avaliação da atividade antimicrobiana do extrato bruto e suas

1
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
EM BIOTECNOLOGIA
PPGBiotec
UEFS
SUZANA FERREIRA MAGALHÃES GADÉA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO
EXTRATO BRUTO E SUAS FRAÇÕES DE
GLISCHROTHAMNUS ULEI (MOLLUGINACEAE)
DO SEMI-ÁRIDO BAIANO
Feira de Santana, BA
2008
2
SUZANA FERREIRA MAGALHÃES GADÉA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO
EXTRATO BRUTO E SUAS FRAÇÕES DE
GLISCHROTHAMNUS ULEI (MOLLUGINACEAE)
DO SEMI-ÁRIDO BAIANO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em
Biotecnologia, da Universidade Estadual de Feira de Santana
como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em
Biotecnologia.
Orientador (a): Profª. Drª. Ana Paula Trovatti Uetanabaro
Co-Orientador (a): Profª. Drª. Angélica Maria Lucchese
Feira de Santana, BA
2008
3
A Deus, aos meus pais, ao meu
marido, aos meus amigos... Aqueles
que
direta
ou
indiretamente
contribuíram para este trabalho.
4
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus que me deu a vida e a oportunidade de
realizar mais esse objetivo.
Agradeço a meus pais, Edson e Ana, pela batalha diária para uma vida digna,
honesta e sempre em crescimento. Pelas noites em claro, pelas preocupações com
meu futuro, pela insistência para que eu sempre queira mais, queira o melhor.
Agradeço ao meu marido, Alex, pelo incentivo, paciência, amizade e amor.
Pela busca, junto comigo, pela realização de meus sonhos, pelo apoio nas horas
difíceis desta jornada.
Às minhas queridas amigas, Carla, Gisele e Clarissa, e o amigo João
Ronaldo, pelas palavras de incentivo, pela paciência, pelos momentos alegres e
estressantes...
Agradeço também às minhas amigas de batalhas, não menos queridas,
Cristiana e Indira, pelo companheirismo, por aqueles momentos de desespero onde
sempre havia uma, nem que fosse somente uma, palavra de consolo, tranqüilidade,
que tudo iria acabar bem... Pela reciprocidade, alegrias e carinho.
Aos meus muitos amigos que não se envolveram diretamente, mas que nunca
esqueciam de perguntar: “e como vai a pesquisa??”
À minha querida orientadora Dra. Ana Paula Trovatti Uetanabaro, pela
oportunidade, pela paciência, pelo incentivo, por acreditar que eu chegaria lá. E
cheguei!
À minha co-orientadora Dra. Angélica Maria Lucchese, pelo apoio, confiança
e incentivo, mesmo nos momentos em que a distância não ajudava muito, mas
sempre resolvíamos esse problema...
Ao pessoal do LAPRON pela ajuda e dedicação para que pudéssemos
realizar nossos experimentos.
Ao pessoal do LAPEM pela compreensão, especialmente ao coordenador Dr.
Aristóteles Góes Neto, pois em muitos momentos tive que me afastar do trabalho por
causa da pesquisa.
À minha mais nova amiga, Renata Pinto, pela ajuda e disponibilidade durante
a pesquisa.
5
Àqueles que estiveram ao meu lado durante esse período, serei eternamente
grata pelo apoio, compreensão, dedicação, companheirismo...
Enfim, a todos que fizeram parte, direta ou indiretamente, desses dois anos
de batalha para o meu crescimento pessoal e profissional, o meu muito obrigada!!!!!!
6
"Cada um que passa em nossa vida, passa sozinho, pois cada pessoa é
única e nenhuma substitui outra.
Cada um que passa em nossa vida, passa sozinho, mas não vai só,
nem nos deixa sós.
Leva um pouco de nós mesmos, deixa um pouco de si mesmo.
Há os que levam muito, mas há os que não levam nada.
Essa é a maior responsabilidade de nossa vida,
e a prova de que duas almas não se encontram ao acaso. "
(Antoine de Saint-Exupéry)
7
RESUMO
Atualmente, muitos estudos sobre atividades de produtos naturais têm sido
enfatizados buscando, principalmente, a atividade destes sobre microrganismos. O
objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade antimicrobiana do óleo essencial,
do extrato bruto e frações de Glischrothamnus ulei Pilg., Molluginaceae e fazer uma
triagem inicial dos grupos de compostos responsáveis pela atividade observada.
Foram utilizadas as técnicas de difusão em disco, concentração inibitória mínima
(CIM) e bioautografia, utilizando o extrato bruto e suas frações da folha e do caule
da G. ulei. Os extratos metanólicos brutos da folha e do caule de G. ulei foram
testados contra os microrganismos: Escherichia coli CCMB 284, E. coli CCMB 261,
sensível à trimetoprima e resistente à sulfonamida, Staphylococcus aureus CCMB
262, resistente à estreptomicina e dihidrostreptomocina, S. aureus CCMB 263,
Bacillus cereus CCMB 282, Salmonella sp. CCMB 281, Pseudomonas aeruginosa
CCMB 268, Candida albicans CCMB 286, C. parapsilosis CCMB 288. Foi observada
atividade dos extratos brutos, das frações em hexano, diclorometano e acetato de
etila, da folha e do caule, utilizando-se a metodologia de difusão em disco. O
resultado de inibição do crescimento microbiano obtido pela MIC corroborou os
resultados da difusão em disco para S. aureus CCMB 262, S. aureus CCMB 263 e
B. cereus CCMB 282. Também foram realizados testes de bioautografia dos extratos
brutos e frações das folhas e caules, e os constituintes nas placas cromatográficas o
que indicaram a presença de terpenos e esteróides em todas as frações e a de
flavonóides para as frações em diclorometano, acetato de etila e butanol. Este é o
primeiro trabalho sobre a atividade antimicrobiana in vitro e do estudo fitoquímico de
G. ulei, espécie vegetal endêmica de Dunas do Rio São Francisco, Pilão Arcado, BA.
Palavras-chave: Atividade antimicrobiana, Glischrothamnus ulei, Molluginaceae,
concentração inibitória mínima (CIM), difusão em disco, bioautografia.
