Universidade do Vale Do Paraíba Instituto de Pesquisa e

Universidade do Vale Do Paraíba
Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas
CARLOS AUGUSTO PRIANTE DA SILVA
FRACIONAMENTO BIOMONITORADO PELA ATIVIDADE CITOTÓXICA DO
EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE Acmella oleracea
Fractionation biomonitored by cytotoxic activity of hydroalcoholic extract of Acmella
oleracea
São José dos Campos- SP
2015
Carlos Augusto Priante da Silva
FRACIONAMENTO BIOMONITORADO PELA ATIVIDADE CITOTÓXICA DO
EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE Acmella oleracea
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da
Universidade do Vale do Paraíba, como
complementação dos créditos necessários para
obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas.
Orientador: Prof Dr Renato Farina Menegon
Co-Orientador: Profa Dra. Cristina Pacheco Soares
São José dos Campos, SP
2015
Ficha
Banca
DEDICATÓRIA
“São como nas grandes histórias. As que tinham mesmo importância. Eram repletas de
escuridão e perigo. E, às vezes, você não queria saber o fim... Porque como podiam ter um
final feliz? Como podia o mundo voltar a ser o que era depois de tudo isso? Mas, no fim, é
só uma coisa passageira, até tudo passar. Um novo dia virá. E, quando o sol brilhar,
brilhará ainda mais forte. Eram essas as histórias que ficavam nas lembranças, que
significavam algo. Mesmo que você fosse pequeno demais para entender o porquê. Mas
acho, que entendo, sim. Agora eu sei. As pessoas dessas histórias tinham várias
oportunidades de voltar atrás mas não voltavam. Elas seguiam em frente, porque tinham
no que se agarrar.”
Samwise Gamgee (JRR Tolkien)
Dedico este estudo,
Aos meus pais, Carlos e Adriana.
Obrigado por acreditarem nos meus
sonhos e histórias mais loucas.
Direcionando-me nesta estrada e
me mostrando novamente a placa de:
Siga em frente;
Always.
AGRADECIMENTOS
Agradeço imensamente a toda minha família, que foram meu suporte e fonte de
energia, me incentivando sempre a continuar e dar meu melhor.
Meus agradecimentos aos meus orientadores Prof. Dr. Renato Farina Menegon e
Coorientador Profa. Dra. Cristina Pacheco Soares sempre me acompanhando e que me
fizeram ser o profissional & a pessoa que sou.
Aos Mestres que colaboraram com este trabalho, com conhecimento e conselhos, com
apoio e presença. Eu lhes agradeço Profa. Dra. Walderez Moreira Joaquim, Prof. Dr.
Newton Soares da Silva e Profa. Dra. Lorena Blau.
Á todos os meus amigos de laboratório, aos que já passaram e aos que permanecem,
todos os dias, no mesmo horário e local compartilhando mais do que o tempo.
Ao Prof. Dr. Milton Beltrame Junior e todos do laboratório de Síntese Orgânica por
disponibilizar seu espaço para parte da realização deste trabalho.
Obrigado Joaquim e S. Antonio pelo imenso auxílio, conselhos e conversas durante o
cultivo das plantas. A simplicidade de um café leva a ideias mais malucas e
cientificamente precisando de comprovação.
Agradeço a todos que de alguma forma fizeram parte deste trabalho, colaborando
como puderam, fazendo parte também desta minha historia, um conto de aventura, drama
etc., que ainda não acabou. Só está começando!!!
Muito Obrigado
Por me ajudarem a completar
Mais este capítulo desta minha aventura.
Em um buraco no chão vivia um hobbit...
RESUMO
O uso de plantas para finalidades curativas e terapêuticas acompanha a sociedade desde os
tempos antigos. Algumas destas plantas produzem substancias tóxicas que podem causar
danos e até mesmo levar o individuo consumidor à morte e devido a esta característica plantas
comumente usadas na medicina popular devem ser mais amplamente estudadas. Acmella
oleracea é uma planta pertencente à família Asteraceae e utilizada na medicina alternativa e
culinária popular. Componentes bioativos, tais como espilantol foram isolados e estudados a
partir de diferentes estruturas da planta, no entanto, vários outros metabólitos secundários
foram associados com sua bioatividade, como os alcaloides e flavonoides. Assim, este estudo
tem como objetivo aplicar, em concentrações variadas, o extrato hidroalcoólico de Acmella
oleracea e suas frações obtidos a partir das folhas da planta, em células L929 (fibroblastos de
camundongo) biomonitorando sua ação através da atividade citotóxica apresentada. A
avaliação através do ensaio de Cristal violeta revelou uma redução da densidade celular nas
frações Acetato de etila, Butanol e Clorofórmio, enquanto a atividade mitocondrial e
lisossomal avaliadas por MTT e Vermelho Neutro, respectivamente, demonstraram uma
diminuição gradativa destas atividades em todos os extratos e frações testadas, com maior
significância no período de 48 h de incubação. O ensaio de Cristal Violeta das subfrações
obtidas através do fracionamento em coluna Sephadex evidenciou a toxicidade das frações
AE6, AE7, AE17, B4, B5, B6 e B13 que quando associadas às análises cromatográficas em
CLAE-DAD de A5, A6, A7, B6 e B7 caracterizam a citotoxicidade e a atividade citotóxica da
planta, podendo estar associada principalmente aos flavonoides e ácidos fenólicos presentes
no extrato, devendo-se alertar ao uso popular e indiscriminado desta planta medicinal.
Palavras-chave: Fracionamento, Citotoxicidade, L929, Acmella oleracea, Acetato de etila.
Fractionation biomonitored by cytotoxic activity of hydroalcoholic extract of Acmella
oleracea
The use of plants for healing and therapeutic purposes accompanies the society since
ancient times. Some of these plants produce toxic substances that can cause damage and
even lead to death the individual consumer and due to this feature plants commonly used
in popular medicine should be more widely studied. Acmella oleracea is a plant belonging
to the family Asteraceae and used in alternative medicine and popular cuisine. Bioactive
components, such as spilanthol been isolated and studied from different plant structures,
however, several other secondary metabolites have been associated with its bioactivity,
such as flavonoids and alkaloids. This study aims to apply, in varying concentrations, the
alcoholic extract Acmella oleracea and its fractions obtained from the leaves of the plant,
in L929 cells (mouse fibroblasts) monitoring their action through the cytotoxic activity
displayed. The assessment by Crystal violet assay showed a reduction in cell density in
fractions ethyl acetate, butanol and chloroform, while the mitochondrial and lysosomal
activity assessed by MTT and Neutral Red, respectively, showed a gradual reduction of
these activities in all extracts and fractions tested, with greatest significance during the 48
h incubation. The Crystal Violet assay of subfractions obtained by fractionation on
Sephadex column showed the toxicity of SU6 fractions, AE7, ae17, B4, B5, B6 and B13
that when attached to chromatographic analysis in HPLC-DAD A5, A6, A7, B6 and B7
characterize the cytotoxicity and the cytotoxic activity of the plant, may be mainly
associated with flavonoids and phenolic acids present in the extract, should be alert to the
popular and indiscriminate use of this medicinal plant.
Keywords: Fractionation, cytotoxicity, L929, Acmella oleracea, Ethyl acetate.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Mapa demonstrativo da distribuição de A. oleracea no Brasil ................................ 33
Figura 2 - Acmella oleracea. .................................................................................................... 34
Figura 3 - Estrutura molecular do espilantol ............................................................................ 35
Figura 4 - Estrutura do homoespilantol. ................................................................................... 36
Figura 5 - Metodologia do plantio de Acmella oleracea. ......................................................... 38
Figura 6 - Fluxograma do fracionamento Liquido-Liquido do extrato bruto de Acmella
oleracea. ................................................................................................................................... 40
Figura 7 - Fluxograma do fracionamento das frações FAE e FB em coluna Sephadex. .......... 43
Figura 8 - Gráficos do teste de Cristal Violeta representando a citotoxicidade dos extratos
Brutos e suas frações, em concentrações de 25 μg/mL, 50 μg/mL, 75 μg/mL, 100 μg/mL, 150
μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 1 mg/mL e os grupos Controle positivo (Somente células,
sem adição de extrato) e Controle negativo (Células em meio com látex, sem adição de
extrato) em células L929, durante o período de incubação de 24 h. Teste estatístico ANOVA
com Significância de≤0.05
P (*), Muito Significativo P≤0.01(**) e Extremamente
Significativo P≤0.001 (***) quando comparados ao grupo controle + .................................... 46
Figura 9 - Gráficos do teste de Cristal Violeta representando a citotoxicidade dos extratos
Bruto e suas frações, em concentrações de 25 μg/mL, 50 μg/mL, 75 μg/mL, 100 μg/mL, 150
μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 1 mg/mL e os grupos Controle positivo (Somente células,
sem adição de extrato) e Controle negativo (Células em meio com látex, sem adição de
extrato) em células L929, durante o período de incubação de 48 h. Teste estatístico ANOVA
com Significância de≤0.05
P (*), Muito Significativo P≤0.01(**) e Extremamente
Significativo P≤0.001 (***) quando comparados ao grupo controle + .................................... 47
Figura 10 - Gráficos representando a atividade mitocondrial em resposta aos extratos Bruto e
suas frações, em concentrações de 25μg/mL, 50 μg/mL, 75 μg/mL, 100 μ g/mL, 150 μg/mL,
250 μg/mL, 500 μg/mL, 1 mg/mL e os grupos Controle positivo (Somente células, sem adição
de extrato) e Controle negativo (Células em meio com látex, sem adição de extrato) em
células L929, durante o período de incubação de 24 h. Teste estatístico ANOVA com
Significância de P≤0.05 (*), Muito Significativo P≤0.01(**) e Extremamente Significativo
P≤0.001 (***) quando comparados ao grupo controle + ......................................................... 49
Figura 11 - Gráficos representando a atividade mitocondrial em resposta aos extratos Bruto e
suas frações, em concentrações de 25μg/mL, 50 μg/mL, 75 μg/mL, 100 μg/mL, 150 μg/mL,
250 μg/mL, 500 μg/mL, 1 mg/mL e os grupos Controle positivo (Somente células, sem adição
de extrato) e Controle negativo (Células em meio com látex, sem adição de extrato) em
células L929, durante o período de incubação de 48 h. Teste estatístico ANOVA com
Significância de P≤0.05 (*), Muito Signi ficativo P≤0.01(**) e Extremamente Significativo
P≤0.001 (***) quando comparados ao grupo ontrole + ........................................................... 50
Figura 12 - Gráficos representando a atividade lisossomal através do teste de Vermelho
Neutro, em relação aos extratos Bruto e suas frações, em concentrações deμg/mL,
25
50
μg/mL, 75 μg/mL, 100 μg/mL, 150 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 1 mg/mL e os grupos
Controle positivo (Somente células, sem adição de extrato) e Controle negativo (Células em
meio com látex, sem adição de extrato) em células L929, durante o período de incubação de
24 h. Teste estatístico ANOVA com Significância≤0.05
de P (*), Muito Significativo
P≤0.01(**) e Extremamente Significativo ≤0.001
P
(***) quando comparados ao grupo
controle + .................................................................................................................................. 52
Figura 13 - Gráficos representando a representando a atividade lisossomal através do teste de
Vermelho Neutro, em relação aos extratos Bruto e suas frações, em concentrações de 25
μg/mL, 50 μg/mL, 75 μg/mL, 100 μg/mL, 150 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 1 mg/mL e os
grupos Controle positivo (Somente células, sem adição de extrato) e Controle negativo
(Células em meio com látex, sem adição de extrato) em células L929, durante o período de
incubação de 48 h. Teste estatístico ANOVA com Significância≤0.05
de P(*), Muito
Significativo P≤0.01(**) e Extremamente Significativo P≤0.001 (***) quando comparados ao
grupo controle + ....................................................................................................................... 53
Figura 14 - Gráficos representando a representando a atividade sob o núcleo celular através do
ensaio de Cristal Violeta, em relação as frações obtidas através da partição em coluna
Sephadex do extrato Acetato de etila. Em concentrações de 250 μg/mL, 500 μg/mL, 1 mg/mL
e os grupos Controle positivo (Somente células, sem adição de extrato) e Controle negativo
(Células em meio com látex, sem adição de extrato) em células L929, durante o período de
incubação de 48 h. Teste estatístico ANOVA com Significância≤0.05
de P(*), Muito
Significativo P≤0.01(**) e Extremamente Significativo P≤0.001 (***) quando comparados ao
grupo controle + ....................................................................................................................... 55
Figura 15 - Gráficos representando a representando a atividade sob o núcleo celular através do
ensaio de Cristal Violeta, em relação as frações obtidas através da partição em coluna
Sephadex do extrato Acetato de etila. Em concentrações de 250 μg/mL, 500 μg/mL, 1 mg/mL
e os grupos Controle positivo (Somente células, sem adição de extrato) e Controle negativo
(Células em meio com látex, sem adição de extrato) em células L929, durante o período de
incubação de 48 h. Teste estatístico ANOVA com Significância≤0.05
de P(*), Muito
Significativo P≤0.01(**) e Extremamente Significativo P≤0.001 (***) quando comparados ao
grupo controle + ....................................................................................................................... 56
Figura 16 - Gráficos representando a representando a atividade sob o núcleo celular através do
ensaio de Cristal Violeta, em relação as frações obtidas através da partição em coluna
Sephadex do extrato Butanol. Em concentrações de 250 μg/mL, 500 μg/mL, 1 mg/mL e os
grupos Controle positivo (Somente células, sem adição de extrato) e Controle negativo
(Células em meio com látex, sem adição de extrato) em células L929, durante o período de
incubação de 48 h. Teste estatístico ANOVA com Significância≤0.05
de P(*), Muito
Significativo P≤0.01(**) e Extremamente Significativo P≤0.001 (***) quando comparados ao
grupo controle +. ...................................................................................................................... 58
Figura 17 - Gráficos representando a representando a atividade sob o núcleo celular através do
ensaio de Cristal Violeta, em relação as frações obtidas através da partição em coluna
Sephadex do extrato Butanol. Em concentrações de 250 μg/mL, 500 μg/mL, 1 mg/mL e os
grupos Controle positivo (Somente células, sem adição de extrato) e Controle negativo
(Células em meio com látex, sem adição de extrato) em células L929, durante o período de
incubação de 48 h. Teste estatístico ANOVA com Significância≤0.05
de P(*), Muito
Significativo P≤0.01(**) e Extremamente Significativo P≤0.001 (***) quando comparados ao
grupo controle +. ...................................................................................................................... 59
Figura 18 - Cromatograma da fração A5. Com destaque para o pico de interesse em 32.350
min e seu respectivo espectro cujo comprimento de onda máximo
λ máx.)
