteína II), (ii) do penton (proteína
III) e (iii) proteína da fibra (proteína IV), além das (iv) proteínas IIIa, VI, VIII e IX;
(v) proteínas V, VII, µ e proteína terminal TP, que estão no core junto com o
genoma (Chatterjee et al., 1985; Vellinga et al., 2005).
37
Fibra
Penton
Hexon
Hexon
Penton + fibra
Figura 9: Estrutura do virion do AdV. (a): Visão geral da localização das proteínas formadoras
do capsídeo. (b): Representação tridimencional do vírus icosaédrico, evidenciando os
componentes principais e secundários do capsídeo. (c): Diagrama representativo da
distribuição das proteínas secundárias em uma face do icosaédrico viral (Vellinga et al,. 2005).
Os AdV são vírus de DNA linear, fita dupla, com 36 Kb de tamanho. É possível
identificar em suas extremidades, sequências invertidas repetidas (ITRs), que
podem variar de 100 a 140 pares de bases. No genoma viral há duas origens
idênticas de replicação do DNA, uma em cada repetição terminal (Davison et
al., 2003). É possível dividir a expressão de proteínas do AdV em três fases:
precoce, intermediária e tardia. Na fase precoce são expressos genes que
modulam as funções celulares, facilitando a replicação do DNA e a transcrição
de genes tardios. Os genes de transcrição intermediários são expressos
imediatamente após a replicação do DNA viral e antes do início da expressão
dos genes tardios. Nessa etapa são produzidas duas proteínas multifuncionais,
o polipeptídeo IX, que compõem o capsídeo junto com o hexon, conferindo
estabilidade à estrutura e auxiliando no empacotamento viral (Villinga et al.,
2005), e o polipeptídeo IVa2, com função de promover a transcrição dos genes
38
tardios (Tribouley et al., 1994). E na fase tardia, todas as proteínas estruturais
serão formadas, exceto a proteína IX (Berk, 2007).
2. 6. 3. Manifestações clínicas
Apesar da existência de pelo menos 51 sorotipos distintos de AdV, apenas 1/3
desses sorotipos estão associados às doenças em humanos. Além de
infecções respiratórias agudas, ocorre uma variedade de outras síndromes
clínicas, com destaque para ceratoconjuntivite epidêmica, conjuntivite folicular
aguda e gastroenteterite aguda (Jawetz et al., 1959; Mautner et al., 1995;
Stroparo et al., 2010).
Os sintomas mais comuns relacionados às doenças respiratórias são
congestão nasal, coriza, dor de garganta e tosse. O período de incubação pode
variar de cinco a dez dias e boa parte das infecções são subclínicas.
Geralmente, os sintomas respiratórios são acompanhados por sintomas
sistêmicos, como febre, mal-estar, mialgia e cefaléia (Moro et al., 2009). Os
AdV podem também causar infecções do trato respiratório inferior em crianças,
como bronquite, bronquiolite, crupe e pneumonia (Village et al., 2003). Os
sorotipos mais comuns são os Ad1-5, 7, 14, 19 e 37, os quais são endêmicos
na maioria das populações (Mahony et al., 2008).
2. 7. Bocavírus
2.7.1 Classificação e aspectos gerais
A primeira descrição do HBoV ocorreu em 2005, na Suécia, quando
pesquisadores investigavam amostras de aspirado de nasofaringe de crianças
com infecção respiratória aguda por meio de seqüenciamento genômico, cuja
análise filogenética revelou tratar-se de um novo parvovírus (Allander et al.,
2005). Em função da proximidade genética com o parvovírus bovino e o
parvovírus canino, fato esse que deu origem ao nome bocavírus, o HBoV foi
classificado como membro da família Parvoviridae, subfamília Parvovirinae e
gênero Bocavirus (McIntosh, 2006).
39
2. 7. 2. Características morfológicas e estruturais
Os parvovírus estão entre os menores vírus conhecidos, medindo de 18 a 26
nm de diâmetro. Como todos os membros dessa família, o HBoV é um vírus de
DNA simples fita, não-envelopado. Esse genoma, que fica protegido por um
capsídeo icosaédrico, possui um tamanho que varia de 4000 a 6000
nucleotídeos (Allander et al., 2005).
O DNA completo contém três ORFs: (i) uma na extremidade 5’, codifica uma
proteína não-estrutural denominada NS1; (ii) a próxima ORF, exclusiva dos
HBoV, codifica outra proteína não-estrutural NP1 e; (iii) na extremidade 3’,
codifica duas proteínas estruturais constituintes do capsídeo viral (VP1 e VP2)
(Schildgen et al., 2008). A função da proteína NS1 ainda é desconhecida, mas
especula-se que ela desempenhe um papel importante durante a replicação
viral (Zhi et al., 2006). A proteína NP1 é ausente nos demais parvovírus e sua
função também é desconhecida (Allander et al., 2005). Nota-se que as regiões
mais conservadas do HBoV são os genes das proteínas NS1 e NP1, enquanto
que os genes para VP1 e VP2 apresentam maior heterogeneidade gênica, e
em função disso são preferidos nas análises filogenéticas do vírus (Gurda et
al., 2010) (Figura 10).
Figura 10: Organização do DNA do HBoV. Destaque para as proteínas não-estruturais NS1
(1920 nucleotídeos), NP1 (660 nucleotídeos) e as proteínas estruturais VP1/VP2 (2016
nucleotídeos). Adaptado de Allander et al., (2005).
2. 7. 3. Manifestações clínicas
Aparentemente, doença
respiratória obstrutiva
parece ser a
principal
apresentação clínica da infecção pelo HBoV (Allander, 2008). Os pacientes
podem desenvolver BVA (Chung et al., 2006, Allander et al., 2007), crupe
40
(Rihkanen et al., 2008), tosse, rinorréia e febre (Allander, 2008; Calvo et al.,
2008).
Os sintomas observados persistem entre uma a duas semanas. Os
diagnósticos clínicos mais comuns dos pacientes positivos para HBoV, com ou
sem co-infecção, são: infecções do trato respiratório superior, bronquiolite,
pneumonia, bronquite e exacerbação aguda de asma (Schildgen et al., 2008).
Outros estudos relataram a incidência de HBoV em pacientes com otite média
e sintomas gastrintestinais (Manning et al., 2006; Albuquerque et al., 2007).
2. 8. Influenza vírus A e B
2.8.1 Classificação e aspectos gerais
Os vírus da influenza, ou vírus da gripe, estão classificados na família
Orthomyxoviridae, gêneros Influenzavirus A, B e C, diferenciados com base na
estrutura da proteína de matriz (M) e da nucleoproteína (NP). Possuem
genoma de RNA de fita simples, polaridade negativa e segmentado. Os Flu A e
Flu B possuem genomas divididos em oito segmentos, enquanto que os vírus
influenza C apresentam sete segmentos (Palese, 2007).
Sua primeira descrição em seres humanos foi em 1933 (Smith et al., 1933).
Essas amostras foram classificadas no gênero A, tendo sido detectado, em
1940, um novo vírus da influenza, classificado como gênero B (Francis , 1940).
Nove anos mais tarde, foi encontrado outro vírus da influenza, classificado,
então, no gênero C (Taylor, 1949; Francis et al., 1953). São responsáveis por
infecções respiratórias agudas, de caráter epidêmico, principalmente em países
de clima temperado. A ocorrência de epidemias anuais é devida a alta taxa de
variação antigênica e mutações nos genes da hemaglutinina (HA) e
neuraminidade (NA) (Kesson, 2007).
Eventualmente, a epidemia ganha proporções globais. Essas pandemias são
conseqüências de reestruturações (reassortment) entre os segmentos gênicos
que codificam a HA e NA, denominado “antigenic shift”, que podem acontecer
em casos de co-infecção com subtipos diferentes, originando um “novo” vírus.
No final do século 19, suspeita-se que o subtipo Flu A H2N2 foi o responsável
41
pela pandemia entre 1889 e 1892, que teve início na Rússia e causou o óbito
de aproximadamente 500 mil pessoas. A pandemia de 1918 (Flu A H1N1),
conhecida como gripe espanhola, percorreu o mundo em três ondas, causando
a morte de mais de 40 milhões de pessoas. Ainda no século XX, três outras
pandemias ocorreram: a gripe asiática em 1957 (Flu A H2N2), de Hong Kong
em 1968 (Flu A H3N2) e russa em 1977 (Flu A H1N1), resultantes do
surgimento de novas linhagens pandêmicas originadas por meio da
transmissão direta interespécies de subtipos de Flu A humanos e aviários.
Embora o subtipo aviário Flu A H5N1, circulante entre 2003 e 2005, não tenha
sido responsável por nenhuma pandemia, seus primeiros casos foram descritos
em 1997, em caracter epidêmico, sendo verificados 18 casos com 6 óbitos
(Subbarao et al., 1998). Desde então, devido elevada patogenicidade e
facilidade de disseminação entre as aves domésticas e migratórias, uma série
de medidas preventivas foram estabelecidas para conter sua disseminação e o
estabelecimento de uma pandemia.
A pandemia mais recente documentada pelo homem ocorreu em 2009,
denominada gripe suína, que marcou o surgimento de um novo subtipo de Flu
A H1N1 (pdn09), formado pela recombinação entre o subtipo suíno
euroasiático (Flu A H1N1) com o subtipo suíno norte americano (Flu A H1N2),
o qual já havia sofrido anteriormente uma tripla recombinação envolvendo
subtipos humano (Flu A H3N2), suíno (Flu A H1N1) e aviário (Potter et al.,
2011; Medina et al., 2011). Os primeiros casos foram descritos em março/abril
de 2009 no México e Estados Unidos. Em junho de 2009, a OMS elevou o nível
de alerta da pandemia para 6. Até 29 de janeiro de 2010, um total de 209
países notificaram casos confirmados laboratorialmente de Flu A H1N1
(pdn09), incluindo pelo menos 14.711 óbitos (WHO, 2010). Somente no Brasil,
até a 47° semana epidemiológica, foram confirmados 30.055 casos de
Síndrome Respiratória Aguda Grave por algum vírus influenza, sendo que 93%
tinham como agente etiológico o Flu A H1N1 (pdn09). A taxa de incidência de
doentes com o subtipo pandêmico de 2009 foi de 14,5 casos para cada 100 mil
habitantes, com as regiões sul e sudeste acumulando maior número de casos
(Secretaria de Vigilância em Saúde, 2009).
42
2. 8. 1. Características morfológicas e estruturais
O Flu A e B possuem envelope derivado da célula hospedeira contendo as
glicoproteínas que consituem as espículas virais hemaglutinina (HA) e
neuroaminidase (NA), e a proteína transmembrana M2 (Flu A) ou NB (Flu B).
Na face interna do envelope, há a proteína da matriz M1 e o core viral de
simetria helicoidal. O core viral, é constituído pelo complexo ribonucleoprotéico
(RNP), segmentado, além das polimerases virais que são três: polimerase
básica 1 (PB1), polimerase básica 2 (PB2) e polimerase ácida (PA) (Figura 11)
(Palese, 2007).
Todos os subtipos de Flu A e Flu B possuem genoma de RNA simples-fita,
polaridade negativa e com oito segmentos, os quais codificam pelo menos 10
proteínas virais (Palese, 2007). A glicoproteína estrutural hemaglutinina HA é
uma proteína trimérica, responsável pela adsorção viral aos receptores
específicos na superfície celular e pela fusão do virion com a membrana da
vesícula
de
endocitose
(Wharton,
1991).
A
glicoproteína
tetramérica
neuroaminidase NA é responsável por hidrolisar resíduos de ácido siálico de
qualquer glicoconjugado (Gottschalk, 1957).
Envelope lipídico
RNP viral
Figura 11: Representação da estrutura do vírus da influenza A. Adaptado de Medina et al.
(2011).
Essas duas glicoproteínas apresentam uma variação antigênica muito grande,
com 16 tipos de HA e nove tipos de NA reconhecidos até hoje, o que permite
43
classificar o Flu A em diferentes subtipos (Medina et al., 2011). As polimerases
virais P ocorrem de três formas, uma polimerase ácida PA e duas polimerases
básicas PB1 e PB2, que se complexam e formam ligação ao final de cada RNP
(Murti et al., 1988). A nucleoproteína NP é a principal proteína formadora do
complexo RNP, e desempenha um papel importante na relação vírus e
hospedeiro (Tian et al., 1985). Localizada na parte interna do envelope viral
está a proteína M1, proteína mais abundante do virion. M2 é uma proteína
tetramérica integral do envelope, que atua como canal de prótons. A NS1 é
uma proteína dimérica nuclear, altamente expressa nas células infectadas, com
atividade de ligação às moléculas fita duplas de RNA (Hatada & Fukada, 1992).
