estudo do efeito de ligantes de tlrs em diferentes estágios
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ESTUDO DO EFEITO DE LIGANTES DE TLRS EM DIFERENTES ESTÁGIOS DA ONTOGENIA E DO DESENVOLVIMENTO DOS LINFÓCITOS B. Bárbara José Antunes Baptista Rio de Janeiro 2009 BÁRBARA JOSÉ ANTUNES BAPTISTA Aluna do curso de Biotecnologia Matrícula 0613800170 ESTUDO DO EFEITO DE LIGANTES DE TLRS EM DIFERENTES ESTÁGIOS DA ONTOGENIA E DO DESENVOLVIMENTO DOS LINFÓCITOS B. Trabalho de Conclusão de Curso, apresentado ao curso de graduação em Biotecnologia, da UEZO como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Tecnólogo em Biotecnologia sobre a orientação da Dr. ElizeAyumi Hayashi. Rio de Janeiro Julho de 2009 ii Baptista, Bárbara José Antunes Estudo do efeito de ligantes de TLRs em diferentes estágios da ontogenia e do desenvolvimento dos linfócitos B. Bárbara José Antunes Baptista, Rio de Janeiro, 2009. Trabalho de Conclusão de Curso – UFRJ/ Instituto de Microbiologia: Prof. Paulo de Góes, 2009. Orientadora: Elize Ayumi Hayashi Co-Orientador: Alberto Félix Antônio da Nóbrega 1. Visão das diferenças fenotípicas entre as subpopulações de linfócitos B de precursores purificados de medula óssea de camundongos jovens, adultos e idosos. 2. diferenças dos linfócitos gerados in vitro na resposta ao LPS ao longo da ontogenia. Trabalho de Conclusão de Curso. I. Elize Ayumi Hayashi. II. Universidade Federal do Rio de Janeioro, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes. Estudo do efeito de ligantes de TLRs em diferentes estágios da ontogenia e do desenvolvimento dos linfócitos B. iii Estudo do efeito de ligantes de TLRs em diferentes estágios da ontogenia e do desenvolvimento dos linfócitos B. Elaborado por Bárbara José Antunes Baptista Aluna do curso de Biotecnologia da UEZO Este trabalho de Graduação foi assinado e aprovado com Grau: 10,0 Rio de Janeiro, 30 de julho de 2009. ________________________________________ Maria de Fátima Sarro da Silva, pós – doutorado. ________________________________________ Sérgio Henrique Seabra, pós – doutorado. ________________________________________ Elize Ayumi Hayashi, pós – doutorado. RIO DE JANEIRO, RJ – BRASIL. JULHO DE 2009 iv AGRADECIMENTOS • A Deus, pela sua amizade que me sustentou em toda a minha vida, por ter me dado forças para não desanimar e desistir nos momentos de dificuldades. • A minha mãe, Odiléa José Antunes, por ter me dado todo o incentivo e apoio durante toda a sua vida. • A minha orientadora, Elize Ayumi Hayashi, por ter me ajudado a concluir este trabalho, pelo acolhimento no laboratório, por toda a paciência em me ensinar, por acreditar em mim, por não me deixar desistir nos momentos de desespero. • Ao meu co-orientador Alberto Félix Antônio da Nóbrega, por ter me acolhido no laboratório, por ter contribuído diretamente com idéias para o meu trabalho de conclusão de curso, por todo o apoio e ajuda me dedicada. • A Profa Maria Bellio, pelos ensinamentos nos seminários, por toda a contribuição nos experimentos. • Aos amigos de laboratório: Alessandra, Roberta, Marcio, Obrigada por toda a ajuda no laboratório. • A banca examinadora desta monografia: Maria de Fátima Sarro, Sérgio Henrique Seabra Filho, Elize Ayumi Hayashi, por toda a disponibilidade e compreensão. v RESUMO Os linfócitos B, células da imunidade adaptativa, reconhecem de forma específica uma gama de antígenos, conferindo ao sistema imune característica de especificidade. Os receptores das células B (BCR), assim como receptores tipo Toll, desempenham um importante papel no desenvolvimento dessas células. Trabalhos prévios evidenciaram que o LPS é capaz de estimular a maturação de linfócitos B. Neste trabalho, foi analisado se essa resposta dos linfócitos B ao LPS se altera ao longo da ontogenia, utilizando um sistema de diferenciação in vitro a partir de precursores purificados de camundongos de diferentes idades. Nossas análises foram realizadas com a utilização de um citômetro de fluxo, para a identifição de marcadores de linhagem e de maturação. Observamos que as células de animais jovens são em geral mais responsivas ao LPS como estímulo de maturação se comparados a animais idosos. Mostramos evidências de que esse fenômeno não é devido a defeitos intrínsecos da linhagem B, mas sim, à presença de porcentagens pequenas de células que não pertencem à linhagem B, que tem efeito inibitório na maturação. Esses resultados sugerem que estudos da ontogenia dos linfócitos B são importantes para melhor compreensão da fisiologia dessas células e possíveis causas de falhas em suas funções. vi ABSTRACT B lymphocytes, cells of adaptive immunity, recognize a range of specific antigens, giving the immune system characteristic of specificity. The B cell receptor (BCR) and Toll type receptors, play an important role in the development of these cells. Previous studies showed that LPS is able to stimulate the maturation of lymphocytes B. In this work, it was examined whether the response of B lymphocytes to LPS changes throughout ontogeny, using a system of differentiation in vitro of precursors purified from mice of different ages. Our tests were performed using flow cytometry to identify markers of lineage and maturation. We observed that cells from young animals are generally more responsive to LPS as a maturation stimulus when compared to older animals. We show evidence that this phenomenon is not due to intrinsic defects of B lineage, but the presence of small percentages of cells that do not belong to the B lineage, which has an inhibitory effect on maturation. These results suggest that studies of the ontogeny of B lymphocytes are important for better understanding of the physiology of these cells and possible causes of failure in their function. vii SUMÁRIO RESUMO.................................................................................................................... PÁG. VI ABSTRACT .................................................................................................... ......... PÁG. VII 1 - INTRODUÇÃO ....................................................................................................... PÁG. 1 1.1 - Desenvolvimento dos Linfócitos B .................................................................. PÁG. 1 1.2 - Subtipos de Células B a partir da diferenciação dos progenitores. ................... PÁG. 3 1.3 - Diferenciação In Vitro do Linfócito B .............................................................. PÁG. 4 1.4 - Papel da Enzima Rag no Desenvolvimento dos Linfócitos B........................... PÁG. 5 1.5 - Receptores semelhantes a Toll (TLRs) ............................................................. PÁG. 6 1.6 - O sistema imunológico ao longo da ontogenia. ................................................ PÁG. 8 2 - OBJETIVO ........................................................................................................... PÁG. 11 2.1 - Objetivos Específicos: .................................................................................... PÁG. 11 3 - METODOLOGIA ................................................................................................ PÁG. 12 3.1 - Obtenção de células totais da medula óssea ................................................... PÁG. 12 3.2 - Contagem Celular........................................................................................... PÁG. 12 3.3 - Análise da purificação e comparação das células dos camundongos............. PÁG. 12 3.4 - Seleção das células precursoras de linhagem B (B220 + IgM-) .................... PÁG. 12 3.5 - Cultura de diferenciação de precursores de células B ................................... PÁG. 13 3.6 - Análise de células por Citometria de Fluxo (FACS) ...................................... PÁG. 13 viii 4 - RESULTADOS ...................................................................................................... PÁG. 15 4.1 - Caracterização da linhagem B e análise da purificação dos precursores de medula óssea em animais de diferentes idades. ........................................................................ PÁG. 15 4.2 - Estudo da maturação das células de linhagem B in vitro ................................ PÁG. 16 4.3 - Diferenciação das células B in vitro em resposta ao LPS em camundongos de diferentes idades. .......................................................................................................... PÁG. 18 4.4 - Menor resposta de células B in Vitro ao LPS não corresponde totalmente com avanço na idade do animal............................................................................................ PÁG. 21 4.5 - Presença de células que não pertencem à linhagem B inibe a diferenciação dos precursores B In Vitro. ................................................................................................. PÁG. 22 5 - DISCUSSÃO .......................................................................................................... PÁG. 25 6 - CONCLUSÃO ....................................................................................................... PÁG. 28 7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... PÁG. 29 ix LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS BCR Receptor de Células B CDR Regiões Determinantes de Complementaridade CLP Progenitores Linfóides Comum EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra-acético HSA Antígeno Estável ao Calor HSCs Células-tronco Hematopoéticas IFN Interferon Ig Imunoglobulina IL-4 Interleucina 4 IL-7 Interleucina 7 LPS Lipopolissacarídeo PAMPs Padrão Molecular Associado a Patógeno PBS Tampão Fosfato de Sódio Pré-BCR Receptor de Células Pre-B PI Iodeto de Propídeo RAG Genes Ativantes de Recombinação SCF Fator de Célula-tronco SL Cadeia Leve Substituta TdT Terminal Deoxinucleotidil Transferase TLRS Receptor tipo Toll TNF-α Fator de Necrose Tumoral Alfa x LISTA DE FIGURA Figura 1............................................................................................................. PÁG. 16 Figura 2............................................................................................................. PÁG. 18 Figura 3............................................................................................................. PÁG. 20 Figura 4............................................................................................................. PÁG. 21 Figura 5............................................................................................................. PÁG. 22 Figura 6............................................................................................................. PÁG. 24 Figura 7............................................................................................................. PÁG. 25 xi 1 - INTRODUÇÃO O estudo da ontogenia em relação a produção das células de linhagem B é importante para a compreensão de mecanismos pelos quais ocorrem diferenças significativas da resposta do sistema imune adquirido ao longo do desenvolvimento e envelhecimento do organismo. O repertório de linfócitos B, com sua capacidade de resposta a infinita quantidade de antígenos externos e de auto-antígenos são também são alvo de estudo de doenças auto-imunes, o que torna essas células foco de muitos estudos atualmente. Serão introduzidos alguns temas, a fim de maior compreensão sobre o a formação da linhagem de células B e da complexidade dos mecanismos envolvidos nesse processo. 1.1 - DESENVOLVIMENTO DOS LINFÓCITOS B As células-tronco hematopoéticas (HSCs) dão origem às células sangüíneas. Tais células se originam, após o nascimento, na medula óssea. Dentre os vários progenitores de linhagens da medula óssea, estão os progenitores linfóides comum (CLPs), que originam as células B e T (ABBAS et al., 2008). As células B ou linfócitos B, juntamente com os linfócitos T, são responsáveis pela Imunidade Adquirida ou Adaptativa, resposta desenvolvida após infecção a fim de eliminála, a qual é capaz de ser altamente específica em distinguir diferentes moléculas (diferentes antígenos), mesmo aquelas que apresentem grandes semelhanças, além de possuir Memória Imunológia, ou seja, ser capaz de se “lembrar” e dessa forma aumentar a resposta a infecções posteriores por um mesmo microrganismo (ABBAS et al., 2008). Os linfócitos B são as únicas células que produzem anticorpos – moléculas cuja função é neutralização do microrganismo, promover fagocitose e a ativação do Sistema Complemento. Até chegar ao estágio de secretar anticorpos, os linfócitos B passam por várias etapas de diferenciação ou estágios de amadurecimento (ABBAS et al., 2008). As etapas de diferenciação dos linfócitos B podem ser definidas pelo: (I) rearranjo dos genes de cadeia pesada e leve da Imunoglobulina; (II) As enzimas que atuam na recombinação e os marcadores de superfícies; (III) A fase do ciclo celular em que a célula se encontra; (IV) A capacidade de responder a estímulos como determinadas citocinas, mitógenos e antígenos (HAYASHI et al., 2005). 1 O rearranjo e a expressão dos genes das Imunoglobulinas (Ig), proteínas formadoras dos receptores dos linfócitos B e/ou dos anticorpos, são os dois eventos principais que ocorrem no processo de amadurecimento dos linfócitos B. A sobrevivência dessas células no organismo dependerá da funcionalidade do seu receptor. Na medula óssea as primeiras células do estágio do desenvolvimento da linhagem B são pré-progenitoras de células B (pré-pro-B). Essa subpopulação não apresenta HSA (Heat Stable Antigen) e BP-1, na presença do estímulo IL-7, adquirem o fenótipo B220+, CD19+, CD43+,CD10+, c-kit+ e passam a ser denominadas células progenitoras de B (proB), já expressam Igα e Igβ – proteínas transmembranas - que fazem parte do receptor de célula B (BCR) e proteínas Vpre e λ5, que formam a cadeia leve substituta, SL (Surrogate light chain) (HAYASHI et al., 2005). Na presença de células estromais, de IL-7 e expressão dos genes ativadores de recombinação 1 e 2 (RAG-1 e RAG-2), ocorre o prosseguimento para o estágio de célula B-I (pré B-I), que possui fenótipo idêntico as das células pro-B, sendo distinguidas apenas por apresentarem rearranjo de alguns genes do BCR, havido rearranjo produtivo (in frame), segue-se para o estágio pré-BII, realiza rearranjo gênico a formar cadeia µ completa do BCR (MELCHERS & ROLINK, 1999). As células pré-BII caracterizam-se por serem fenotipicamente c-kit-, CD43-, CD25+ (MELCHERS & ROLINK, 1999; ROLINK et al., 1994), expressam também o receptor pré – antigênico (pré – BCR) formado pela cadeia µ e cadeia leve substituta. O pré – BCR fornece sinais para a sobrevivência e proliferação das células para continuação do desenvolvimento. Na ausência do receptor de célula pré-B (pré – BCR) as células sofrem morte programada (ABBAS et al., 2008). A cadeia leve devidamente rearranjada, junto com a cadeia µ e os componentes Igα e Igβ do receptor dão origem ao receptor de células B (BCR), nesse estágio as células B são denominadas Células B imaturas, que ainda expressam o marcador AA4 (ROLINK, ANDERSSON & MELCHERS, 1998). A formação e a funcionalidade de tais receptores no conhecimento de auto-antígenos são cruciais para que a célula continue seu desenvolvimento, uma vez que ocorre reconhecimento ávido de auto-antígeno as células podem ser eliminadas ou levadas a alterar seu receptor. Na medula óssea as células B imaturas podem ser divididas em dois grupos: (I) células B imaturas, caracterizadas fenotipicamente com B220low, IgMlow, IgD-; (II) células B de transição, caracterizadas fenotipicamente com B220intern, igMhigh, IgDlow (CARSETTI et al., 1995). 