(
é de 224 nm
determinado como Composto A. .............................................................................................. 60
Figura 19 - Cromatograma da fração A6. Com destaque para o pico de interesse em 32.331
min e seu respectivo espectro cujo comprimento de onda máximo
λ máx.)
(
é de 228 nm
determinado como Composto B ............................................................................................... 61
Figura 20 - Cromatograma da fração A7. Com destaque para o pico de interesse em 2.952 min
e seu respectivo espectro cujo comprimento de onda máximo
λ máx.)( é de 222 nm
determinado como Composto C. .............................................................................................. 61
Figura 21 - Cromatograma da fração B6. Com destaque para os picos de interesse em 2.957
min, 5.565 min e 17.409 min e seus respectivos espectros cujo comprimento de onda máximo
(λ máx.) é de 258 nm, 324 nm e 319 nm determinados como Composto D, Composto E e
Composto F respectivamente ................................................................................................... 62
Figura 22 - Cromatograma da fração B6. Com destaque para os picos de interesse em 1.835
min, 4.043 min e 11.949 min e seus respectivos espectros cujo comprimento de onda máximo
(λ máx.) é de 325 nm, 285 nm e 206 nm determinados como Composto G, Composto H e
Composto I respectivamente .................................................................................................... 62
Figura 23 - Cromatograma do espilantol empregando metodologia utilizada para análise das
frações Acetato de etila. Com destaque para o pico de interesse em 34.083 min e seu
respectivo espectro cujo comprimento de onda máximoλ(máx.) é de 229 nm determinado
como Espilantol de acordo com Santos (2010) ........................................................................ 63
Figura 24 - Cromatograma do espilantol empregando metodologia utilizada para análise das
frações Butanol. Com destaque para o pico de interesse em 44.446 min e seu respectivo
espectro cujo comprimento de onda máximoλ m
( áx.) é de 229 nm determinado como
Espilantol de acordo com Santos (2010) .................................................................................. 64
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Gêneros de Asteraceae que estão na Lista Vermelha realizada pela revista da Flora
Brasileira. Onde (n) e (%) apontam o número de espécies e sua percentagem, respectivamente
.................................................................................................................................................. 29
Tabela 2 - Principais características que diferem os gêneros Acmella e Spilanthes, segundo
Jansen (1981). ........................................................................................................................... 30
Tabela 3 - Composição química em 100g de folhas de A. oleracea. ....................................... 34
Tabela 4 - Fase móvel empregada para análise por CLAE-DAD da Fração Acetato de Etila
(FAE) ........................................................................................................................................ 44
Tabela 5 - Fase móvel empregada para análise por CLAE-DAD da Fração Butanol (FB) .... 44
Tabela 6- Presença de atividade por teste realizado ................................................................. 51
Tabela 7 - Comparação entre as atividades das frações AE e B............................................... 57
Tabela 8 - Caracterização dos compostos obtidos por cromatografia das frações A5, A6, A7,
B6 e B7 ..................................................................................................................................... 65
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
A.oleracea: Acmella oleracea
a.C: Antes de Cristo
ACN: Acetonitrila
ºC: Graus Celsius
CEN: Centro de Estudos da Natureza
CLAE-DAD: Cromatografia Líquida de Alta Aficiência com Detector de Arranjo de
Diodos
cm: centímetro
CO2: Gás Carbônico
d.C: Depois de Cristo
DMEN: Meio Eagle Modificado por Dulbecco
DMSO: Dimetil Sulfóxido
DNA: Ácido desoxirribonucleico
EtOHEB: Extrato Bruto
EUA: Estados Unidos da América
FA: Fração Aquosa
FAE: Fração Acetato de etila
FB: Fração Butanol
FC: Fração Clorofórmio
FH: Fração Hexâno
g: gramas
h: horas
HL60: Células de leucemia promielocítica humana
INCA: Instituto Nacional do Câncer
IP&D: Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento
kg/dia: quilograma por dia
L929: Linhagem de células de fibroblasto de camundongo
MCA: Medicina Complementar Alternativa
min: Minuto
mg: Miligrama
mg/ mL: Miligrama por mililitros
mL: Mililitro
mL/min: Mililitro por minuto
MTC: Medicina Tradicional Chinesa
MTT: Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio
nM: nanomolar
OMS: Organização Mundial de Saúde
PBS: Solução Salina Tampão Fosfato
pH: Potencial Hidrogeniônico
SDS: Dodecilsulfato de sódio
SFB: Soro Fetal Bovino
S. oleracea: Spilanthes oleracea
SP: São Paulo
SUS: Sistema Único de Saúde
UNIVAP: Universidade do Vale do Paraíba
μL: Microlitros
μg: Microgramas
μg/ml: micrograma/mililitro
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 14
1.1
1.2
OBJETIVO GERAL ....................................................................................................... 16
OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................................... 16
2
REVISÃO DE LITERATURA ....................................................................................... 17
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.5.1
COEVOLUÇÃO HOMEM/PLANTA ............................................................................ 17
A IMPORTÂNCIA DAS PLANTAS PARA A SOCIEDADE ....................................... 21
METABÓLITOS SECUNDÁRIOS E SUAS APLICAÇÕES ........................................ 23
RELAÇÃO BENEFÍCIOS/MALEFÍCIOS: PLANTAS TÓXICAS ............................... 26
FAMÍLIA: ASTERACEAE, GÊNERO: ACMELLA/SPILANTHES ............................ 29
Espécie: A. oleracea, o jambu ........................................................................................ 32
3
METODOLOGIA ........................................................................................................... 38
3.1
3.2
3.4
3.5
3.6
3.7
3.7.1
3.7.2
3.7.3
3.8
3.9
CULTIVO DA PLANTA MEDICINAL ......................................................................... 38
PROCESSO DE EXTRAÇÃO ........................................................................................ 38
FRACIONAMENTO LÍQUIDO-LÍQUIDO................................................................... 39
LINHAGEM CELULAR ESTUDADA .......................................................................... 40
PREPARAÇÃO DAS CÉLULAS PARA EXPERIMENTAÇÃO .................................. 41
DETERMINAÇÃO DA CITOTOXICIDADE ............................................................... 41
Ensaio de MTT ................................................................................................................ 41
Ensaio de Cristal Violeta ................................................................................................ 42
Teste de Vermelho Neutro ............................................................................................... 42
FRACIONAMENTO EM COLUNA SEPHADEX ........................................................ 43
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA- CLAE ............................... 44
4
RESULTADOS ............................................................................................................... 45
5
DISCUSSÃO .................................................................................................................. 66
6
CONCLUSÃO ................................................................................................................ 71
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................... 72
APÊNDICE A - LEITURAS E ESPECTROS NA ÍNTEGRA DAS FRAÇÕES A5, A6, A7,
A11, A14, B6, B7, B13, ESPILANTOL EM FAE E ESPILANTOL EM FB ......................... 80
14
1
INTRODUÇÃO
A flora mundial possui um grande potencial farmacêutico, nutricional, dentre outros, o
que explica a relação de dependência dos homens pelas plantas e sua de dependência para
suas inúmeras atividades essenciais à vida.
Sabe-se que existem aproximadamente 50.000 espécies vegetais só no Brasil e
acredita-se que ao menos metade destas possa conter alguma propriedade terapêutica,
podendo ser utilizadas para o tratamento de diversas doenças. Entretanto, menos que 1%
dessas espécies com potencial medicinal foi devidamente estudada, fazendo com que muitas
destas plantas medicinais não tenham suas atividades aproveitadas pela sociedade, atividades
importantes para o tratamento de determinadas doenças cujo conhecimento é então perdido
(GIULIETTI et al., 2005; MILLANI et al., 2010).
As ervas medicinais vem aumentando sua importância na medicina tradicional, porém
está incluso na Medicina Complementar Alternativa (MCA), o principal sistema utilizador de
plantas para fins terapêuticos. A MCA baseia-se em um conjunto de sistemas médicos, onde
se aplicam práticas e produtos que não são considerados parte da medicina convencional, ou
moderna, sendo a fitoterapia seu sistema de aplicação que possui maior influência dos
vegetais. Este consiste em uma ciência que visa o tratamento e cura de algumas doenças
através das ervas e plantas que apresentam propriedades medicinais curativas (FONSECA;
PEREIRA, 2004).
Os produtos fitoterápicos, assim como qualquer medicamento, deve oferecer garantia
de qualidade, ter efeitos terapêuticos comprovados, composição padronizada e segurança de
uso para a população. A eficácia e a segurança destes devem ser validadas por meio de
estudos farmacológicos e toxicológicos não-clínicos e clínicos, com auxílio de levantamentos
etnofarmacológicos, documentações tecnocientíficas e em bibliografia das plantas medicinais
em que derivam estes produtos (AGENCIA NACONAL DE VIGILANCIA SANITARIA,
2012).
Contudo ainda há um indiscriminado uso de diversas plantas e de seus extratos
baseados somente em conhecimentos populares, os quais, muitas vezes, são aliados à crença
de que por ser natural não causam reações adversas, mesmo não havendo sido realizados os
devidos estudos toxicológicos da planta. Isto acaba por aumentar os riscos de intoxicação,
agravamento de sintomas e em alguns casos o falecimento do usuário (TUROLLA;
NASCIMENTO, 2006).
15
Fonseca e Pereira (2004) ressaltam que as plantas são capazes de produzir diferentes
substâncias tóxicas em pequenas ou grandes quantidades para sua defesa contra vírus,
bactérias, fungos e animais predadores. Estas substancias são chamadas de metabólitos
secundários, e ajudam na adaptação e sobrevivência do vegetal. Segundo os autores, pesquisas
e estudos têm comprovado que muitos destes metabólitos extraídos de plantas medicinais
podem causar danos ao material genético animal, como mutações (adição, substituição ou
deleção de base no DNA), podendo levar ao desenvolvimento de doenças como o câncer.
Dentre os principais metabólitos de plantas que podem causar estes danos ao
organismo, caracterizando sua toxicidade, estão os glicosídeos cianogênicos, ricina, alcaloides
como a coniina, certos agentes e compostos antitumorais como os alcaloides de vinca
(vincristina e a vimblastina) e o taxol, além de alguns flavonoides e terpenóides como as
lactonas sesquiterpênicas (MENGUE; MENTZ; SCHENKEL, 2001).
Desta forma, é imprescindível que as plantas popularmente usadas tenham seus
estudos de segurança e atividade realizados com uma maior importância. Dentre estas plantas
temos a Acmella oleracea (A. oleracea). Nativa da Amazônia, A. oleracea é uma planta
herbácea e hortaliça que apresenta largo consumo na região norte do Brasil, principalmente no
Pará onde suas folhas são utilizadas na culinária local (PIMENTEL, 1985).
Também conhecida como jambú, esta planta possui propriedades químicas
importantes que vem despertando o interesse farmacêutico, destacando-se principalmente
as alquilamidas (VILLACHICA et al., 1996; BAE et al., 2010). Seu principal princípio ativo,
o espilantol, é uma N-alquilamida (N- isobutil-amida espilantol) (BOONEN et al., 2010) e é
obtido em maior quantidade a partir de suas inflorescências e folhas. Este composto ativo vem
ganhando espaço no meio industrial, principalmente como parte de produtos cosméticos e
possíveis medicamentos para o tratamento de diversas doenças e aflições (GUSMÃO et al.,
2005). Dentre estas aflições, A. oleracea é comumente usada em casos de dor de dente,
gargarejo e estomatites. Outros estudos demonstraram também a capacidade curativa de suas
folhas e inflorescências, como as ações diurética, antibacteriana e anti-inflamatória (WU et
al., 2008) e, por esta razão, são usadas em infusões para o tratamento de algumas doenças
como a anemia, dispepsia e malária (RANZI, 2005).
Estas amplas atividades terapêuticas são explicadas por sua composição. Todavia a
grande variedade de metabólitos secundários no vegetal aumenta não apenas seu potencial
terapêutico como também a possibilidade de um ou mais destes compostos serem tóxicos.
Entretanto, poucos estudos sobre A. oleracea e a atuação de seus compostos bioativos no
16
organismo, assim como estudos genotoxicológicos, foram devidamente realizados, a fim de
comprovar a segurança e eficácia do emprego terapêutico popular de seus extratos.
1.1 OBJETIVO GERAL
Este estudo objetivou avaliar a ação citotóxica in vitro do extrato das folhas de
Acmella oleracea em células de linhagem L929 (fibroblasto de camundongo), e identificar as
classes químicas dos metabólitos secundários responsáveis pelos danos citotóxicos às células.
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
•
Obter as frações do extrato bruto das folhas de Acmella oleracea por
fracionamento líquido-líquido através de solventes com grau crescente de polaridade
(Hexano, Clorofórmio, Acetato de etila, e N-butanol).
•
Avaliar a toxicidade das frações obtidas (Acetato de etila (FAE), Butanol (FB),
Clorofórmio (FC), Hexano (FH), além dos extratos Bruto (EtOHEB) e da Fração Aquosa
(FA)) em linhagem celular L929 pelas atividades mitocondrial e lisossomal, além de sua ação
sob o núcleo celular, verificando a densidade e viabilidade celular pelos métodos de
Vermelho Neutro, MTT e Cristal Violeta, respectivamente.
•
Separar em coluna de Sephadex as frações anteriores e identificar as subfrações
de maior atividade por meio de biomonitoramento pelo teste de Cristal Violeta.
•
Classificar os metabólitos secundários presentes nas frações de A. oleracea,
obtidas por Sephadex, em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE-DAD) identificando
ou grupo de metabólitos responsável por sua atividade citotóxica.
17
2
REVISÃO DE LITERATURA
A seguir a revisão bibliográfica que este estudo se baseou, afim de e enfatizar a
importância das plantas para a humanidade e de introduzir a Acmella oleracea alvo dete
trabalho.
2.1 COEVOLUÇÃO HOMEM/PLANTA
A importância que as plantas exercem sobre a sociedade desde tempos imemoriais é
inegável. Desde o surgimento da vida na terra as plantas vêm intensificando sua influência,
seja como doadora de dióxido de carbono para a estabilização de uma atmosfera primordial
perturbada por eventos cataclísmicos e oxigênio para a respiração animal, seja como fonte de
alimento e materiais necessários à sobrevivência humana.
A vida surgiu, evoluiu, se extinguiu, adaptou-se e evoluiu novamente, porém as
plantas permaneceram, e se adaptaram. Diz-se então que houve, e há uma coevolução entre
plantas e vida, definida posteriormente, e principalmente, como vida animal.