A proteína NS2 ou NEP (nuclear export protein) está associada à proteína da
matriz M1, e juntas são importantes para exportar o complexo RNP viral
(Neumann et al., 2000).
2. 8. 3. Manifestações clínicas
A gripe é uma doença de início súbito acompanhada por febre, comumente
alta, caracterizada por sintomas do trato respiratório superior que incluem
tosse, dor na garganta, tosse, rinorréia e congestão nasal. Podem aparecer
sintomas sistêmicos, como mialgia, cefaléia e fraqueza, que resultam em um
número significativo de hospitalizações em todos os grupos etários (Thompson
et al., 2004). As internações mais graves, como pneumonia viral, ou
complicações que podem levar a óbito, estão mais associadas às infecções
pelo vírus influenza A (Simonsen et al., 2000). Nesses casos é possível existir
a infecção mista entre o Flu e bactérias, como Haemophilus influenzae,
Staphylococcus aureus e Streptococcus pneumoniae.
2. 9. Diagnóstico laboratorial das infecções pelos vírus respiratórios
2.9.1 Breve histórico
Weller e Enders conseguiram realizar o primeiro isolamento de patógenos
virais humanos em cultura de células (Weller & Enders, 1948). Desde então, o
isolamento em cultura de célula é reconhecidamente o “padrão ouro” para
diagnóstico dos diversos vírus respiratórios, devido à elevada especificidade,
além de permitir a detecção de possíveis sorotipos desconhecidos ou de
variantes genotípicas do vírus (Siqueira et al., 1986; John et al., 1990). A partir
44
da década de 70 observou-se a aplicação de anticorpos fluorescentes e
anticorpos monoclonais, que aumentou a sensibilidade dos diagnósticos
microbiológicos (Ginocchio et al., 2007).
A introdução de técnicas moleculares como o desenvolvimento da Reação em
Cadeia pela Polimerase (PCR), descrita por Saiki et al. (1985) e principalmente
por Mullis et al. (1986) ao amplificar o gene da β-globina humana, foi marcante
para a obtenção de diagnósticos virológicos com maior sensibilidade e
especificidade. Sendo assim, a utilização de testes baseados na amplificação
do ácido nucléico aumentou significativamente as opções de diagnósticos
laboratoriais a cerca dos vírus respiratórios, os quais antes ficavam limitados
aos métodos convencionais (isolamento em cultura celular a partir de
secreções respiratórias e testes sorológicos dos espécimes isolados).
Os métodos moleculares são mais sensíveis e rápidos quando comparados
aos métodos convencionais, principalmente aqueles em formato "multiplex",
com os quais é possível detectar um amplo painel de patógenos respiratórios
com um único teste. A aplicação de técnicas moleculares na rotina diagnóstica
pode melhorar o manejo do paciente, com possibilidade de terapia antiviral,
quando possível, diminuindo o uso equivocado de antimicrobianos e o tempo
de estadia hospitalar, além de propiciar o isolamento de pacientes infectados.
Entretanto, deve-se entender que os resultados moleculares positivos precisam
ser corretamente interpretados, uma vez que, especialmente para as viroses
respiratórias, tal resultado positivo pode indicar doença, infecção, excreção
subclínica do agente viral ou contaminação cruzada durante a preparação dos
testes.
Resumindo, as viroses respiratórias podem ser diagnosticadas por meio de:
Isolamento viral por meio da técnica de ovos embrionados ou através linhagens
celulares
diversas;
métodos
sorológicos
como
teste
de
inibição
da
hemaglutinação, inibição de hemadsorção, teste de fixação do complemento,
teste de neutralização; métodos não-sorológicos como a reação de
imunofluorescência direta (RIFD) e indireta (RIFI) e teste imunoenzimático
(ELISA); métodos baseados na amplificação dos ácidos nucléicos como o RTPCR e suas variações, reação de amplificação baseada no ácido nucléico
45
específico (NASBA) e a amplificação circular isotérmica (LAMP). A utilização
dos testes moleculares quantitativos, introduzidos ao final da década de 90 por
meio da PCR em tempo real, proprocionou uma interpretação mais próxima do
real tornou-se possível. (Mahony et al., 2008). Este método será descrito no
item seguinte, por se tratar metodologia usada no presente estudo.
2.9.2. PCR em tempo real (rtPCR)
A detecção por PCR em tempo real (rtPCR) é similar aos testes que utilizam
técnicas de PCR padrão, sendo que a diferença fundamental reside no fato de
que os alvos da amplificação são visualizados em tempo real. A detecção em
tempo real pode ser alcançada de duas formas. A primeira baseia-se na
utilização do corante fluorescente SYBR® GREEN, que se polimeriza junto às
moléculas de DNA alvo à medida que estas são amplificadas.
A segunda forma de detecção baseia-se na utilização de dois iniciadores e uma
sonda específica TaqMan® duplamente marcada, cuja fluorescência é
vizualizada durante a fase de extensão, na qual a atividade nuclease da
enzima Taq polimerase cliva a sonda, permitindo a emissão do sinal
fluorescente (Figura 12). Testes de rtPCR que utilizam sondas como princípio
de detecção tendem a ser mais específicos, tendo em vista que há a ligação de
três oligonucleotídeos ao alvo de interesse enquanto que os ensaios baseados
com corante SYBR® GREEN utilizam apenas dois oligonucleotídeos (Beck &
Henrickson, 2010).
46
Corante emissor
Sonda
Corante inibidor
Taq pol.
®
Figura 12: Princípio do funcionamento da sonda TaqMan . (A) Hibridização da sonda intacta
com o ácido nucléico; (B) Fase de extensão da enzima Taq polimerase; (C) Clivagem da sonda
em função da atividade de nuclease da enzima Taq polimerase e emissão do sinal fluorecente.
Adaptado de http://www.apliedbiosystems.com/absite/us/en/home/aplications-technologies/realtime-pcr/taqman-and-sybr-green-chemistries.html?!CID=EDI-Lm4. Acesso em 21 de setembro
de 2011.
À medida que a reação de rtPCR ocorre, o alvo de interesse é amplificado em
um termociclador de tempo real, o sinal fluorescente é emitido e captado a
cada ciclo de reação. Se o sinal de fluorescência estiver acima do ponto de
corte do teste (threshold), ajustado na fase exponencial da reação, as amostras
são consideradas positivas para o patógeno pesquisado.
Outra vantagem adicional para o rtPCR é a natureza quantitativa do teste. Para
cada amostra positiva é estabelecido um valor de Ct (ciclo no qual a
fluorescência emitida atravessa o threshold). Por meio do Ct é possível
determinar a quantidade inicial de RNA ou DNA na amostra através de uma
47
curva padrão. Para testes qualitativos, quanto menor o Ct maior é a
concentração de moléculas alvo na amostra. rtPCR está rapidamente
ganhando impulso no mercado mundial e se tornando uma ferramenta cada
vez mais importante para o diagnóstico de vírus respiratórios (Brittain-Long et
al., 2008; Lassaunière et al., 2010).
Nesse novo panorama dos diagnósticos das infecções respiratórias virais é
possível destacar o rtPCR no formato “multiplex”, cujo fundamento é baseado
no fato de que os termocicladores para o rtPCR são capazes de detectar
simultaneamente diferentes comprimentos de onda de fluorescência. Um sinal
fluorescente em qualquer uma das reações indica um resultado positivo,
enquanto que a cor da fluorescência emitida na reação é utilizada para
identificar o agente patogénico. O número de agentes patogénicos que podem
ser detectados numa única reacção está limitado ao número de filtros
fluorescentes existentes no sistema (Beck & Henrickson, 2010).
Apesar da facilidade em se obter ácidos nucleicos relativamente puros a partir
de amostras clínicas, tendo em vista o uso de sistemas semi-automáticos nos
quais a extração do ácido nucleíco é automatizada, ocasionalmente impurezas
que permanecem na reação podem inibir a amplificação do ácido nucleico. Por
esta razão, é importante a incorporação de um controlo interno em cada
amostra testada. O controle interno deve sempre produzir um resultado positivo
considerando que a amostra foi processada corretamente. Para que um
resultado negativo seja validado, o controle interno deve deve ser amplificado
de acordo com os parâmetros esperados (Rosenstraus et al., 1998).
Considerando a detecção dos picornavírus, os métodos baseados na
amplificação dos ácidos nucléicos, como RT-PCR e NASBA, foram descritos
com uma sensibilidade superior à da cultura (Gama et al., 1988; Hyypia et al.,
1998; Blomqvist et al., 1999). A fim de distinguir infecções causadas por HRV e
EV, são indicados testes que utilizam como alvo genes para as proteínas VP1
e VP2 (Kiang et al., 2007). PCR no formato multiplex e RT-rtPCR foram
descritos com elevada sensibilidade e maior rapidez (Kares et al., 2004;
Scheltinga et al., 2005).
48
Dessa forma, as técnicas moleculares têm norteado o diagnóstico dos EV
associadas ao sistema respiratório, já que são mais rápidas e sensíveis que os
métodos convencionais (Rotbart et al., 1991), permitindo detectar baixos níveis
de sorotipos de EV cultiváveis e não-cultiváveis em indivíduos sintomáticos e
assintomáticos (Nokso-Koivisto et al., 2002, Oberste et al., 2003). A maioria
dos RT-PCR, utiliza primers para a região conservada não-codificadora 5’, e
um segundo PCR direcionado para a amplificação dos genes VP1 e VP2 pode
ser utilizada para fazer a distinção entre EV e HRV (Landry et al., 2003).
Com base na biologia molecular a identificação do HPeV pode ser alcançada
por meio da técnica de RT-PCR, utilizando como alvos as regiões conservadas
da terminação 5’ ou a região VP1 do genoma (Arola et al., 1996; Al-Sunaidi et
al., 2007), sendo que alguns estudos indicaram que a detecção dos
parechovírus por meio do RT-PCR é mais sensível que a cultura (Vuorinen et
al., 2003; Kares et al., 2004).
Várias técnicas moleculares de RT-PCR foram descritas para o diagnósticos
das HCoV, seja no formato “nested” ou em tempo real. Utilizam como alvo da
amplificação os genes da polimerase viral ou do nucleocapsídeo (Adachi et al,
2004; Woo et al, 2005). Menos de cinco cópias de RNA por reação podem ser
amplificados por meio do PCR em tempo real (Emery et al, 2004).
Para a detecção de PIV, a primeira RT-PCR apresentou uma sensibilidade
analítica de 600 cópias/ml (Fan et al., 1998). O gene para a HN se tornou o
alvo mais comum nas técnicas moleculares, pois por meio desse gene foi
possível elaborar testes sorotipos específicos (Bellau-Pujol et al, 2005).
“Nested”, semi “nested” e PCR multiplex foram descritos, bem como mais
recentemente a reação de rtPCR multiplex (Mahony et al., 2008).
Vários métodos moleculares foram descritos para a detecção do VSR,
demonstrando sensibilidade superior em relação à cultura (Kehl et al., 2001;
Wang et al., 2009). É possível utilizar diferentes formatos de detecção baseado
em RT-PCR, hibridização, seqüenciamento, PCR-ELISA e RT-PCR em tempo
real (Mahony et al., 2008). Os principais genes utilizados para a amplificação
por meio do RT-PCR são os da proteína de fusão, do nucleocapsídeo e da
proteína L da polimerase (Weinberg et al., 2004; Lee et al., 2006).
49
Como não poderia ser diferente, os testes moleculares são de fato o método de
maior sensibilidade para a detecção do hMPV (Mahony et al., 2008). Desde a
descrição do primeiro RT-PCR para a detecção do hMPV (van de Hoogen et
al., 2003), os principais alvos escolhidos para a amplificação são os genes da
polimerase viral, da proteína da matriz, da proteína F e da nucleopreteína N.
