Técnico Comunicado

Comunicado145
Técnico
ISSN 1809-502X
Cruz das Almas, BA
Dezembro, 2010
Detecção de Vírus
Transmitidos por Ácaros
Brevipalpus em seus Vetores
Karen Sumire Kubo1
Marinês Bastianel 2
Valdenice Novelli 3
Marcos Antônio Machado4
Juliana Freitas-Astúa5
A importância dos ácaros do gênero Brevipalpus vem
crescendo, tornando-se evidente seu potencial como
praga de plantas, especialmente por sua capacidade
de transmitir vírus (CHILDERS et al., 2003; KITAJIMA
et al., 2010). Os vírus transmitidos por Brevipalpus sp.
(VTBs) têm em comum, além do vetor, a morfologia
das partículas e semelhanças em sintomas e efeitos
citopatológicos que induzem nas plantas hospedeiras
(KITAJIMA et al., 2003). Os sintomas nos
hospedeiros consistem de lesões locais (cloróticas,
necróticas, manchas verdes ou ainda manchas
anelares) em folhas e ramos afetados (KITAJIMA et
al., 2003). Ao contrário de outros vírus que invadem
sistemicamente seus hospedeiros, as partículas dos
VTBs permanecem concentradas nas lesões, não
sendo capazes de circular nas plantas que infectam.
A relação dos VTBs com seus vetores não é
completamente conhecida. A otimização dos
protocolos de extração de ácidos nucleicos e a
possibilidade de se utilizar primers específicos não
apenas para a sua detecção nos hospedeiros, mas
também em seus vetores, são passos importantes para
os estudos da interação vetor-patógeno-hospedeiro.
Podem também ser úteis para o manejo de culturas
com relação às doenças causadas pelos VTBs, como a
mancha anular do cafeeiro, a leprose dos citros e a
pinta verde do maracujazeiro, pois, em alguns casos, é
possível a detecção precoce dos vírus nos ácaros antes
mesmo do aparecimento dos sintomas no campo.
Os Vírus Transmitidos por Ácaros
Brevipalpus
Dentro do gênero Brevipalpus, as espécies de maior
importância econômica são B. californicus (Banks), B.
obovatus (Donnadieu) e B. phoenicis (Geijskes) (Figura
1). Essas três espécies foram relatadas em 928 espécies
pertencentes a 513 gêneros distribuídos em 139
famílias vegetais, compreendendo monocotiledôneas,
dicotiledôneas, plantas anuais, perenes e ornamentais,
entre outras (Childers et al., 2003).
Engenheira-florestal, doutoranda da Unicamp, Campinas, SP, [email protected]
Engenheira-agrônoma, D.Sc., pesquisadora do Centro APTA Citros Sylvio Moreira-IAC, Cordeirópolis, SP, [email protected]
Bióloga, D.Sc., pesquisadora do Centro APTA Citros Sylvio Moreira-IAC, Cordeirópolis, SP, [email protected]
4
Engenheiro-agrônomo, D.Sc., pesquisador do Centro APTA Citros Sylvio Moreira-IAC, Cordeirópolis, SP, [email protected]
5
Engenheira-agrônoma, Ph.D., pesquisadora da Embrapa Mandioca e Fruticultura, Cruz das Almas, BA, [email protected]
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Detecção de Vírus Transmitidos por Ácaros Brevipalpus em seus Vetores
Os vírus transmitidos por Brevipalpus são divididos em
dois tipos: nucleares (VTB-N) e citoplasmáticos (VTB-C),
em função principalmente do seu local de maturação na
célula hospedeira (KITAJIMA et al., 2003). Os vírus do
tipo nuclear foram encontrados pela primeira vez em
orquídeas infectadas pela mancha da orquídea (Orchid
fleck virus, OFV) (DOI et al., 1969). Posteriormente,
foram descritos em citros, café e em cerca de 20
espécies de plantas ornamentais, causando as doenças
conhecidas como leprose dos citros do tipo nuclear
(Citrus leprosis virus, nuclear type, CiLV-N) e mancha
anular do cafeeiro (Coffee ringspot virus, CoRSV), entre
outras (KITAJIMA et al., 2010). Esses vírus induzem a
formação de um viroplasma eletrontransparente no
núcleo da célula hospedeira. As partículas virais têm
forma de bastonetes curtos, com largura de 40 nm e
comprimento de 100 nm, que podem aparecer dispersos
no viroplasma ou no nucleoplasma. Frequentemente,
formam arranjos de membranas dispostas em círculo.