Tomando conhecimento destas importâncias, o então agora homem passou a explorar
as capacidades das plantas. Descobriu-se então, não só suas propriedades nutricionais como
fonte de alimento, mas também suas propriedades curativas. Assim deu-se inicio a utilização
das plantas como remédio primitivo para cura e tratamento de males que assolavam os
homens.
A curiosidade e necessidade do homem permitiu que ao longo do tempo diversas
substâncias, chamadas de metabólitos secundários, e terapias viessem a serem descobertas,
propondo a criação e o avanço da Medicina Complementar Alternativa (MCA).
A MCA consiste em um conjunto de sistemas médicos, onde se aplicam práticas e
produtos que não são considerados parte da medicina convencional ou tradicional. Seus
métodos permitem que haja uma organização de acordo com suas aplicações: Sistemas
médicos alternativos (Homeopatia, ayurvédica, etc.), Intervenções mente-corpo (meditações,
etc), Terapias biológicas (fitoterapia e seus produtos naturais), dentre outras. Esses níveis
organizacionais quando aplicados juntamente com a medicina tradicional são denominados de
práticas complementares, quando utilizados separadamente à medicina tradicional são ditos
como práticas alternativas (TESSER; BARROS, 2008).
18
O conhecimento sobre as aplicações e propriedades de plantas medicinais foram
passadas ao longo de gerações por famílias, xamãs, pajés, curandeiros e, enfim, médicos. A
cultura popular permitiu que a MCA se sustentasse ao longo dos anos até a atualidade, onde o
avanço tecnológico predomina na medicina tradicional. Entretanto, ressurge na sociedade
moderna o interesse nas plantas medicinais devido, a sua facilidade de aplicação, podendo ser
utilizadas de diversas formas (através de cataplasmas, infusão, suco, chá, tintura, unguento,
vinho medicinal, etc.), além de serem rentáveis e de baixo custo monetário, aproveitando-se
de suas diversas estruturas vegetais como raízes, caules, flores, sementes e folhas
(BRANDÃO, 1991). O alto custo dos medicamentos atuais, principalmente de determinadas
doenças como o câncer, têm levado a população a procurar na MCA uma alternativa tão
eficaz quanto à medicina tradicional, utilizando-se, em sua maioria, de fitoterápicos, sendo
estes de fácil acesso e mais econômicos (FONSECA; PEREIRA, 2004).
Como já dito, há na MCA as terapias biológicas, utilizando-se de produtos de origem
naturais para fins terapêuticos. Nesta categoria denomina-se fitoterapia a ciência que visa o
tratamento e cura de algumas doenças através das ervas e plantas que apresentam
propriedades medicinais curativas (FONSECA; PEREIRA, 2004).
Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS) aproximadamente 80% da
população mundial já fez uso de ervas medicinais em busca de solução e alívio para alguns
sintomas de suas doenças (MILLANI et al., 2010), o que evidencia a crescente participação
das plantas na medicina atual. Este alto percentual pode ser explicado, principalmente, pela
comprovada eficácia dos medicamentos naturais e seu baixo custo monetário, além do
aumento nos estudos e pesquisas envolvendo plantas medicinas e suas substâncias. Devido a
estas principais características, alguns autores como Cunha (2004), defendem a inclusão da
MCA e especificamente a fitoterapia no Sistema Único de Saúde (SUS) propondo, por
exemplo, que a homeopatia, Medicina Tradicional Chinesa (MTC) e a fitoterapia sejam
incorporadas como atendimento básico à sociedade.
Ao decorrer dos séculos as plantas continuaram a ter um importante papel na
sociedade, onde a tecnologia surgia e se aprimorava. Em geral, a população fez destas plantas
a base de sua medicina curativa até o surgimento e evolução de novas tecnologias e da
medicina contemporânea. Assim, ao longo dos anos, este conhecimento sobre ervas curativas
foi passado por pequenas populações e entre famílias, até que estas plantas com capacidade
curativa se tornaram o pilar da Medicina Alternativa.
19
Estas capacidades vêm sendo analisadas a milhares de anos. Por volta de 3000 a.C,
chineses já se utilizavam de ervas para fins medicinais, este interesse despertado há milênios
permitiu que 5136 espécies de plantas medicinais fossem estudadas no país para ter seu uso
aprovado atualmente. Destas, 300 espécies possuem seus princípios ativos devidamente
caracterizados (FOGLIO et al., 2006). Ainda neste período, na China, Shen Nung tornou-se
autor do que se tornaram os primeiros dados escritos sobre usos de remédios à base de plantas
medicinais, esta obra ele chamou de Pen Ts’ao, “A Grande Fitoterapia” (TOMAZZONI;
NEGRELLE; CENTA, 2006). A medicina chinesa veio a se tornar uma das principais
referências à MCA, porém esta possuía seus ideais se formando também em outras partes do
mundo.
No Egito antigo, aproximadamente em 2000 a.C, as plantas também eram usadas para
fins medicinais. Sabe-se, através do papiro de Ebers que data de 1500 a.C, que cerca de 700
substâncias variadas e extratos vegetais eram utilizados e descritos pelos egípcios
(ALMEIDA, 1993).
As utilizações de plantas pela humanidade ultrapassam continentes, sendo encontrados
registros desta relação homem/planta nos quatro cantos do globo. Do outro lado do Oceano
Atlântico, as antigas civilizações americanas cultivavam e cultuavam o que veio a ser um
fenômeno gastronômico, econômico e medicinal: o cacau, fonte do chocolate. A cerca de
1000 a.C os Maias e Astecas cultivavam o cacau no México e passaram a utilizar dessa
cultura como forma de alimento e moeda, realizando rituais em agradecimento aos deuses
pela dádiva do fruto. O cacau ficou restrito a America até a chegada dos europeus quando,
principalmente, os espanhóis disseminaram o chocolate pelo mundo por volta de 1500 d.C.
(DILLINGER et al., 2000; RUSCONI; CONTI, 2010).
Seguindo no tempo, mas ainda em grandes civilizações, na Grécia em meados de 460377 a.C surgiam compilações e obras sobre a utilização de plantas. Hipócrates, conhecido
como Pai da Medicina, escreveu o chamado Corpus Hipocratium, uma reunião de
conhecimentos médicos e que indicava produtos vegetais para determinada enfermidade
(MARTINS et al., 2000). Dioscórides, outro importante médico grego, considerado o pai da
farmacognosia, catalogou em sua obra chamada de “De Matéria Médica”, no século I d.C,
aproximadamente 600 plantas já utilizadas como medicamentos em seu tempo, onde muitas
destas ainda são aplicadas na MCA atualmente. Este período histórico na Grécia foi marcado
pelo desenvolvimento cientifico e medicinal, havendo uma imensa descoberta e promoção do
20
conhecimento a cerca das capacidades curativas das plantas (TOMAZZONI; NEGRELLE;
CENTA, 2006).
Com a ascensão do Império Romano, declínio da Grécia, e por fim a queda de Roma
há a chegada da Idade Media na Europa. Neste período do século V-XV d.C o controle e
restrição exercido pela Igreja católica sobre a sociedade científica impediu o avanço do
conhecimento e pesquisas em geral. Deste modo, poucos estudos e informações sobre ervas
medicinais foram produzidos e divulgados à população (MARTINS et al., 2000).
Por volta do século XIV-V, com o fim da Idade Média, foi potencializado o avanço
científico e tecnológico. Este período foi marcado também pela exploração naval e a
descoberta do Novo Continente, propagando, assim, o conhecimento geral. Ao norte do
continente americano as civilizações astecas e maias já cultivavam vegetais para consumo e
para fins terapêuticos como relatado anteriormente. Ao sul lendas relacionando dádivas
divinas e plantas são passadas por gerações até hoje. Como exemplo pode-se citar as lendas
da mandioca e do guaraná. Estas histórias indígenas foram passadas por gerações e remonta à
origem divina destas plantas, a divulgação destas histórias pode explicar o grande consumo
destes produtos até a atualidade, principalmente entre a população brasileira. No Brasil até
meados de 1500, a utilização de plantas e suas aplicações curativas eram restritas aos povos
indígenas, até a chegada dos colonizadores que trouxeram, mas principalmente levaram a
compreensão a cerca da flora presente no novo mundo (BARRETO, 2011; MÜHLEN;
MARTINS; ANDO 2000; SILVA, 2004).
Assim deu-se a expansão e globalização do conhecimento sobre a capacidade curativa
e terapêutica das diversas espécies de plantas espalhadas pelo planeta. Neste período até os
tempos atuais a tecnologia se tornou um fator importante para o homem. Este passou a ser
dependente da tecnologia, e com seu foco voltado a ela, houve variadas descobertas
científicas.
Porém as plantas continuaram e continuam fazendo parte das mais básicas até as mais
necessárias atividades do homem, mesmo que minimamente favorecida, pois com a constante
evolução da tecnologia, principalmente na medicina, as plantas antes definidas como a
principal fonte de alívios e cura de doenças, agora passaram a serem consideradas
“alternativas” nas formas de tratamento. Todavia as plantas continuaram a ser a principal
fonte medicamentosa atualmente, mas associada à tecnologia para potencializar suas
aplicações e atividades.
21
2.2 A IMPORTÂNCIA DAS PLANTAS PARA A SOCIEDADE
Desta interação planta-tecnologia descobriram-se variadas substâncias extraídas dos
vegetais. Estas substâncias foram nomeadas de metabólitos secundários por apresentarem uma
distribuição restrita entre as espécies vegetais e não serem essenciais à manutenção da vida,
ao contrário dos metabólitos primários (carboidratos, lipídeos, aminoácidos e ácidos
nucléicos), que são essenciais para todas as espécies vivas.
Mais recentemente foram desenvolvidos novos métodos para o isolamento e análise de
substâncias ativas, sendo assim possível identificar e caracterizar as substâncias nos extratos
vegetais, podendo indicar qual composto, ou grupo de compostos, pode ser o responsável pela
atividade da planta. Estas novas técnicas fizeram ressurgir o interesse por compostos de
origem vegetal que pudessem ser utilizados como protótipos para o desenvolvimento de
novos fármacos (TUROLLA; NASCIMENTO, 2006).
Diversos exemplos podem ser citados a respeito da descoberta dos metabólitos
secundários, porém dentre os mais importantes e de amplo uso pela medicina tradicional está
a morfina. Esta é extraída da espécie Papaver somniferum L. (Papaveraceae) conhecida
popularmente como papoula. A morfina foi primeiramente isolada pelo farmacêutico alemão
F. Setürner em 1803. Nesta mesma planta a por volta de 1824, isolou-se a codeína pelo
químico francês Pierre Jean Robiquet e posteriormente a papaverina, por George Fraz Merck
na Alemanha em 1848 (FOGLIO et al., 2006).
Como exemplo há também as espécies Digitalis purpurea L. e a Digitalis lanata Ehr.,
utilizadas a milhares de anos. Contudo em 1928 foram isolados por Sydney Smith, na
Inglaterra, seus metabólitos; glicosídeos cardiotônicos, denominados cardenolídeos. Dentre
eles estão a digitoxina e a digoxina, que vem sendo utilizadas amplamente em medicamentos
para afecções cardíacas (FOGLIO et al., 2006).
Doenças cardíacas estão entre as mais visadas para descobertas e desenvolvimento de
tratamentos. Entretanto é inegável que o câncer é a doença com maior atenção em pesquisas
para na procura de curas. A dificuldade de tratamento desta enfermidade e o crescente
aumento de doentes incentivou a utilização de plantas como recurso para uso terapêutico na
sociedade atual.
Uma pesquisa realizada pelo Instituto Nacional do Câncer (INCA) em 2009 revelou
que para os anos de 2012 e 2013 as estimativas para ocorrência de novos casos de câncer no
22
Brasil chegariam a aproximadamente 518.510 (INSTITUTO NACIONAL DO CÂNCER,
2009).
Assim, o câncer tornou-se um evidente problema de saúde pública, sendo, como em
muitas outras doenças, os países de baixa e média renda os mais afetados com mortes. Novas
estimativas de casos desta doença indicam que no ano de 2030 haverá aproximadamente 27
milhões de casos incidentes, em mais de 17 milhões casos levará a mortes e 75 milhões de
pessoas vivas, anualmente, irão ter câncer (INSTITUTO NACIONAL DO CÂNCER, 2009).
Estes fatores quando somados aos modos de tratamentos invasivos e de grandes efeitos
colaterais utilizados pela medicina tradicional atual, como as cirurgias, radiação, dentre
outros, fizeram com que muitos pacientes com câncer e outras enfermidades,
aproximadamente 60%, busquem algum método alternativo, como a MCA, para seu
tratamento (ARAÚJO et al., 2007).
Com o passar dos anos algumas vitórias da medicina no combate ao câncer foram
realizadas sendo que muitas destas estão intimamente ligadas a compostos vegetais. Sabe-se
que alguns medicamentos utilizados na quimioterapia são isolados a partir de plantas ou
derivados de um protótipo natural, pode-se citar dentre estes compostos ativos a vimblastina e
a vincristina, essas substâncias são alcaloides isolados de Catharanthus roseus (L) G. Don.
Há também o irinotecano, um alcaloide obtido a partir da casca de Camptotheca acuminata
Decne, (MORAES; ALONSO; OLIVEIRA-FILHO, 2011), além de outras substâncias como
etoposídeo tenoposídeo, topotecano e taxanos (CRAGG et al., 1993).
O taxol, uma substância quimioterápica isolada a partir da planta Taxus brevifolia é
também um importante agente antimitótico usado principalmente no tratamento do câncer de
ovário, mama e pulmão. Sua ação se baseia na interferência na função adequada dos
microtúbulos celulares ligando-se à proteínaβ -tubulina. No entanto, a vimblastina atua
diretamente na despolimerização dos microtúbulos, ligando-se a proteína αβ -tubulina na fase
S do ciclo celular não permitindo sua polimerização. Estas duas substâncias e suas influências
nas proteínas dos microtúbulos incapacitam o uso adequado do citoesqueleto, levando, em sua
maioria, à morte celular (BONATO; SHARAN; CHIUCHETTA, 2006; BRANDÃO et al.,
2010).
Estas atividades, dentre outras, justificam o grande interesse das substâncias
medicinais produzidas pela natureza, seja de origem vegetal ou animal. Os produtos naturais e
seus derivados representam mais que 50% de todos os medicamentos em uso clínico no
23
mundo, salientando o importante e fundamental papel das plantas no tratamento e prevenção
de diversas doenças (EL-SHEMY et al., 2007, GURIB-FAKIM, 2006).