Foi descrito que o gene para a proteína P seria o alvo ideal para a
amplificação, por ser uma região conservada do genoma e por permitir a
genotipagem do vírus (Mackay et al., 2004). A rtPCR também é utilizada para o
diagnóstico de hMPV. O ensaio em tempo real foi desenvolvido para detectar o
gene N de todas as estirpes de hMPV, e constatou-se que o método possui
maior sensibilidade, especificidade e velocidade que os RT-PCR convencionais
(Mackay et al., 2003; Maertzdorf et al., 2004).
para o AdV a maior parte dos testes moleculares utiliza como alvo da
amplificação o gene da proteína hexon que evidencia o gênero dos AdV (Allard
et al., 1992), enquanto que outros métodos, voltados para a amplificação dos
genes da fibra viral ou genes do RNA vírus associado (RNA regulatório
encontrado no citoplasma de células hospedeiras), são utilizados para a
genotipagem (Ma & Mathews, 1996; Osiowy et al., 1998; Echavarria et al.,
1998). Para a caracterização genotípica é possível utilizar a reação de
polimorfismo de tamanho de fragmentos restrição do DNA em gel de agarose
(RFLP) ou mesmo a realização da PCR com primers específicos (Wadell et al.,
1980; Allard et al., 2001). O PCR em tempo real que permite a detecção de
todos os 51 genotipos de AdV também foi descrito (Claas et al., 2005).
As infecções por HBoV tem sido diagnosticadas por métodos moleculares, uma
vez que métodos de isolamento viral, modelo animal e detecção de antígenos
por anticorpos ainda estão sendo aperfeiçoados (Schildgen et al., 2008). Para
fins diagnósticos, regiões mais conservadas do genoma são priorizadas, e
dessa forma temos mais testes direcionados para a amplificação dos genes
NS1 e NP1 (Allander et al., 2005; Schildgen et al., 2008). Para estudos
filogenéticos ou de variabilidade, os genes das proteínas estruturais VP1 e VP2
são os alvos de escolha da amplificação, visto que possuem maior
variabilidade (Chieochansin et al., 2007). Diversas metodologias de PCR em
tempo real tem sido descritas para a detecção do HBoV, pois além de permitir
50
um certo grau de quantificação da carga viral na amostra, diminui as chances
de contaminação, diminui o tempo do diagnóstico e aumenta a especificidade
do ensaio (Arnold et al., 2006; Lu et al., 2006; Allander et al., 2007).
Os principais testes moleculares utilizados para a detecção dos Flu incluem o
RT-PCR e suas variações, NASBA e LAMP. Em um estudo, NASBA foi mais
sensível que os testes de IF e isolamento viral, enquanto que o LAMP
demonstrou sensibilidade equivalente ao isolamento (Moore et al., 2004). Nos
casos do RT-PCR e suas variações, como o RT-PCR no formato multiplex e o
RT-PCR em tempo real, são utilizados primers específicos para os genes da
proteína da matriz M1, NS, HA e NA, por meio dos quais é possível detectar os
diferentes gêneros dos vírus influenza e determinar o subtipo de Flu A
encontrado (Ellis et al., 1997). Portanto, são diagnósticos mais rápidos e
sensíveis que o método padrão de detecção dos vírus influenza (Templeton et
al., 2004).
51
3. OBJETIVOS
52
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Determinar a freqüência de vírus respiratórios por meio de técnica de biologia
molecular em pacientes atendidos com IRA, em uma unidade de ProntoAtendimento e uma Unidade Básica de Saúde, no período de agosto de 2007 a
agosto de 2009, na cidade de Vitória, Espírito Santo, Brasil.
3.2. Objetivos Específicos
1. Aplicar para o diagnóstico virológico em casos de IRA um novo painel de
“Multiplex
Real
Time-PCR”
para
detecção
dos
principais
vírus
respiratórios humanos, a saber: Flu A (sazonal), Flu A H1N1 (pdn09), Flu
B e HRV, HCoV-229, HCoV-43, HCoV-63 e HCoV-HKU, PIV 1-4, hMPV
A/B, VSR A/B, AdV, EV , HPeV e HboV.
2. Investigar a presença dos vírus recentemente descritos, a saber: Flu A
H1N1 (pdn09), hMPV, HBoV, HCoV-63 e HCoV-HKU, em indivíduos
com IRA;
3. Detectar a freqüência de infecção mista entre os vírus pesquisados neste
grupo de pacientes.
53
4. MATERIAL E MÉTODOS
54
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Descrição do estudo
Trata-se de um estudo de corte transversal, utilizando amostras de secreção de
nasofaringe (SNF) de indivíduos arrolados entre agosto de 2007 a agosto de
2009, conservadas em freezer – 70°C. A coleta ocorr eu na Policlínica São
Pedro e na Unidade de Saúde de Maruípe, de acordo com o protocolo
estabelecido pela vigilância de vírus respiratórios do Ministério da Saúde, com
os seguintes critérios de inclusão: indivíduos de qualquer faixa etária,
procedentes de Vitória, com síndrome gripal, apresentando febre, coriza, alem
de um ou mais dos seguintes sintomas: tosse, mialgia, obstrução nasal, dor de
cabeça, dor de garganta e dor de ouvido, com até cinco dias de início dos
sintomas. A coleta na Policlínica São Pedro ficou sob a responsabilidade do
Núcleo de Doenças Infecciosas (NDI) do Centro de Ciências da Saúde da
Universidade Federal do Espírito Santo e na Unidade Básica de Saúde de
Maruípe, pelo Laboratório de Saúde Pública da Secretaria Estadual de Saúde
do Espírito Santo.
4.2. Coletas de dados
O espécime clínico (SNF) foi obtido por meio de aspiração, utilizando sonda
uretral número 6, acoplada a um equipo de infusão de soro, conectado a um
aspirador manual ou de parede. A sonda foi introduzida alternadamente em
ambas as narinas até a altura da nasofaringe, com movimentação constante,
porém delicada, a fim de evitar sangramentos na mucosa. Após a coleta, o
equipo conectado à sonda uretral contendo a amostra era acondicionado em
embalagem plástica fechada e identificado, e em seguida colocado em caixa
térmica refrigerada para ser transportado até o laboratório de Vírus
Respiratórios do NDI (LABVIR), onde era mantido sob refrigeração a 4ºC até o
seu processamento, por um período não superior às 24h. Nenhuma das
amostras passou por congelamento antes do seu processamento inicial.
Os dados clínicos e epidemiológicos foram obtidos por meio de uma entrevista
seguindo o roteiro de uma ficha epidemiológica (Anexo 1), utilizada pelo
Programa de Vigilância de Vírus Respiratórios do Ministério da Saúde.
55
4.3. Métodos Laboratoriais
4.3.1. Processamento das amostras
Após avaliar se o espécime foi adequadamente coletado, transportado e
armazenado, a fim de minimizar a geração de falsos positivos e negativos, os
procedimentos foram realizados em Cabine de Segurança Biológica Classe 2
(NB2), de acordo com as boas práticas laboratoriais, utilizando os
equipamentos de proteção individual (EPI) indicados. As amostras de SNF
foram divididas em duas alíquotas destinadas para diferentes técnicas
laboratoriais: reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e real time RT-PCR
(RT-rtPCR).
A primeira alíquota destinada à realização da RIFI foi obtida por lavagens do
equipo e da sonda com tampão salino fosfato (PBS). A secreção foi
homogeneizada com auxílio de uma pipeta Pasteur e o sedimento obtido por
centrifugação a 600 x g por 10 minutos. O sobrenadante foi então desprezado
e o sedimento contendo as células de descamação foi depositado sobre as
lâminas para imunofluorescência, respeitando a marcação individual de cada
um dos 10 círculos delimitados de 0,5 cm de diâmetro. Para cada amostra
clínica foram feitas duas lâminas.
Após a secagem das lâminas no interior da Cabine NB2, o material foi fixado
em acetona PA a 4oC por 10 minutos. As lâminas previamente identificadas
foram finalmente armazenadas a -70o C até o momento da realização da
técnica de RIFI. A segunda alíquota destinada à análise pela técnica de realtime RT-PCR foi acondicionada, em meio de cultura MEM (minimal essential
medium)
de
Eagle
contendo
agentes
antimicrobianos
(estreptomicina,
penicilina e anfotericina B), em criotubo de fundo cônico e tampa rosqueada.
Esses microtubos foram guardados a -70oC até o momento da realização das
técnicas citadas (Fluxograma 1).
56
Fluxograma 1: Representação esquemática do processamento das amostras.
4.3.2. Reação de imunofluorescência indireta
Para o teste da RIFI utilizou-se o Kit ‘’Respiratory panel 1 Viral Screening &
Identification KitTH” (Chemicon Internectional, INC. Temecula, CA). Por meio
desse Kit foram pesquisados em cada amostra clínica sete diferentes vírus:
AdV, Flu A, Flu B, PIV-1-3, e VSR. Em cada círculo da lâmina de IF contendo
material clínico fixado, adicionou-se uma gota da solução de anticorpo
monoclonal (IgG) específico para cada um dos vírus separadamente.
Em seguida as lâminas foram incubadas por 30 minutos a 37oC em câmara
úmida. As lâminas foram, então, lavadas por três ciclos de 5 minutos com PBS,
secadas e incubadas novamente nas mesmas condições anteriores, porém
cobertas por anti-IgG de camundongo conjugado ao isotiocianato de
fluoresceína. Após, foram novamente lavadas por três ciclos de 5 minutos com
PBS. A montagem das lâminas para a leitura foi feita com uma gota de glicerol
tamponado no meio do círculo e recoberto por uma lamínula. A leitura foi
realizada em microscópio de fluorescência de epi-iluminação (Olympus Optical
CO, LTDA, Tókio Japão) com aumento de 400 vezes.
57
4.3.3. Interpretação dos resultados de RIFI
Todas as lâminas positivas apresentaram fluorescência de coloração verdemaçã intensa, sempre localizada no interior da célula. O padrão de coloração
mais
comumente
identificado
foi
granular,
porém,
grandes
inclusões
homogeneamente coradas apareceram em alguns casos. Qualquer coloração
extracelular ou fragmentos de células mostrando fluorescência foram
considerados inespecíficos. Durante a leitura das lâminas foi assegurada a
existência de pelo menos três células intactas por campo, visto que um número
insuficiente de células por campo poderia levar a resultados falsos negativos.
Uma vez identificada fluorescência característica a amostra foi considerada
positiva, levando em consideração os seguintes padrões específicos de
coloração: (i) Flu, fluorescência presente somente no núcleo, no citoplasma ou
em ambos; (ii) PIV1-3, fluorescência citoplasmática com aspecto de grânulos
finos; (iii) VSR, florescência citoplasmática, com a possibilidade de ocorrência
de corpúsculos de inclusão e partículas finas fluorescentes; (iv) AdV,
fluorescência variável, podendo ser nuclear e citoplasmática.
Os resultados foram considerados negativos quando as lâminas apresentavam
ausência de fluorescência específica e com predomínio de coloração
avermelhada nas células devido à presença do corante azul de Evans no
conjugado.
4.3.4. Diagnóstico virológico por Real Time PCR
Esta etapa do diagnóstico viral foi realizada no Laboratório de Vírus
Respiratórios do Instituto Oswaldo Cruz da Fundação Oswaldo Cruz – Rio de
Janeiro
4.3.4.1. Extração do Ácido Nucléico
As amostras foram submetidas ao método de extração pelo kit "MagNA Pure
LC Total Nucleic Acid Isolation" (ROCHE, versão 12.0), através de método
automatizado por meio do “MagNA Pure LC 2.0 Instrument" (ROCHE). Esse
método de extração baseia-se na propriedade de ligação de moléculas de RNA
e DNA a partículas magnéticas. As partículas magnéticas de sílica (Magnetic
glass particles- MGPs), estruturas de superfície vítrea e núcleo magnético,
formam ligações com moléculas de DNA e RNA (Figura 13).
58
Amostra
Figura
13:
Ruptura celular e
digestão protéica
com tampão de
lise e proteinase K
Diagramação
Ligação de
ácidos nucléicos
à superfície das
partículas
magnéticas
das
etapas
Separação
magnética do
complexo
ácido
nucléicoMGPs
de
extração
Remoção dos
debris
celulares
através de
lavagem
dos
Separação
magnética do
complexo
ácido
nucléicoMGPs
espécimes.
Eluição dos
DNA/RNA em
altas
temperaturas
durante a
remoção das
MGPs
Adaptado
de
http://www.roche-applied-science.com/proddata/gpip/3_8_2_1_1_6.html. Acesso em 12 de
janeiro de 2012.
