EXAME de ENGENHARIA GENÉTICA

EXAME de ENGENHARIA GENÉTICA
Data: 21 de Janeiro de 2004
Duração máxima: 2h 30 min
As bactérias gram-negativas do complexo Burkholderia cepacia (BCC) são importantes
organismos patogénicos oportunistas, podendo conduzir a infecções respiratórias
persistentes e ao rápido declíneo da função pulmonar em doentes com fibrose quística
(FQ). No entanto, o resultado clínico destas infecções por bactérias do BCC, após
colonização, é variável e, por enquanto, imprevisível. Estas bactérias são transmitidas
entre doentes, por contacto social ou durante a hospitalização, sendo o ambiente uma
outra fonte de contaminação.
1) Num estudo realizado em Portugal, que envolveu 113 isolados do BCC obtidos de 23
doentes infectados, sob vigilância durante um período de 7 anos no Hospital de Santa
Maria, mais de metade dessas bactérias foram isoladas em série de doentes
persistentemente infectados (Cunha et al., J. Clinical Microbiol., 41, 4113-412,
2003). Usando a ribotipagem clássica, demonstrou-se que os 113 isolados
representavam apenas 14 diferentes estirpes diferentes que, ou infectavam
persistentemente o mesmo doente, ou tinham sido transmitidas entre doentes ou
obtidas do ambiente.
a) Refira-se sucintamente, às bases do método de ribotipagem e às razões da sua
aplicabilidade no referido estudo.
b) Compare a ribotipagem clássica e a ribotipagem por PCR.
c) Indique um outro método molecular, mais discriminatório do que a ribotipagem,
referindo os seus fundamentos e os seus inconvenientes face à ribotipagem.
2) A maioria dos isolados do BCC de doentes com FQ produzem um polissacárido
extracelular, o cepaciano, que poderá desempenhar um papel na colonização e
persistência de BCC no pulmão destes doentes. Pretende-se pois esclarecer esta
hipótese. Para isso, tem que se obter mutantes não produtores de EPS que se
distinguem dos produtores pela observação do fenótipo das colónias formadas que é
mucoso, em contraste com as não produtoras, não mucosas. Para obter esses
mutantes, a partir de um isolado clínico mucoso, recorreu-se à mutagénese aleatória
usando o transposão Tn5 (Kmr)
a) Indique os vários passos de uma experiência que permita obter, com sucesso,
esses mutantes EPS-, com o transposão provavelmente inserido em genes
necessários para a síntese do cepaciano.
b) Tendo obtido 10 colónias EPS- que considerou serem fortes candidatos a terem o
transposão Tn5 inserido no genoma,
i)
indique 2 técnicas que poderá usar para confirmar quais os candidatos que
têm de facto o transposão inserido no genoma, indicando os passos
ii)
principais dessas técnicas, bem como o material biológico e o tipo de
equipamento necessário à sua execução.
suponha que foi possível sequenciar a região do DNA genómico onde o
transposão Tn5 se inseriu num dos mutantes EPS-. Encontrando-se
disponível a sequência completa do genoma de um isolado clínico do BCC
(http://www.Sanger.ac.uk), esta informação pôde ser explorada para
localizar, no cromossoma, uma região mais extensa centrada no ponto de
inserção do transposão. Com base nesta análise, verificou-se que o gene
interrompido (CepX) faz parte de um agrupamento genético de 12 genes
que, com base na comparação da sua sequência de nucleótidos, codificam
proteinas homólogas de enzimas que participam na biossíntese de EPS em
outros sistemas biológicos, anteriormente estudados, pelo que se
considerou que se tinha encontrado o agrupamento de genes biossintéticos
do cepaciano (Moreira et al., Biochem. Biophys Res. Commun., 312,
323-333, 2003).
a) Suponha que quer superproduzir e purificar a proteína CepX para a
caracterizar bioquimicamente. Refira os vários passos de uma estratégia
experimental que permita atingir este objectivo.
b) Após a clonagem e sequenciação do gene CepX e caracterização bioquímica
da enzima CepX pretende esclarecer a importância para essa actividade
enzimática, de um determinado resíduo aminoacídico presente no interior de
uma sequência que se pressupõe constituir o centro activo. Refira-se à
abordagem experimental que poderia usar para o efeito.
c) Suponha que quer demonstrar que os 12 genes do agrupamento genético
constituem um operão, ou seja, que são transcritos, coordenadamente,
originando um transcrito multicistónico (que inclui informação dos vários
genes) e não vários transcritos de genes individuais.
Que tipo de experiência deveria realizar e que resultados deveria obter caso a
hipótese do operão estivesse correcta?
3) Durante a continuada terapia com antibiótico, os isolados sequenciais da mesma
estirpe, que contaminou durante vários anos um mesmo doente, apresentam
resistência a um dos 2 únicos antibióticos a que era sensível o isolado original.
Pretende identificar (entre todos os genes do genoma) os genes cuja transcrição se
encontra incrementada nas variantes resistentes isoladas mais recentemente, de modo
a encontrar pistas para o esclarecimento dos mecanismos envolvidos na emergência
da resistência ao referido antibiótico.
a) indique, justificando, as 2 técnicas que podem ser usadas para este fim. Explique
porque razões a disponibilidade da sequência completa do genoma de uma estirpe
de BCC as tornou praticáveis.
b) Compare as 2 técnicas quanto aos seus fundamentos e às
vantagens/inconvenientes.