8
ABSTRACT
Currently, many studies about natural products activities have been mainly
focusing on their activity on microorganisms. The aim of the present study was to
evaluate the antimicrobial activity of essential oil, crude extract, and fractions of
Glischrothamnus ulei Pilg. (Molluginaceae) and to carry out an initial screening of the
groups of compounds related to the observed activity. antimicrobial activity of G. ulei
crude extract and its leaf and steam fractions were evaluated using diffusion in disc
test, Minimum Inhibitory Concentration (MIC), and bioautography. Leaf and steam
crude
methanolic
extracts
of
G.
ulei
were
tested against
the
following
microorganisms: Escherichia coli CCMB 284, E. coli CCMB 261, sensible to
trimethoprim and resistant to sulfonamide, Staphylococcus aureus CCMB 262,
resistant to streptomicin and dihydrostreptomocin, S. aureus CCMB 263, Bacillus
cereus CCMB 282, Salmonella sp. CCMB 281, Pseudomonas aeruginosa CCMB
268, Candida albicans CCMB 286, and C. parapsilosis CCMB 288. Leaf and steam
activity of crude extracts was observed in hexane, methylene dichloride and ethyl
acetate fractions using disc diffusion methodology. The result of microbial growth
inhibition obtained by MIC corroborated the disc diffusion results for S. aureus CCMB
262, S. aureus CCMB 263, and B. cereus CCMB 282. Bioautographic tests of leaves
and steams crude extracts and fractions were also carried out, revealing the
presence of terpenes and steroids in all the fractions and flavonoids in methylene
dichloride ethyl acetate and butanol fractions. This is the first work about both in vitro
antimicrobial activity and phytochemical study of G. ulei, an endemic plant species of
São Francisco sand dunes (Pilão Arcado, Bahia, Brazil).
Keywords: Antimicrobial activity, Glischrothamnus ulei, Molluginaceae, Minimum
Inhibitory Concentration (MIC), disc diffusion, bioautography.
9
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1:
Esquema simplificado da fase metodológica da pesquisa........ 26
Figura 2:
Fotos de G. ulei no campo, em Pilão Arcado, e das exsicatas
do Hebário da UEFS (HUEFS), número de acesso 53039........ 27
Figura 3:
Mapa da Bahia indicando a cidade da coleta............................ 28
Figura 4:
Figura ilustrativa da montagem da placa de 96 poços para o
experimento de determinação da concentração inibitória
mínima dos extratos de G. ulei contra microrganismos
patogênicos ao homem.............................................................. 32
Figura 5:
Atividades do extrato bruto de G. ulei contra B. cereus CCMB
282 (A), S. aureus CCMB 262 (B)............................................. 35
Figura 6:
Fotografia das placas de microdiluição contendo os
resultados da concentração inibitória mínima do extrato
metanólico bruto de G. ulei contra B. cereus CCMB 282 (A),
C. albicans CCMB 288 (B) e Salmonella sp. CCMB 281 (C);
da fração em acetato de etila contra C. albicans CCMB 286
(D) e Salmonella sp. CCMB 281 (F); da fração em butanol
contra Salmonella sp. CCMB 281 (E); da fração em
diclorometano contra B. cereus CCMB 282 (G), S. aureus
CCMB 263 (H)........................................................................... 42
Figura 6
Fotografia das placas de microdiluição contendo os
resultados da concentração inibitória mínima da fração em
diclorometano contra C. albicans CCMB 288 (I); da fração
em hexano contra S. aureus CCMB 262 (J), S. aureus
CCMB 263 (L) e B. cereus CCMB 282 (M); da fração em
butanol contra C. albicans CCMB 286 (N), B. cereus CCMB
282 (O)...................................................................................... 43
(continuação):
Figura 7:
Fotografia das placas cromatográficas com as frações em
hexano (A e B), acetato de etila (C) da folha (1) e do caule
(2), visualizadas com revelador AS (A), seguido por
aquecimento a 100°C e com revelador NP/PEG sob luz UV
no espectro de 365 nm (B) e (C).............................................. 46
Figura 8:
Bioautografia referente às frações diclorometano (A, B, C) e
hexano (D) frente aos microrganismos B. cereus (A), S.