Em placas de plástico de 36 poços, 200 µL de amostra e de controle negativo
foram adicionados a 300 µL de tampão de lise e ligação em seus respectivos
poços, homogeneizados, e em seguida, 3 µL de controle interno positivo de
vírus do mosaico do capim bromo (BMV) disponível com o kit de PCR em
tempo real "FTD Respiratory Pathogens 21 plus". Uma vez finalizada, a placa
de extração foi então recoberta com papel laminado e transportada para a
extração automatizada via “MagNA Pure L.C 2.0” (Figuras 14 e 15).
Figura 14: MagNA Pure LC 2.0 Instrument (ROCHE).
Em seguida, foi necessário colocar todos os descartáveis (placas e ponteiras
plásticas) exigidos pela extração automatizada no interior do equipamento, e
59
em cada um dessas placas foram adicionados os reagentes restantes para a
extração (31,2 mL de Tampão de lavagem I, 15,6 ml de Tampão de lavahem II,
23,6 ml de Tampão de lavagem III, 6,3 ml de tampão de eluição, 4,2 ml de
Proteinase K e 5,8 ml de Suspensão de MGPs).
Figura 15: Câmera interna do “MagNA Pure LC 2.0 Instrument”.
Uma vez inserida todas as amostras no programa, o processamento
automático das amostras ocorreu com um volume final de eluição de 100 µL.
4.3.4.2. Reação de transcrição reversa, seguida de PCR em tempo real (RTrtPCR)
Para a detecção molecular por meio do PCR "multiplex" em tempo real com
transcrição reversa foram utilizados os kits "AgPath-ID™ One-Step RT-PCR"
(Ambion, cat # AM1005) e "Fast-track Diagnostics Respiratory 21 plus" (FTD
21 plus - Luxemburgo-LUX, 2010), por meio do qual se investigou os seguintes
patógenos respiratórios: Flu A sazonal, Flu A H1N1 pandêmico, Flu B e HRV,
HCoV63, HCoV229, HCoV43 e HCoVHKU, PIV1-4, hMPV A/B, VSR A/B, AdV,
EV,
HPeV,
HboV,
Mycoplasma
pneumoniae
(Mpneu),
Chlamydophila
pneumoniae (Cpneu), Haemophilus influenzae (HiB), Staphylococcus aureus
(Saur) e Streptococcus pneumoniae (Spneu).
60
Todos os patógenos respiratórios, além do controle interno da reação (vírus
bromomosáico - BMV), foram agrupados formando seis “multiplex” distintos
para a detecção dos vírus: (i) Multiplex 1: Flu A, Flu B, Flu A (H1N1) e HRV; (ii)
Multiplex 2: HCoV63, HCoV229, HCoV43 e HCoVHKU; (iii) Multiplex 3: PIV-2,
PIV-3, PIV-4 e BMV; (iv) Multiplex 4: PIV-1, hMPV A/B, HBoV e mycoplasma
pneumoniae; (v) Multiplex 5: VSR A/B, AdV, EV e HPeV; (vi) Multiplex 6:
Chlamydophila
pneumoniae,
Streptococcus
pneumoniae,
Haemophilus
influenza tipo B e Staphylococcus aureus.
O propósito do kit "AgPath-ID™ One-Step RT-PCR" é, em uma mesma etapa de
reação, obter a transcrição dos ácidos nucléicos extraídos (RNA total ou RNAm)
em DNA complementar (cDNA) e a amplificação dos alvos de interesses por
meio da DNA polimerase "AmpliTaq Gold®" no mesmo poço da placa de RTrtPCR. Já o kit "Fast-track Diagnostics Respiratory 21 plus" disponibiliza seis
painéis diferentes de iniciadores e sondas TaqMan® específicas para os
patógenos de interesse. As sequências alvos de cada patógeno estão listadas
na Tabela 1.
Tabela 1: Sequências alvos dos patógenos respiratórios amplificados.
Patógeno
Sequência alvo
Flu A
Gene da proteína de matriz
Flu A H1N1
Segemento 6 do gene NA
Flu B
Segmento 8 do gene NS1/NEP
PIV 2
Gene da proteína HN
PIV 3
Gene da proteína HN
PIV 4
Gene da proteína de fusão
HCoV 43
Gene da nucleoproteína N
HCoV 63
Gene da nucleoproteína N
HCoV 229
Gene da nucleoproteína N
HCoV HKU
Gene da nucleoproteína N
EV
Genes do domínio IV e V
HPeV
Gene da região não-codificadora 5’
61
HRV
Gene da região não-codificadora 5’
VSR A
Gene da proteína do nucleocapsídeo
VSR B
Gene da proteína do nucleocapsídeo
AdV
Hexon
PIV 1
Gene da proteína HN
hMPV A
Gene da glicoprotepina de fusão
hMPV B
Gene da glicoprotepina de fusão
Mpneu
Gene da adesina P1
HBoV
Gene NP1
Saur
Gene da proteína cinase histidina
HiB
Gene BexA
Spneu
Gene LytA
Cpneu
Gene da cadeia beta da RNA polimerase
Essas sondas TaqMan®, específicas para cada gene, são duplamente
marcadas com uma molécula fluorescente, uma na extremidade 5’ e a segunda
na extremidade 3’. A primeira etapa do ensaio consiste na desnaturação do
DNA. Durante a etapa de hibridização, a sonda e os primers hibridizam-se
especificamente ao alvo. Na fase de extensão, a atividade nuclease da enzima
Taq polimerase cliva a sonda, permitindo a emissão do sinal fluorescente. Os
detectores do equipamento são programados para a leitura de quatro emissões
distintas de fluorescência: (i) sonda TaqMan® FAM (fluorescência com
comprimento de onda 483/533 nm); (ii) sonda TaqMan® VIC (fluorescência com
comprimento de onda 523/568 nm); (iii) sonda TaqMan® Cy5 (fluorescência
com comprimento de onda 625/660 nm); (iv) sonda TaqMan® ROX
(fluorescência com comprimento de onda 585/ 610 nm).
As amostras positivas apresentam sinal de fluorescência emitido acima do
ponto de corte do teste (threshold). Adicionalmente, os valores de Ct (ciclo no
qual a fluorescência emitida atravessa o threshold) devem ser observados.
Quanto menor o valor de Ct, maior a concentração de moléculas alvo na
amostra. Portanto, durante as análises preliminares é necessário ajustar
manualmente os parâmetros “Baseline” e “Threshold” do teste. De acordo com
62
o fabricante do kit, o “baseline” deve ser ajustado entre o 3° ciclo e o ciclo no
qual se inicia a amplificação. Enquanto que o “threshold” é ajustado na fase log
ou fase exponencial da amplificação (Figura 16). A curva de amplificação dos
controles negativos deve estar abaixo do “threshold”. De acordo com o
fabricante do kit, os controles positivos de cada patógeno devem estar
amplificados, com valores de Ct menores ou iguais a 33. Já os controles
positivos internos devem estar amplificados com valor de Ct igual a 30,
podendo variar entre 27 atá 33, de acordo com o equipamento.
A técnica foi realizada conforme descrito a seguir: em uma placa de 96 poços,
10 µL de RNA extraído foi misturado com 1 µL da transcriptase reversa (25X
RT-PCR enz mix), 12,5 µL do tampão para o rRT-PCR (2X RT-PCR Buffer) e
1,5 µL do mix de primers e sondas (PP mix), configurando um volume final de
25 µL. A placa foi, então, coberta com adesivo óptico e passou por uma
homogeneização e centrifugação para em seguida ser transportada para o
equipamento de PCR em tempo real. Para a reação utilizou-se o termociclador
ABI 7500 (Applied Biosystems®, Foster City, CA). A amplificação ocorreu nas
seguintes condições: 50°C/15' (transcrição reversa) , 95°C/10' (ativação
enzimática), seguidos de 40 ciclos de 95°C/8" e 60° C/34" (amplificação). A
leitura da fluorescência era feita no passo de 60°C /34" de cada ciclo.
De acordo com o fabricante do kit FTD 21 plus, ensaios para avaliar a
especificidade foram realizados utilizando 46 patógenos distintos, entre vírus e
bactérias. Nenhum vírus ou bactéria foram detectados pelos seis grupos de
sondas e iniciadores do kit, exceto os patógenos relacionados no próprio kit de
RT-rtPCR. Para a avaliação clínica de sensibilidade do teste foi utilizada a
versão anterior do FTD 21 plus como técnica de referência. Os resultados do
PCR referência e FTD 21 plus foram equivalentes, com sensibilidade e
especificidade de 100%.
63
Linha do “Threshold”
Valor do Ct
Figura 16: Gráfico ilustrativo do ponto de corte e Ct dos testes. Adaptado de
HTTP://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/applications-technologies/real-timepcr/real-time-pcr-vs-traditional-pcr.html?ICID=EDI-Lm2. Acesso em 14 de janeiro de 2012.
4.4. Análise Estatística
Todas as informações foram codificadas e armazenadas anonimamente em um
banco de dados criado para este fim, programa estatístico SPSS 17.01 – data
entry (“Statistical Pacckage for the Social Sciences”). Foram realizadas
análises exploratórias e os resultados representados em tabelas e gráficos. Os
dados foram avaliados quanto à freqüência e completitude e calculadas as
medidas de tendência central e dispersão.
4.5. Aspectos Éticos da Pesquisa
Este estudo faz parte de um projeto anteriormente aprovado pelo Comitê de
Ética em Pesquisa do CCS – UFES, com o registro de número CEP-093/07 e a
coleta de dados foi autorizada pela Secretaria Municipal de Saúde de Vitória.
4.6. Soluções e reagentes
4.6.1. Tampão fosfato:
Tampão PBS (10x) pH 7,2; Solução isotônica e não tóxica, indicada para a
lavagem e processamento de material coletado da nasofaringe.
64
NaCl P.A. (VETEC Química Fina - Brasil) ......................................................80g
Na2HPO4 P.A. (VETEC Química Fina - Brasil) ............................................11,5g
KH2PO4 P.A. (VETEC Química Fina - Brasil) ...................................................2g
Água destilada q.s.p. ..............................................................................1000 mL
Para a rotina a solução tampão era diluída a PBS (1x), onde 100 ml da solução
mãe era diluída em Água destilada q.s.p. 1000 ml, seguida de autoclavação.
4.6.2. Solução de antimicrobianos:
4.6.2.1. Antibiótico liofilizado Penicilina/Estreptomicina:
Penicilina (SIGMA Chemical CO. , St Louis - USA) ........................10.000 UI/mL
Estreptomicina (SIGMA Chemical CO. , St Louis - USA) .................... 10 mg/mL
PBS (1x) q.s.p. ........................................................................................... 20 mL
4.6.2.2. Antimicótico liofilizado Anfotericina B ( Cfinal : 500µg/ml):
Anfotericina B (CRISTÁLIA - BRA) .................................... 50 mg (todo o frasco)
PBS (1x) q.s.p. ..........................................................................................100 mL
• Ao final do preparo das respectivas soluções foi realizado uma
esterilização por meio de uma filtração a vácuo, utilizando micromembrana 0,22 µm, no interior de cabine de segurança biológica.
• Micro-membrana de éster de celulose com poro de 0,22 µm e diâmetro
de 47 mm (MILLIPORE Indústria e Comércio Ltda, São Paulo - BRA).
4.6.3. Soluções para armazenagem dos espécimes
4.6.3.1. Meio mínimo essencial (MEM) com glutamina e sem bicarbonato
MEM (10x) pH = 7,2 (CULTILAB - BRA)................................................... 10,15 g
NaHCO3 (VETEC - Brasil)............................................................................. 2,2 g
Água Milli-Q q.s.p................................................................................... 1.000 mL
65
• A solução MEM (1x) pH = 7,2 era obtida por meio de uma alíquota de
100 mL de MEM (10x), diluída em Água Milli-Q q.s.p 1.000 mL.
• Esterilização por filtração a vácuo em membrana com poros de 0,22 µm.
4.6.3.2. Soro albumina bovina (BSA)
O preparo da solução de proteína fetal bovina deve ser realizado
vagarosamente devido à baixa solubilidade do reagente, com agitação
magnética por um período mínimo de 10 minutos. A proporção indicada entre o
BSA e o solvente é de 1:10.
