Trabalho

XIII JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO – JEPEX 2013 – UFRPE: Recife, 09 a 13 de dezembro.
Diversidade Genética do Beijupirá (Rachycentron canadum) na costa
Nordeste do Brasil.
Mondrian Rodrigues de Sales1, Marcos Antonio Pergentino da Silva2, Maria Raquel Moura Coimbra3

Introdução
O beijupirá (Rachycentron canadum) é um peixe pelágico economicamente importante e distribuído em águas
tropicais e subtropicais quentes, com produção aquícola ainda incipiente no Brasil. Em aquicultura, uma das formas de
melhor aproveitar o potencial de uma espécie é explorar a heterose por meio do cruzamento de reprodutores que
pertençam a grupos genéticos distintos, de tal sorte que o acesso à variação genética existente em populações selvagens
é uma informação essencial.
A ocorrência de estratificação genética populacional ao longo da costa brasileira pode ser aproveitada na exploração
da heterose, que costuma estar associada ao aumento da sobrevivência e da adaptabilidade na aquicultura. Dessa forma,
identificar populações genéticas distintas é fundamental na formação de plantéis.
Os marcadores moleculares microssatélites permitem investigar diferenças genéticas entre populações, constituindo
ferramentas informativas e necessárias para a obtenção de parâmetros genéticos.
O objetivo deste trabalho foi avaliar a diversidade genética em uma população de 22 beijupirás da costa do Rio
Grande do Norte (RN) e otimizar a amplificação de 8 loci de microssatélite nesta população.
Material e métodos
Foram coletados vinte e dois exemplares de beijupirá, na costa do Rio Grande do Norte, e retirado um pedaço de
tecido da nadadeira caudal, para extração de DNA. O DNA foi extraído com o kit DNeasy Blood and Tissue kit
(Qiagen), de acordo com o protocolo do fabricante e quantificados em um espectrofotômetro do tipo nanovue.
Foram selecionados 25 loci de marcadores de microssatélite desenvolvidos por Renshaw (comunicação pessoal) e por
Pruett et., al (2005). Tais marcadores foram inicialmente otimizados para temperatura de anelamento e concentração de
magnésio em uma população de 22 indivíduos. Os produtos de PCR foram separados em gel de agarose a 1% e
posteriormente em gel de poliacrilamida, a 4 ou 5%, dependendo do locus.
As reações tiveram volume final de 10 uL, consistindo de 1 uL ou 2 uL de DNA (20-40 ng/uL), 1X Tampão de PCR
(20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 40 mM NaCl), 1U de Taq DNA polimerase recombinante, 10 pmol/uL de cada primer,
200uM de dNTP, 1,5 ou 2,5 mM de MgCl2 Os ciclos de PCR consistiu de uma desnaturação inicial de 94 ° C por 4
minutos, seguido de 35 ciclos de 94 ° C durante 30 segundos, temperatura de anelamento otimizado durante 30
segundos, extensão a 72 ° C durante 1 minuto e uma extensão final a 72 ° C durante 40 minutos.
Os produtos de PCR foram aquecidos para desnaturação da fita de DNA e formamida foi adicionada para impedir a
reunião das fitas de DNA. A separação dos alelos de cada locus de microssatélite foi feito em gel de poliacrilamida
(Fig. 2) com programação de 1500 v 60 mA e 55 W. Inicialmente foi feita uma pré-corrida com duração de 30 - 40 min
para aquecimento uniforme do gel e, em seguida, uma eletroforese com duração de 1h30 min - 2 horas foi conduzida
com os mesmos parâmetros da pré-corrida. Após a eletroforese, os géis foram corados com nitrato de prata a 2% e
revelados com carbonato de sódio e fixados em ácido acético 10%.
As imagens dos alelos foram registradas em um scanner e o tamanho dos alelos foi estimado a partir da comparação
da altura dos alelos com um marcador de 10 bp (Invitrogen) e calculados em um software Kodak (Kodak MI).
Os parâmetros genéticos como número de alelos (A), Heterozigosidades observadas (Ho) e esperadas (He),Coeficiente
de endogamia (FIS), Equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE), Desequilíbrio de ligação (LD), índice de diferenciação
populacional (FST) foram calculadas no programa Genepop 4.0 (Raymond & Rousset, 1995). Alelos Nulos foram
calculados por meio do Microchecker (Oosterhout et al., 2004) e o Número de Alelos Efetivos (Ae), através do
Genealex (Peakall & Smouse, 2006).
Resultados e Discussão
Um total de 57 alelos foi encontrado em oito marcadores microssatélite, variando de 1 a 14 (Tab.1). Números
similares de alelos foram encontrados por Pruett et., al (2005) e Gold et., al (2013) que avaliaram populações do Golfo
1
Primeiro Autor é Graduando em Engenharia de pesca, Departamento de Pesca e Aquicultura, Laboratório de Genética aplicada, Universidade
Federal Rural de Pernambuco, Rua Dom Manuel de Medeiros, s/n, Recife, PE, CEP: 52171-900. E-mail: [email protected]
2
Segundo Autor é Graduando em Engenharia de pesca, Departamento de Pesca e Aquicultura, Laboratório de Genética aplicada Universidade Federal
Rural de Pernambuco, Rua Dom Manuel de Medeiros, s/n, Recife, PE, CEP: 52171-900. E-mail: [email protected]
3
Terceiro Autor é Professor Associado do Departamento de Pesca e Aquicultura, Laboratório de Genética aplicada, Universidade Federal Rural de
Pernambuco, Rua Dom Manuel de Medeiros, s/n, Recife, PE, CEP: 52171-900. E-mail: [email protected]
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do México e Atlântico Norte-ocidental.