aureus CCMB 262 (B e D) e S. aureus CCMB 263 (C)............ 47
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1:
Massa obtida, em gramas, e rendimento, em %, dos extratos
brutos e frações da folha e do caule da G. ulei........................ 34
Tabela 2:
Média dos diâmetros dos halos de inibição do crescimento
microbiano pelo teste de difusão em disco, em mm, dos
extratos metanólicos e de suas frações da folha e do caule
de G. ulei (Molluginaceae) contra os microrganismos testes.. 37
Tabela 3:
Resultados da Concentração Inibitória Mínima (CIM), em
mg.mL-1, do extrato bruto metanólico da folha de G. ulei
(Molluginaceae) e suas frações............................................... 44
Tabela 4:
Resultados da Concentração Inibitória Mínima (CIM), em
mg.mL-1, com o extrato bruto metanólico do caule de G. ulei
(Molluginaceae) e suas frações............................................... 44
11
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO
12
2
2.1
2.2
OBJETIVOS
OBJETIVO GERAL
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
16
16
16
3
3.1
3.2
REVISÃO DA LITERATURA
17
FITOTERAPIA
17
ANTIBIÓTICOS: MECANISMO DE AÇÃO, RESISTÊNCIA
DE MICRORGANISMOS E A NECESSIDADE DO DESENVOLVIMENTO DE NOVOS FÁRMACOS
18
3.3
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE EXTRATOS DE PLANTAS 20
3.4
MÉTODOS ANTIMICROBIANOS
22
3.4.1 Teste de Difusão em Disco
23
3.4.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
24
3.4.3 Bioutografia
24
3.5
GLISCHROTHAMNUS ULEI E A FAMÍLIA MOLLUGINACEAE
25
4
4.1
4.2
26
27
4.3.1
4.3.2
4.3.3
4.4
MATERIAIS E MÉTODOS
COLETA DO MATERIAL VEGETAL
OBTENÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL, EXTRATO BRUTO E
SUAS FRAÇÕES
Óleo Essencial
Extrato Bruto Metanólico
Obtenção das Frações do Extrato Bruto Metanólico
TRIAGEM DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO EXTRATO
BRUTO E SUAS FRAÇÕES
Microrganismos
Teste da difusão em disco
Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
BIOAUTOGRAFIA
5
RESULTADOS E DISCUSSÃO
34
6
CONCLUSÕES
50
7
REFERÊNCIAS
51
4.2.1
4.2.2
4.2.3
4.3
29
29
29
29
29
29
30
31
32
12
1 INTRODUÇÃO
Diferentes culturas dos mais distintos lugares, desenvolvidas ou não,
conhecem e utilizam o potencial terapêutico dos vegetais no tratamento de doenças,
práticas estas que acompanham o homem desde a pré-história e que evoluíram com
ele ao longo dos anos (CRUZ; NOZAKI; BATISTA, 2000; NOVAIS et al., 2003).
Dentre os principais produtos de origem vegetal com atividade antimicrobiana,
podem ser citados os extratos, as frações, o látex e os óleos essenciais. No Brasil,
muitas plantas são utilizadas na forma de extrato bruto, infusões ou emplastos, para
o tratamento de enfermidades comuns, sem nenhuma evidência científica de sua
ação (PESSINI et al., 2003).
A história da fitoterapia se mistura um pouco com história da farmácia, pois
somente com a revolução industrial e o conseqüente aumento da produção de
compostos
terapêuticos
sintéticos
houve
a
preferência
por
medicamentos
industrializados. O difícil controle de qualidade sobre os extratos também acelerou o
processo de troca das plantas medicinais por fármacos industrializados (REIS,
2006).
Nos últimos anos muitas pessoas vêm sendo curadas de infecções severas
usando alternativas terapêuticas com antibióticos (NOVAIS et al., 2003). Porém, a
utilização indiscriminada destes fármacos propiciou o aparecimento de vários
microrganismos resistentes. A partir daí foi verificada a necessidade de pesquisar
novas substâncias que pudessem agir como quimioterápicos (NOVAIS et al., 2003;
REIS, 2006).
Atualmente, muitos estudos sobre atividades de produtos naturais têm sido
enfatizados e eles buscam principalmente a atividade destes sobre microrganismos.
Isto acontece porque, a cada dia, as drogas existentes se tornam menos eficazes
diante dos microrganismos, devido aos mecanismos de resistência desenvolvidos
por estes através de mutações (COUTINHO et al., 2003/2004).
A resistência aos antimicrobianos é um processo genético relacionado à
existência de genes no microrganismo que codificam diferentes mecanismos que
evitam a ação das drogas. Ela pode ter origem em mutações que ocorrem no
microrganismo durante seu processo reprodutivo ou através do intercâmbio de
material genético (transferência horizontal gênica - THG) através da conjugação,
transdução e transformação (BASTOS, 2007). Genomas bacterianos estão em
13
constante fluxo gênico devido a componentes genéticos móveis, como plasmídeos,
transposons, bacteriófagos, e pela organização de seu genoma em operons, que
permite transferência conjunta de genes com funções similares. Por isso, qualquer
segmento de DNA de uma população pode ser transferido horizontalmente. Porém,
somente uma pequena parte deste DNA será mantida na célula receptora e
transferida para gerações posteriores, pois muitos mecanismos, como alterações
físicas e ambientais, limitam a aquisição horizontal de genes (UETANABARO;
GÓES-NETO, 2006).
A utilização de plantas medicinais no Brasil tem sido prática curativa desde
antes do descobrimento, sendo os primeiros médicos, originalmente portugueses,
bastante influenciados pela cultura indígena, inicialmente e, depois, pela cultura
africana (OLIVEIRA, 2005).
A fitoterapia é bastante adotada pela população carente tanto da área rural
como também da urbana, devido à fácil disponibilidade e menores custos, sendo o
uso de plantas como uma fonte de medicamentos uma solução alternativa para
problemas de saúde bem estabelecido em algumas culturas e tradições mundiais, a
exemplo da Ásia, América Latina e África. Por causa do aumento no interesse por
produtos naturais, o uso de plantas medicinais tornou-se geral (DUARTE, 2006).
No contexto econômico, o conhecimento tradicional associado ao uso de
plantas medicinais brasileiras tem um papel chave no processo de geração de
inovações para a indústria, seja na localização de novas plantas, seja na sugestão
de sua atividade farmacológica, agindo como filtro para que ocorra a inovação. O
que tem ocorrido de fato é uma “corrida pelo conhecimento tradicional”,
principalmente pelos notáveis índices de crescimento do mercado de plantas
medicinais e seus derivados (REZENDE; RIBEIRO, 2005).