2 As células B imaturas deixam à medula óssea via artéria central e vão para o baço, único órgão periférico que abriga células B imaturas (JANEWAY, TRAVERS et al., 2002). Dessas células imaturas somente 30 a 50% conseguem sobreviver durante algumas semanas (ALLMAN et al., 1993; ROLINK, ANDERSSON & MELCHERS, 1998). Essas células no baço são denominadas células B de transição e são subdivididas em 3 grupos: (I) T1, com fenótipo B220interm, CD21low, CD23low, IgMhigh,IgDlow; (II) T2, com fenótipo B220high, Cd21interm/high, CD23+, IgMhigh, IgDhigh ( Lorder et al., 1999); (III) T3, com fenótipo CD23+, IgMlow e que ainda expressam AA4.1 (ALLMAN et al., 2001). No baço as células B completam seu amadurecimento e são capazes de responder a antígenos estranhos, se tornando linfócitos efetores, células secretoras de anticorpos, denominadas plasmócitos. 1.2 - SUBTIPOS DE CÉLULAS B A PARTIR DA DIFERENCIAÇÃO DOS PROGENITORES. Na medula óssea as células tronco hematopoéticas dão origem a maior parte das células B, denominadas células B-2. Essas passam por uma série de seqüências, como síntese de proteínas, receptores os quais exigidos para muitas transformações e se comprometem com o desenvolvimento da linhagem de células B da Zona marginal e células B Foliculares (ABBAS et al., 2008). As células B foliculares formam a maior parte das células B chamadas de maduras, já que apresentam co-expressão de receptores IgM e IgD de membrana e habilidade de circular. As células B foliculares são também denominadas células B circulantes, uma vez que migram de um órgão linfóide para o outro e residem em compartimentos especializados conhecidos como folículos de células B. O BAFF um ligante trófico da família de citocinas de necrose tumoral (TNF) mantêm, em parte, as células B nesses compartimentos (ABBAS et al., 2008). As células B da zona marginal localizadas próximo ao seio marginal do baço, expressam IgM e marcador de superfície CD21. Essas células parecem mediar resposta imunológica dependentes de células T, apesar de mediarem geralmente resposta imunológicas a antígenos circulantes independente de T, além de se diferenciarem em plasmócitos secretores de IgM de vida curta (ABBAS et al., 2008). 3 Outro subtipo de células B são as células B-1 desenvolvidas a partir de célulastronco hematopoéticas no fígado fetal. No adulto são encontradas como população autorenovavéis de células B-1 em peritônio e mucosas. As células B-1 apresentam um repertório de diversidade menor em relação as células B convencionais. Essas células são fontes de rápida produção de anticorpos contra microrganismos no peritônio e análogas às células T γδ, pois possuem um repertório limitado de receptores de antígenos e acredita-se que a resposta imunológica inicial ocorra de forma parecida em ambas (ABBAS et al., 2008). 1.3 - DIFERENCIAÇÃO IN VITRO DO LINFÓCITO B A diferenciação de células B In Vitro, geralmente, utiliza-se células estromais da linhagem S17 e ST2 obtidas através da clonagem dessas células em culturas de células de medula e de fígado fetal respectivamente, alem da citocina IL-7 (NAMEN et al., 1988; CUMANO et al., 1990; HARDY et al., 1991; ROLINK et al., 1991), que pode ser fornecida pelas células estromais ou purificada de sobrenadante de células transfectadas com o DNA recombinante contendo o gene para a IL-7 (NAMEN et al., 1988). A citocina IL-7 é uma glicoproteina de 25 kDa , que tem o papel de potencializar o crescimento dos precursores linfóides através da ligação com o receptor de IL-7 presente nas células na fase pro-B, pre-B-I e no início da fase pre-B-II, estimula a proliferação celular nesses estágios in vivo. Condições em que IL-7 se encontra saturante na cultura as células nos estágios pro/pre-B-I crescem em detrimento das outras células presentes na cultura (inclusive as pre-B-II), e inibem a sua diferenciação para os próximos estágios (HAYASHI et al., 2005). A cultura em fígado fetal (fetal liver organ culture-FLOC) é outro sistema de diferenciação In Vitro, que utiliza partes de fígado fetal como suporte para o crescimento de precursores B, e é capaz de manter um padrão de diferenciação semelhante ao obtido in vivo (CEREDIG et al., 1998). Reconhece-se que na medula óssea e outros órgãos linfóides primários, existe um microambiente formado de diferentes tipos celulares do estroma que fornecem os inúmeros fatores que atuam na diferenciação das células hematopoiéticas, “mas não se sabe, se um único tipo celular é capaz de fornecer todos os suportes necessários na diferenciação das 4 células B, nem as fases em que essas interações com as células estromais se fazem necessária” (HAYASHI et al., 2005). 1.4 - PAPEL DA ENZIMA RAG NO DESENVOLVIMENTO DOS LINFÓCITOS B Nos eventos de origem do receptor de célula B (BCR) ocorre recombinação somática efetuada, principalmente, pela enzima Rag e alguns fatores de transcrição. Os receptores são gerados por rearranjo em cada linfócito de genes de região variável (V), com genes da região de diversidade (D) e/ou com genes de região de junção (J) (ABBAS et al., 2008). O receptor de células B (Ig) é formado por uma cadeia pesada e uma cadeia leve, cada uma das cadeias possui uma região constante (C) e uma região variável (V). Os genes que formam a região variável da cadeia pesada são os V, D, J e os que formam a região variável da cadeia leve são os: V, J, e ambos contêm, logo após esses segmentos gênicos, os segmentos que codificam suas respectivas regiões constantes. As enzimas Rag1 e Rag 2 (recombination activating gene ou Recombinationactivating protein) possuem seus genes localizados no cromossomo 11. Essas enzimas reconhecem a região de clivagem do DNA nas regiões entre os genes V, D e J (cadeia pesada) e V e J (cadeia leve) por meio de seqüências de nucleotídeos. Tem por atividade clivar os segmentos codificadores que são unidos por ligases específicas, gerando uma seqüência codificadora capaz de ser transcrita em RNAm ( RNA mensageiro), que será traduzido em polipeptídio nascente, o qual é processado e glicosilado, dando origem a um polipeptídio maduro (OETTINGER et al.,1990). A junção de dois polipeptídeo, um de cadeia pesada e outro de cadeia leve por pontes dissulfeto forma um heterodímero e a junção de dois desses heterodímeros por pontes dissulfeto entre as duas cadeias pesadas forma uma molécula de Imunoglobulina completa. O processamento do receptor de célula B (BCR) pelas enzimas Rag 1 e 2 ocorre por etapas. Inicia-se na etapa de diferenciação da linhagem de linfócitos B: Pré B-I, em que há expressão da enzima TdT (Transferase desoxinocleotidil terminal), a qual realiza a adição de até 20 nucleotídeos, auxiliando o mecanismo de diversidade juncional, expressão dos genes ativadores de recombinação 1 e 2 ( RAG1 e RAG 2) e rearranjo dos segmentos DJH. No estágio de precursora de célula BII, ocorre rearranjo entre o segmento VH e o rearranjo DJH pela atuação das Rags, formando uma cadeia µ completa do BCR (ABBAS et al., 2008). 