A heterozigosidade média esperada e observada encontradas foi de 0,6528 e 0,5714, respectivamente. Gold et., al
(2013) encontrou uma heterozigosidade esperada média de 0,6592 para os oito loci aqui avaliados em quatro
populações, sendo uma população do Atlântico Norte-ocidental, duas populações do Golfo do México e uma outra de
Taiwan.
Três dos nossos marcadores com repetições tetranucleotídicas (Rca1B-F06, Rca1B-H09 e Rca1B-C06) foram
comparados com dados brutos de Gold et., al (2013) e os resultados mostraram um compartilhamento de alelos e suas
frequências, sugerindo um intenso fluxo gênico retratado por um F ST de 0,0088 entre a população do Rio Grande do
Norte e aquelas do Atlântico Norte-ocidental e Golfo do México. Os resultados mostraram que a população do Rio
Grande do Norte e aquelas do Golfo do México e do Atlântico Norte-ocidental fazem, na verdade, parte uma única
população.
A avaliação de populações mais ao sul do Rio Grande do Norte poderá revelar alguma estratificação genética, uma
vez que nesta região a corrente do Brasil é predominante.
Agradecimentos
Agradecemos à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Fundação de Amparo à
Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco (FACEPE) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPQ).
Referências
Benetti DD, Alarcon JF, Stevens O’Hanlon B, Rivara JA, Banner-Stevens G, Rotman FJ (2003) Advances in hatchery
and growout technology of marine finfish candidate species for offshore aquaculture in the Caribbean. Proceedings of
the Gulf and Caribbean Fisheries Institute, 54, 473 – 487.
Bridger CJ, Costa-Pierce BA (2002) Sustainable development of offshore aquaculture in the Gulf of Mexico. Gulf
Carib. Fish. Inst. 53: 255-265.
Gold JR , Giresi MM , Renshaw MA, Gwo J. Population Genetic Comparisons among Cobia from the Northern Gulf of
Mexico, U.S. Western Atlantic, and Southeast Asia. North American Journal of Aquaculture 2013, 75:1, 57-63
Oosterhout WFV, Hutchinson DP, Willis M, Shipley P (2004). Micro-Checker: software for identifying and correcting
genotyping errors in microsatellite data. Mol. Ecol. Notes 4: 535-538.
Peakall R, Smouse PE GenAlEx 6: Genetic Analysiz in Excel Population genetics software for teaching and research.
Mol. Ecol. Notes. 2006; 6: 288-295.
Pruett CL, Saillant E, Renshaw MA, Patton JC, Rexroad CE, Gold JR. Microsatellite DNA markers for population
genetic studies and parentage assignment in cobia, Rachycentron canadum. Molecular Ecology Notes 2005, v. 5, 84-86.
Raymond M, Rousset F Genepop (version 1.2): population genetics software for exact tests and ecumenicism. Journal
of Heredity. 1995; 86: 248-249.
Renshaw A. Microsatellite Markers for Cobia, Rachycentron canadum. Comunicação pessoal
Shaffer RV, Nakamura EL (1989) Synopsis of the biological data on the cobia, Rachycentron canadum (Pisces:
Rachycentridae). US Department of Commerce, NOAA Technical Report NMFS 82.
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Figura 1. Ilustração da espécie de beijupirá (Rachycentron canadum).
Figura 2. Aplicação de amostras em gel de
Poliacrilamida.
Tabela 1. Parâmetros Genéticos
Estatística
Rca1-A11
Rca1B-F06
Rca1B-H09
Rca1-B12
Rca1B-C06
Rca1B-A10
Rca1-D04
Rca1-D08
N
22
22
22
22
22
22
22
22
Tamanho
alelos
166-196
264-300
178-226
171-183
357-421
171-201
123-129
172
A
8
10
11
3
14
6
4
1
Ho
0,5000
0,5909
0,6818
0,4545
0,7272
0,5909
0,4545
0
He
0,7285
0,7376
0,8592
0,3816
0,7610
0,6629
0,4390
0
FIS
0,3714
0,2036
0,2105
-0,1966
0,0456
0,1111
-0,0363
-
HWE
*
*
*
NS
NS
NS
NS
*
Ae
5,158
8,100
8,243
1,595
10,452
3,106
1,815
1
Alelos nulos
Sim
Não
Sim
Não
Não
Não
Não
-
N= Tamanho amostral,Tamanho dos alelos em pares de base, A= número de alelos por locus, Ho= heterozigosidade observada, He= Heterozigosidade
esperada, FIS = Coeficiente de endogamia, HWE = Equilíbrio de Hardy Weinberg, * = P<0,05, NS =Não significante, Ae= Numero de Alelos efetivos.
Tabela 2. Índice de diferenciação
genética populacional
Microssatélite
Fst
Rca1B-C06
0.0236
Rca1B-F06
0.0004
Rca 1B-H09
0.0023
Fst Total
0,0088