Segundo Serafin (2006), o mercado da Fitoterapia movimenta, mundialmente,
21 bilhões de dólares ao ano. Somente no Brasil, este mercado movimenta 400
milhões ao ano, sendo importantíssimo conquistar cada vez mais um pedaço maior
desse mercado bilionário. Para seguir esta tendência, da busca pelo natural e do
fenômeno mercadológico, que movimenta significativas cifras em dólares, o mundo
volta às atenções para biodiversidade brasileira, cuja reserva natural apresenta
muitas
possibilidades
de
descobertas
relevantes
para
terapêutica,
fitoterápicos, fitofármacos, e até mesmo fármacos (SERAFIN, 2006).
como
14
O potencial econômico das plantas medicinais pode ser grande, embora seja
uma questão complexa. Um novo medicamento pode ter um custo muito alto mas
pode dar um retorno muito maior. Assim, essa busca incessante pela planta pode
causar uma perturbação na biota da região. Esse desequilíbrio tem provocado um
amplo movimento de proteção ao uso da biodiversidade, incluindo debates e
tentativas de estabelecimento de legislação em nível, também, internacional
(GIULIETTI et al., 2003).
No Brasil, a fitoterapia se tornou uma alternativa econômica em relação aos
medicamentos industrializados, já que acontece pela utilização direta da planta no
tratamento das doenças e de nosso país possuir uma das mais ricas biodiversidades
do mundo, com cerca de metade das espécies vegetais do planeta (OLIVEIRA,
2005; REIS, 2006). Mesmo não contando com elevada diversidade como a Mata
Atlântica, outros biomas no Brasil, como a Caatinga, são de extrema importância em
termos biotecnológicos, especialmente quando consideramos o endemismo de
animais e plantas desta região (GIULIETTI et al., 2003). Os organismos endêmicos
desta região são potenciais fontes de moléculas bioativas, especialmente por serem
encontrado apenas nesta região e terem sido pouco estudadas até o momento. Isso
mostra a grande relevância de estudos sobre estes organismos da Caatinga que,
por sua vez, encontra-se em processo avançado de degradação devido à
antropização da região (CASTELLETTI, et al., 2003; ANDRADE et al., 2005).
O semi-árido brasileiro ocupa cerca de 900.000 Km2, aproximadamente 8%
do território nacional (GIULIETTI et al., 2006), onde se estima haver 8.000 espécies
vegetais, sendo 318 endêmicas da Caatinga (NOVAIS et al., 2003). A Caatinga,
bioma com características peculiares, localiza-se na região do semi-árido ocupando
uma área aproximada de 735.000 km² (GIULIETTI al., 2006), abrangendo nove
estados nordestinos (Piauí, Maranhão, Ceará, Rio Grande do Norte, Paraíba,
Pernambuco, Alagoas, Sergipe e Bahia), além da região norte do estado de Minas
Gerais (MG). Essa região abrange 60% da área do Nordeste, incluindo o norte de
MG (área da SUDENE), e 13% do Brasil, com 56% da população nordestina
contando com o norte de MG e 16% da população brasileira. Das terras recobertas
com a caatinga, 50% são de origem sedimentar, ricas em águas subterrâneas. A
altitude da região varia de 0-600 m. A temperatura varia de 24 a 28º C. A
precipitação média é de 250 a 1000 mm e o déficit hídrico elevado durante todo o
ano (RESERVA DA BIOSFERA DA CAATINGA, 2007). Algumas famílias de plantas
15
apresentam grande diversidade neste bioma, sendo a família Leguminosae a mais
diversa, com 293 espécies em 77 gêneros, das quais 144 são endêmicas da região
(QUEIROZ, 2006). Na literatura, a grande maioria das espécies de Molluginaceae
(Família Molluginaceae) que ocorre nas regiões tropicais semi-áridas tem sido pouco
estudada. Poucos trabalhos foram realizados, e mesmo assim, com finalidades de
identificação botânica, como são exemplos Lemos (2004) que registrou a presença
da espécie Mollugo verticilata L. no Parque Nacional Serra da Capivara, Piauí, e
Gomes; Rodal; Melo que, em 2005, registrou a presença desta mesma espécie na
Chapada de São José, Buíque, Pernambuco. Rocha; Queiroz; Pirani; (2004)
registraram a ocorrência das espécies Mollugo verticilata L. e Glischrothamnus ulei
Pilg. em ambiente de dunas no bioma da Caatinga, e acreditam na possibilidade de
endemismo da última devido a sua distribuição geográfica muito restrita.
A Caatinga ainda é uma área pouco explorada quanto ao seu potencial
biotecnológico e, por isso, se constitui em um ambiente de grande interesse na
prospecção de novas moléculas com atividade biológica, em especial as plantas
endêmicas desta região. Devido à escassez de trabalhos sobre a atividade
microbiana de espécies da família Molluginaceae, esta pesquisa é de suma
importância, pois ampliará o conhecimento das propriedades antimicrobianas da
espécie Glischrothamnus ulei Pilg. (Molluginaceae), endêmica do bioma caatinga, de
áreas de dunas interiores do rio São Francisco, região de Pilão Arcado, Bahia,
potencialmente exploráveis, que poderão contribuir na descoberta de novos
medicamentos fitoterápicos, auxiliando para a melhoria da qualidade de vida da
população em termos de saúde.
16
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a atividade antimicrobiana do óleo essencial, do extrato bruto e
frações de Glischrothamnus ulei Pilg., Molluginaceae, planta endêmica da região de
Dunas do Rio São Francisco, região de Pilão Arcado, BA.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Avaliar a atividade antimicrobiana do óleo essencial, extrato bruto e suas
frações da G. ulei através do teste de difusão em disco contra Escherichia coli
CCMB 284, Escherichia coli CCMB 261, sensível à trimetoprima e resistente à
sulfonamida, Staphylococcus aureus CCMB 262, resistente à estreptomicina e
dihidroestreptomicina, Staphylococcus aureus CCMB 263, Bacillus cereus CCMB
282, Salmonella sp. CCMB 281, Pseudomonas aeruginosa CCMB 268, Candida
albicans CCMB 286, Candida parapsilosis CCMB 288.