BSA liofilizado(HyClone Laboratories, Inc. Utah - USA) ................................ 25g
Água Milli-Q q.s.p...................................................................................... 250 mL
66
5. RESULTADOS
67
5. RESULTADOS
Foram analisadas 162 amostras provenientes de mesmo número de pacientes
com infecção respiratória aguda. As amostras estavam armazenadas em
freezer a – 70ºC, no NDI – CCS – UFES, coletados entre 2007 a 2009,
provenientes de três municípios da região metropolitana de Vitória, sendo a
grande maioria de Vitória (Figura 17).
= 159
=1
=2
Figura 17: Mapa da Região Metropolitana de Vitória. Destaque para o número de amostras
coletadas por Município.
Destas amostras, 79 (49%) foram de pacientes do gênero masculino, enquanto
que 83 (51%) foram do gênero feminino.
Quanto à faixa etária houve maior número de crianças, com uma mediana de
sete anos considerando todas as amostras do projeto (Gráfico 1). Um total de
108 (66,7%) pacientes são representados por crianças com idade de 0 a 9
anos.
68
Gráfico 1: Distribuição dos pacientes de acordo com a faixa etária.
As 162 amostras coletadas foram testadas por meio da RIFI e 32 (21,2%)
apresentaram fluorescência positiva para os seguintes vírus: 13 Flu A (8,6%), 9
Flu B (5,9%), 2 PIV-1 (1,3%), 2 PIV-3 (1,3%) e 6 VSR (4%). Não houve
amostras positivas para AdV e PIV-2 (Gráfico 2).
Gráfico 2: Prevalência dos vírus respiratórios detectados por meio de RIFI.
Com o RT-rtPCR foram identificadas 71 amostras positivas (43,8%), com os
seguintes resultados: 8 influenza A [2 FluA H1N1 pandêmico (1,2%) e 6 FluA
(3,7%)], 10 FluB (6,2%), 13 HRV (8%), 5 coronavírus [3 HCoV-43 (1,9%), 1
HCoV-63 (0,6%) e 1 HCoV-HKU (0,6%)], 3 PIV-1 (1,9%), 1 PIV-2 (0,6%), 4
PIV-3 (2,5%), 2 PIV-4 (1,2%), 5 HBoV (3,1%), 5 hMPV (3,1%), 1 AdV (0,6%), 2
EV (1,2%) e 12 VSR (7,4%). Não houve amostras positivas para o coronavirus
229 e HPeV (Gráfico 3).
69
Gráfico 3: Prevalência dos vírus respiratórios detectados por rRT-PCR.
A freqüência de identificação viral por meio de RT-rtPCR de acordo com a faixa
etária mostrou que a faixa etária de 0 a 2 anos de idade (37,6% da população)
apresentou 2 casos positivos de Flu A H1N1 pandêmico, 2 casos de Flu A, 3 de
Flu B, 8 de HRV, 2 de HCoV-43, 1 de HCoV-63, 1 HCoV-HKU, 1 de PIV-1, 3
de PIV-3, 5 de HBoV, 3 de hMPV, 1 de AdV e 8 casos positivos para VSR. Já
na faixa etária de três e nove anos de idade, observou-se 1 caso positivo para
Flu B, 2 casos de HRV, 1 de PIV-1, 2 de PIV-4, 2 de hMPV, 1 de EV e 4 de
VSR. Enquanto que nos indivíduos com idade de 10 a 19 anos, houve 1 caso
de HRV positivo, 1 de PIV-3 e 1 de EV. Nas idades de 20 a 39 anos, verificouse 4 casos positivos de Flu A, 6 positivos de Flu B, 1 positivo de PIV-1, 1
positivo de PIV-2, 1 positivo de HCoV-43. Para a faixa etária acima de 40 anos
observou-se apenas 2 casos positivos de HRV (Gráfico 4).
70
Gráfico 4: Distribuição das viroses respiratórias por faixa etária.
Conforme dito anteriormente, a coleta de espécime clínico foi realizada no
período de agosto de 2007 a agosto de 2009, porém, de forma homogênea
somente ocorreu durante o ano de 2008, no qual foram coletadas 128 amostras
(79%) (Gráfico 5). Ao avaliarmos a sazonalidade viral ao longo de 2008,
contatou-se que nove casos positivos (75%) de VSR ocorreram entre maio,
abril e maio. Também no mesmo período foram observados 5 casos positivos
(83,3%) de Flu A sazonal. Entre os meses que marcam o inverno no país,
foram observados uma alta frequência de casos positivos para HRV (8
amostras positivas – 62%) e para Flu B (8 amostras positivas – 80%). Ao final
do ano, entre outubro a dezembro, o agente viral mais freqüente foi o hMPV (4
casos positivos – 80%).
71
Gráfico 5: Distribuição da coleta de amostras e de agentes virais no ano de 2008.
De todos pacientes acometidos por algum patógeno respiratório identificamos
seis casos de infecção viral mista, todos ocorreram em crianças com até 2
anos de idade. O VSR foi o vírus mais freqüente nas coinfecções (50%).
Observou-se 1 caso de VSR e FluA, 1 caso de VSR e HBoV, 1 caso de VSR e
HCoV-63, 1 caso de HRV e HBoV, 1 caso de HRV e PIV-3 e 1 caso de HCoV
43 e hMPV (Tabela 2).
Tabela 2: Infecção mista de vírus respiratórios.
Flu A HRV HCoV HCoV PIV- HBoV hMPV VSR
Flu A
HRV
HCoV43
HCoV63
PIV 3
HBoV
hMPV
VSR
-
43
63
3
0
0
0
0
0
0
1
-
0
0
1
1
0
0
-
0
0
0
1
0
-
0
0
0
1
-
0
0
0
-
0
1
-
0
-
72
Foram identificados 71 (44,4%) amostras positivas para as bactérias estudadas
(Gráfico 6). Não houve casos positivos para M. pneumoniae e C. pneumoniae.
Gráfico 6: Freqüências de bactérias pesquisadas nas amostras clínicas.
Foram constatados um total de 31 casos de infecção mista envolvendo
bactérias. Desses, apenas dois casos foram positivos exclusivamente para
bactérias: ambos S. aureus com S. pneumoniae. Os demais 23 casos foram de
infecção mista entre bactérias e vírus, assim distribuídos: (i)S. pneumoniae
ocorreu em 19 amostras, sendo 5 com HRV, 3 com VSR, 3 com FluB, 2 com
PIV-1, 2 com PIV-3, 2 com hMPV, 1 com PIV-4 e 1 com EV; (ii) S. aureus em 4
amostras (1 com FluB, 1 com FluA e 2 com FluA H1N1) e; (III) H. influenzae em
1 amostras (com PIV-4). Em 5 amostras foi evidenciado infecção mista com
mais de dois patógenos: FluA/VSR/HiB/Spneu; FluA/VSR/HiB; HRV/PIV3/Spneu; hMPV/Saur/Spneu e VSR/Saur/Spenu; FluA H1N1.
73
6. DISCUSSÃO
74
6. DISCUSSÃO
6.1. Aspectos Gerais do Estudo
Este estudo objetivou a detecção de vírus respiratórios clássicos e emergentes
em casos de doença gripal utilizando a técnica de PCR em tempo real no
formato “multiplex”, cujo espectro de detecção do painel virológico contempla
23 patógenos do trato respiratório, 18 virais e cinco espécies bacterianas ("FTD
Respiratory Pathogens 21 plus").
A detecção com base no kit "FTD Respiratory Pathogens 21 plus" se destaca
tanto a nível nacional quanto internacional, considerando que os estudos mais
recentes descrevem a detecção de vírus respiratórios com base em ensaios
limitados à detecção de oito a 21 patógenos respiratórios, incluindo os
bacterianos (Bellau-Pujol et al., 2005; van de Pol et al., 2006; Li et al., 2007;
Brittain-Long et al., 2008; Brunstein et al., 2008; Wang et al., 2009; BrittainLong et al., 2010; Lassaunière et al., 2010; Renois et al., 2010; Bezerra et al.,
2011; Chen et al., 2011; Raboni et al., 2011; Kodani et al., 2011; Sanghavi et
al., 2012).
A utilização de uma técnica diagnóstica com esse amplo painel de detecção
viral se mostra promissora considerando as diretrizes do Sistema de Vigilância
da Influenza. No Brasil, a rede de laboratórios de referência para vírus
respiratórios é composta de três laboratórios credenciados junto à OMS como
Centros de Referência para influenza e a utilização de uma técnica com
elevada sensibilidade e especificidade, cujo painel de detecção pesquisa
praticamente todos os principais vírus respiratórios humanos, corrobora com as
metas estabelecidas pelo Ministério da Saúde. Portanto, com o ensaio em
tempo real que simultaneamente detecta vários agentes etiológicos é possível
fornecer informações mais precisas para as autoridades competentes a cerca
dos principais vírus respiratórios em circulação na comunidade, e em seguida
planejar políticas de saúde pública com base em dados epidemiológicos como
a sazonalidade dos vírus detectados, distribuição geográfica e grupos de risco.
Outros fatores que ratificam o uso do RT-rtPCR são que estes testes detectam
mais vírus em comparação a técnicas como o isolamento viral ou RIFI (Kim et
75
al., 2009; Murali et al., 2009), além do fato de que o diagnóstico das viroses
respiratórias com base no isolamento viral ou sorologia ora é muito lento ora
apresenta baixa sensibilidade (Gunson et al., 2005). Portanto, ao utilizar RTrtPCR é possível investigar vírus convencionais, que muitas vezes não são
incluídos nos diagnósticos não-moleculares, como o HRV e os vírus recém
descobertos, denominados vírus emergentes, tais como HCoV-NL63, HCoVHKU1, HBoV e hMPV. Algumas das limitações da utilização do RT-rtPCR no
formato “multiplex” é que a técnica depende diretamente da quantidade de
fluorófores disponíveis, fato que determina o número de alvos que podem ser
detectados simultaneamente, além do elevado custo dos kits que apresentam
um amplo painel de detecção viral (Beck et al., 2010).
Todas as normas, procedimentos e estratégias adotadas durante o presente
estudo tiveram como referência as orientações do Sistema de Vigilância de
Influenza
estabelecidas
pelo
Ministério
da
Saúde,
inclusive
a
folha
epidemiológica padronizada.
6.2. Características Demográficas
O critério de inclusão do estudo, conforme anteriormente mencionado,
relacionou todos os pacientes sintomáticos para doença gripal, independente
da faixa etária dos casos. Nota-se, entretanto, que mais da metade (66,7%) da
população que fez parte deste estudo foi de crianças com até nove anos de
idade, sendo 37,6% de zero a dois anos e 29% de três a nove anos. A maior
freqüência de crianças no estudo é conseqüência do fato de que IRA são as
infecções mais comuns neste grupo, ocorrendo três a oito vezes por ano em
lactentes e crianças jovens, com incidência variando inversamente com a idade
(Bryce et al., 2005; Rodrigues et al., 2011). Isso se justifica pelo fato das
crianças serem mais suceptíveis à infecções respiratórias do que os adultos em
função de características anatômicas, fisiológicas e imunológicas (Lanata,
1998).
Outra faixa etária significativa no estudo foi o grupo de indivíduos de 20 a 39,
correspondendo a 23,4 % dos pacientes, que representam principalmente
estudantes jovens e trabalhadores. Em adultos, os vírus respiratórios são os
principais agentes etiológicos de casos de pneumonia adquirida na
76
comunidade (De Roux et al., 2004). Estima-se que um adulto tem em média
duas a quatro doenças respiratórias anualmente (Henrickson et al., 2004). Em
países de clima temperado, pelo menos uma dessas infecções é grave o
bastante para restringir a atividade do indivíduo por aproximadamente três dias
(Monto et al., 1995, 2001), o que se reflete em faltas no trabalho e em
instituições de ensino, e um aumento na demanda por atendimentos em postos
de saúdes.
6.3. Prevalência viral
A freqüência de detecção viral em IRA depende de muitos fatores, tais como
critérios de seleção do paciente, gravidade da doença, época do ano e método
de diagnóstico (Straliotto et al., 2002). Outra questão fundamental para a
detecção de vírus respiratórios é o tipo de espécime clínico coletado (Ahluwalia
et al., 1987; Barnes et al., 1989; Meerhoff et al., 2010). Nesse estudo foi
escolhido o aspirado de secreção de nasofaringe como técnica de coleta.