5 O estágio celular pré B-II pode ser dividido em 3: (I) As células estão na fase mitótica e expressam o pré-BCR, constituído pela cadeia µ e proteínas substitutas de cadeia leve, SL. Se o BCR for funcional ocorre sinalização para o desligamento da maquinaria enzimática que age na recombinação somática; (II) As células deixam de expressar as SL e voltam a expressar o RNAm das enzimas Rags; (III) nesse estágio as enzimas Rags efetuam o rearranjo da cadeia leve. Existem dois Loci de cadeia leve қ e λ, que parece ser rearranjados independentes um do outro, entretanto o rearranjo қ é superior ao de λ, aumentando de 5 a 10 vezes mais as chances de se ter rearranjo қ; A cadeia leve é definitivamente arranjada e unida a cadeia µ e aos componentes Igα e Igβ, formando completamente o BCR e causando desativação das Rags, no estágio de células imaturas (MELCKERS & ROLINK et al., 2000). Depois de formado o receptor as enzimas podem ser ativadas novamente caso esse receptor faça reconhecimento de autoantígeno, ocasionando o “editing” do receptor (MELAMED et al., 1998). 1.5 - RECEPTORES SEMELHANTES A TOLL (TLRS) Os receptores semelhantes a Toll fazem parte de uma família de receptores reconhecedores de padrão. Esses receptores são encontrados em uma gama de tipos celulares e possuem vias de tradução de sinal intracelulares que ativam várias respostas pró-inflamatórias na célula. O receptor tipo Toll é de uma família conservada de proteínas que desempenham funções de resposta na imunidade natural a patógenos (ABBAS et al., 2008), mas recentemente estudos mostram que os receptores tipo Toll também estão envolvidos no amadurecimento de linfócitos B (HAYASHI et al., 2005), esses receptores formam uma família de 11 receptores identificados até os presentes estudos (AKIRA, TAKEDA & KAISHO, 2001). São encontrados em superfície da membrana celular, como os TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 e em membranas intracelulares, como os TLR3, TLR7, TLR8, TLR9. Possuem em sua estrutura intracelular domínio de homologia ao receptor Toll/IL-1 (TIR), importante para a interação com proteínas citoplasmáticas responsáveis pela cascata de sinalização para os diferentes produtos da estimulação via TLRs (JENKINS et al., 2009). Estudos indicam que essas proteínas são também responsáveis pela variação no padrão de resposta a diferentes ligantes desses receptores (ABBAS et al., 2008). Cada um dos TLRs tem padrão de reconhecimento molecular característico, por exemplo os receptores intracelulares fazem o reconhecimento de 6 seqüências gênicas não próprias, enquanto os receptores da superfície celular fazem o reconhecimento de polipeptídeos não próprios (ABBAS et al., 2008). O TLR4 reconhece LPS bacteriano gram-negativo; mananos fúngicos, fosfolipídeos parasitários entre outros. Esse receptor é um dos principais focos de estudos entre os receptores tipo Toll no amadurecimento das células B, tendo em vista que seu agonista, o LPS é capaz de ativar linfócitos B, estimulando a proliferação e secreção de anticorpo de forma independente do receptor BCR (ANDERSSON, COUTINHO & MELCHERS, 1977; HOSHINO et al., 1999), além da maturação do mesmo, no entanto, os mecanismos pelo qual acontece não estão bem estabelecidos. Estudos demonstram que o LPS seria um co-estimulo para o aparecimento de células B1, através de doses aplicadas em camundongos deficientes nesse tipo celular (MURAKAMI et al., 1997) e também agiria de forma peculiar com proteínas ligadas ao aparecimento do BCR que é sinal de proliferação e amadurecimento para as células B. O melhor compreendimento da ativação e o amadurecimento de células B permitem melhor entender o funcionamento de uma das células de defesa do sistema imune com grande capacidade de identificar antígenos e o/os passos em que essa mesma célula pode causar dano irreversível ao organismo quando faz reconhecimento de auto-antígenos. Os sítios de ligação dos ligantes microbianos nos receptores tipo Toll ainda estão sendo estudados por cristalografia de raio- X e analises de mutações. Os receptores tipo Toll reconhecem padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) e a base estrutural para a diversidade de reconhecimento à diferentes moléculas ainda é desconhecida (ABBAS et al., 2008). Algumas vias de sinal através de Toll induzem a dimerização do receptor. Interações homotipicas TIR-TIR são realizadas e fazem o recrutamento de outras proteínas, através de cascata de sinalização, que iniciam um downstream para ativar de alguns fatores de transcrição, como: NF-қB e AP-1 estes estimulam a expressão de genes de muitas moléculas do sistema imune, principalmente citocinas pró-inflamatórias (JENKINS et al., 2009; JANEWAY et al., 2002). A proteína Myd88 é uma proteína adaptadora que inicia a cascata de sinalização de alguns receptores tipo Toll e pode ser a chave para se entender as vias de sinalização desses receptores, entretanto outras três proteínas adaptadoras são conhecidas: Mal (Myd88 semelhante à adaptadora) /TIRAP (proteína adaptadora contendo domínio TIR) 7 Trif (adaptadora contendo domínio TIR induzindo interferon-β) e TRAM (molécula adaptadora relacionada com a Trif). Estudos demonstram que os ligantes de Toll têm importante participação na diferenciação de células B, por exemplo: O LPS (agonista de TLR4) e seqüências CpG (agonista de TLR9) além de possuírem papel na ativação de citocinas pró-inflamatórias também estão envolvidos na maturação e ativação das células B respectivamente (AZULAY-DEBBY, 2007; HAYASHI et al., 2005). Contudo, pouco se sabe sobre a expressão desses receptores e funcionamento dos mesmos no desenvolvimento dessas células e acredita-se que a sinalização TLR e o BCR podem agir de forma sinérgica na ativação da maturação das células B (HAYASHI et al., 2005). 1.6 - O SISTEMA IMUNOLÓGICO AO LONGO DA ONTOGENIA. A ontogenia, formação e desenvolvimento desde a fecundação do óvulo até a morte do indivíduo vêm sendo estudada, entre outros aspectos, para o entendimento da fisiologia dos linfócitos B. É reconhecido que no homem, o sistema imune neonatal tem sido considerado pouco competente na geração de resposta imune. Seu sistema adquirido não se apresenta bem desenvolvido e suas defesas são de origem materna, que possui vida curta. No outro extremo da idade, o sistema imune passa a ter dificuldade de responder a patógenos aos quais já foi exposto anteriormente, bem como a novos patógenos, levando as várias doenças infecciosas e neoplásicas. Em estudos com camundongos idosos saudáveis, anticorpos e respostas imunológicas são de curta duração, e a hematopoiése da medula é restrita aos ossos vertebral, esterno, costelas, ossos planos do crânio e pélvis e ao final dos ossos longos. Já nos jovens existem mais ossos com medula ativa produzindo células B. O declínio da função imunológica com o envelhecimento tem sido atribuído a vários fatores inclusive alterações ambientais e uma falha de células senescentes (THOMAN & WEIGLE, 1989; HODES, 1995; PROUST et al., 1996; BURNS & GOODWIN, 1997; HODES, 1997), associado também a deficiências de células