• Determinar a concentração mínima inibitória (CIM) do extrato bruto e suas
frações sobre os microrganismos testes;
• Verificar a atividade antimicrobiana dos extratos fracionados utilizando-se a
técnica da bioautografia;
• Triagem fitoquímica da espécie estudada.
17
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 FITOTERAPIA
Desde a mais remota antiguidade que se é conhecida a utilização de plantas
para cura de enfermidades, passando este saber popular a ser um objeto de
interesse. Os mais antigos registros sobre plantas medicinais datam de 2700 a.C. na
China e 1500 a.C. no Egito. Hipócrates (460-361 a.C.), uma das figuras mais
importantes na história da saúde, considerado “pai da medicina”, catalogou e
empregou centenas de remédios de origem vegetal. Durante a Idade Média, parte
destes antigos registros foi preservada e passada para o ocidente (CARVALHO,
2004).
No Brasil, país com uma das maiores diversidades vegetais do mundo, com
mais de 55.000 espécies descritas de cerca de 500.000 existentes (NODARI;
GUERRA, 2000), várias plantas foram utilizadas pelos indígenas como remédio para
suas doenças e como veneno em suas guerras e caças (CARVALHO, 2004). Desta
forma, a fitoterapia foi muito importante até meados do século XIX, com a Revolução
Industrial, quando foi perdendo lugar para os produtos de origem animal e sintéticos
(CARVALHO, 2004; REIS, 2006).
Atualmente, a utilização de medicamentos fitoterápicos tem aumentado dentro
da população brasileira. Alguns fatores contribuíram para isso, como os avanços
científicos que deram a oportunidade da criação de fitoterápicos seguros e
eficientes, como também a busca por medicamentos menos agressivos à saúde.
Esta forma de terapia gera cerca de 22 bilhões de dólares, onde se acredita que o
Brasil, com sua magnitude floral, seja amplamente beneficiado. Porém, o país não
tem muito destaque no mercado mundial de fitoterápicos, mesmo esta produção
tendo menores custos do que a produção de fármacos, devido a falta de uma
política para desenvolvimento da indústria, principalmente, fitofarmacêutica; a
ausência de integração entre as diversas áreas do conhecimento necessárias para
obter um resultado efetivo; e a falta de compromisso da indústria nacional de
fitoterápicos que visa o lucro rápido e não a competição pela descoberta de novos
fitofármacos (YUNES; PEDROSA; CECHINEL FILHO, 2001; SIMÕES; SCHENKEL,
2002).
18
O Governo Federal aprovou a Política Nacional de Plantas Medicinais e
Fitoterápicos, por meio do Decreto Presidencial Nº. 5.813, de 22 de junho de 2006, a
qual se constitui em parte essencial das políticas públicas de saúde, meio ambiente,
desenvolvimento econômico e social como um dos elementos fundamentais de
transversalidade na implementação de ações capazes de promover melhorias na
qualidade de vida da população brasileira. As ações decorrentes desta política,
manifestadas no Programa Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos - PNPMF,
são imprescindíveis para a melhoria do acesso da população aos medicamentos, à
inclusão social e regional, ao desenvolvimento industrial e tecnológico, à promoção
da segurança alimentar e nutricional, além do uso sustentável da biodiversidade
brasileira e da valorização e preservação do conhecimento tradicional associado das
comunidades tradicionais e indígenas. Uma das propostas do PNPMF é inserir
plantas medicinais, fitoterápicos e serviços relacionados à fitoterapia no SUS, com
segurança, eficácia e qualidade, em conformidade com as diretrizes da Política
Nacional de Práticas Integrativas e Complementares no SUS (BRASIL, 2007).
3.2
ANTIBIÓTICOS:
MECANISMO
DE
AÇÃO,
RESISTÊNCIA
DE
MICRORGANISMOS E A NECESSIDADE DO DESENVOLVIMENTO DE NOVOS
FÁRMACOS
A quimioterapia antimicrobiana começou em 1935, com a descoberta das
sulfonamidas. Em 1940, foi demonstrado que a penicilina poderia ter uma
terapêutica eficaz. Durante os 25 anos seguintes, as pesquisas concentraram-se nas
substâncias de origem microbiana (JAWETZ; MELNICK; ADALBERG, 1998).
O agente antimicrobiano ideal exibe a chamada toxicidade seletiva. Isto
significa que o fármaco é prejudicial ao parasita e não ao hospedeiro. Em doses
tolerantes ao hospedeiro, o fármaco tem a capacidade de lesar o parasita (JAWETZ;
MELNICK; ADALBERG, 1998; BLACK, 2002). Os antibióticos podem agir sobre as
bactérias susceptíveis afetando seu crescimento e reprodução, causando um efeito
bacteriostático, e/ou induzindo sua morte, causando um efeito bactericida
(FERREIRA, 2007). O mecanismo de ação da maioria dos antimicrobianos não está
totalmente elucidado, todavia, podem ser divididos em 5 categorias: (I) inibição da
síntese da parede celular; (II) inibição da função da membrana celular; (III) inibição
da síntese de proteínas; (IV) inibição da síntese de ácidos nucléicos (JAWETZ,
19
MELNICK, ADALBERG, 1998; TORTORA, FUNK, CASE, 2000; BLACK, 2002;
TRABULSI, TOLEDO, 2004); e (V) ação como antimetabólito (BLACK, 2002).