2.3 METABÓLITOS SECUNDÁRIOS E SUAS APLICAÇÕES
A origem destes princípios ativos e de muitas substâncias vegetais ainda não é
completamente esclarecida. Sabe-se que o metabolismo primário começa com a fotossíntese e
forma entre outros produtos as proteínas, ácidos nucleicos, polissacarídeos e lipídeos. Da
mesma forma, sabe-se que há o metabolismo secundário, que segue diferentes vias e dá
origem a substâncias diversas (FREIRE, 2004). A complexidade das vias do metabolismo
secundário e os fatores que os alteram, como a temperatura e estresse hídrico, tornam ainda
mais difícil o estudo dos produtos deste metabolismo. Porém, diversos bioativos produzidos
pelas plantas em seu metabolismo secundário têm suas origens completamente esclarecidas e
estudadas.
Produtos do metabolismo secundário possuem diversas funções nos vegetais, porém
nenhuma destas é considerada essencial para a vida da planta ou de outro organismo que os
produzem. Contudo, ainda assim são importantes no processo de desenvolvimento vegetal,
pois cada composto produzido por este processo metabólico confere à planta uma
determinada característica adaptativa e vantagem para o sucesso e sobrevivência do indivíduo.
Dentre estas características estão as funções de atrativo aos polinizadores para uma
disseminação da espécie mais eficiente, defesa contra herbívoros e patógenos e uma defesa
química, a alelopatia, contra predadores e competidores inter e até mesmo intraespécie
(LÓPEZ-BUCIO et al., 2006; SIMÕES et al., 2003).
Diversos são os bioativos produzidos pelo metabolismo secundário, dentre os mais
estudados, devido a sua alta atividade e aplicações terapêuticas, estão os flavonoides,
alcaloides e terpenóides. Muitos destes metabólitos podem causar danos ao organismo,
caracterizando sua toxicidade, entre eles estão os glicosídeos cianogênicos, ricina, alcaloides
como a coniina, alcaloides de vinca como a vincristina e a vimblastina, o taxol, flavonoides e
terpenóides como as lactonas sesquiterpênicas. Esta toxicidade pode ser determinada quando
relacionada a outros fatores como a dosagem ingerida, por exemplo. Na ausência destes
fatores estes compostos podem ter sua toxicidade reduzida ou não apresentá-la (MENGUE;
MENTZ; SCHENKEL, 2001).
24
Os flavonoides estão presentes no grupo de metabólitos denominados de compostos
fenólicos e são considerados uma das classes de bioativos de maior importância e ampla
utilização pelo mundo. As atividades destes compostos estão diretamente relacionadas à sua
estrutura química, possuindo, em geral, estrutura de quinze carbonos dispostos em dois anéis
aromáticos ligados por uma cadeia de três carbonos, ou seja C6 -C3 –C6. Como relatado, estes
compostos podem ter diferentes funções adaptativas nas plantas, alguns flavonoides, como os
flavonóis, atuam como atrativo aos polinizadores que enxergam em uma faixa de luz
ultravioleta invisível ao olho humano, gerando o chamado guia de nectário utilizado pelos
insetos para o direcionamento ao pólen. Os flavonóis possuem também, assim como as
flavonas, atividade como protetores químicos, pois absorvem luz protegendo as células
vegetais dos danos causados pela grande incidência de luz solar, sendo de extrema
importância na flora de países tropicais ou em regiões equatoriais e desérticas (FERREIRA;
OLIVEIRA; SANTOS, 2008).
Na medicina alternativa e até mesmo na tradicional, o grupo dos flavonoides possui
grande notoriedade, devido principalmente à suas variadas propriedades medicinais como
antioxidante, anti-inflamatória, antiviral, antitumoral, dentre outras (SIMÕES et al., 2003).
Sua atividade como antioxidante é decorrente da capacidade de reduzir a formação de radicais
livres e neutralizar as espécies oxidantes e pode ser correlacionada a sua atividade como
fotoprotetora nos vegetais (MILITÃO, 2005). A atividade tóxica dos flavonoides em células
tumorais tem sido descritas em diversos estudos. Como exemplo, temos os experimentos de
Sonoda et al. (2004) que testaram 17 flavonoides em células de leucemia humana (HL60),
destes 10 apresentaram citotoxicidade. Contudo, esta atividade pode não ser especificamente
para células tumorais, podendo também causar danos a uma célula normal.
Em um estudo envolvendo flavonoides, realizado por Beutler et al. (1998), foi
avaliada a atividade citotóxica de 79 flavonas e sua ação no processo de polimerização dos
microtúbulos celulares. Este estudo revelou que os compostos com o grupamento 3-metoxi
são inibidores da polimerização da tubulina. Sabe-se ainda que alguns flavonoides como a
apigenina, miricetina e quercetina são capazes de induzir a morte por apoptose em células
leucêmicas através do estimulo da liberação do citocromo-c.
Os flavonoides estão entre os metabólitos mais estudados, porém outro grupo de alto
impacto na medicina são os alcaloides. Estes formam um grupo de compostos químicos que
estão presentes naturalmente em plantas, em alguns animais e até mesmo em determinados
microrganismos. São estruturados, principalmente, por átomos de nitrogênio, estando
25
incluídos neste grupo fármacos como a morfina, codeína e seus derivados (DEROSA;
MAFFIOLI, 2014; FOSSATI et al., 2014).
Entre os animais produtores de alcaloides, por seu metabolismo, estão as ascídias
marinhas, sendo estas o único invertebrado marinho gerador destes metabolitos. Nos últimos
25 anos uma grande quantidade de alcaloides foram isolados destes animais como, por
exemplo, as lamelarinas, ecteinascidinas, pirazinas bis-esteroidais e as pyrido acridinas. As
atividades antitumorais destes alcaloides de origem marinha em linhagem celulares humanas
já foram comprovadas e estudadas, outros estudos estão sendo realizados para que haja a
síntese de medicamentos derivados destes alcaloides (LI et al., 2013; MENNA, 2014).
Alcaloides de origem vegetal também estão sendo estudados com afinco. Estes estudos
possibilitaram a descoberta de diversas substâncias de notável importância no tratamento de
algumas doenças, como o câncer, diabetes, dentre outras.
A vincristina e vimblastina estão entre estes importantes alcaloides. Estas são extraídas
da Catharanthus roseus (L.) G. Don, mais conhecida como Vinca. A planta costumeiramente
utilizada para o tratamento da diabetes passou a ser um maior alvo de estudos após uma
pesquisa que avaliava a atividade hipoglicemiante da planta. Contudo os resultados
mostraram uma granulocitopenia produzida pelo extrato, devido a uma supressão da medula
óssea, assim supostamente haveria uma atividade em modelos de leucemia e linfomas. Esta
atividade foi comprovada posteriormente, havendo assim o isolamento da vincristina e
vimblastina e suas aplicações específicas. A atividade antimitótica destes alcaloides
possibilitou sua aprovação para uso medicamentoso por volta de 1965, sendo então,
principalmente, a vincristina utilizada para casos de leucemia, enquanto a vimblastina é
indicada em casos de câncer de mama, leucemia, linfoma, câncer de pulmão e testicular
(BRANDÃO et al., 2010; MORAES; ALONSO; OLIVEIRA-FILHO, 2011).
Os alcaloides ganharam fama na medicina tradicional devido as suas altas atividades,
geralmente apresentando algum grau de toxicidade. Essa toxicidade, quando não exagerada,
pode ser usada a favor da medicina em medicamentos para diversas doenças, como dito
anteriormente. Alguns dos remédios utilizados para o tratamento de alguns tipos de câncer,
por exemplo, são sintéticos derivados de alcaloides que apresentam toxicidade. Este é o caso
do irinotecano.
O irinotecano é um anticancerígeno utilizado desde meados de 1996 no tratamento dos
cânceres de cólon, pulmão e ovário. Este é um análogo da camptotecina que possui baixa
atividade anticancerígena, porém apresentava alta toxicidade para os rins em ensaios clínicos.
26
Esta característica se dá devido a instabilidade do anelα -hidroxi-δ-lactônico quando in vivo e
à pH neutro, pois ao atingir os rins a mudança do pH reestrutura a molécula causando danos
ao órgão (ALMEIDA et al., 2005; CHABNES; ROBERTS, 2005, BRANDÃO et al., 2010).
Em se tratando de atividade tóxica pode-se citar como um claro exemplo o Acônito. O
gênero vegetal Aconitum é conhecido principalmente por sua toxicidade. Estas plantas fazem
parte da MTC e são utilizadas como analgésica, antirreumática e para indicações
neurológicas. Todavia muitos estudos foram realizados e os resultados comprovam sua
toxicidade, tendo como alvos o sistema nervoso central, coração e músculos. Isto se dá pela
presença de alcaloides diterpenicos como a aconitina. Este alcaloide suprime inativação de
canais de Na+ dependentes de voltagem, além de promover a peroxidação lipídica e induzir a
apoptose em células do coração, fígado, dentre outro órgãos (AMERI, 1998; FU et al., 2006).
Este efeito duplo de beneficio/malefício torna ainda mais importante os estudos a
cerca de plantas medicinais, pois como visto, uma planta de atividade curativa pode ao
mesmo tempo ser tóxica a um organismo.
2.4 RELAÇÃO BENEFÍCIOS/MALEFÍCIOS: PLANTAS TÓXICAS
Com o avanço da tecnologia e a junção desta a MCA a sociedade passou a ver nas
plantas uma fonte, antiga, porém agora mais segura, para o tratamento, prevenção e alívio dos
sintomas de suas doenças, sejam elas gripes e dores de cabeça até cânceres, diabetes e AIDS.
Diante da importância dos medicamentos fitoterápicos e o grande uso destes pela
população, cresce a preocupação das autoridades com a regulamentação e normalização
destes medicamentos. Alguns países europeus, onde há um amplo consumo de ervas
medicinais, esperam unificar suas legislações referentes à produção e comercialização de
fitoterápicos. Entretanto, há países como os Estados Unidos onde os produtos de origem
vegetal são considerados suplementos nutricionais, não havendo assim a necessidade de
maiores estudos sobre a segurança e eficácia dos medicamentos vegetais (TUROLLA;
NASCIMENTO, 2006).
Os fitoterápicos, assim como todos os medicamentos, devem oferecer garantia de
qualidade, ter efeitos terapêuticos comprovados, composição padronizada e segurança de uso
para a população. A eficácia e a segurança destes devem ser validadas por meio de
levantamentos etnofarmacológicos, documentações tecnocientíficas e em bibliografia sobre os
27
estudos farmacológicos e toxicológicos não-clínicos e clínicos das plantas medicinais em
questão (AGENCIA NACONAL DE VIGILANCIA SANITARIA, 2012).
Contudo, mesmo com todas estas etapas para a validação de um fitoterápico ainda há
um indiscriminado uso tradicional de diversas plantas medicinais baseados somente em
conhecimentos populares, passados de gerações em gerações por familiares, e estes muitas
vezes são aliados à crença de que por ser natural não causam reações adversas. Estas crenças
acabam por levar a inúmeras intoxicações, pois como visto, as plantas podem curar e
intoxicar, dependendo de sua preparação e concentração quando ingerida. Sendo assim, o uso
de ervas medicinais sem a devida comprovação de sua eficácia e segurança de alto risco
(TUROLLA; NASCIMENTO, 2006).
A resposta para este duplo efeito das plantas medicinais esta no fato de que os
vegetais, em geral, são capazes de produzir diferentes substâncias em grandes quantidades, já
denominadas anteriormente de metabólitos. Muitas destas são tóxicas, e são utilizadas pelas
plantas em sua defesa contra vírus, bactérias, fungos e animais predadores (FONSECA;
PEREIRA, 2004).
Segundo Fonseca e Pereira (2004), pesquisas e estudos têm comprovado que muitas
destas substâncias extraídas de plantas medicinais podem causar danos no material genético,
caracterizando-se a mutação (adição, substituição ou deleção de base no DNA), causando
importantes efeitos colaterais aos organismos que a ingerem, como o desenvolvimento de
cânceres. No Brasil algumas plantas tiveram sua genotoxicidade como alvo de estudos, dentre
elas destacam-se a lobeira (Solanum lycocarpum), o barbatimão (Stryphnodendron
adstringens), a espinheira-santa (Maytenus ilicifolia), a goiabeira (Psidium guajava) e a
sucupira (Pterodon emarginatus) (SOUZA, 1997; TEIXEIRA; VICENTINI, 1997;
FONSECA; PEREIRA, 2004).
Estes estudos se tornam de extrema importância quando se analisam os dados de que,
só no Brasil, há aproximadamente mais de 50.000 espécies vegetais (GIULIETTI et al.,
2005), acreditam-se que ao menos metade destas possa conter alguma propriedade
terapêutica, entretanto nem 1% dessas espécies com potencial medicinal foi devidamente
estudada (MILLANI et al., 2010), isto quando relacionada ao uso tradicional e indiscriminado
tornam as pesquisas ainda mais essenciais para a segurança da saúde da população.
Entretanto, estes estudos são demorados e na sua maioria caros, possuindo diversas
complicações como, por exemplo, a diversidade de biomas e suas características restritas. Tal
como no Brasil, onde há uma grande variedade de biomas com uma diversidade enorme de
28
espécies vegetais endêmicas adaptadas às condições e fatores ambientais como o clima, solo e
água característicos daquele local de sua existência. Neste caso as substâncias de usos
medicinais produzidas por estas plantas endêmicas possuem uma forte ligação e interação
com o ambiente. Sabe-se que estas condições (sazonais, de luminosidade, temperatura e
clima) podem alterar a composição química dos produtos produzidos por estas plantas
(FREIRE, 2004), tornando estes compostos ineficazes ou até mesmo tóxicos para o uso
terapêutico.
Como um fator adicional, estão as circunstâncias em que estas plantas são exploradas.
Atualmente, a utilização de plantas medicinais no Brasil ainda está vinculada à exploração
intensiva e extensiva do material silvestre. Os desmatamentos e a exploração predatória
colocam em risco espécies que ainda não conhecemos e que poderiam vir a ser úteis na cura
de doenças (FREIRE, 2004). Na seguinte tabela (Tabela 1) pode-se notar o grande número de
gêneros listados com aproximadamente 165 espécie ameaçadas de extinção. Esta Lista
Vermelha foi organizada pela revista da Flora Brasileira em 2007 e já naquele ano havia
tantos espécimes ameaçados (NAKAJIMA et al., 2012). Pode-se observar também o gênero
Acmella, estudado neste trabalho e descrito no tópico seguinte, apresentando uma espécie
ameaçada de extinção.
Quando se considerando a importância das plantas medicinais não apenas como
recurso terapêutico, mas também como fonte de recursos econômicos, é vital o
estabelecimento de linhas de ação voltadas para o desenvolvimento de técnicas de manejo
sustentáveis (MILLANI et al., 2010).