T-help (SONG et al., 1997). A resposta proliferativa de células B humanas purificadas do sangue periférico para estimulação com anti-IgM, ou anti-M, com o ativador policlonal SAC, ou com MAb contra 8 CD20 ou CD40, tem sido relatada a ser reduzidas nos idosos (WHISLER et al., 1995) e a auto-imunidade parece aumentar (GOIDL et al.; 1981; ZHAO et al., 1995), entretanto outros estudos indicam que a resposta proliferativa se mantem com o envelhecimento e a susceptibilidade e a capacidade de ativação de apoptose modificada (VONGTHIP & SOUVANNAVONG et al., 1998). A morte fisiológica celular, Apoptose desempenha importante papel na homeostase do sistema imunológico e é fundamental seleção negativa e, por conseguinte na supressão de células auto-reativas (GOLSTEIN et al., 1991; COHEN et al., 1992). Muitos estudos têm sido realizados sobre a linhagem de células-T, associada ao papel do envelhecimento de linfócitos B na susceptibilidade à apoptose, mas existem pouca informações a respeito. A idade se reflete também na diminuição do repertório de diversidade dos linfócitos B, no entanto, os mecanismos moleculares permanecem obscuros. Em estudos com ratos de idade avançada observou-se declínio no RNA mensageiro das enzimas Rag1 e Rag 2 (JOSEPH et al., 2009). Os fotores transcricionais de regulação da linfopoeise de células B, por exemplo: E2A, EBF, e Pax-5 (ZHUANG et al., 1994; KEE et al., 2000; KEE & MURRE, 1998; O'RIORDAN & GROSSCHEDL, 1999), estão envolvidos na regulação da mesma e podem ser significativos em estudos de declínio do repertório de células B no envelhecimento. As primeiras especificações de linhagem B envolvem a expressão de E2A e sua redução resulta na inibição da linfopoeiese de células B (ZHUANG et al., 1996; KEE et al., 2000; KEE & MURRE 1998; O'RIORDAN & GROSSCHEDL, 1999). Uma importante função do E2A é promover a expressão das cadeias leves substitutas e facilitar a formação do pré-célula B receptor (preBCR). Outros fatores tais como: EBF e interferon são críticos na regulação da expressão da cadeia leve substituta. No entanto, não se sabe que elementos influenciam a expressão de tais moléculas reguladoras na medula e que elementos são necessários para a manutenção normal da linfopoeise B ou para provocar linfoipoiese anormal na velhice. Tem-se reconhecido que o microambiente da medula óssea tem importante papel na deficiência de B linfopoiese na velhice fato sugerido pelo os estudos de Stephan (STEPHAN et al., 1997), que têm mostrado que células estromais dentro do microambiente da medula óssea de camundongos com idade são menos capazes de apoiar o desenvolvimento B lineage in vitro. Em especial, Labrie (LABRIE et al., 2004) demonstrou que a senescencia de células da medula desempenha papel importante em 9 limitar a expressão da RAG enzima e recombinação gênica nas células B precursoras. Postula-se que deficiências nos fatores intrínsecos de células B podem contribuir para o estado anormal da linfopoiese em organismos envelhecidos. Experimentos indicam que células B de organismos jovens comparados com organismos adultos são mais responsivas a estímulos, entretanto os mecanismos e as razões pelas quais essas respostas são distintas ainda estão em estudo. Na ontogenia dessas células, a relação dos diferentes acontecimentos de desenvolvimento com os diferentes receptores celulares ainda não está bem esclarecida, e acredita-se que a sua compreensão seja a chave para elucidamento das distintas respostas de células B a antígenos. 10 2 - OBJETIVO Nosso objetivo neste projeto é avaliar os efeitos diretos e indiretos dos ligantes dos receptores tipo Toll no desenvolvimento de linfócitos B ao longo da ontogenia, analisando a resposta a estes ligantes na diferenciação de linfócitos B in vitro a partir de precursores purificados de camundongos em diferentes idades. 2.1 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS: 1) Detectar por citometria de fluxo as diferenças fenotípicas entre as subpopulações de linfócitos B gerados na presença ou ausência de LPS (agonista de TLR4) em culturas de precursores purificados de medula óssea de camundongos jovens, adultos e idosos. 2) Identificar se as diferenças dos linfócitos gerados in vitro na resposta ao LPS ao longo da ontogenia podem ser conseqüência da influência de outras linhagens celulares ou de propriedades intrínsecas dos linfócitos B, analisando o papel de outras linhagens celulares em culturas mistas de precursores B purificados com outras linhagens celulares. 11 3 - METODOLOGIA 3.1 - OBTENÇÃO DE CÉLULAS TOTAIS DA MEDULA ÓSSEA: Foram obtidos camundongos fêmeas, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, do instituto de microbiologia, setor imunologia, da linhagem CS7BL/6J de 6 meses, 3 meses e 20 dias de idade. A suspensão de células totais da medula óssea foi obtida, cortando-se as extremidades do fêmur e com o auxilio de seringa tamanho 22G para os animais de 3 e 6 meses e de seringa tamanho 27,5G para animais de 20 dias contento PBS (tampão fosfato de sódio), EDTA 2 mM com 5% de soro fetal bovino, para lavagem das células do canal medular. As células foram separadas por idade dos camundongos em tubos tipo Falcon de 50 mL. Foram centrifugadas em 1300 rpm a 4°C por 7 minutos. Posteriormente, o sobrenadante foi removido e as células foram ressuspendidas em 5 mL de ACK, para causar lise de hemácias, novamente centrifugação nas mesmas condições iniciais e em seguida, o sobrenadante foi retirado e as células foram ressuspendidas em 5 mL de PBS, EDTA 2 mM com 5% de soro fetal bovino para posterior contagem celular. 3.2 - CONTAGEM CELULAR: A contagem das células viáveis foi realizada com Azul de Tripan utilizando microscópio óptico, em Câmara de Neubauer. 3.3 - ANÁLISE DA PURIFICAÇÃO E COMPARAÇÃO DAS CÉLULAS DOS CAMUNDONGOS: Para a verificação das subpopulações de medula e da pureza dos precursores após a separação magnética, foram separadas alíquotas de 0,2 x 106 células de medula dos camundongos das diferentes idades, e das amostras pós-separação magnética a fim de observar o padrão do fenótipo celular com marcação por anticorpos acoplados a fluorocromos por citometria de fluxo. 3.4 - SELEÇÃO DAS CÉLULAS PRECURSORAS DE LINHAGEM B (B220 + IGM-): Foram utilizados tubo tipo Falcon para centrifugação das células de medula óssea em 1300 rpm a 4°C por 7 minutos, o sobrenadante foi retirado e as células foram ressuspendidas num volume determinado de tampão de acordo com o número de células totais recuperadas para camundongos de diferentes idades. Foi adicionado a cada volume, anticorpo α IgM acoplado a microbeads magnéticas (Miltenyi Biotec) para uma concentração final do mesmo de 1:20. As células foram incubadas por 20 minutos em gelo. Após incubação as células foram centrifugadas e ressuspendidas em 500 µL de PBS, EDTA 2 mM com 5% de 12 soro fetal bovino para serem passadas na coluna magnética seguindo o protocolo do fabricante. A separação das células B220+ IgM- da medula óssea por seleção negativa, foi feita por depleção das células não marcadas com o anticorpo específico, após lavagem indicada em protocolo. As células obtidas posterior passagem na coluna foram centrifugadas em 1300 rpm a 4°C por 7 minutos e ressuspendidas em meio de cultura. Em seguida realizou-se contagem celular e posteriormente as células foram resuspendidas em volume de acordo com o número de células totais recuperadas em cada tubo tipo Falcon (6 meses, 3meses, 20 dias) e marcadas com anticorpo α CD19 acoplado a microbeads magnéticas para concentração final do mesmo de 1:10. As células foram incubadas por 20 minutos em banho de gelo, centrifugadas e ressuspendidas em 10 mL, novamente centrifugadas e passadas em coluna magnética para seleção positiva seguindo protocolo de seleção do fabricante. As células obtidas foram centrifugadas e ressuspendidas em meio OptiMEM, 10% de soro fetal bovino, 5 ×10-5 M de 2-β- mercaptoetanol, 100 U/mL de estreptomicina e 100 µg/mL de penicilina, centrifugadas e ressuspensas em 1mL para contagem celular e plaqueadas. 