Resistência a um antibiótico significa que um microrganismo antes sensível à
ação de um antibiótico não é mais afetado por ele. Um fato relevante na resistência
dos microrganismos aos antibióticos é que muitas drogas são bacteriostáticas
(BLACK, 2002). O uso inadequado de drogas também vem agravando o problema
de resistência dos microrganismos, além de outros fatores, como o aparecimento de
cepas bacterianas multirresistentes (FERREIRA, 2007) A resistência bacteriana
tornou-se um grande problema frente às doenças infecciosas, pois já houve casos
de patógenos resistentes à maioria dos medicamentos disponíveis no mercado,
aumentando assim os custos com os serviços de saúde (ORLANDO, 2005).
Internacionalmente, observou-se o rápido agravamento do problema da
resistência aos antibióticos. Assumiu-se que os antibióticos, devido a grande
evolução dos microrganismos, necessitavam passar por uma reavaliação do seu
valor intrínseco, pois já não mais ofereciam a certeza da cura e, pior, favoreciam a
seleção de certas mutações, adaptações e migrações que terminaram provocando a
emergência de novos agentes patógenos, assim como a aquisição de virulência por
microrganismos não patogênicos. São exemplos dessa evolução microbiana:
Staphylococcus aureus resistente a vancomicina, no Japão, em 1996 e nos Estados
Unidos, em 1997; o reconhecimento de cepas de Micobacterium tuberculosis
multirresistentes às drogas, nos Estados Unidos, em 1997; cepa virulenta de
influenza aviária, em Hong Kong (1997-98) (MARQUES, 2002; ALANIS, 2005).
Contudo, não será somente a criação de novos medicamentos que será resolvido o
problema da resistência a antibióticos. Além disso, é necessário um uso mais
consciente dos medicamentos por parte dos profissionais de saúde, melhores
práticas de controle de infecções e melhores ferramentas para diagnósticos claros e
rápidos dos pacientes, especialmente os mais carentes (ALANIS, 2005).
Uma bactéria é considerada resistente quando consegue crescer em
concentrações mais altas do que a maior concentração da droga no sítio da infecção
(TORTORA et al., 2005; FERREIRA, 2007). Múltiplos são os mecanismos de
resistência adquirida, incluindo perda da permeabilidade da membrana, exclusão
ativa do antimicrobiano, alteração do sítio de ligação, alteração do receptor da
membrana, superprodução de enzimas-alvo, síntese de enzimas que inativam o
fármaco e rotas metabólicas alternativas (MOREIRA, 2004). Com o crescente
20
problema da resistência microbiana, não há perspectiva para o uso de antibióticos.
Algumas medidas devem ser tomadas para resolver esse problema, como controlar
o uso indiscriminado dos antibióticos, ampliar os estudos sobre o mecanismo
genético de resistência e continuar as pesquisas para desenvolver novas drogas.
Assim, as pesquisas que visam o estudo e avaliação dos produtos de produtos
naturais como terapêuticos e/ou com atividade antimicrobiana devem ser ampliadas
no intuito de criar novas drogas e melhorar as já existentes, para que estas voltem a
ter alguma atividade (COUTINHO et al., 2003/2004).
Nas discussões sobre pesquisa e desenvolvimento, sempre é destacada a
importância tanto dos novos fármacos, quanto dos fármacos já conhecidos de
elevado interesse social e de expressão estratégica para o país. São incluídos os
fitoterápicos, fitofármacos, produtos biotecnológicos; medicamentos genéricos;
medicamentos similares que apresentem vantagens tecnológicas (MARQUES, 2002;
ELISABETSKY, 2003; CALIXTO, 2003). Quando citadas as demandas de
medicamentos essenciais, são enfatizados: antibióticos e medicamentos destinados
à prevenção e ao tratamento do câncer, diabetes, Aids, tuberculose, malária e outras
doenças transmissíveis, como as tripanossomíases e as leishmanioses, doenças
que atingem ou ameaçam milhões de pessoas na África e América Latina
(MARQUES, 2002; OLIVEIRA; LABRA; BERMUDEZ, 2006). O Ministério da Saúde
também já demonstrou que dentro de suas atuais prioridades está a orientação para
produção desses novos medicamentos (MARQUES, 2002; BRASIL, 2007). A
Organização Mundial de Saúde (OMS) também reconhece a importância no
desenvolvimento de novos fármacos e acredita que o conhecimento tradicional sobre
produtos da biodiversidade é extremamente necessário para o combate de doenças
que destroem populações dos países em desenvolvimento (FUNARI; FERRO,
2005).
3.3 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE EXTRATOS DE PLANTAS
As plantas que contêm compostos aromáticos são usadas tradicionalmente
na medicina popular e também para aumentar a vida útil dos alimentos, mostrando
inibição de bactérias, fungos filamentosos e leveduras, na indústria farmacêutica, na
medicina alternativa e na de terapias naturais (HAMMER; CARSON; RILEY, 1999;
SARTORATTO et al., 2004). O uso de extratos vegetais e fitoquímicos com
21
finalidade medicinal é uma das mais antigas formas de aplicação medicinal da
humanidade (ARAÚJO; LEON, 2001). A OMS estima que mais de 65% da
população dos países desenvolvidos utilizem plantas medicinais para cuidados
básicos com a saúde. Graças à atividade metabólica secundária dos vegetais
superiores, estes produzem substâncias antibióticas como mecanismo de defesa
contra predação por microrganismos, insetos e herbívoros (GONÇALVES; ALVES
FILHO; MENEZES, 2005).
Os óleos essenciais e os extratos de diversas espécies da planta podem
controlar o crescimento dos microrganismos relacionados à pele, à cárie dental,
incluindo as bactérias Gram-negativas e Gram-positivas (SARTORATTO et al.,
2004). Em 2000, Rauha et al. demonstraram a atividade antimicrobiana de extratos
de 29 espécies, comercializadas ou coletas em diferentes locais da Finlândia, ricos
em flavonóides, frente a nove microrganismos, sendo esses efetivos contra Grampositivos, como Staphylococcus aureus e S. epidermidis, Bacillus subtilis; e Gramnegativos como Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa; e também fungos
filamentosos, como Aspergillus niger, e leveduras como Candida albicans e
Saccharomyces cerevisiae.