Apesar de ser desconfortável ao paciente, trata-se de um método com
sensibilidade superior à coleta por meio de “swab” nasal, já que o aspirado
permite a obtenção de grande quantidade de células de descamação do
epitélio de nasofaringe, ideal para a pesquisa de antígenos e de ácidos
nucléicos virais (Heikkinen et al., 2001; Sung et al., 2008; Spyridaki et al.,
2009).
Como já descrito em outros trabalhos, os testes por RIFI podem apresentar
sensibilidade equivalente ao diagnóstico por isolamento de determinados vírus
respiratórios (Siqueira et al., 1986; John et al., 1990). Muitos laboratórios
empregam a RIFI para a detecção de vírus respiratórios, devido à velocidade e
à facilidade no diagnóstico (Straliotto et al., 2002). Além disso, a RIFI permite
uma rápida caracterização dos grupos virais e sub-grupos que circulam na
população, especialmente para os vírus da influenza (Schmidt et al., 1982). Em
nosso trabalho todas as amostras coletadas foram submetidas à técnica de
RIFI utilizando o Respiratory panel 1 Viral Screening & Identification KitTM
(Chemicon Internectional, INC. Temecula, CA) que identifica antígenos virais
de: AdV, Flu A e B, PIV-1, 2 e 3 e VSR. No entanto, das 162 amostras testadas
77
por RIFI, em 11 destas a conclusão do resultado não foi possível devido à
escassez de células fixadas às lâminas.
A taxa de prevalência viral por meio do RIFI foi de 21,2%. Considerando
apenas crianças com até cinco anos de idade, nossa prevalência foi de 18,4%.
Relativamente inferior em comparação com outros estudos baseados nessa
mesma técnica, como Straliotto et al. (2002), cujos resultados descreveram um
taxa de prevalência de 36,6% em crianças menores de cinco anos de idade
com IRA. Seja em pacientes em idade adulta ou infantil, a prevalência viral
encontrada em nosso trabalho está de acordo com estudos que indicam que a
taxa de detecção pode variar de 13 a 45% em crianças com doença
respiratória, ao utilizar técnicas com base em anticorpos fluorescentes e cultivo
celular (Erdman et al., 2003; Syrmis et al., 2004; Bellau-Pujol et al., 2005).
Os vírus influenza foram os vírus respiratórios com maior taxa de detecção por
meio de RIFI (14,5%), sendo detectados 13 espécimes positivos para Flu A e
nove para Flu B. Avaliando apenas os recém nascidos e crianças com até
cinco anos, a prevalência de Flu A/B foi 9,2%. Resultados semelhantes foram
descritos por Costa et al. (2006), que detectaram taxa de prevalência de 9,5%
de Flu A/B por meio de RIFI em crianças com até cinco anos de idade.
O VSR foi o vírus mais freqüentemente encontrado após os vírus influenza por
meio da RIFI (3,7%), entretanto com uma prevalência muito inferior a outros
achados de estudos semelhantes, que foram de 26,2% e 26,4%, ao avaliarem
crianças menores de cinco anos com IRA (Straliotto et al., 2002; Costa et al.,
2006). Vale ressaltar ainda que todos os seis espécimes com fluorescência
positiva para VSR foram de recém nascidos e crianças com até três anos de
idade. Vários autores têm demonstrado que o VSR é o agente etiológico mais
freqüente de infecções respiratórias agudas em crianças menores de cindo
anos de idade (Cintra et al., 2001; Bosso et al., 2003; Moura et al., 2003).
Considerando então apenas crianças com até cinco anos, a prevalência para o
VSR foi de 6% em nosso estudo.
Checon et al. (2002) demonstraram uma maior prevalência de VSR
especialmente em recém nascidos (60%), ao avaliar IRA em crianças menores
de cinco anos, encontrando uma associação significativa entre o diagnósticos
78
de BVA com a infecção por VSR. Conforme já amplamente difundido na
literatura, o VSR é o principal agente etiológico da BVA (Panitch et al., 2001;
Straliotto et al., 2002; Henrickson et al., 2004), sendo esta a infecção mais
comum que acomete o trato respiratório inferior em lactente, evoluindo a partir
de quadros de síndrome gripal (Ngai & Bye, 2002).
Um total de 2,6% de PIV foi encontrada neste estudo, sendo de 1,3% para
cada PIV-1 e PIV-3, enquanto que nenhuma amostra apresentou fluorescência
positiva para PIV-2. De fato, o PIV-2 apresenta as menores taxas de infecção
quando comparado aos PIV-1 e PIV-3, e geralmente está associado a casos de
laringite (Henrickson et al., 2003; Mahony et al., 2008). Um estudo realizado em
Fortaleza, no qual 3070 SNF foram testados por meio de RIFI para traçar o
perfil epidemiológico das parainfluenzaviroses em pacientes de zero a 16 anos
com IRA, uma prevalência relativamente baixa foi descrita para o PIV-1 (0,4%),
PIV-2 (0,1%) e PIV-3 (3,2%) (Fé et al., 2008). Vieira et al. (2001) descreveram
uma prevalência de 0,4% de PIV-3, ao estudarem indivíduos de zero a 15
anos, com infecção do trato respiratório inferior, por meio de RIFI e cultivo
celular. No mesmo estudo, nenhum caso de PIV-1 e PIV-2 foram detectados.
Já Costa et al. (2006) descreveram uma prevalência de 6,3% para as
parainfluenzaviroses, ao estudarem crianças com até cinco anos em casos de
IRA. Nessa mesma faixa faixa etária, nosso estudo encontrou uma prevalência
de 2,2% para PIV-3, e nenhum caso de PIV-1 e PIV-2. A prevalência de PIV-3
na faixa etária infantil está de acordo com outros estudos (Shetty et al., 2003;
Weinberg et al., 2006). De fato a utilização de somente RIFI para a detecção de
PIV contribui para a baixa prevalência do agente viral, uma vez que estudos
com base em cultivo celular e RT-PCR ostentam maiores prevalências (13%)
(Legg et al., 2005; Cabello et al., 2006).
Também não foi identificada nenhuma amostra positiva para AdV por meio da
RIFI. A detecção de antigenos virais é útil para a maioria dos vírus
respiratórios, porém esta metodologia apresenta baixa sensibilidade para o
diagnóstico de AdV (Stroparo et al., 2010). Luiz et al. (2010), ao realizarem a
caracterização molecular de AdV em crianças menores de cinco anos com IRA
em Minas Gerais, descreveram uma prevalência de 3% para o AdV com base
na RIFI. Um estudo anterior, realizado em Curitiba para avaliar a sazonalidade
79
e incidência de vírus em casos de IRA em indivíduos de todas as idades,
descreveu uma prevalência para o AdV de 2,2%, sendo que o método de
detecção utilizada foi a RIFI e cultivo celular (Tsuchiya et al., 2005).
A elevada taxa de amostras negativas encontradas com RIFI (78,8%) foi um
achado relevante em relação à detecção viral. Ao concentrar nosso estudo nos
pacientes com até cinco anos, a taxa de amostras negativas foi ainda maior
(81,6%). Resultado semelhante também foi observado por Tsuchyia (2005) que
relatou 70% de espécimes negativos ao testá-los por meio de RIFI em uma
população com todas as idades. No Brasil, um estudo prospectivo para
determinar a incidência de casos de IRA e identificar os vírus associados a eles
com base na RIFI, realizado com crianças oriundas de uma creche em
Salvador, descreveu 57,2% de amostras negativas (Souza et al., 2003). Esse
elevado número de resultados negativos em pacientes sintomáticos é uma
limitação intrínseca da técnica de RIFI, que além da baixa sensibilidade em
comparação com PCR para determinados agentes virias, como o AdV, não
apresenta anticorpos específicos para os demais vírus respiratórios humanos
(Freymuth et al., 1987).
Utilizando então RT-rtPCR em formato “multiplex” para a detecção de vírus
respiratórios clássicos e emergentes verificamos que a taxa de detecção viral
foi de 43,8%. Esta taxa é semelhante à descrita em um estudo realizado na
Suécia, de 48%, que também investigou pacientes de todas as idades com
IRA, por RT-rtPCR em “multiplex” para detecção de 15 patógenos respiratórios
(Brittain-Long et al., 2008). A análise apenas da faixa etária de zero a cinco
anos revelou uma prevalência em nosso estudo de 53,4% contrastando com os
18,4% encontrado por RIFI nesta mesma faixa etária, ou seja, um aumento
superior a três vezes a capacidade de detecção de RT-rtPCR em relação ao
RIFI.
O uso da metodologia RT-rtPCR em nosso estudo elevou a prevalência viral
total nos espécimes em 22,6% em relação à RIFI para a detecção de vírus
respiratórios, o que era esperado por poder detectar um número maior de
agentes infecciosos virais. Lassaunière et al. (2010), ao comparar a taxa de
detecção viral de um RT-rtPCR “multiplex” com a RIFI, observaram um
80
aumento na detecção de 29,3%. Kuypers et al. (2006) apontaram uma
sensibilidade ainda maior do rtPCR em comparação com a RIFI, de cerca de
40%. van de Pol et al. (2006), comparando o rtPCR com testes diagnósticos
convencionais, como RIFI e isolamento em cultura celular, descreveram um
aumento da taxa de detecção viral de 24% para 43% e de 3,5% para 36%,
respectivamente.
Das amostras positivas pelo RT-rtPCR, 47,9% corresponderam a vírus respiratórios
que não foram testados pelo kit de RIFI utilizado neste estudo, tais como HRV, HCoV,
hMPV, HBoV e EV. Este achado é importante para reforçar o uso de painéis
virológicos que identifiquem múltiplos patógenos causadores IRA, visto que a maior
parte deles não é detectada com base em reações de imunofluorescência. Conforme
Kuypers (2006) ao estudar crianças com idade média de um ano de quatro meses com
IRA, a detecção apenas do hMPV, ausente na RIFI, foi responsável por elevar em
30% a sensibilidade da rtPCR. No presente estudo, considerando crianças menores
de cinco anos, a detecção de somente hMPV aumentou a taxa de prevalência viral de
18,4% por meio da RIFI, para 27,1% com base na detecção por RT-rtPCR. Ao
considerar todas as idades, a detecção do hMPV foi responsável por elevar a
prevalência de 21,2% (RIFI) para 26% (RT-rtPCR). Se ao hMPV acrescentar a
detecção de HRV por RT-rtPCR, ambos ausentes no painel de detecção da RIFI, a
prevalência passa para 38% em crianças com até cinco anos, enquanto que a
prevalência total eleva-se para 33,9%. Isso mostra a importância de ambas as viroses
em aproximadamente 20% na faixa etária pediátrica, e em 12,7% considerando todas
as idades. Excluindo hMPV e HRV e somando-se os outros vírus não detectados por
RIFI e detectados por RT-rtPCR no presente estudo, a prevalência passa para 38,1%
em crianças até cinco anos e a prevalência total para 32,6%. Neste estudo, o RTrtPCR demonstrou então uma sensibilidade consideravelmente superior que a RIFI,
especialmente para a detecção dos agentes virais na faixa etária infantil, com
destaque para a participação do hMPV e HRV como agentes infecciosos do trato
respiratório superior.
No presente estudo foi verificada discordância de resultados entre os dois
métodos de detecção envolvendo amostras positivas para Flu A e Flu B. Das
13 amostras positivas para Flu A por meio da RIFI, nove foram negativas
quando testadas com RT-rtPCR. Das nove amostras positivas para Flu B
através de RIFI, três foram negativas e uma foi positiva para EV ao serem
testadas com o RT-rtPCR. Tal discordância pode ser explicada ao avaliarmos
81
os valores de Ct dos controles internos das amostras negativas no RT-rtPCR.
Das nove amostras negativas para Flu A, apenas duas apresentaram valores
de Ct do controle interno ideais. As demais sete amostras negativas
apresentaram valores de Ct dos seus respectivos controles internos
ligeiramente superiores que o ideal indicado pelo fabricante do kit. Portanto, a
não detecção de ácido nucléico viral, apesar do uso de controle interno, em
casos positivos para antígeno viral sugere que possa ter ocorrido falha durante
a extração das amostras ou, ainda que improvável, deve-se considerar uma
possível degradação de ácido nucléico viral. A análise das amostras
discordantes para Flu B revelou que os valores de Ct dos controles internos
estavam de acordo com o estabelecido pelo kit, portanto, a elucidação desses
resultados conflitantes poderia ser realizada por meio do isolamento dessas
amostras em cultivo celular, ou através da repetição da extração seguida por
nova amplificação.