3.5 - CULTURA DE DIFERENCIAÇÃO DE PRECURSORES DE CÉLULAS B: LPS (Lipopolissacarídeo) foi utilizado, em diferentes concentrações e tempo de cultura, como estímulo para maturação das células B220+ IgM-, após 3 dias de cultura das mesmas. As concentrações de LPS utilizadas foram as seguintes: 12,5; 2,5; 0,5 µg/mL. Foram cultivadas 0,2x106 células / 200 µL / poço (placa de 96 poços) em meio de cultura OpitMEM suplementado como descrito acima, com os determinados estímulos em estufa umidificada a 37°C, com CO2 a 7%. 3.6 - ANÁLISE DE CÉLULAS POR CITOMETRIA DE FLUXO (FACS): Para a análise fenotípica das células por citometria de fluxo, foi realizada a marcação das diferentes amostras com um “mix” de anticorpos acoplados a fluorocromos. Os anticorpos usados foram os seguintes: CD23 PE, B220 FITC, IgM Alexa, CD23 APC, CD69 PE, IgM FITC. Esses anticorpos foram diluídos em tampão PBS suplementado com 5% de soro fetal bovino e azida a 0.05% para a preparação dos diferentes “mix”. As amostras foram incubadas em volume de 30µl por 20 min. a 4 °C e lavadas com o mesmo tampão usado 13 para a incubação. Após a lavagem, as células foram ressuspendidas com o tampão para a separação de alíquotas da amostra para a marcação das células em cultura, a fim de observá-las em análises de citometria de fluxo. 14 4 - RESULTADOS 4.1 - CARACTERIZAÇÃO DA LINHAGEM B E ANÁLISE DA PURIFICAÇÃO DOS PRECURSORES DE MEDULA ÓSSEA EM ANIMAIS DE DIFERENTES IDADES. A fim de se estudar o efeito do LPS como estímulo de maturação para os linfócitos B, via receptor tipo Toll 4, na linfopoeise de células B dos camundongos de diferentes idades, foram realizados para obtenção e análise de maturação das células B experimentos in vitro. Como passo inicial do estudo, as células hematopoéticas do canal medular do fêmur dos camundongos C57BL/6 de 20 dias, 3 meses e 6 meses foram retiradas e posteriormente incubadas com anticorpos monoclonais anti-IgM acoplados a micro-partículas magnéticas para depletar linfócitos B, e com anticorpos anti-CD19 acoplados a micro-partículas magnéticas, para a obtenção dos precursores (B220 +IgM-) de células B. A analise populacional das medulas ósseas dos animais das diferentes idades bem como a avaliação da pureza dos precursores B purificados foi feita por citometria de fluxo (Figura 1). Na citometria de fluxo, as células B foram visualizadas a partir da detecção da fluorescência emitida por anticorpos acoplados a flurocromos, específicos para marcadores de superfície característicos de diferentes estágios da linfopoiese B. Antes da purificação, a porcentagem de precursores na medula total dos camundongos eram de: 36%, 20% e 8,16% para camundongos de 20 dias, 3 meses e 6 meses respectivamente.Tal fato pode ser remetido ao declínio da linfopoiese B ao longo da ontogenia já descrito em outros trabalhos (CLAIRE-ANNE SIEGRIST*, RICHARD ASPINALL, 2009). De acordo com o experimento realizado, a porcentagem de precursores recuperados também varia após a purificação nos camundongos de idades diferentes. Nos camundongos de 20 dias há 97% de pureza comparada com 95% e 86% de pureza dos camundongos de 3 e 6 meses respectivamente, ou seja, com o avanço da idade, menor foram as porcentagens dos precursores. Dessa maneira, a diminuição de células B na medula óssea dificulta a purificação das mesmas em meio a outras linhagens celulares presentes na medula. 15 Figura 1: Análise da purificação das células da medula óssea. Gráfico das Subpopulações de células B B220+ e IgM + da medula óssea total e de precursores B purificados. Nessa análise foram utilizados camundongos de diferentes idades: 20 dias; 3 meses e 6 meses. As células da medula óssea total foram incubadas com anti-IgM magnético, passadas na coluna para seleção negativa, posteriormente as células depletadas foram incubadas com anticorpo anti-CD19 magnético para a seleção positiva. Amostras de células da medula óssea total e dos precursores purificados foram incubadas com anticorpo anti-B220 FITC e anti-IgM Alexa 647 para análise por citometria de fluxo. 4.2 - ESTUDO DA MATURAÇÃO DAS CÉLULAS DE LINHAGEM B IN VITRO As células obtidas da medula óssea dos camundongos foram colocadas em placas de cultura contendo meio de cultura e incubadas por 3 dias para diferenciação celular. Nas primeiras 24 horas surgem os linfócitos IgM+ e em 72 horas passam ser aproximadamente cerca de 50% da população B220+ presente em cultura, posteriormente a esse período ocorre aumento da mortalidade celular. Após diferenciação as células foram estimuladas a maturação in vitro pelo mitógeno LPS. A transição do estágio das células imaturas para células B maduras inclui mudanças na expressão de marcadores, como menor expressão do marcador AA4.1 e expressão do marcador CD23. Utilizamos a expressão de CD23 como leitura para avaliar o nível de maturação in vitro. A análise do nível de expressão CD23 a partir dos linfócitos 16 estimulados com LPS, por citometria de fluxo, envolve: seleção das células nucleadas, exclusão das células mortas, identificação das populações B220+, IgM+ e CD23 + de células B ( Figura 2). As células nucleadas foram selecionadas em um gráfico de tamanho (forward scatter) e granulosidade (side scatter) por uma área de estudo previamente delimitada (gate) que abrange as populações de macrófagos, polimorfonucleares e linfócitos (Figura 2a). Para exclusão de células mortas foi utilizado iodeto de propideo (PI), um composto fluorescente que se liga ao DNA e não atravessa membrana celular devido a sua baixa lipofilicidade. Quando este atravessa a membrana plasmática é sinal que ela esta danificada, indicando perda de viabilidade celular. O PI fluoresce em canais específicos do citômetro de fluxo, FL-2 e FL-3, possibilitando a identificação das células marcadas com esse composto. Normalmente as células com PI são visualizadas formando uma diagonal na analise de citometria, e assim podem ser excluídas com a delimitação de uma gate (Figura 2b). Os marcadores de superfície B220, CD23 e o receptor de células B IgM caracterizam estágios do desenvolvimento das células B. Em animal adulto três principais subpopulações de células B são descritas na medula óssea de acordo com o padrão de expressão de B220 e IgM (CARSETTI et al., 1995): (I) Células B imaturas B220lowIgMlow, que correspondem ao estágio mais imaturo de linfócitos B, IgM+;(II) Células B transicionais B220interm/highIgMhigh, mais avançadas na maturação; e (III) Células B maduras foliculares recirculantes B220highIgMlow. Na Figura 2c podemos observar que o sistema de diferenciação in vitro permite a geração de linfócitos B imaturos e transicionais, mas não maduros. O marcador de superfície CD23 sugere que as células B estão avançando no estágio de maturação. Esse marcador é expresso em uma significativa parte das células transicionais e em todas as células maduras da linhagem B. 17 Figura 2: Abordagem Usada para Análise da Maturação das Células B. Análise das subpopulações que expressam CD23. (a) seleção das células nucleadas por citometria em gráfico de tamanho (forward scatter) e granulosidade (side scatter); (b) Padrão de identificação de células viáveis por fluorescência com utilização de iodeto de propídeo (PI), onde a região R7 corresponde as células viáveis; (c) identificação das células B precursoras (B220+ IgM-, em R5), imaturas e transicionais ( B220+IgM+, em R1); (d) identificação das células CD23+, em R8. 