29
Tabela 1 - Gêneros de Asteraceae que estão na Lista Vermelha realizada pela revista da Flora Brasileira.
Onde (n) e (%) apontam o número de espécies e sua percentagem, respectivamente
Fonte: Adaptado de Nakajima et al. (2012)
2.5 FAMÍLIA: ASTERACEAE, GÊNERO: ACMELLA/SPILANTHES
Dentre os vários grupos vegetais, a família Asteraceae, anteriormente conhecida como
Compositae, está entre as mais importantes, não só por apresentar grande diversidade de
espécies, mas também por estas espécies possuírem diversos compostos de aplicação
terapêutica. Variadas espécies desta família são produtoras, principalmente, de óleo essencial,
estes são de grande importância comercial, utilizados em indústrias de perfumes, cosméticos e
licores (CRAVEIRO et al., 1981; AGOSTINI et al., 2005).
Muitas são consideradas invasoras e agressivas, estas características podem ser
atribuídas a determinados metabólitos produzidos pelas plantas, estas substâncias químicas
liberadas no meio inibem ou retardam a germinação e/ou estabelecimento de plantas
competidoras pelo habitat (CHENG, 1992; FERREIRA et al., 2001).
30
A família é composta por aproximadamente 25.000 espécies distribuídas em 1.100
gêneros. Espalhadas pelo planeta, sendo cosmopolitas, estas plantas tem preferência a regiões
temperadas e subtropicais (RITTER; BAPTISTA, 2005; MOREIRA et al., 2003). Dentre
estas espécies estão membros como a alface, chicória, girassol, camomila e carqueja, dentre
diversos outros de grande importância econômica e nutricional para a sociedade.
No continente americano as asteraceas representam cerca de 50% das espécies,
predominantemente na America Latina. Distribuídas pelo Brasil há aproximadamente 4000
espécies em diversas regiões; áridas, semiáridas e montanhosas, e em diferentes estratos;
ervas, subarbustos, trepadeiras e, até mesmo, árvores (VULPI et al., 2007).
Estão presentes nesta família os gêneros Acmella e Spilanthes, sendo o gênero
Acmella o primeiro a ser descrito, por volta de 1807. Ambos os gêneros eram considerados
como um só, onde De Candolle em 1836 considerou o gênero Acmella como uma seção do
gênero Spilanthes. Entre 1981-85, R. K. Jansen revisou estes gêneros e confirmou, por
estudos morfológicos e cromossômicos, que ambos eram gêneros distintos, com
características distintas, como visto na Tabela 2 (MOORE, 1907).
Tabela 2 - Principais características que diferem os gêneros Acmella e Spilanthes, segundo Jansen (1981).
n=
Fonte: Bringel Jr (2007).
Assim, estas diferentes características determinaram a divisão dos dois gêneros, O
número de espécies por gênero também foi alterado nesta revisão de Jansen, havendo então 30
espécies para Acmella e 6 espécies pra Spilanthes em todo o mundo, todas com preferências a
regiões tropicais. Contudo ainda pode-se observar, atualmente, em trabalhos publicados a
utilização da nomenclatura Acmella apenas como um sinônimo de Spilanthes. Segundo
31
Bringel Jr (2007), isto ocorre, pois em 1884 Baker utilizou esta situação na obra Flora
Brasiliensis, dando espaço aos herbários para identificarem algumas espécies destes gêneros
com nomenclaturas sinônimas (BRINGEL JR, 2007).
As trinta espécies pertencentes ao gênero Acmella são caracterizadas por serem ervas,
anuais ou perenes de preferência a climas tropicais, destas, cinco são consideradas
pantropicais, tendo sua presença em variados continentes como na América, África, Ásia e
Oceania (JANSEN, 1985, SILVA; SANTOS, 2011).
Só Brasil está descrita a presença de dez espécies, pertencentes à Acmella, distribuídos
por todo o país. Dentre elas estão Acmella bellidioides (Smith in Rees) R.K. Jansen,
A.brachyglossa Cass., A. ciliata (Kunth) Cass., A. decumbens var. decumbens R.K. Jansen, A.
leptophylla (DC.) R.K. Jansen, A .oleracea (L.) R.K. Janen, A. psilocarpa R.K. Jansen, A.
pusilla (Hooker e Arnott) R.K. Jansen, A. serratifolia R.K. Jansen, A. uliginosa (Sw.) Cass e,
a mais recentemente descrita, A. marajoensis G.A.R. Silva & J.U.M. Santos (JANSEN, 1985).
Mondin, Magenta e Nakajima. (2010) citaram ainda a presença de Acmella alba (L’Hér.) R.K.
Jansen; A. oppositifolia R.K. Jansen e A. paniculata (Wall. Ex DC.) R.K. Jansen, sendo estas
encontradas pela primeira vez no Brasil.
Dentre estas espécies, cinco estão presentes na Amazônia. São elas: A. brachyglossa
Cass., A. ciliata (Kunth) Cass., A. oleracea (L.) R.K. Jansen, A. oppositifolia R.K. Jansen e A.
uliginosa (Sw.) Cass. (SILVA, 2008; MONDIN; MAGENTA; NAKAJIMA, 2010).
O gênero Spilanthes possui basicamente as mesmas preferências climáticas e as
mesmas características ao gênero Acmella, com exceção a determinadas características
primárias, morfológicas e genéticas como observadas na Tabela 2. Estudos mostram que o
gênero apresenta uma série de efeitos biológicos, como a atividade anestésica local, atribuídos
principalmente seu mais importante bioativo; o espilantol (NOMURA, 2013).
Anteriormente à revisão deste gênero eram citadas aproximadamente 60 espécies
presentes neste, espalhadas por todo planeta. Porém após a revisão ficou definida apenas 6
espécies de Spilanthes restritas à América do Sul, Índia, norte da Austrália, Malásia e nas
regiões no centro e oeste da África. Contudo, como em muitas situações os gêneros Acmella e
Spilanthes são descritos como um só, diversas espécies são nominadas como Spilanthes
mesmo pertencendo a Acmella e vice-versa (NOMURA, 2013; SILVA; SANTOS, 2011).
Estas situações, devido principalmente as considerações de Baker em 1884, tornam
difícil nomear as espécies utilizadas em estudos científicos e organizar as informações
adequadas das mesmas. Como exemplos desta situação podem citar as espécies de Spilanthes
32
oleracea, S. ciliata e S. uliginosa, estas podem ser encontradas também nomeadas como
Acmella, como citado anteriormente (NIGRINIS; CARO; OLARTE, 1986).
2.5.1 Espécie: A. oleracea, o jambu
Acmella oleracea possui variadas sinonímias como: Acmella ciliata Kunth, Spilanthes
oleracea L., Cotula pyretharia L., Pyrethrum spilanthus Medik., Spilanthes acmella var
oleracea (L.) C. B. CLARK ex HOOK. F., Spilanthes fusca MART (LORENZI; MATOS,
2002), Bidens fervida Lan, Bidens fusca Lan, Isocarpa pyrethraria (L.) Cass, Spilanthes
radicans Schrad. Ex D. C., Spilanthes oleracea b fusca (Lam.) D. C., dentre outras (HIND;
BIGGS, 2003, BORGES, 2009).
Estas múltiplas sinonímias ocorre devido à situação relatada no tópico acima, tendo
como as principais utilizadas a Acmella oleracea, Spilanthes oleracea, Spilanthes acmella e
Spilanthes acmella var oleracea, tornando sua nomenclatura confusa. Esta confusão é natural,
visto que esta planta foi realocada em diferentes gêneros e teve seu nome cientifico alterado
diversas vezes ao longo dos anos.
A. oleracea foi primeiramente documentada em 1896 por Augustine Henry, porém era
nomeada de Acmella paniculata (Wall, exD.C.) R.K. Jansen. No século seguinte, nos anos de
1904-41, Hayata e Kitamura realizaram estudos sobre a família anteriormente chamada de
Compositae em Taiwan, nestes os autores passaram a chamar a planta de Spilanthes acmella
(L.) Murray, alterando seu gênero. Mais algumas décadas se passaram e em 1981-85, Jansen
revisou este gênero por análise cladística e morfológicas. Por suas conclusões a planta teve
novamente seu gênero modificado, restaurando-a para Acmella. (KOSTER; PHILIPSON,
1950; FAVORETO; GILBERT, 2010).
Assim determinou-se o gênero da planta mais conhecida como jambu. Esta possui
também diversos nomes populares como agrião-do-Pará, agrião-do-norte, agrião-bravo,
agrião-do-brasil, botão-de-ouro, entre outros (FAVORETO; GILBERT, 2010; NOMURA,
2013).
O jambu é uma planta herbácea e hortaliça, pertencente à família Asteraceae
(Compositae). Nativa da Amazônia, a planta tem presença nas regiões tropicais e subtropicais
do planeta, principalmente na Índia onde é conhecida como Akarkara ou planta-da-dor-dedente (Figura 1) (PIMENTEL, 1985; FAVORETO; GILBERT, 2010). É de largo consumo na
região Norte do Brasil, como hortaliça, principalmente no Pará onde faz parte de comidas
33
típicas, como o pato no tucupi e o tacacá, em saladas ou em outros pratos (SAWAKI, 2000).
Mas só recentemente a atividade desta planta nativa do Brasil despertou o interesse da
indústria brasileira, estimulando seu grande cultivo na região centro-sul do país
(CAVALCANTI, 2008).
Figura 1 - Mapa demonstrativo da distribuição de A. oleracea no Brasil
Fonte: adaptado de Borges, Pich e Amaral (2012).
Esta planta (Figura 2) é considerada uma hortaliça doméstica devido a sua
importante participação na economia familiar de pequenos agricultores dos estados da
região Norte do Brasil, sendo vendida em feiras populares. Seu cultivo é principalmente
realizado para o consumo familiar (NASCIMENTO, 2012). Em uma pesquisa realizada
com feirantes regionais do Pará, constatou-se que o consumo médio de jambu é de
aproximadamente 15 Kg/dia (BORGES, 2009).
34
Figura 2 - Acmella oleracea.
Fonte: Acervo do autor
A planta apresenta melhor desenvolvimento em climas quentes e úmidos, com
temperaturas médias de 25,9°C, atingindo aproximadamente 40-60 cm de altura
(ALBURQUERQUE, 1989; VILLACHICA et al., 1996). A cultura do jambu pode ocorre por
propagação de sementes ou estaca, apresentando um ciclo de 45-70 dias, dependendo da
temperatura e umidade durante seu crescimento. No Estado de São Paulo este ciclo é de
geralmente 90 dias, exigindo pouca tecnologia para o seu manuseio (CAVALCANTI, 2008;
BORGES, 2009). Estas características tornam seu cultivo fácil e de alto rendimento, fato este
que chama principalmente a atenção de seus produtores e consumidores.
Analisando a composição química de 100 g de folhas frescas da planta verificou-se
uma grande quantidade de substancias que caracterizam, principalmente, seu amplo uso
alimentício (Tabela 3).
Tabela 3 - Composição química em 100g de folhas de A. oleracea
Conteúdo
Água
Proteínas
Lipídeos
Carboidratos
Fibras
Cálcio
Colina
Ferro
Fósforo
Vitamina B1
Vitamina B2
Vitamina C
Cinzas
Adaptado de Nascimento (2012)
Massa (g)
89
1,9
0,3
7,2
1,3
0,162
0,020
0,004
0,041
0,00003
0,00021
0,020
1,6
35
Devido a sua popularidade na culinária e para fins medicinais, cresce atualmente o
interesse das indústrias cosméticas e farmacêuticas pelo jambú. Sendo assim seu cultivo nos
últimos anos vem sendo observado nas regiões Centro-Oeste e Sudeste do Brasil
(CAVALCANTI, 2008). As propriedades químicas de A. oleracea também vêm despertando
o interesse farmacêutico, principalmente pelo seu princípio ativo, o espilantol (VILLACHICA
et al., 1996).
Este é uma proeminente alcamida alifatica, a N- isobutil-amida espilantol, de fórmula
molecular C14H23NO (BOONEN et al., 2010), obtidos a partir da inflorescência e das folhas
da planta (Figura 3). Este composto ativo possui um potencial uso industrial, sendo citado
como indicativo para diversas doenças, é considerado ainda como o responsável pelo
formigamento e popular efeito analgésico da planta (GUSMÃO et al., 2005).
Figura 3 - Estrutura molecular do espilantol
Fonte: Cavalcanti (2008).
O espilantol é encontrado na planta na presença com uma segunda alcamida (N-2metilbutil-2E,6Z,8E-decatrienamida)
em
menor
quantidade
denominada
também
homoespilantol, esta também vêm tendo seus estudos de efeitos determinados e caracterizados
(Figura 4) (LEY et al., 2006).
36
Figura 4 - Estrutura do homoespilantol.
Fonte: Cavalcanti (2008).
Inúmeras patentes foram desenvolvidas visando a utilização do espilantol e sua
extração, assim como o extrato da planta e suas aplicações. Estas patentes envolvem, por
exemplo, fórmulas para higiene realizadas por pesquisadores no Japão, ou para indústrias
farmacêuticas, de cosméticos e alimentícias (CAVALCANTI, 2008).
Esta composição da planta caracterizam suas variadas propriedades medicinal. A.
oleracea é comumente usada em casos de dor de dente, gargarejo e estomatites. Outros
estudos demonstraram também sua ação como diurético, antibacteriana e anti-inflamatória
(WU et al., 2008). Suas folhas e flores são usadas em infusões para o tratamento de algumas
doenças como a anemia, dispepsia e malária (RANZI, 2005). A atividade diurética do chá das
inflorescências
da
planta
é
atribuída
principalmente
à
presença
de
alcaloides
(RATNASOORIYA et al., 2004). Chakraborty et al. (2010) atribuíram também os efeitos
anti-inflamatório e antipirético à presença de flavonoides.
Em um estudo utilizando o extrato etanólico de flores de S. acmella var oleracea
detectou-se a redução em 40% da atividade da enzima lipase pancreática humana in vitro,
sugerindo que ele contém um inibidor de lipase com potencial para atuar como um agente
para emagrecimento (EKANEM et al., 2007).
Em outro estudo Moreira et al. (1989) em experimento com o extrato de Spilanthes
acmella var. oleracea determinaram que o mesmo possui a capacidade de induzir convulsão
generalizada em ratos, dando informações importantes sobre sua potencial toxicidade.
Muitas pesquisas ainda precisam ser realizadas, pois diversos são os metabólitos
presentes nas plantas em geral e sabe-se que um metabólito isolado, ou em conjunto com
outros, são responsáveis por cada efeito terapêutico da planta. Assim experimentos que visam
37
identificar estes compostos ativos e caracterizar sua ação ao organismo são de vital
importância para determinar o potencial toxico de uma planta.