A cerca dos dois casos de Flu A H1N1 (pdn09), que foram detectados por RTrtPCR e não o foram por RIFI, acredita-se que apesar do kit de RIFI contemplar
anticorpos monoclonais para a detecção do subtipo Flu A H1N1(pdn09), o
mesmo apresenta baixa sensibilidade para o novo subtipo pandêmico de 2009.
Outra hipótese a se considerar é uma possível escassez de células nas
lâminas observadas, comprometendo a visualização da fluorescência, já que
houve também dois casos positivos para Flu A sazonal por RT-rtPCR que não
foram detectados através de RIFI. Constatamos que a maior prevalência, com
base na detecção por meio do RT-rtPCR, foi observada para o Flu (11,1%),
assim como nos resultados com base no RIFI, indicando que o Flu é um
importante agente viral em pacientes com IRA considerando pacientes de
todas as idades, atendidos em unidades básica de saúde. Este resultado está
de acordo com diversos estudos que descreveram este vírus como responsável
por 2 a 24,5% das infecções respiratórias atendidas nas unidades básicas de
saúde na Bahia, Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul e São Paulo, ao utilizarem
diferentes metodologias de detecção viral (Arruda et al., 1991; Nascimento et
al., 1991; Straliotto et al., 2002; Souza et al., 2003; Bellei et al., 2008). BrittainLong et al. (2008), ao estudarem o valor clínico de um RT-rtPCR “multiplex”
para 15 patógenos respiratórios, utilizando a mesma metodologia de extração
82
de ácidos nucléicos descrita em nossa pesquisa, demonstraram também que o
Flu foi o vírus respiratório com maior prevalência (26%) entre os indivíduos
estudados.
Neste estudo, a frequência total de Flu A H1N1 sazonal foi de 9,2% e o subtipo
pandêmico de 2009 foi de 1,2%. Em Curitiba, ao longo dos meses que
marcaram a circulação do Flu A H1N1 (pdn09) no Brasil, foi descrito uma
prevalência de 9% do vírus Flu A sazonal e de 36% para patotipo pandêmico
em pacientes hopitalizados com síndrome gripal (Raboni et al., 2011). Contudo,
sabe-se que a prevalência do Flu A H1N1 (pdn09) ao sul do país ocorreu de
forma singular quando comparada com outras regiões do Brasil. A baixa
prevalência encontrada para o Flu A H1N1 (pdn09) é explicada ao se
considerar que apenas 20% dos espécimes pesquisados no presente estudo
foram coletados em 2009.
Verificou-se que o HRV apresentou a segunda maior freqüência de detecção
por meio do RT-rtPCR, com um total de 13 amostras, o que representa 8% da
população estudada. Estudos a cerca da etiologia viral das infecções
respiratórias demonstram que os HRV são os principais responsáveis pelas
infecções do trato respiratório superior, incluindo resfriados comuns e casos de
otite média aguda (Papadopoulos et al., 2000; Nokso-Koivisto et al., 2002,
2004; Moreira et al., 2011), além de doenças mais graves do trato respiratório
inferior (McMillan et al., 1993; Papadopoulos et al., 2000). Bellei et al. (2008),
ao estudarem adultos com síndrome gripal, identificou que o segundo vírus
mais prevalente foi o HRV. Na ausência de epidemias de influenza, infecções
por HRV representam cerca de 30-50% das doenças respiratórias anualmente
(Heikkinen & Järvinen, 2003).
No presente estudo, foi observado que 80% das amostras positivas para HRV
foram de lactentes e crianças com até nove anos de idade, sendo que para a
faixa etária de zero a cinco anos a prevalência foi de 10,9%. Moreira et al.
(2011), pesquisando crianças atendidas em um ambulatório de uma creche em
São Paulo, detectou uma prevalência para o HRV de 27,5 %, uma prevalência
relativamente superior à nossa uma vez que o estudo foi realizado com uma
população sitiada em local de aglomeração.
83
Em um estudo longitudinal realizado em Salvador-BA, o HRV foi o vírus mais
freqüente (48,3%) em crianças com febre e infecção do trato respiratório
inferior (Souza et al., 2003). Pitres et al. (2005) descreveram o HRV como o
segundo agente mais freqüentemente detectado em secreção nasal de
lactentes hospitalizados com bronquiolite viral aguda. Muito se discute a cerca
do real papel dos HRV nos casos de infecção do trato respiratório inferior,
tendo em vista que a detecção de HRV nesses pacientes poderia ser explicada
pela persistência do vírus nas vias aéreas, sugerindo infecções sucessivas.
Enquanto alguns autores adimitem uma correlação significativa dos HRV com
quadros graves de BVA em lactentes (Papadoupolos et al., 2002), outros
afirmam que mais estudos são necessários para elucidar essa questão, uma
vez que na maior parte dos casos o HRV aparecem em infecções mistas com o
VSR (Pitres et al., 2005, Berezin et al., 2006; Nascimento et al., 2010). De toda
forma, a utilização de metodologias moleculares, como a descrita em nosso
estudo, se mostrou eficaz na detecção das rinoviroses.
Quanto à detecção do VSR, encontramos uma prevalência total de 7,4%. De
forma semelhante, Raboni et al. (2011) descreveram uma prevalência de 8%
para o VSR ao estudarem indivíduos de todas as faixas etárias com IRA por
meio de um RT-rtPCR em “multiplex” para 14 vírus respiratórios. Foi observado
que 83,3% dos casos encontrados de VSR no presente estudo foram
exclusivamente em lactentes e crianças com até cinco anos de idade. Tal
achado está favorecido, pelo menos parcialmente, pelo perfil populacional
deste estudo, que é em sua maioria representada pela faixa etária infantil.
Conforme Jhawar (2003) aproximadamente 80% dos casos de VSR são
detectados no primeiro ano de vida, sendo que estes estão fortemente
associados à BVA. Aos dois anos de idade, praticamente todas as crianças já
foram infectadas por VSR pelo menos uma vez (Maggon et al., 2004). No
Brasil, vários estudos realizados com crianças menores de cinco anos, com
quadro clínico de infecção respiratória do trato inferior, especilamente BVA e
pneumonia, descrevem uma prevalência para o VSR que varia de 29 a 69%
(Cuevas et al., 2003; Bezerra et al., 2011; De Paulis et al., 2011; Salomão et
al., 2011; Bueno et al., 2012).
84
Considerando as viroses emergentes (hMPV, HBoV, HCoV-NL63, HCoV-HKU1
e Flu A H1N1), a prevalência total foi de 8,4%. Destaca-se o fato de que todos
os espécimes positivos foram de crianças com até cinco anos de idade, grupo
este que apresentou uma prevalência ainda maior de 12,9%, o que leva a crer
que esses novos vírus podem ter um importante papel nas faixas etárias mais
jovens. Resultados semelhantes foram descritos por Albuquerque et al. (2009)
ao pesquisarem a circulação no Rio de Janeiro dos vírus respiratórios
emergentes - HMPV, HBoV, Cor-NL63, Cor-HKU1 e dois novos poliomavírus
humanos – constatou uma prevalência de 9,2% em crianças e jovens com até
15 anos de idade entre 2006 e 2007.
A taxa de ocorrência total do HBoV foi de 3,1% e, considerando crianças com
até cinco anos, a taxa foi de 5,4%. A frequência de infecção por HBoV foi
descrita em taxas que variaram de 3% a 19% em crianças com IRA (Lu et al.,
2006; García-García et al., 2008; Kim et al., 2011; Pilger et al., 2011; ProençaModena et al., 2011). Neste sentido, Manning et al. (2006) descreveram
prevalência de 8,2% para HboV em crianças em idade pré-escolar, enquanto
que Pilger et al. (2011) detectaram taxas de 13,2% para o HBoV ao
investigaram estes vírus em lactentes com até um ano de vida admitidos na
sala de emergência pediátrica com suspeita de ITR inferior em Porto AlegreRS. Recentemente em Pernambuco, foi descrito uma significativa associação
do HBoV com quadros asmáticos em crianças menores de cinco anos com IRA
(Bezerra et al., 2011). De fato, Lüsebrink et al. (2009) descreveram em seu
artigo de revisão que a maioria das infecções primárias por HBoV ocorre em
crianças com menos de dois anos, apesar de também ocorrer em crianças
mais velhas. Em nosso estudo, todas as amostras positivas para HBoV foram
de lactentes com até dois anos de idade, o que mais uma vez reforça a maior
freqüência da infecção na população infantil. Entretanto, a sua patogenicidade
não está bem definida visto que outros vírus tem sido detectados em infecções
mistas com o HboV (Longtin et al., 2008).
hMPV foi encontrado neste estudo em uma prevalência total de 3,1% ou de
4,3% considerando apenas a faixa etária de zero a cinco anos. Este resultado
está de acordo com outras pesquisas que indicam que a prevalência pode
variar de 3,9-12% em crianças com IRA (Peiris et al., 2003; Galiano et al.,
85
2004; Williams et al., 2004; Manoha et al., 2007). Um estudo realizado também
em Vitória, verificou uma taxa de prevalência de 13,8% de hMPV em amostras
de crianças menores de um ano com diagnóstico clínico de BVA, sendo o
segundo agente mais importante na BVA após o VSR (Sant’Ana, 2007).
Foi detectada uma prevalência de 1,2% para os novos vírus HCoV-NL63 e
HCoV-HKU1, considerando a faixa etária até cinco anos. Na mesma faixa
etária, a prevalência dos quatro HCoV juntos foi de 4,4%. Não há, até o
momento, estudos que relatam a circulação dos HCoV clássicos e emergentes
em pacientes com IRA no Estado do Espírito Santo. Sabe-se que o subtipo NL63 causa doença respiratórias em crianças, idosos e imunodeficientes, com
uma prevalência variando de 1 a 9,3% em pacientes mais jovens (Fielding et
al., 2011), enquanto que estudos de prevalência do subtipo HKU-1 indicam
uma taxa de detecção de 2% a 5% em pacientes hospitalizadas com infecção
respiratória aguda (Woo et al., 2005; Vabret et al., 2006; Talbot et al., 2009).
Resultado semelhante ao descrito no presente estudo foi encontrado por
Bezerra et al. (2011) que identificaram uma prevalência de 3,2% para os HCoV
(HCoV-OC43, HCoV-HKU1, HCoV-229E e HCoV-NL63) ao estudarem crianças
com até cinco anos em Recife-PE, diagnósticadas com IRA. Os HCoV-NL63 e
HCoV-HKU1 foram também descritos por um estudo no Rio de Janeiro , com
prevalência de 0,96% (Albuquerque et al., 2009). Uma pesquisa retrospectiva,
realizada em São Paulo com espécimes coletados de crianças com até 15
anos, revelou uma prevalência de 3,6% para o HCoV-HKU1, sendo que
nenhum outro coronavírus foi encontrado (Goes et al., 2011). Em São Paulo,
em um caso fatal de paciente adulto internado com suspeita de Flu A H1N1
pandêmico, foi confirmada a infecção por HCoV-NL63 (Cabeça et al., 2012).
Esses achados confirmam a distribuição desses novos coronavírus, pelo
menos na região sudeste do país.
Os demais vírus clássicos detectados (AdV, EV, PIV, HCoV-OC43),
encontrados em uma prevalência total de 9,9%, representaram 20% das
amostras positivas. O AdV foi a virose respiratória que menos contribui para a
prevalência desse grupo, uma vez que somente um caso foi detectado (0,6%).
Dessa forma, pouco se sabe ainda sobre a epidemiologia do AdV nos estado
do Espírito Santo, apesar do uso de uma técnica de elevada sensibilidade
86
como o RT-rtPCR, o que sugere uma baixa circulação do vírus na capital
capixaba.
Foram detectados dois casos positivos para EV. Apesar da baixa prevalência
na população estudada (1,2%), trata-se da primeira descrição de EV no
município de Vitória, em indivíduos com IRA. No Brasil, são mais comuns
estudos que descrevem a prevalência de EV em pacientes com meningite
(Lamarão et al., 2005; Gomes et al., 2007). Portes et al. (1998), em um estudo
longitudinal realizado no Rio de Janeiro, que isolou 45 EV de indivíduos com
IRA do trato superior ou do trato inferior, descreveram que a prevalência das
enteroviroses se revelou inferior à frequência dos casos positivos para Flu, AdV
e VSR. Achado esse que é parcialmente semelhante ao encontrado neste
estudo, exceto pelo AdV. Mais recentemente, em uma pesquisa prospectiva
realizada em São Paulo, com pacientes adultos diagnosticados com IRA, foi
descrita uma prevalência compatível com a encontrada no presente estudo de
1,9% para EV (Bellei et al., 2008).