Os vírions são organizados radialmente, gerando
configurações conhecidas como “roda de carroça”
(KITAJIMA et al., 2010).
apresentando largura de 60 a 70 nm e comprimento
de 110 a 120 nm. Estas ocorrem isoladas ou
agrupadas sempre no lúmen do retículo
endoplasmático. Ocasionalmente, as partículas
baciliformes podem ser encontradas na cavidade
perinuclear, possivelmente migrando do retículo
endoplasmático. Diferente do tipo nuclear, o
viroplasma dos vírus do tipo citoplasmático ocorre
como inclusões citoplasmáticas eletrondensas e
vacuoladas, de forma e dimensões variadas
(KITAJIMA et al., 2003).
Pouco se sabe ainda sobre a interação destes vírus
com seus hospedeiros e vetores, mas supõe-se que os
vírus do tipo nuclear interagem de forma distinta da
dos citoplasmáticos. Embora durante muito tempo os
VTBs tenham sido classificados como possíveis
rhabdovirus, Locali-Fabris et al. (2006) propuseram,
com base na sequência genômica do CiLV-C, a criação
de um novo gênero de vírus, o Cilevirus, tendo como
membro-tipo o CiLV-C. De acordo com Kondo et al.
(2006), apesar de o OFV fazer parte da família
Rhabdoviridae, deve ser considerado o membro-tipo do
recém-proposto gênero Dichorhabdovirus. Como
outros VTB-N apresentam similaridade de sequência
com OFV, é possível que também pertençam ao
mesmo gênero (Locali-Fabris, Machado & FreitasAstúa, dados não publicados).
Detecção dos VTBs em seus Vetores
Figura 1. Colônia de ácaros B. phoenicis mantidos em frutos
de laranjeira doce Citrus sinensis (L.) Osbeck.
Os vírus do tipo citoplasmático foram encontrados
pela primeira vez em amostras de folha afetadas pela
“lepra explosiva”, um isolado do vírus da leprose dos
citros C (Citrus leprosis virus C, CiLV-C) da Argentina
(KITAJIMA et al., 1974). Outros exemplos de VTB-C
são os causadores da pinta verde do maracujazeiro
(Passion fruit green spot virus, PFGSV), da mancha
anular de Solanum violaefolium (Solanum violaefolium
ringspot virus, SvRSV), além de cerca de 20 vírus
distintos, a maior parte deles infectando plantas
ornamentais (KITAJIMA et al., 2010). As partículas
são curtas, baciliformes e com membrana,
Os sintomas causados por VTB em seus hospedeiros
vegetais são característicos e, no geral, facilmente
identificáveis (Figura 2). Além disso, estão atualmente
disponíveis primers específicos para o diagnóstico de
algumas enfermidades causadas por esses fitovírus.
No entanto, com exceção de um relato evidenciando a
detecção do CiLV-C em ácaros virulíferos (Novelli et
al., 2007), não há informação sobre a detecção de
outros VTBs em Brevipalpus. Este trabalho mostra que
é possível utilizar a técnica de RT-PCR com primers
específicos para a detecção tanto de VTB-C (CiLV-C e
SvRSV) quanto de VTB-N (OFV e Clerodendrum
chlorotic spot virus - ClCSV) em seus vetores, o que
abre importante caminho para estudos de interação
vírus-vetor, além da possibilidade de usar essa técnica
para o monitoramento de ácaros virulíferos nas
culturas de importância econômica, como citros e
orquídeas e, possivelmente, café e maracujá.