38
3
METODOLOGIA
A seguir os protocolos experimentais que este estudo utilizou para a obtenção de seus
resultados.
3.1 CULTIVO DA PLANTA MEDICINAL
O semeio das plantas medicinais deu-se em estufa associada a um sistema de irrigação
e de equipamento de sombrite para garantir o suprimento necessário de água e luz adequado
para o desenvolvimento das plantas. Estas estufas estão localizadas no Centro de Estudos da
Natureza (CEN) da Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP) em São José dos CamposSP.
As sementes foram dispostas em um único vaso de polietileno de 20 litros contendo
areia e húmus na proporção de 4:1, respectivamente, e em seguida recobertas com uma
pequena quantidade de areia. Após a germinação, as plântulas de jambú foram transferidas
para uma placa de isopor com células de 5 cm por 5 cm (Figura 5).
Ao atingirem aproximadamente 10 cm as plantas foram transplantadas separadamente
em vasos de polietileno de 5 litros com substrato de terra adubada, de onde foram, por fim,
coletadas para a extração.
Figura 5 - Metodologia do plantio de Acmella oleracea.
3.2 PROCESSO DE EXTRAÇÃO
A extração das folhas de A. oleracea foi realizada em parceria com o laboratório de
Síntese Orgânica, localizado no Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D) da
UNIVAP.
Para a extração foram colhidas folhas de Acmella oleracea, após estas atingirem sua
fase adulta, gerando um peso fresco de aproximadamente 195 g. Este material foi seco em
39
estufa a 50°C por 8 dias, até que sua variação de peso seco atingisse 10 a 15% do peso fresco.
As folhas foram, então, pulverizadas em almofariz e em seguida pesadas, atingindo
aproximadamente 24 g.
No aparelho extrator Soxhlet a amostra foi colocada em um cilindro confeccionado de
papel de filtro. Este foi colocado no interior do aparelho Soxhlet. No balão com o solvente
etanol 70% (600 mL) aquece e o vapor proveniente deste aquecimento irá subir pela conexão
do balão e ao entrar em contato com o condensador liquefaz-se, caindo no cilindro contendo a
amostra a ser extraída. Ao preencher totalmente o cilindro, o solvente, já com a substância a
ser extraída, é sifonado para o balão onde encontrava-se inicialmente, e o processo se reinicia
até que a extração seja completa, durando um período de 4 horas por cada extração.
Após o termino da extração, o solvente foi evaporado sob pressão reduzida utilizandose de aparelho rotaevaporador (Büchi), o extrato foi distribuído em placas de Petri e alocados
em estufa à 50°C para a secagem final, onde foi obtido um extrato com 3,40 g. Após esta
última secagem o extrato foi armazenado em freezer à -20°C até a realização de seu
fracionamento.
3.4 FRACIONAMENTO LÍQUIDO-LÍQUIDO
O extrato bruto obtido foi ressuspenso em 20 mL de água destilada e fracionado
utilizando um funil de separação de 150 mL. Neste funil foram adicionados 20 mL de hexano,
agitando-se e aguardando a separação das fases. A fase aquosa foi transferida para um béquer,
e em seguida o hexano foi retirado e armazenado em um erlenmeyer de 100 mL. A fração
aquosa foi retornada ao funil, adicionando-se mais 20 mL de hexano, este procedimento foi
realizado por três vezes.
Este mesmo processo de fracionamento foi realizado também com os solventes:
clorofórmio, acetato de etila e com n-butanol (Figura 6).
Ao término de todas as extrações foram adicionados 0,5 g de sulfato de sódio anidro
nas fases orgânicas para remover vestígios de água, após dez minutos as frações finais foram
filtradas e secas em rotaevaporador. Após a secagem as frações foram armazenadas em
freezer a -20 ºC.
Estes extratos secos foram diluídos em meio de cultura DMEM
suplementado com 10% SFB e 1% de antibiótico, sendo calculadas as concentrações para
aplicação nas células.
40
Figura 6 - Fluxograma do fracionamento Liquido-Liquido do extrato bruto de Acmella oleracea.
3.5 LINHAGEM CELULAR ESTUDADA
A linhagem celular L929 (Fibroblasto de Camundongos, ATCC CCL-1) utilizada nos
experimentos está relacionada a diversos estudos e pesquisas sobre citotoxicidade e alterações
morfológicas celulares. Esta linhagem foi obtida a partir do Instituto Adolfo Lutz - Seção de
Cultura Celulares (SP) e propagadas no laboratório de Dinâmica e Compartimentos Celulares,
localizado no Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba
(UNIVAP).
As células foram mantidas em garrafas de cultura 25cm2 (TPP, Switzerland) com meio
DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium, Gibco BRL) suplementado com 10% de Soro
Fetal Bovino (SFB, Gibco BRL) e 1% de antibiotico e antimicótico (Gibco BRL) e incubadas
em estufa a 37°C em atmosfera de 5% de CO2. Este meio foi trocado a cada dois dias.
41
3.6 PREPARAÇÃO DAS CÉLULAS PARA EXPERIMENTAÇÃO
Para a realização dos experimentos as células foram removidas das garrafas de
culturas e passadas para placas de cultura de 96 poços (TPP, Switzerland).
Nesta transferência foi adicionada tripsina para que as células possam desaderir da
garrafa de cultura e ser centrifugadas em um tubo Corning® de 15 ml. Descartou-se o meio
do tubo e em seguida ressuspendeu-se o pellet formado, desta suspensão foram retirados 10
μL para ser realizada a contagem do número de células em câmara de Neubauer.
Através da equação: C1 . V1 = C
2
. V2 foi calculada a concentração de células, em
volume de 105 células, e meio de cultura necessários para diferentes concentrações da futura
aplicação dos extratos.
Após plaqueadas, as células permaneceram incubadas em estufa a 37°C em atmosfera
de 5% de CO2 por 24 hs para a devida aderencia. Em seguida nestas células, foram adicionados
os extratos e suas frações em concentrações crescentes de 25μg/mL, 50 μg/mL, 75 μg/mL,
100 μg/mL, 150 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL e 1 mg/mL, em seguida estas voltam a ser
incubadas em estufa a 37 °C por períodos de 24 e 48 horas.
3.7 DETERMINAÇÃO DA CITOTOXICIDADE
Estes testes forma realizados no laboratório de Dinâmica e Compartimentos Celulares,
localizado no Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba
(UNIVAP), sob a supervisão da Profª Drª Cristina Pacheco Soares.
3.7.1 Ensaio de MTT
Para ensaio de MTT {brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio]}
(Sigma®) segui-se o protocolo de plaqueamento, citado no subtópico 3.5, a uma densidade de
1xl05 por poços em placas de 96 poços. Foram então adicionadas sobre as culturas de células,
cultivadas em triplicata, as diluições do extrato em suas diferentes, nos demais poços foram
adicionados pedaços de luva descartável e filtro de papel e um somente de células, constituindo os
grupos controles negativos e positivos. As culturas foram incubadas com as diluições por períodos de
24 e 48 horas .
42
Após a incubação os poços foram lavados com PBS, em seguida foi adicionado o MTT (5
mg/mL) diluído em PBS na concentração de 200 μl. As células foram incubadas por 60 minutos
a 37° C em estufa. Posteriormente foram adicionados às placas 200 μl de DMSO
(Dimetilsulfóxido, Sigma®) por poço, e agitadas por 60 minutos para diluição dos cristais de
formazan. A leitura da absorbância das placas foi feita em espectrofotômetro (Elisa Spectracount,
Packard, EUA) a 570 nm. A análise estatística deu-se pelo teste ANOVA em GraphPad Prism®
5 com Significância de ≤0.05
P
(*), Muito Significativo
P≤0.01(**) e Extremamente
Significativo P≤0.001 (***) quando comparados ao grupo controle +.
Os dados obtidos foram transformados em porcentagem de atividade mitocondrial em
relação ao controle e assim, calculados pela fórmula a seguir:
% viabilidade = (absorbância das células tratadas - absorbância do branco) x 100
3.6.2 Ensaio de Cristal
Violeta
(absorbância
das células controle. - absorbância do branco)
3.7.2 Ensaio de Cristal Violeta
Após o plaqueamento e incubação com extrato por 24 e 48 h foi adicionado nos poços
a solução de coloração de Cristal Violeta (Sigma®) a 5% por 3 minutos. Decorrido este
tempo as placas foram lavadas em água corrente por 2 minutos. Por fim adicionou-se a
solução de eluição de SDS a 1%, por 1 hora em temperatura ambiente.
A leitura da absorbância das placas foi feita em espectrofotômetro (Elisa Spectracount,
Packard, EUA) a 570 nm. A análise estatística deu-se pelo teste ANOVA em GraphPad Prism®
5 com Significância de ≤0.05
P
(*), Muito Significativo P≤0.01(**) e Extremamente
Significativo P≤0.001 (***) quando comparados ao grupo controle +.
3.7.3 Teste de Vermelho Neutro
Neste teste as células foram plaqueadas de acordo com o protocolo citado em 3.5,
sendo em seguida adicionadas as frações do extrato em suas devidas concentrações. Após a
incubação por 24 e 48 h foi adicionado em cada poço 200 µL da solução de Vermelho Neutro
à 100 µg/mL, incubando por 2 horas em estufa a 37°C. Ao termino da incubação foi
adicionado 200 µL da solução de álcool etílico em agitação por 10 minutos.
43
A leitura da absorbância das placas foi feita em espectrofotômetro (Elisa Spectracount,
Packard, EUA) a 570 nm. A análise estatística deu-se pelo teste ANOVA em GraphPad Prism®
5 com Significância de ≤0.05
P
(*), Muito Significativo P≤0.01(**) e Extremamente
Significativo P≤0.001 (***) quando comparados ao grupo controle +.
3.8 FRACIONAMENTO EM COLUNA SEPHADEX
O fracionamento por cromatografia de filtração molecular em coluna Sephadex foi
realizado com as frações bioativas FAE e FB e permitiu uma maior purificação das amostras.
Foi utilizado como eluente o metanol, as amostras foram aplicadas em coluna
Sephadex LH-20 (2,5x40 cm), separando as moléculas presentes por tamanho, onde nas
primeiras frações obtidas há a presença de moléculas maiores, enquanto as menores estarão
nas ultimas frações saídas do processo (Figura 7).
Após o fracionamneto foram obtidas 18 sbfrações de FAE e 13 de FB. Estas
subfrações foram submetidas novamente ao teste de citotoxicidade de Cristal violeta pelo
período de 48 h de incubação, nas maiores concentrações de 250 μg/mL, 500 μg/mL e
1 mg/mL.
Figura 7 - Fluxograma do fracionamento das frações FAE e FB em coluna Sephadex.
Fracionamento Líquido-Líquido
Fracionamento em coluna Sephadex
44
3.9 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA- CLAE
As análises por CLAE foram realizadas em equipamento Shimadzu UFLC
Prominence, equipado com detector de arranjo de diodos (Diode Array Detector – DAD), e
coluna HypersilODS C-18 (25 cm x 4,6 mm x 5 µm). As análises foram feitas em modo
gradiente, sendo que para as frações oriunda do fracionamento por Sephadex da fração acetato
de etila (FAE) empregou-se mistura acetonitrila (ACN) e água deionizada listada na Tabela 4,
e as análises da fração butanol (FB) empregaram as condições listadas na Tabela 5.
Tabela 4 - Fase móvel empregada para análise por CLAE-DAD da Fração Acetato de Etila (FAE)
Solvente
ACN
Água
0 min
10%
90%
Tempo de análise
35 min
70%
30%
40 min
70%
30%
Tabela 5 - Fase móvel empregada para análise por CLAE-DAD da Fração Butanol (FB)
Solvente
ACN
Água
0 min
10%
90%
Tempo de análise
30 min
40 min
30%
70%
70%
30%
45 min
70%
30%
Todas as análises foram feitas em fluxo de 1 ml/min, com volume de injeção de 25 µL,
sendo as amostras diluídas na concentração aproximada de 5 mg do extrato para 1 mL de
metanol.
45
4
RESULTADOS
O teste de Cristal violeta revelou, no período de incubação de 24 h, a citotoxicidade da
fração FAE a partir da concentração de 250 μg/mL, sendo mais pronunciada na concentração
de 1 mg/mL (Figura 8).
No período de 48 h as frações FAE e FB também apresentaram citotoxicidade, sendo
mais elevada a partir da concentração de 150 µg/mL em FAE e 250 µg/mL em FB. A fração
FC apresentou citotoxicidade apenas na concentração mais elevada de 1 mg/mL, também no
período de 48 h de incubação (Figura 9).
46
Figura 8 - Gráficos do teste de Cristal Violeta representando a citotoxicidade dos extratos Brutos e suas frações, em concentrações de 25 μg/mL, 50 μg/mL, 75
μg/mL, 100 μg/mL, 150 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 1 mg/mL e os grupos Controle positivo (Somente células, sem adição de extrato) e Controle negativo
(Células em meio com látex, sem adição de extrato) em células L929, durante o período de incubação de 24 h. Teste estatístico ANOVA com Significância de
P≤0.05 (*), Muito Significativo P≤0.01(**) e Extremamente Significativo P≤0.001 (***) quando comparados ao grupo controle +
FAE
FB
EtOHEB
FC
FA
FH
47
Figura 9 - Gráficos do teste de Cristal Violeta representando a citotoxicidade dos extratos Bruto e suas frações, em concentrações de 25 μg/mL, 50 μg/mL, 75
μg/mL, 100 μg/mL, 150 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 1 mg/mL e os grupos Controle positivo (Somente células, sem adição de extrato) e Controle negativo
(Células em meio com látex, sem adição de extrato) em células L929, durante o período de incubação de 48 h. Teste estatístico ANOVA com Significância de
P≤0.05 (*), Muito Significativo P≤0.01(**) e Extremamente Significativo P≤0.001 (***) quando comparados ao grupo controle +
FAE
EtOHEB
FB
FC
FA
FH
48
O ensaio de MTT permitiu verificar que no período de incubação de 24 h houve
redução da atividade mitocondrial nas frações FAE, FC e FB, apresentando redução
significativa na concentração de 1 mg/mL. Porém o EtOHEB apresentou um significante
aumento da atividade mitocondrial de acordo com as concentrações crescentes testadas, sendo
mais expressiva em 250 μg/mL (Figura 10).
Em 48 h de incubação, com excessão do EtOHEB, todas as frações apresentaram uma
redução da atividade mitocondrial, sendo assim citotóxicas. O unico extrato a não aprensentar
uma redução significativa em 48 h, EtOHEB, também não apresentou um aumento de
atividade mitocondrial, em contraste ao relatado em 24 h. Como em 24 h, a redução em 48 h
foi observada em uma escala crescente de acordo com as concentrações testadas, sendo
portanto mais expressiva na concentração de 1 mg/mL (Figura 11).