Embora a infecção por HCoV- OC43 seja associada a doenças respiratórias
mais brandas, há relatos de IRA mais graves, como bronquiolite e pneumonia,
o que apoia a necessidade de métodos rápidos e confiáveis para a detecção
destas coronaviroses (Vabret et al., 2003). Vijgen et al. (2005) descreveu uma
prevalência de 3,1% para o HCoV-OC43, ao estudar pacientes hospitalizados
com IRA de todas as idades. Tal achado é compatível com a prevalência de
HCoV-OC43 encontrada em nosso estudo de 1,9%, a qual também está de
acordo com Bellei (2008), que identificou uma frequência de 2,3% de HCoVOC43 em suas amostras.
As PIV apresentaram uma prevalência total de 6,2% por meio do Rt-rtPCR. Em
Minas Gerais, Costa et al. (2006) descreveram uma prevalência para as PIV de
6,3% ao estudarem crianças com IRA. No presente estudo, considerando a
faixa etária de zero a cinco anos, a prevalência de PIV foi ainda maior (7,7%).
As PIV muitas vezes são substimadas como agentes atiológicos em casos de
IRA na faixa etária infantil, porém representam a segunda causa mais comum
de infecções respiratórias em crianças após RSV (Henrickson et al., 2003).
Como já era esperado, a PIV-3 foi a parainfluenzavirose mais frequente, com
87
prevalência de 2,5%, seguida da PIV-1 (1,9%), PIV-4 (1,2%) e PIV-2 (0,6%).
Os PIV estão relacionados com todos os tipos de doenças do trato respiratório
inferior e superior, sendo que a maioria das doenças sintomáticas é causada
por PIV-3 e 1, e em menores taxas pelo PIV-2 e PIV-4 (Weinberg et al., 2006).
Uma frequência inferior a nossa foi descrita por Bellei et al. (2008) para PIV-1,
PIV-2 e PIV-3 de 0,2%, 0,2% e 0,5%, respectivamente. É importante ressaltar
que até o momento este é o primeiro estudo a descrever amostras positivas
para PIV-4 em casos de IRA no Brasil.
Apesar da cepa HCoV-229E ser geralmente encontrada em crianças e idosos
com quadro de resfriado comum (Talbot et al., 2009), nenhuma amostra foi
positiva em nosso estudo. Embora o HPeV seja frequentemente isolado de
pacientes com IRA (Nix et al., 2008), não houve amostras positivas no presente
estudo.
6.4. Sazonalidade
As taxas de detecção viral não foram igualmente distribuídas ao longo do
período do estudo. Tomando como referência as coletas realizadas ao longo de
2008, observa-se que a maior concentração das amostras ocorreu nos meses
de março, abril e maio de 2008, totalizando 45 amostras (27,7%). Ao analisar a
prevalência viral nesses meses, que marcam o final do verão e início do outono
no país, foi possível constatar que o vírus mais frequente foi o VSR, encontrado
em nove amostras, o que representa 75% das amostras positivas para o VSR
em nosso estudo. Nossos achados estão de acordo com Checon et al. (2002),
que ao pesquisarem a sazonalidade do VSR em crianças com até 5 anos de
idade no município de Vitória-ES, constataram que 88,5% dos casos de VSR
se concentraram nos meses de fevereiro, março e abril. Em centros urbanos, a
maior parte das infecções por VSR geralmente ocorre durante o final do
outono, primavera, com picos no inverno, dependendo do tipo de clima (Collins,
2007). Em locais de clima tropical e sub-tropical a maior prevalência do VRS
está ligada ao meses mais chuvosos (Chew et al., 1998; Weber et al., 1998;
Simoes, 1999; Shek & Lee, 2003; Costa et al., 2006; Bellei et al., 2008; Bezerra
et al., 2011). Em outro estudo também realizado no município de Vitória,
San’Ana et al. (2007) detectaram o VSR ao longo de todo o ano, porém com
88
picos de ocorrência nos meses de março de 2004 e maio e junho de 2005,
coincidindo com meses de elevados índices pluviométricos na região. Também
foi observado nesse mesmo estudo que o hMPV apresentou distribuição
temporal que se sobrepôs à do VRS, com um discreto aumento na freqüência a
medida que se reduzia o número de casos de VRS. Outros estudos indicam
que a distribuição do hMPV pode se apresentar mais estendida e
acompanhando os picos de ocorrência de VSR (Boivin et al., 2003; Mackay et
al., 2006; Rafiefard et al., 2008).
Controversamente, em nosso estudo nenhum caso de hMPV foi detectado nos
meses de maior ocorrência de VRS. Entretanto, a prevalência do hMPV ao
longo do ano de 2008 foi maior no último trimestre do ano, sendo que de
outubro a dezembro foram detectados quatro casos de hMPV (80%). Em
climas temperados, a maior parte das infecções por hMPV ocorrem entre
dezembro e fevereiro (outono/inverno) (Maggi et al., 2003; van de Hoogen et
al., 2003), enquanto que em regiões subtropicais, os maiores picos de
incidência são observados durante a primavera e verão (Peiris et al., 2003). No
mesmo período apenas um caso de VSR foi detectado no presente estudo,
sugerindo mais uma vez o aumento da freqüência das metapneumoviroses à
medida que decai os números de casos positivos para VSR, tal como foi
destacado por Sant’Ana et al. (2007). Outros meses que apresentaram picos
de ocorrência de casos de doença gripal em 2008 foram agosto, outubro e
dezembro, onde as demais viroses se apresentaram de forma endêmica ao
longo do ano.
É importante destacar que os únicos dois casos de Flu A H1N1 (pdn09) foram
detectados em agosto de 2009. Outras pesquisas realizadas no Brasil que
identificaram o Flu A H1N1 (pdn09) ao longo do mesmo ano (Watanabe et al.,
2011; Raboni et al., 2011). O primeiro caso confirmado do subtipo pandêmico
de Flu A de 2009, surgiu em abril e rapidamente se espalhou pelo mundo. No
Brasil, o primeira descrição ocorreu na 27° epidemi ológica (maio de 2009), com
pico de incidência em junho e uma redução de 99% em dezembro (Ministério
da Saúde, 2009).
89
Em Vitória, ao analisar o padrão sazonal das influenzaviroses, constatou-se
que 83% dos casos positivos para Flu A sazonal se concentraram no início do
outono, enquanto que 80% das amostras positivas para Flu B foram coletadas
entre o final do inverno e meados da primavera, durante o ano de 2008, o que
sugere que as influenzaviroses A e B co-circularam durante 2008, porém de
forma alternada. Conforme Neto et al. (2003), as doenças respiratórias
causadas pelos vírus da influenza atingem pico máximo no inverno, inclusive
no Brasil, mas também podem ser observadas durante todo o ano, indicando
circulação constante.
Em países de clima temperado, as infecções por HRV ocorrem durante todo o
ano, com picos no início do outono e fim da primavera. Já nos países do
hemisfério sul com clima tropical, a maior incidência de rinoviroses ocorre nos
meses mais frios (Couceiro & Albuquerque, 2008). Neste estudo, observou-se
que 92,3% das rinoviroses foram distribuídas ao longo dos meses mais frios do
ano , entre abril a agosto de 2008, sendo que mais da metado dos casos (62%)
ocorreram durante o inverno. Achado semelhante foi descrito por Bellei et al.
(2008), que indicou uma maior prevalência de rinoviroses nos meses do outono
ao longo de 2001 e 2003. Em Curitiba, também foi destacada a maior
circulação de HRV no inverno (Tsuchiya et al., 2005; Raboni et al., 2011).
A análise das sazonalidades do HBoV bem como das PIV 1-4, também indicou
um maior frequência de detecção entre o outono e inverno de 2008. E pelo
menos uma coronavirose foi detectada ao longo de cada estação do ano em
2008, sugerindo que a sazonalidade de HCoV ocorre de maneira constante no
município de Vitória, entretanto, um estudo longitudinal com maior número de
amostra seria necessário para esclarecer a sazonalidade das coronaviroses na
região.
6.5. Infecções virais mistas
Neste estudo, observou-se apenas seis casos de infecção mista envolvendo
exclusivamente vírus respiratórios, com uma prevalência relativamente baixa
(3,7%). Outros estudos, com base em rtPCR, descreveram taxas que variaram
de 5 a 10% independente da faixa etária dos pacientes (Wallace et al., 2004;
Laguna-Torres et al., 2009). Sanghavi et al. (2012) descreveram uma taxa de
90
infecção mista de 10,4% ao avaliar pacientes adultos e crianças com IRA por
meio de RT-rtPCR para a detecção de 11 vírus respiratórios, sendo que o
agente viral mais comum entre elas foi o VSR.
No presente estudo, considerando apenas crianças menores de cinco anos, a
prevalência de infecções mistas foi de 6,5%, sendo que o vírus mais freqüente
nessas co-detecções também foi o VSR. Greensill et al. (2003), ao avaliar
crianças internadas com bronquiolite causada por VSR, descreveram que 70%
dos casos era de infecção mista com hMPV, sugerindo uma maior gravidade
nesses casos uma vez que esses pacientes estavam sob ventilação mecânica.
Contraditoriamente, uma menor gravidade em casos de co-infecção por RSV e
hMPV em crianças hospitalizadas foi descrita, uma vez que os pacientes que
apresentavam monoinfecção por VSR prolongaram o período de internação e
apresentaram quadros mais graves de hipóxia (Canducci et al., 2008). Em
nosso estudo, não foram detectados nenhum casos de infecção mista
envolvendo o VSR e o hMPV.
Apesar da detecção comum do VSR nas infecções mistas, achados recentes
revelam que a gravidade da doença na monoinfecção ou infecção mista com
VSR é a mesma. De Paulis et al. (2011), em estudo realizado em São Paulo,
apontaram uma taxa de infecção mista com VSR de 31% em crianças
hospitalizadas com até dois anos de idade. Bezerra et al. (2011) descreveram
uma taxa de co-detecção de 39,6% em crianças menores de cinco anos com
IRA, sendo VSR e também AdV, HBoV e HRV os vírus mais comuns.
Deve-se ter em mente que vírus respiratórios detectados por ensaios altamente
sensíveis podem refletir infecção assintomática em vez de ser a causa da
doença presente, principalmente em casos de infecção viral mista. Até certo
ponto, a probabilidade de que um patógeno seja o agente etiológico deve ser
relacionada com o valor de Ct da reação, considerando que menores valores
de Ct sugerem maior probabilidade de que o agente detectado seja o causador
da doença (Brittain-Long et al., 2008).
91
7. CONCLUSÕES
92
7. CONCLUSÕES
•
Este estudo afirma o relevante papel da técnica RT-rtPCR no formato
multiplex,
no
diagnóstico
de
vírus
respiratórios,
com
aumento
significativo de detecção quando comparado com os resultados obtidos
com a técnica de imunofluorescência indireta.
•
Foi verificada a circulação de vírus emergentes em pacientes com
infecção do trato respiratório superior, a saber: Flu A H1N1 pandêmico,
hMPV, HBoV, HCoV-NL63, e HCoV-HKU1.
•
Com base da detecção por RT-rtPCR, o vírus influenza foi o agente
infeccioso mais prevalente nos casos de IRA (11,1%), ratificando o seu
papel importante nos casos de infecção respiratória aguda do trato
superior.
•
O HRV e VSR foram os 2° e 3° agentes virais mais detectados por meio
do RT-rtPCR, respectivamente, sendo que a maior parte dos espécimes
clínicos positivos de ambos os vírus ocorreram na faixa etária pediátrica.
•
Quanto às infecções mistas, o VSR foi o vírus mais encontrado em
associações a outros agentes virais.
•
Quanto à sazonalidade, no ano de 2008, foi verificada uma maior
ocorrência de coleta de amostras de pacientes com infecções
respiratórias agudas do trato superior, durante os meses que marcam o
outono na região, sendo que o principal agente etiológico detectado
nesse período foi o VSR, semelhante a estudos anteriores realizados no
município de Vitória-ES.
93
9. REFERÊNCIAS
94
9. REFERÊNCIAS
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10. ANEXOS
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10. ANEXOS
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