Detecção de Vírus Transmitidos por Ácaros Brevipalpus em seus Vetores
2008). A extração de RNAs foi adaptada de Gibbs e
Mackenzie (1997) por Novelli et al. (2007) para
ácaros da espécie Brevipalpus phoenicis, possibilitando
a otimização do protocolo para um resultado
consistente a partir de apenas 10 ácaros. Com o
intuito de verificar se o protocolo de extração de
Novelli et al. (2007) seria aplicável a outras espécies
de Brevipalpus e ainda se primers desenhados para
amplificar SvRSV, OFV e ClCSV em plantas seriam
eficientes na detecção dos vírus em seus vetores,
foram instalados experimentos de aquisição desses
VTBs e também de CiLV-C, como controle.
Figura 2. Sintomas de lesões localizadas cloróticas ou
necróticas anelares induzidas por A. CiLV-C em laranjeira
doce; B. SvRSV em Solanum violaefolium (foto cortesia Prof.
Elliot W. Kitajima, ESALQ/USP); C. OFV em orquídea; D.
ClCSV em Clerodendrum speciosum.
Com base em sequências genômicas virais, primers
foram desenhados para amplificar fragmentos de
CiLV-C (Locali et al., 2003), SvRSV (Ferreira et al.,
2006), OFV (Kubo et al., 2009) e ClCSV (KUBO et al.,
cDNAs foram sintetizados com a enzima M-MLV-RT e
primers randômicos (Invitrogen) e as reações de
polimerase em cadeia (PCR) foram realizadas com a
enzima Taq DNA polimerase (Invitrogen). Ácaros B.
phoenicis alimentaram-se por cinco dias de lesões
causadas por CiLV-C ou ClCSV, B. obovatus
alimentaram-se de folhas com lesões de SvRSV e B.
californicus, de folhas com sintomas causados pelo
OFV. B. phoenicis utilizados para controle negativo de
CiLV-C e ClCSV foram obtidos na criação do
Laboratório de Acarologia do Centro APTA Citros
Sylvio Moreira-IAC; as outras espécies de ácaros
avirulíferos foram coletadas em plantas
assintomáticas de S. violaefolium (B. obovatus) e
orquídeas (B. californicus).
O resultado da RT-PCR (Figura 3) evidencia, de
maneira inequívoca e específica, a detecção de quatro
VTBs, dois do tipo nuclear e dois do tipo
citoplasmático, em seus ácaros vetores.
Figura 3. Gel de agarose 1% evidenciando o resultado da RT-PCR para a detecção de Citrus leprosis virus C (CiLV-C), Orchid
fleck virus (OFV), Clerodendrum chlorotic spot virus (ClCSV) e Solanum violaefolium ringspot virus (SvRSV) em ácaros
virulíferos utilizando primers específicos para cada um dos respectivos vírus. Coluna 1) ácaros virulíferos para CiLV-C, OFV,
ClCSV ou SvRSV, respectivamente; 2) ácaros avirulíferos; 3) controle positivo (folhas sintomáticas para cada um dos respectivos
vírus: CiLV-C, OFV, ClCSV e SvRSV); 4) folhas sadias de citros, orquídea, clerodendron e solano, respectivamente.
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Detecção de Vírus Transmitidos por Ácaros Brevipalpus em seus Vetores
Considerações Finais
Ainda existem muitos aspectos a serem elucidados em
relação aos VTBs. O fato de esses vírus invadirem os
hospedeiros de forma localizada e não sistêmica
dificulta qualquer tipo de estudo aprofundado sobre as
interações vírus-planta-vetor, incluindo a biologia da
transmissão viral. A detecção de VTBs em seus
vetores aumenta a confiabilidade na instalação de
experimentos de transmissão destes patógenos,
possibilitando a confirmação da condição virulífera de
ácaros a serem utilizados. Ademais, a detecção de
vírus no vetor abre portas para a possibilidade de
monitorar populações virulíferas no campo, visando a
auxiliar a tomada de decisão sobre aplicação de
acaricidas para o manejo das doenças.
Referências
CHILDERS, C. C., RODRIGUES, J. C. V., WELBOURN,
W. C. Host plants of Brevipalpus californicus, B.
obovatus and B. phoenicis (Acari: Tenuipalpidae) and
their potential involvement in the spread of virus
diseases vectored by these mites. Experimental and
Applied Acarology, v.30, n.1/3, p.29-105, 2003.