49
Figura 10 - Gráficos representando a atividade mitocondrial em resposta aos extratos Bruto e suas frações, em concentrações de 25 μg/mL, 50 μg/mL, 75
μg/mL, 100 μg/mL, 150 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 1 mg/mL e os grupos Controle positivo (Somente células, sem adição de extrato) e Controle negativo
(Células em meio com látex, sem adição de extrato) em células L929, durante o período de incubação de 24 h. Teste estatístico ANOVA com Significância de
P≤0.05 (*), Muito Significativo P≤0.01(**) e Extremamente Significativo P≤0.001 (***) quando comparados ao grupo controle +
FAE
FB
EtOHEB
FC
FA
FH
50
Figura 11 - Gráficos representando a atividade mitocondrial em resposta aos extratos Bruto e suas frações, em concentrações de 25 μg/mL, 50 μg/mL, 75
μg/mL, 100 μg/mL, 150 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 1 mg/mL e os grupos Controle positivo (Somente células, sem adição de extrato) e Controle negativo
(Células em meio com látex, sem adição de extrato) em células L929, durante o período de incubação de 48 h. Teste estatístico ANOVA com Significância de
P≤0.05 (*), Muito Significativo P≤0.01(**) e Extremamente Significativo P≤0.001 (***) quando comparados ao grupo ontrole +
FAE
EtOHEB
FB
.
FC
FA
FH
51
Estes resultados de atividade mitocondrial podem ser comparados à atividade
lisossomal avaliada através do teste de Vermelho Neutro (Tabela 6). Este teste revelou, em 24
h de incubação, um aumento gradativo de acordo com as concentrações, nas frações FA, FAE,
FB e no EtOHEB. Na fração FB este aumento da atividade lisossomal ocorreu até a
concentração de 100 µg/mL, após esta, houve uma diminuição da atividade (Figura 12).
No período de incubação de 48 h com os extratos houve um resultado diferente do
relatado em 24 h Todos os extratos e frações testados apresentaram baixa atividade lisossomal
quando comparados ao grupo Controle +, apresentando diminuição mais expressiva de
atividade na concentração de 1 mg/mL (Figura 13).
Tabela 6- Presença de atividade por teste realizado
52
Figura 12 - Gráficos representando a atividade lisossomal através do teste de Vermelho Neutro, em relação aos extratos Bruto e suas frações, em
concentrações de 25 μg/mL, 50 μg/mL, 75 μg/mL, 100 μg/mL, 150 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 1 mg/mL e os grupos Controle positivo (Somente células,
sem adição de extrato) e Controle negativo (Células em meio com látex, sem adição de extrato) em células L929, durante o período de incubação de 24 h.
Teste estatístico ANOVA com Significância de P≤0.05 (*), Muito Significativo P≤0.01(**) e Extremamente Significativo P≤0.001 (***) quando comparados
ao grupo controle +
FAE
EtOHEB
FA
FB
FC
FH
53
Figura 13 - Gráficos representando a representando a atividade lisossomal através do teste de Vermelho Neutro, em relação aos extratos Bruto e suas frações,
em concentrações de 25 μg/mL, 50 μg/mL, 75 μg/mL, 100 μg/mL, 150 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 1 mg/mL e os grupos Controle positivo (Somente
células, sem adição de extrato) e Controle negativo (Células em meio com látex, sem adição de extrato) em células L929, durante o período de incubação de
48 h. Teste estatístico ANOVA com Significância de P≤0.05 (*), Muito Significativo P≤0.01(**) e Extremamente Significativo P≤0.001 (***) quando
comparados ao grupo controle +
FAE
FB
EtOHEB
FC
FA
FH
54
Após a determinação da citotoxicidade das frações FAE e FB foi realizado um novo
fracionamento, por cromatografia líquida de filtração molecular (Sephadex LH-20), com estes
extratos para uma maior purificação das substancias presentes. Este processo, quando
realizado com o extrato FAE, gerou ao total 18 frações nomeadas de AE1-AE18, entretanto as
frações AE1, AE2, AE3, AE4, AE15 e AE18 não puderam ser testadas por não possuírem
massa de extrato suficiente para a realização do ensaio.
As demais frações obtidas foram submetidas novamente ao ensaio de Cristal Violeta,
apenas no período de incubação de 48 h e somente nas maiores concentrações (250 µg/mL,
500 µg/mL 1 mg/mL). O ensaio revelou uma atividade tóxica na linhagem celular L929 para
as frações AE5, AE6, AE7 e AE17, com redução da população celular com significância a
partir da concentração de 500 µg/mL para as duas primeiras, somente na concentração de 1
mg/mL na fração AE7 (Figura 14) e 500 µg/mL em AE17. As frações AE11 e AE14
apresentaram uma redução significante na concentração de 250 µg/mL (Figura 15), com um
aumento gradativo da população celular até a concentração de 1 mg/mL que ultrapassou o
controle positivo.
Entretanto em AE8, AE9, AE10, AE12 e AE16 houve um aumento do número de
população celular em todas as concentrações (Figura 15), também ultrapassando o controle
positivo onde não houve adição dos extratos. Este aumento observado apresentou
significância somente nas frações AE10 e AE12, caracterizando um efeito proliferativo dos
extratos nas células testadas.
55
Figura 14 - Gráficos representando a representando a atividade sob o núcleo celular através do ensaio de Cristal Violeta, em relação as frações obtidas através
da partição em coluna Sephadex do extrato Acetato de etila. Em concentrações de 250 μg/mL, 500 μg/mL, 1 mg/mL e os grupos Controle positivo (Somente
células, sem adição de extrato) e Controle negativo (Células em meio com látex, sem adição de extrato) em células L929, durante o período de incubação de
48 h. Teste estatístico ANOVA com Significância de P≤0.05 (*), Muito Significativo P≤0.01(**) e Extremamente Significativo P≤0.001 (***) quando
comparados ao grupo controle +
AE5
AE6
AE7
AE8
AE9
AE10
56
Figura 15 - Gráficos representando a representando a atividade sob o núcleo celular através do ensaio de Cristal Violeta, em relação as frações obtidas através
da partição em coluna Sephadex do extrato Acetato de etila. Em concentrações de 250 μg/mL, 500 μg/mL, 1 mg/mL e os grupos Controle positivo (Somente
células, sem adição de extrato) e Controle negativo (Células em meio com látex, sem adição de extrato) em células L929, durante o período de incubação de
48 h. Teste estatístico ANOVA com Significância de P≤0.05 (*), Muito Significativo P≤0.01(**) e Extremamente Significativo P≤0.001 (***) quando
comparados ao grupo controle +
AE11
AE12
AE13
AE14
AE16
AE17
57
Ao realizar o fracionamento do extrato Butanólico em coluna Sephadex foram obtidas
13 frações que em seguida foram submetidas ao ensaio de citotoxicidade em células L929
assim citado anteriormente com as frações derivadas de Acetato de etila.
O ensaio revelou um aumento no numero de população celular com significância em
todas as concentrações testadas nas frações B1, B2, B3 (Figura 16), B7, B8, B10, B11 e B12
(Figura 17), este aumento foi mais elevado que o grupo controle positivo onde não foi
adicionado o extrato das frações sobre as células.
As frações B4, B5 (Figura 16), B9 e B13 (Figura 17), apresentaram um pequeno
aumento na concentração de 250 µg/mL e posteriormente uma redução gradativa em 500
µg/mL e 1 mg/mL, sendo mais significante na maior concentração testada. Em B6 (Figura 16)
houve toxicidade significante em 250 µg/mL e 500 µg/mL, porém havendo um aumento da
população celular em 1 mg/mL.
Ao término das análises das frações derivadas de FAE e FB pode-se criar a Tabela 7
comparando as atividades citotóxica e proliferativa dos extratos em suas respectivas
concentrações.
Tabela 7 - Comparação entre as atividades das frações AE e B
58
Figura 16 - Gráficos representando a representando a atividade sob o núcleo celular através do ensaio de Cristal Violeta, em relação as frações obtidas através
da partição em coluna Sephadex do extrato Butanol. Em concentrações de 250 μg/mL, 500 μg/mL, 1 mg/mL e os grupos Controle positivo (Somente células,
sem adição de extrato) e Controle negativo (Células em meio com látex, sem adição de extrato) em células L929, durante o período de incubação de 48 h.
Teste estatístico ANOVA com Significância de P≤0.05 (*), Muito Significativo P≤0.01(**) e Extremamente Significativo P≤0.001 (***) quando comparados
ao grupo controle +.
59
Figura 17 - Gráficos representando a representando a atividade sob o núcleo celular através do ensaio de Cristal Violeta, em relação as frações obtidas através
da partição em coluna Sephadex do extrato Butanol. Em concentrações de 250 μg/mL, 500 μg/mL, 1 mg/mL e os grupos Controle positivo (Somente células,
sem adição de extrato) e Controle negativo (Células em meio com látex, sem adição de extrato) em células L929, durante o período de incubação de 48 h.
Teste estatístico ANOVA com Significância de P≤0.05 (*), Muito Significativo P≤0.01(**) e Extremamente Significativo P≤0.001 (***) quando comparados
ao grupo controle +.
60
Em seguida à determinação da citotoxicidade das subfrações obtidas, através do
fracionamento em coluna Sephadex dos extratos FAE e FB, foram selecionadas aquelas com
atividade tóxica comprovada para serem analisadas por cromatografia CLAE-DAD. Pode-se
assim relacionar sua atividade com seus componentes presentes.
Pela comparação dos comprimentos de onda de maior absorção (λmáx) em literatura,
pode-se inferir à quais classes fitoquímicas pertencem os compostos que apresentam maior
área de integração nos cromatogramas obtidos a partir de cada subfração. Os espectros de UV
apresentados nas figuras a seguir são representativas dos grupos de compostos justapostos ao
selecionado, que apresentam enorme similaridade em seus espectros de absorção.
Figura 18 - Cromatograma da fração A5. Com destaque para o pico de interesse em 32.350 min e seu
respectivo espectro cujo comprimento de onda máximo λ( máx.) é de 224 nm determinado como
Composto A.
61
Figura 19 - Cromatograma da fração A6. Com destaque para o pico de interesse em 32.331 min e seu
respectivo espectro cujo comprimento de onda máximo (λ máx.) é de 228 nm determinado como
Composto B
Figura 20 - Cromatograma da fração A7. Com destaque para o pico de interesse em 2.952 min e seu
respectivo espectro cujo comprimento de onda máximo (λ máx.) é de 222 nm determinado como
Composto C.
62
Figura 21 - Cromatograma da fração B6. Com destaque para os picos de interesse em 2.957 min, 5.565
min e 17.409 min e seus respectivos espectros cujo comprimento de onda máximo (λ máx.) é de 258
nm, 324 nm e 319 nm determinados como Composto D, Composto E e Composto F respectivamente
Figura 22 - Cromatograma da fração B6. Com destaque para os picos de interesse em 1.835 min, 4.043
min e 11.949 min e seus respectivos espectros cujo comprimento de onda máximo (λ máx.) é de 325
nm, 285 nm e 206 nm determinados como Composto G, Composto H e Composto I respectivamente
Para se relacionar os componentes das subfrações testadas e sua possível relação com
as atividades tóxicas observadas foram realizadas a análise cromatográfica dos extratos FAE e
FB para determinar a presença específica do principal bioativo de Acmella oleracea, o
espilantol. Este composto foi extraído seletivamente segundo Yasuda, Takeya e Itokawa
63
(1980) e foi analisado por CLAE-DAD empregando-se os mesmos métodos cromatográficos
utilizados para as análises das subfrações de FAE e FB (figuras 23 e 24). A presença de
espilantol não pode ser evidenciada nas subfrações A5, A6, A7, B6 e B7.
Figura 23 - Cromatograma do espilantol empregando metodologia utilizada para análise das frações
Acetato de etila. Com destaque para o pico de interesse em 34.083 min e seu respectivo espectro cujo
comprimento de onda máximo (λ máx.) é de 229 nm determinado como Espilantol de acordo com
Santos (2010)
64
Figura 24 - Cromatograma do espilantol empregando metodologia utilizada para análise das frações
Butanol. Com destaque para o pico de interesse em 44.446 min e seu respectivo espectro cujo
comprimento de onda máximo (λ máx.) é de 229 nm determinado como Espilantol de acordo com
Santos (2010)
Através dos espectros obtidos e da literatura, pode-se identificar os compostos
encontrados nas frações A5, A6, A7, B6 e B7 após as análises por CLAE-DAD. Apontando
os ácidos fenólicos e flavonoides como os mais abundantes nestes extratos (Tabela 8).
65
Tabela 8 - Caracterização dos compostos obtidos por cromatografia das frações A5, A6, A7, B6 e B7
Tempo de
retenção
λmáx nm
Classe
química
Referência
A
32,35
224
Ácido fenólico
Fisher et al.,
2011
B
32,33
228
Ácido fenólico
Fisher et al.,
2011
C
3,63
222
Ácido fenólico
Fisher et al.,
2011
D
2,96
258
Ácido fenólico
E
5,56
324
Derivados de
ácido cafeico
F
17,41
319
G
1,83
325
H
4,04
285
I
11,95
206 / 260
Ácidos
fenólicos /
Cumáricos
Derivados de
ácido cafeico /
Flavonóides
Derivados
ferúlico /
cumárico
Ácidos
fenólicos
Grignon-Dubois
& Rezzonico,
(2012)
Grignon-Dubois
& Rezzonico,
(2012)
Jimenez et al.,
(2014)
Espilantol
(FAE)
44,45
229
N-alquilbutilamida
Santos (2010)
Espilantol
(FB)
34,08
229
N-alquilbutilamida
Santos (2010)
Composto
A5
A6
A7
B6
B7
Grignon-Dubois;
Rezzonico (2012)
Jimenez et al.
(2014)
Ignat, Volf &
Popa, (2011)
66
5 DISCUSSÃO
O MTT é um teste constantemente usado para caracterizar a toxicidade de um
composto, por exemplo, pois este avalia a viabilidade celular pela atividade mitocondrial.
Após a absorção do sal MTT pelas células este se direciona para as mitocôndrias onde é
reduzido à formazana. A formazana que se acumula no interior da célula é extraída pela
adição do solvente DMSO (VALADARES; CASTRO; CUNHA, 2007).