A espécie Lantana achyranthifolia está listada como a mais importante, dentre
44 espécies, no tratamento de infecções gastrintestinais no México (HERNÁNDEZ et
al., 2005).
O Brasil está dentro de uma série de países que têm uma diversidade
florística e uma importante tradição no uso de plantas medicinais para aplicações
antibacterianas e antifúngicas. Muitos países mantiveram programas de pesquisa
para selecionar medicinas tradicionais para a atividade antimicrobiana, como é o
exemplo da Índia, da Palestina, da África, de Honduras, da Jordânia, de Cuba e da
Itália (DUARTE et al., 2005).
As plantas dos biomas brasileiros têm sido utilizadas também como
medicamentos naturais por populações locais no tratamento de diversas doenças
tropicais, incluindo a esquitossomose, a leishmaniose, a malária e infecções fúngicas
e bacterianas. Entretanto, apesar da rica flora, somente os dados de algumas
plantas estão disponíveis, incluindo espécies nativas e exóticas (SARTORATTO et
al., 2004).
Em termos de pesquisa no Brasil, plantas da Coleção do Centro de Pesquisas
Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA/UNICAMP) têm sido amplamente
22
estudadas, quanto à sua ação contra diversas bactérias, dentre elas Pseudomonas
aeruginosa ATCC 13388, Salmonella cholerasuis CCT 4296, Staphylococcus aureus
CCT 2740, Escherichia coli CCT 0547, Bacillus subtilis CCT 2576 e a levedura
Candida albicans ATCC 10231. Estes estudos demonstraram que extratos, frações e
compostos isolados de Mikania laevigata Sch. Bip ex Baker, M. glomerata Sprengel,
Artemisia annua L., Phyllanthus niruri L., Phyllanthus amarus Schumach. & Thonn e
Achyrocline satureioides (Lam.) puderam controlar um ou mais dos microrganismos
testados (SARTORATTO et al., 2004).
As plantas aromáticas têm grande importância para as indústrias de
alimentos, cosméticos e fármacos. Folhas de Origanum vulgare L., O. applii L., O.
basilicum L., O. gratissimum L., Mentha spicata L. e M. piperita L. var. citrata têm
sido utilizadas como chás, embora o óleo essencial seja utilizado em cosméticos e
farmácias. Os índices dos óleos essenciais em espécies diferentes são influenciados
pelo material, pelas condições da cultura e pelo ambiente genético, e finalmente, a
colheita e o processamento da colheita (SARTORATTO et al., 2004).
O conhecimento sobre o potencial terapêutico desses vegetais vem
despertando o interesse científico, onde estão sendo buscados novos caminhos
para controle e tratamento de variadas doenças (COUTINHO et al., 2003/2004).
Até o momento não foram encontrados trabalhos na literatura que
relacionassem atividade antimicrobiana com óleos essenciais e extratos de vegetais
da família Molluginaceae.
3.4 MÉTODOS ANTIMICROBIANOS
Um amplo número de bioensaios é utilizado para avaliar a atividade
antimicrobiana de extratos de plantas, bem como também de compostos isolados.
Esses bioensaios que são utilizados nos laboratórios de microbiologia têm por
finalidade encontrar o melhor agente antimicrobiano. Dentre os testes disponíveis
para atividade microbiana encontram-se as técnicas de difusão, diluição e os
métodos automatizados (COLE, 1994).
23
3.4.1 Teste de Difusão em Disco
Na década de 40, os resultados de testes com discos de papel foram
inicialmente interpretados pelo método determinado halo versus não-halo. O
desenvolvimento de um halo de inibição era considerado evidência de sensibilidade
do microrganismo ao antimicrobiano. As bactérias resistentes eram classificadas
como tal quando cresciam exatamente até a borda do disco (KONEMAN et al.,
2001).
O princípio básico do método de difusão em disco para as provas de
sensibilidade antimicrobiana é estabelecer a dose responsável pela curva de
crescimento dada por um determinado inóculo contra um dado antimicrobiano, seja
ele um antibiótico, extrato vegetal ou composto isolado de um extrato (COLE, 1994;
KONEMAN et al., 2001).
Nesta técnica, utilizam-se discos de papel impregnados com quantidades
definidas do antimicrobiano. Estes discos são colocados em contato com a
superfície úmida do ágar, já semeado com uma suspensão microbiana. A amostra é
absorvida pelo papel de filtro e o seu conteúdo se difunde no meio circundante. Após
a incubação, na placa semeada com a suspensão bacteriana, ocorre o
desenvolvimento das células no ágar e, simultaneamente, a difusão do
antimicrobiano. Na área onde o antimicrobiano é suficiente para impedir o
crescimento do microrganismo, pode ser observado o halo de inibição (COLE, 1994;
KONEMAN et al., 2001).
Cole (1994) afirma que as zonas de inibição do teste de difusão em disco
podem ser influenciadas por diversos fatores, dentre eles, a densidade do inóculo, o
volume e concentração do antimicrobiano, e a duração do ensaio, pois há
possibilidade do microrganismo desenvolver o processo de desintoxicação e/ou a
alta difusão dos compostos, resultando em baixa concentração.
Quando os mecanismos de difusão e de produção de halos de inibição
tornaram-se bem conhecidos, tornou-se evidente que os fatores que influem na
velocidade de difusão in vitro não se correlacionam necessariamente com a
atividade antimicrobiana in vivo. E a impossibilidade de se obter resultados
quantitativos nas provas iniciais de sensibilidade com discos foi considerada uma
desvantagem clara (KONEMAN et al., 2001). O diâmetro da zona de inibição é
24
influenciado pelo poder de difusão do agente antimicrobiano através do ágar, que
está relacionado está relacionado com a solubilidade da substância teste
(ESTRELA, 2000; PETRONE; BALDASSI; BIDOIA, 2004). O crescimento dos
microrganismos sensíveis somente ocorrerá até a região que contiver a
concentração de extrato suficiente à sua inibição (PETRONE; BALDASSI; BIDOIA,
2004).