4.3 - DIFERENCIAÇÃO DAS CÉLULAS B IN VITRO EM RESPOSTA AO LPS EM CAMUNDONGOS DE DIFERENTES IDADES. No estudo presente foi utilizado sistema experimental in vitro de diferenciação de células B com meio de cultura e adição do mitógeno LPS. Sistemas experimentais In Vitro de diferenciação têm sido extensamente utilizados para o estudo dos processos envolvidos no desenvolvimento da linhagem B (HARDY et al., 1991; CUMANO et al., 1990; RAY et al., 1998; ROLINK et al., 2000). Após 2 dias, as culturas de precursores B purificados foram estimuladas com LPS e incubadas por mais um dia, e posteriormente recolhidas e marcadas com anticorpos antiB220, anti-IgM e anti-CD23, a fim de se visualizar a maturação das células B pelo agonista de TLR4. A presença de diferentes subpopulações foi analisada por citometria utilizando a abordagem descrita no item 4.3. A porcentagem das subpopulações de linfócitos B que expressaram CD23 foi analisada nos camundongos de diferentes idades (Figura 3a). 18 Figura 3 a: Análise Comparativa da Expressão de B220 e CD23 em Resposta ao LPS ao Longo da Ontogenia das Células B. Os gráficos apresentam a porcentagem de células CD23+ dentro da população IgM+ das culturas de precursores B de camundongos de diferentes idades: 20 dias, 3 meses e 6 meses, estimuladas por 20 horas com LPS a 12,5 µg/mL (a direita) comparado com o controle de células não tratadas com LPS (a esquerda), após 3 dias de cultura celular. As células forma purificadas em coluna magnética, incubadas com anticorpo anti- B220 e anti- CD23. As amostras foram lidas no citometro de fluxo. 19 Nos camundongos jovens foi observado um aumento de 3 vezes na porcentagem de CD23 comparado com controle. Em relação aos camundongos adultos também houve aumento de aproximadamente de 3 vezes da porcentagem de CD23, após as células receberem o estímulo LPS para maturação. Os resultados demonstram que o organismo envelhecido tende a responder de forma igual ao organismo jovem ao LPS. Em camundongos de 20 dias aumentou de 7,5% para 21,8% a porcentagem de células B CD23+, nos camundongos de 3 meses aumentou de 5,3 para 16% e em camundongos de 6 meses aumentou de 4,2% para 11,5%, significando que ao longo da ontogenia a resposta ao LPS se mantém. Por outro lado verificamos que a expressão de CD23 é maior em camundongos de 20 dias em relação aos camundongos de 3 e 6 meses (Figura 3b). Figura 3b: Análise da expressão de CD23 em camundongos de diferentes idades. O gráfico mostra a porcentagem de CD23+ em células B de camundongos de 20 dias, 3 meses e 6 meses de idade tratados com LPS em diferentes concentrações: 0,5µg/mL; 2,5µg/mL; 12,5µg/mL. 20 4.4 - MENOR RESPOSTA DE CÉLULAS B IN VITRO AO LPS NÃO CORRESPONDE TOTALMENTE COM AVANÇO NA IDADE DO ANIMAL. Ao relacionar a porcentagem de células CD23+ com o envelhecimento do animal em um segundo experimento, foi observado que em camundongos de 3 meses a porcentagem de CD23 em culturas estimuladas com LPS era menor em relação ao camundongo de 6 meses (Figura 4). Observamos que esse resultado coincidiu com baixa pureza de precursores (85%) dos animais de 3 meses, menor que na cultura de precursores de animais de 7 meses (96%) neste caso. A influencia de outras linhagens diferentes de B na maturação das células B poderia ser a causa pela qual houve pouca diferenciação dos precursores das células B de camundongos de 3 meses, assim, experimentos com cultura de células B com outras linhagens celulares foram realizados. É presente na literatura que a linfopoiese de células B na medula parece diminuir em virtude do envelhecimento do animal, tendo-se por outro lado um aumento de outras linhagens celulares, entretanto, ainda não se tem confirmado como essas alterações podem afetar a diferenciação de células B. Figura 4: Análise do desenvolvimento das células B In Vitro. Gráfico de coluna da diferenciação das células B em CD23+ por estimulo de LPS em camundongos de diferentes idades. Os precursores purificados dos camundongos, após 3 dias de cultura, foram estimulados com LPS a 12,5 µg/mL por 24 horas, a fim de observar diferenciação celular da linhagem B nos camundongos. As células da cultura foram incubadas com anticorpo anti-B220 e anti-CD23 acoplados a fluorocromo e analisadas por citometria. 21 4.5 - PRESENÇA DE CÉLULAS QUE NÃO PERTENCEM À LINHAGEM B INIBE A DIFERENCIAÇÃO DOS PRECURSORES B IN VITRO. Os precursores purificados dos camundongos de 20 dias foram utilizados para observação da diferenciação das células B na presença do agonista LPS e de células de que não pertencem à linhagem B. Em cultura celular de camundongos de 20 dias foram adicionadas células de outras linhagens presentes na medula óssea tanto dos próprios camundongos de 20 dias quanto de camundongos de 4 meses, em diferentes tempos de estímulo e diferentes concentrações de LPS para maturação das células B (figura 5 a e 5 b). Após analise da cultura de células B com outras linhagens celulares foi observado que em diferentes concentrações de LPS: 12,5 µg/mL e 0,25µg/mL na presença de linhagens celulares diferentes de B ocorreu um declínio na porcentagem de linfócitos B CD23+. Em 20 horas de estimulo com LPS foi observado que a porcentagem de CD23 diminui em culturas de linfócitos B com 5% e 20% de linhagens celulares diferentes de B de camundongos de 20 dias. Com linhagens celulares diferente de B de camundongos de 4 meses, o efeito inibitório de CD23 foi mais acentuado (Figura 5a). Em 72 horas de estímulo com LPS em diferentes concentrações na presença de linhagens celulares não-B tanto de camundongos de 20 dias quanto de 4 meses ocorreu diminuição na porcentagem de células B CD23+ (Figura 5b). Entretanto esse efeito pode ser mais bem visualizado nas primeiras 20 horas de estímulos em cultura com linhagens celulares diferentes de B de camundongos de 4 meses. Visto que a diferenciação das células B ocorre com o agonista LPS independente da idade dos camundongos e que na presença de outras linhagens celulares ocorre diminuição da diferenciação das células B em CD23+, acredita-se então não ser um defeito intrínseco dos linfócitos, mas o microambiente em que esse se encontra que influencia na maturação dessas células B. 22 Figura 5 a: Análise da diferenciação das células B na presença de linhagem celular diferente de B em 20 horas de estímulo com LPS. Análise da maturação das células B por porcentagem de CD23 em 20 horas de estímulo com LPS. Foram utilizadas as porcentagens de 5 % e 20% das células não B obtidas de camundongos na cultura das células B. Células de camundongos de 20 dias foram estimuladas com LPS em diferentes concentrações: 12,5 µg e 2,5µg, após 3 dias de cultura, na presença de linhagem celular diferente de B dos próprios camundongos de 20 dias e de camundongos de 4 meses. 