DOI, Y.; ARAI, K.; YORA, K. Distribution of bacilliform
virus particles in Lasaki disease and Cymbidium ringspot
disease. Annals of Phytopathological Society of Japan,
v.35, p.388, 1969.
FERREIRA, P. T. O., LOCALI, E. C., FREITAS-ASTÚA,
J.; ANTONIOLI-LUIZON, R., GOMES, R. T., MACHADO,
M. A., KITAJIMA, E. W. Caracterização de um vírus
baciliforme isolado de Solanum violaefolium transmitido
pelos ácaros Brevipalpus phoenicis e Brevipalpus
obovatus (Acari: Tenuipalpidae). Summa
Phytopathologica, v. 33, n. 3, p. 264-269, 2007.
GIBBS, A., MACKENZIE, A. A primer pair for amplifying
part of the genome of all potyvirids by RT-PCR. Journal
of Virological Methods, v.63, p.9-16, 1997.
KITAJIMA, E. W., CHAGAS, C. M.; RODRIGUES, J. C.
V. Brevipalpus-transmitted plant virus and virus-like
diseases: cytopathology and some recent cases.
Experimental and Applied Acarology, v.30, n.1-3, p.
135-160, 2003.
KITAJIMA, E. W., RODRIGUES, J. C. V., FREITASASTÚA, J. An annotated list of ornamentals naturally
found infected by Brevipalpus mite transmitted viruses.
Scientia Agricola, v.67, n.3, p. 348-371, 2010.
KITAJIMA, E. W., ROSILLO, M. A., PORTILLO, M. M.,
MÜLLER, G. W., COSTA, A. S. Microscopia eletrônica
de tecidos foliares de laranjeiras infectadas pela lepra
explosiva da Argentina. Fitopatologia v.9, p. 55-56,
1974.
KONDO, H., MAEDA, T., SHIRAKO, Y., TAMADA, T.
Orchid fleck virus is a rhabdovirus with an unusual
bipartite genome. Journal of General Virology, v.87, p.
2413-2421, 2006.
KUBO, K. S., STUART, R. M., FREITAS-ASTÚA, J.,
ANTONIOLI-LUIZON, R., LOCALI-FABRIS, E. C.,
COLETTA-FILHO, H. D., MACHADO, M. A., KITAJIMA,
E. W. Evaluation of the genetic variability of Orchid fleck
virus by single-strand conformational polymorphism
analysis and nucleotide sequencing of a fragment from
the coat protein gene. Archives of Virology, v.154, n.6,
p.1009-1014, 2009.
KUBO, K. S., FREITAS-ASTÚA, J., MACHADO, M. A.,
BORGES, K., KITAJIMA, E. W. Partial sequencing of
Clerodendron chlorotic spot virus, a new virus
transmitted by Brevipalpus mites. XIV International
Congress of Virology, abstract book, p. 357, 2008.
LOCALI, E.C., FREITAS-ASTÚA, J., SOUZA, A.A.,
TAKITA, M.A., ASTÚA-MONGE, G, ANTONIOLI, R.,
KITAJIMA, E.W., MACHADO, M.A. Development of a
molecular tool for the diagnosis of leprosis, a major
threat to citrus production in the Americas. Plant
Disease, v.87, p.1317-1321, 2003.
LOCALI-FABRIS, E.C., FREITAS-ASTÚA, J., SOUZA, A.
A., TAKITA, M. A., ASTÚA-MONGE, G., ANTONIOLILUIZON, R., RODRIGUES, V., TARGON, M. L. N.,
MACHADO, M. A. Complete nucleotide sequence,
genomic organization and phylogenetic analysis of Citrus
leprosis virus cytoplasmic type. Journal of General
Virology, v.87, p. 2721–29, 2006.
NOVELLI, V. M., FREITAS-ASTÚA, J., BASTIANEL, M.,
LOCALI-FABRIS, E. C., ANTONIOLI-LUIZON, R.,
RIBEIRO, B.M., MACHADO, M.A. Detecção do vírus da
leprose dos citros no ácaro vetor. Laranja, v. 28, n. 1, p.
39-46, 2007.
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Tratamento das ilustrações: Maria da Conceição Pereira
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