O ensaio de Cristal Violeta também é comumente utilizado em testes de
citotoxicidade,
nesta
técnica
o
marcador
cristal
violeta
cora
o
DNA
(Ácido
Desoxirribonucléico) de células viáveis, podendo-se assim avaliar fotometricamente a
densidade de células em um poço da placa de cultura após a incubação com os extratos e suas
frações. Para este ensaio seguiu-se o protocolo anteriormente citado de plaqueamento
(STONE, 2010).
Assim como o uso de Vermelho Neutro, que é realizado em ensaios de
sobrevivência/viabilidade celular. Neste ensaio somente as células vivas, com suas
membranas viáveis, são capazes de incorporar o corante em seus lisossomos (pH lisossômico
< pH citoplasmático), podendo, por este acumulo de corante, ser medidos fotometricamente
(GRIFFON; MERLIN; MARCHAL, 1995).
A redução da população celular observada através do teste de Cristal Violeta,
principalmente, em FAE e FB no período de incubação de 48 horas, e a diminuição gradativa
das atividades mitocondrial e lisossomal, avaliadas por MTT e Vermelho Neutro
respectivamente, em todos os extratos e frações testadas e com maior significância no período
de 48 h de incubação, podem ser explicadas pelos compostos presentes no extrato das folhas
da planta, esta composição caracteriza suas variadas propriedades medicinais.
A. oleracea é comumente usada em casos de dor de dente, gargarejo e estomatites,
outros estudos demonstraram também sua ação como diurética, antibacteriana e antiinflamatória (WU et al., 2008). Suas folhas e flores são usadas em infusões para o tratamento
de algumas doenças como a anemia, dispepsia e malária (RANZI, 2005). A atividade
diurética do chá das inflorescências da planta é atribuída principalmente à presença de
alcaloides (RATNASOORIYA et al., 2004), já Chakraborty et al. (2010) atribuíram também
os efeitos anti-inflamatório e antipirético à presença de flavonoides.
Alguns metabólitos secundários já possuem seu mecanismo de ação conhecido, como
os alcaloides que podem agir sobre as células despolimerizando seu citoesqueleto, ou
67
determinados flavonoides que são capazes de induzirem a morte celular por apoptose através
do estimulo à liberação do citocromo-c (BRANDÃO et al., 2010).
Em um estudo utilizando o extrato bruto de Acmella oleracea diluído em metanol,
observou-se uma importante redução da viabilidade celular pelo ensaio MTT e
despolimerização do citoesqueleto levando as células à morte por apoptose (PRIANTESILVA, 2012), sendo, estes resultados, relacionados aos alcaloides e flavonoides presentes na
planta.
Estes dados podem ser associados com os obtidos através do ensaio de MTT neste
trabalho, onde se determinou que em todas as frações, com exceção do EtOHEB,
apresentaram uma redução da atividade mitocondrial extremamente significante no período de
48 h. O EtOHEB apresentou um aumento significativo da atividade mitocondrial no período
de 24 h, porém este aumento não foi observado no período de 48 h, sugerindo que a atividade
mitocondrial deste extrato irá decair conforme aumente o período de incubação. A
contradição entre estes resultados de atividade mitocondrial do extrato bruto quando
comparado ao realizado por Priante-Silva (2012) está relacionada ao método de diluição.
Neste estudo o extrato foi diluído em meio de cultura e apresentou pequenos fragmentos, estes
podem ter sido absorvidos pelas células devido ao seu tamanho, reduzindo sua atividade.
Na medicina alternativa e até mesmo na tradicional, os flavonoides possuem grande
notoriedade, devido principalmente à suas variadas propriedades medicinais como
antioxidante, anti-inflamatória, antiviral, antitumoral, dentre outras (SIMÕES et al., 2003).
Sonoda et al. (2004) testaram 17 flavonoides em células de leucemia humana (HL60), destes
10 apresentaram citotoxicidade. Contudo, esta atividade pode também causar danos a uma
célula normal e esta intimamente ligada a sua ação direta sobre as mitocôndrias.
Oliveira et al. (2011) determinaram em seus estudos que as frações clorofórmica e
Acetato de etila de Licania tomentosa Benth foram citotóxicas para as larvas Artemia salina,
sendo consideradas a presença de metabólitos antitumorais, antibacterianos e antifúngicos. A
atividade antitumoral das frações do caule de Salacia crassifólia enfatizou a citotoxicidade da
fração Acetato de etila, superando 90% de morte celular (OLIVEIRA et al., 2012). Outros
estudos evidenciam ainda mais a toxicidade das frações Acetato de etila, butanólica e
clorofórmica.
A avaliação da atividade antimicrobiana das frações de Morus alba L. sobre diversas
bactérias e fungos revelou que todas as frações, Acetato de etila, clorofórmica, hexânica e
68
butanólica, apresentaram atividade desde moderada, para as três primeiras até fraca para a
ultima fração (PEREIRA et al., 2012).
Ainda sobre a atividade antimicrobiana, as frações Acetato de etila e Metanol das
folhas de Spilanthes acmella (S. acmella) apresentaram uma alta atividade sob Klebsiella
pneumoniae, os autores atribuíram a estes resultados a presença de flavonoides, taninos e
outros fitoquímicos (ARORA; VIJAY; KUMAR, 2011). Em testes com as frações
Clorofórmio e Hexano das folhas de S. acmella revelaram a atividade antifúngica contra
Saccharomyces cerevisiae (PRACHAYASITTIKUL et al., 2009). Prachayasittikul et al.
(2009) também testaram a atividade antioxidante da planta e relataram a alta atividade das
frações Acetato de etila, Hexano, Clorofórmio e Metanol, sendo a fração Acetato a mais
potente e associada aos compostos fenólicos que compõem a planta.
Estas atividades mesmo que em plantas e linhagens de células diferentes classificam as
frações Acetato de etila, Butanol e Clorofórmio como tóxicas em testes in vitro, isto ocorre,
pois a fração clorofórmica e Acetato de etila são responsáveis pela extração de compostos
apolares fenólicos como: flavonoides, cumarinas, quinonas e taninos, o que justificaria os
resultados obtidos neste estudo (BORGES; PICH; AMARAL, 2012).
Através da análise em conjunto dos três testes de citotoxicidade realizados neste
estudo juntamente como os dados observados durante o processos, pode-se dizer que a
citotoxicidade de A. oleracea está relacionada a uma possível inativação do núcleo celular,
dando a estas células uma característica de célula enucleada, onde apesar da falta desta
organela seu metabolismo e algumas atividades continuam a serem realizadas por até
aproximadamente 72 h antes de sua morte iminente (GOLDMAN; POLLACKT; HOPKINST,
1973). Em resposta a este dano a célula continua a metabolizar e endocitar o extrato,
aumentando sua atividade lisossomal e posteriormente reduzindo esta atividade devido ao
processo de morte e redução de seu metabolismo, podendo ser observadas diversas vesículas
pinocíticas presentes no citoplasma.
O mesmo pode ser dito sobre a atividade mitocondrial avaliada, porem ao comparar
esta atividade com a redução da densidade apresentada pela marcação de núcleo pode-se
concluir que houve uma maior redução em Cristal Violeta pois ao ativar um processo de
morte onde há interferência no núcleo, as células entram em apoptose, tendo assim um maior
numero de mitocôndrias em atividade durante este processo de morte celular intrínseca.
Podendo ser comprovado através dos resultados de Priante-Silva (2012) que apontaram a
apoptose como a principal via de morte após a incubação com o extrato de S. oleracea.
69
Ao submeter as frações FAE e FB a um novo fracionamento, em coluna Sephadex,
pode-se confirmar a citotoxicidade observada nos primeiros ensaios deste estudo, estes
resultados podem ser relacionados aos compostos presentes nas frações obtidas das folhas da
planta.
O segundo fracionamento gerou 18 subfrações de FAE e 13 de FB, entre as frações
testadas de FAE apenas AE5, AE6, AE7 e AE17 (Figura 14) apresentaram com redução da
população celular gradual com significância quando testados com o ensaio de Cristal Violeta,
esta atividade tóxica pode ser corelacionada a possível presença de flavonoides e ácidos
fenólicos observados nas análises cromatográficas das frações A5, A6 e A7 (Figura 18, 19 e
20). As frações AE11 e AE14 apresentaram uma redução significante na concentração de 250
µg/mL (Figura 15), com um aumento gradativo da população celular até a concentração de 1
mg/mL que ultrapassou o controle positivo, indicando que em menores concentrações a fração
apresenta uma toxicidade mais elevada quando comparada a maior concentração.
Ao realizar o ensaio de Cristal Violeta comas subfrações oriundas de FB observou-se
que somente B4, B5, B6 e B13 apresentaram uma redução da população celular. Assim
como nas subfrações de FAE pode ser associada a esta atividade tóxica a presença de
flavonóides e ácidos fenólicos indicados pela análise cromatográfica das subfrações B6 e B7.
Em B6 onde foi observado a possível presença de quercetina e ácidos fenólicos, derivados de
ácido cafeico e flavonóides, ácidos fenólicos e ácidos cumáricos, ocorreu a mesma situação
observada em AE11 e AE14, onde menores concentrações do extrato tiveram uma redução
celular mais significante que em maiores concentrações. Assim, esta situação pode ser
explicada pelos compostos presentes nestas frações, principalmente por flavonoides
conhecidos por sua dose dependência, como caracterizado neste estudo.
O ensaio também revelou um aumento no número de população celular com
significância em todas as concentrações testadas nas frações B1, B2, B3 (Figura 16), B7, B8,
B10, B11 e B12 (Figura 17), este aumento foi mais elevado que o grupo controle positivo
onde não foi adicionado o extrato das frações sobre as células. Estes resultados podem ser
relacionado a presença de compostos como açúcares e gorduras comumente extraídos com o
solvente utilizado nesta fração. Estes compostos serviram de base para aumentar a taxa de
divisão celular e, portanto a o numero de população celular (BRUM; ARRUDA;
REGITANO-D´ARCE, 2009).
Não foi possível identificar o bioativo espilantol nas subfrações submetidas à CLAEDAD após uma análise cromatográfica específica para este composto. Sendo assim, descarta-
70
se o espilantol como possível responsável pelas atividades citotóxicas observadas neste
estudo, podendo-se inferir que outros compostos extraídos com os diferentes solventes como
citado anteriormente, dentre eles os flavonóides e ácidos fenólicos, são os responsáveis pela
toxicidade de Acmella oleracea.
Nomura (2013) determinou a toxicidade in vivo da planta quando administrada em
camundongos em altas concentrações alertando ainda mais a sociedade. Com 500 mg/kg os
animais passaram a ter dificuldades de locomoção e contorções abdominais, ao aumentar a
dose para 5000 mg/kg os animais apresentaram convulsão, depressão respiratória e óbito em
apenas 3 minutos após a aplicação intraperitoneal do extrato etanólico de A. oleracea,
estipulando uma dose letal media de 889 mg/kg.
Contrastando com o observado neste estudo, onde a FAE apresentou uma redução de
mais de 50% a partir da concentração de 150 µg/mL e EtOHEB a partir de 500 µg/mL. Devese levar em consideração que este estudo foi baseado em teste in vitro, enquanto Nomura
(2013) utilizou-se de dados in vivo, envolvendo o metabolismo animal, método de absorção,
método de extração, dentre outros fatores, que podem alterar a potencialidade do extrato.
Contudo abre-se, com este estudo, observações sobre a capacidade tóxica de Acmella
oleracea e caracteriza-se a presença de compostos, principalmente flavonoides, possivelmente
responsáveis por esta atividade, podendo estes ser um dos responsáveis pelas diversas
atividades terapêuticas da planta e serem empregados em medicamentos e pesquisas futuras.
71
6 CONCLUSÃO
A partir do teste de Cristal Violeta determinou-se que as frações Acetato de etila,
Butanol e Clorofórmio, obtidas do extrato hidroalcoólico de Acmella oleracea reduziram
significantemente a densidade celular a partir da concentração de 150 µg/mL em FAE, 250
µg/mL em FB e 1 mg/mL em FC, pricipalmente no período de 48 h.
Os testes de MTT e Vermelho Neutro revelaram a diminuição das atividades
mitocondrial e lisossomal, respectivamente, em todos as frações testadas, com exceção do
EtOHEB no teste de MTT.
O ensaio de Cristal Violeta com as subfrações após o fracionamento em coluna
Sephadex- LH20 demonstraram a citotoxicidade das frações AE5, AE6, AE7, AE17, B4, B5,
B6 e B13 que quando associadas às análises cromatográficas em CLAE-DAD de A5, A6, A7,
B6 e B7 mostram que os ácidos fenólicos e compostos fenólicos são os possíveis responsáveis
pela toxicidade observada, já que não foi observada a presença de espilantol nestas
subfrações.
Sendo assim este estudo comprova a toxicidade de A. oleracea in vitro, indicando
contudo que esta planta pode ser utilizada para consumo desde que em baixas concentrações,
que devem ser mais bem estudadas.
72
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80
APÊNDICE A - Leituras e espectros na íntegra das frações A5, A6, A7, A11, A14, B6,
B7, B13, ESPILANTOL EM FAE e ESPILANTOL EM FB
Nesta seção apresentam-se os apêndices do trabalho. Estando dispostas as leituras e
espectros na íntegra das frações A5, A6, A7, A11, A14, B6, B7, B13, ESPILANTOL EM
FAE e ESPILANTOL EM FB, obtidos através das análises dos extratos em CLAE-DAD.
A5
Espectro CLAE-DAD
A5
Espectro CLAE-DAD
A5
Espectro CLAE-DAD
A6
Espectro CLAE-DAD
A6
Espectro CLAE-DAD
A6
Espectro CLAE-DAD
A6
Espectro CLAE-DAD
A6
Espectro CLAE-DAD
A7
Espectro CLAE-DAD
A7
Espectro CLAE-DAD
A7
Espectro CLAE-DAD
A7
Espectro CLAE-DAD
A11
Espectro CLAE-DAD
A11
Espectro CLAE-DAD
A14
Espectro CLAE-DAD
B6
Espectro CLAE-DAD
B6
Espectro CLAE-DAD
B6
Espectro CLAE-DAD
B6
Espectro CLAE-DAD
B7
Espectro CLAE-DAD
B7
Espectro CLAE-DAD
B7
Espectro CLAE-DAD
B7
Espectro CLAE-DAD
B13
Espectro CLAE-DAD
B13
Espectro CLAE-DAD
Espilantol- FAE
Espectro CLAE-DAD
Espilantol- FAE
Espectro CLAE-DAD
Espilantol- FAE
Espectro CLAE-DAD
Espilantol- FAE
Espectro CLAE-DAD
Espilantol- FB
Espectro CLAE-DAD
Espilantol- FB
Espectro CLAE-DAD
112
Espilantol- FB
Espectro CLAE-DAD