23 Figura 5 b: Análise da diferenciação das células B na presença de linhagem celular diferente de B em 72 horas de estímulo com LPS. Análise da maturação das células B por porcentagem de CD23 em72 horas de estímulo com LPS. Foram utilizadas também nesse experimento as porcentagens de 5 % e 20% das células não B obtidas de camundongos na cultura das células B. Células de camundongos de 20 dias foram estimuladas com LPS em diferentes concentrações: 12,5 µg e 2,5µg, após 3 dias de cultura, na presença de linhagem celular diferente de B de camundongos de 20 dias e 4 meses. 24 5 - DISCUSSÃO As células tronco-hematopoéticas são geralmente menos de uma por 5 x 104 células da medula óssea (KUBY et al., 2008) e a partir dela originam-se os precursores linfóides comum (CLPs), desses uma pequena parte se diferenciam em células B. Entretanto a porcentagem de células B tende a diminuir ainda mais ao longo da ontogenia de um organismo (CLAIRE-ANNE SIEGRISY* & RICHARD ASPINALL, 2009). As células B podem se diferenciar em sistemas in vitro até o estágio de células transicionais (CEREDIG et al., 1998), na presença de células estromais, da citocina IL-7 ou de mitógenos. Estudos demonstraram que o LPS, agonista de TLR4, promove maturação dos linfócitos (HAYASHI et al., 2005). Assim, in vitro, o LPS em células imaturas (AA4lowIgMhigh) estimula a expressão do marcador de superfície CD23, e as células que expressam esse marcador passam para novo estágio de desenvolvimento e são chamadas células B transicionais. No entanto, os fatores envolvidos na regulação da expressão de CD23 em células B ainda são desconhecidos. Sabe-se que o BAFF é importante fator para a sobrevivência e maturação dos linfócitos B no baço e é capaz de induzir as células B transicionais a expressarem o marcador CD23 (GORELIK et al., 2004). A capacidade de induzir a expressão de CD23 pelo LPS já foi descrita na literatura também para linfócitos B maduros. Os linfócitos B maduros CD23+ têm os níveis de CD23 aumentados na presença de LPS e IL-4, num fenômeno chamado de superindução de CD23 (CONRAD et al., 1988). A ativação dos linfócitos B pelo LPS também já é descrita, e ocorre de maneira semelhante à que ocorre em linfócitos B maduros. Nossos resultados iniciais confirmaram que a linfopoiese de B tende a diminuir com a idade do animal como descrito em literatura. As causas porque tal fato ocorre ainda não foram esclarecidas. Assim, no presente trabalho, com camundongos de diferentes idades, foi estudado se a maturação in vitro dos linfócitos B a partir de precursores purificados da medula óssea, estimulada ou não por LPS, pode variar ao longo da ontogenia, verificando o papel de outras linhagens celulares nesse processo. Vimos que nos camundongos de 20 dias na presença de LPS ocorreu maior diferenciação dos precursores em células CD23+ comparado com os outros camundongos de idades adulta. Sugerindo que os linfócitos B de camundongos de 20 dias são capazes de maior maturação em resposta ao LPS. 25 Em uma segunda avaliação do comportamento das células B da medula óssea em resposta ao LPS, verificamos que as células B dos camundongos de 3 meses, apresentavam menor porcentagem de CD23+ em relação as células B dos outros camundongos estudados. Vale ressaltar que neste experimento em particular, nos animais de 3 meses a porcentagem de precursores purificados encontrava-se menor em relação aos precursores dos animais de 7 meses, sugerindo que possíveis linhagens celulares diferentes de B poderiam estar interferindo na maturação dos linfócitos B pelo agonista de TLR4, LPS. A influencia de outras linhagens estaria inibindo não só a maturação dos camundongos de 3 meses, como também dos camundongos de 7 meses, uma vez que nesses últimos também foi observado declínio da porcentagem de CD23 comparado com camundongos jovens. A fim se confirmar a hipótese que a inibição da maturação dos linfócitos não era efeito intrínseco dos mesmos, mas o microambiente em que se encontravam, foi realizado experimento com 20 e 72 horas de estímulo com LPS, na presença de linhagem diferente de B de camundongos de 20 dias e 4 meses. A inibição da maturação pelo LPS foi claramente visualizada na presença das linhagens não-B, confirmando a hipótese. O efeito inibitório de linhagens não-B presentes poderia ser explicado pelos tipos de linhagens presentes; ou as condições que se encontravam essas linhagens no microambiente do camundongo antes de serem postas em cultura, ou ainda citocinas liberadas por essas que estariam fazendo o efeito inibitório. O LPS é pontencial ativador de macrófagos e outros tipos celulares da medula óssea levando essas células a secretarem algumas citocinas, como IFN tipo I e TNF-α que podem também inibir o desenvolvimentos de B (LIN, DONG, COOPER, 1998; UEDA et al., 2004). Outros estudos mostram que células Natural Killer (NK), bem como presença de certas citocinas em cultura de células B inibe o desenvolvimento dos linfócitos B (CLAIRE-ANNE SIEGRISY* & RICHARD ASPINALL, 2009; ANNE, KING, RICHARD* et al., 2009). Poderiam então essas mesmas células ter uma influencia na maturação dos linfócitos? Caso tenha, em que proporções seriam capazes de inibir a maturação? Nossos estudos demonstraram que em 5% de linhagem celular não-B presente em cultura já é capaz de inibir a maturação dos linfócitos B. De acordo com os resultados encontrados seria importante identificar que tipo de linhagem celular estaria realizando o efeito inibitório da maturação dos linfócitos B e determinar se a inibição ocorre por simples contato ou pela secreção de alguma citocina, 26 esses estudos seriam um acréscimo ao entendimento do comportamento do linfócito B em meio a outro tipo celular na cultura, entre outros aspectos. De fato, observamos neste trabalho que em estudos do desenvolvimento de células B os níveis de pureza são de extrema importância, pois pequena quantidade de outras linhagens ou citocinas podem influenciar nos resultados finais. Os conhecimentos adquiridos por esses estudos presentes, além dos já existentes, possibilita o estabelecimento de cultura de linfócitos B com maiores critérios, levando em consideração a porcentagem de outras linhagens diferentes B, bem como a influencia do LPS na maturação dos linfócitos B ao longo da ontogenia, além de refletir em conhecimento para a imunologia básica. 27 6 - CONCLUSÃO 1) O LPS, agonista de TLR4, é capaz de induzir maturação dos linfócitos B. Resultado observado através da leitura de CD23 como marcador de maturação. 2) Linfócitos B de camundongos jovens são em geral mais responsivas ao LPS comparado com os linfócitos B dos camundongos adultos e idosos por apresentarem maior nível de pureza dos precursores B. 3) Linhagens celulares diferentes de B são capazes de inibir a ação estimulatória do LPS no desenvolvimento dos linfócitos B mesmo em porcentagens muito pequenas. 28 7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS • ABUL K. ABBAS, ANDREW H. LICHTMAN, SHIV PILLAI. (2008). Imunologia Celular e Molecular: Amadurecimento, ativação e Regulação dos Linfócitos. 6 ed. Rio de Janeiro. Cap 8. • ANNE M. KING, PATRICIA KEATING, BLOMBERG, RICHARD L. RILEY (2009). NK cells in the CD19_ B220+ bone marrow fraction are increased in senescence and reduce E2A and surrogate light chain proteins in B cell precursors. Mech Ageing Dev. Jun; 130(6): 384-92. Epub 2009 Mar 24. • ANNOEK E.C. BROERSA, JULES P.P, MEIJERINK B & JAN J. CORNELISSEN (2002). 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