3.4.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
Os métodos de diluição in vitro detectam possíveis atividades antimicrobianas
de compostos, utilizando métodos celulares sem alvo específico (SARTORI, 2005).
O ensaio para a determinação da concentração inibitória mínima (CIM), ou Minimum
Inibitory Concentration (MIC), é obtido através da macro ou microdiluição de
compostos que consiste em se preparar diluições sucessivas do antimicrobiano a ser
testado, em meios de cultura sólidos ou líquidos, semear o microrganismo e após a
incubação verificar a menor concentração (maior diluição) do antimicrobiano que
inibiu o crescimento do microrganismo. Para a determinação dos resultados pode-se
usar a verificação visual por turbidez, mensurar a viabilidade e proliferação das
células através de corantes indicadores de oxi-redução como Alamar blue e Cloreto
de 2,3,5-trifeniltetrazólio ou utilizar aparelhos, como o espectrofotômetro (PFALLER;
BARRY, 1994; NCCLS, 2003; BAKER; TENOVER, 1996; DUARTE et al., 2005).
Determina-se a CIM como sendo a concentração mais baixa de um agente
antimicrobiano que impede o crescimento visível de um microrganismo no teste de
sensibilidade por diluição em ágar ou caldo (NCCLS, 2002; 2003). As vantagens
desse método é proporcionar mais informações quantitativas e poder ser aplicado a
uma variedade mais ampla de isolados do que as provas por difusão (KONEMAN et
al., 2001).
3.4.3 Bioutografia
A bioautografia é um método útil para a localização de substâncias com ação
antimicrobiana, sendo em um extrato ou em frações complexas, como os derivados
dos produtos naturais (CAMPOS, 2006). Nesta técnica, um meio de cultura sólido,
fundido e inoculado, é aplicado sobre a placa cromatográfica na qual foi eluído o
25
extrato ou fração. Durante o período de incubação da placa, os compostos
ultrapassarão o meio por difusão, formando zonas de inibição do crescimento
microbiano (CAMPOS, 2006). A comparação desenvolvida pelo cromatograma sob
circunstâncias idênticas e visualizada com o uso de reagentes apropriados pode
fornecer informações úteis sobre a natureza de compostos ativos, permitindo um
isolamento biodirecionado (CAMPOS, 2006; VALGAS et al., 2007). Uma vantagem
deste método é a possibilidade de usar para fases móveis solventes de baixa
volatilidade (VALGAS et al., 2007).
3.5 GLISCHROTHAMNUS ULEI E A FAMÍLIA MOLLUGINACEAE
Glischrothamnus ulei é um arbusto com cerca de 30 cm, com folhas
cartáceas, flores amareladas com forte odor de mel e bem viscosas, segundo
identificação realizada no Herbário da Universidade Estadual de Feira de Santana
(HUEFS), e pertence à Família Molluginaceae. Esta família é composta por 14
gêneros, com cerca de 125 espécies distribuídas na América do Norte, Índias
Ocidentais, América Central, América do Sul, Ásia, Europa, África e Austrália
(VICENT, 2004). Em geral, seus representantes se desenvolvem em lugares abertos
e secos, como também em lugares fechados. Várias espécies de Glinus e Mollugo
são consumidas como verdura e também são usadas como medicamento
tradicional. Os gêneros de Molluginaceae já foram considerados como integrantes
da Família Aizoaceae; porém, recentes estudos separam alguns gêneros para a
Família Molluginaceae por apresentarem hábito não suculento, flores com sépalas
livres ou ligeiramente conados na base, filamentos das anteras conados na base,
formando um tubo pequeno (em Aizoaceae as tépalas são conpiscuamente fundidas
na base, formando um tubo evidente, o qual por sua vez é adnado aos filamentos) e
pela produção de antocianinas (em vez de betalaínas), característica também
apresente em Caryophyllaceae (ACOSTA, 2002).
26
4 MATERIAL E MÉTODOS
A Figura 1 mostra um fluxograma de toda a parte experimental seguida neste
trabalho.
Coleta da G. ulei
Óleo essencial
Extrato metanólico bruto
Fração
hexano
Fração
acetato de etila
Fração
diclorometano
Testes biológicos
Difusão em disco
CIM
Fração
butanol
Triagem fitoquímica
Bioautografia
Figura 1 – Esquema simplificado da fase metodológica da pesquisa.
27
4.1 COLETA DO MATERIAL VEGETAL
Caule e folhas de G. ulei (Figura 2) foram coletados no mês de fevereiro de
2007, em Dunas do São Francisco, na região de Pilão Arcado, Bahia (Figura 3). O
material foi acondicionado em sacos de nylon, em formato de rede. Logo após a
coleta, o material foi seco à temperatura ambiente por 7 dias e encaminhado para o
Laboratório de Química de Produtos Naturais e Bioativos (LAPRON) na
Universidade Estadual de Feira de Santana – UEFS, Feira de Santana, BA.
Figura 2 - Fotos de G. ulei no campo, em Pilão Arcado, e das exsicatas do Hebário da UEFS
(HUEFS), número de acesso 53039.
28
Figura 3 - Mapa da Bahia indicando a cidade da coleta.
Fonte:http://www.transportes.gov.br/bit/estados/port/ba.htm
29
4.2 OBTENÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL, EXTRATO BRUTO E SUAS FRAÇÕES
4.2.1 Óleo Essencial
Após a secagem do material, procedeu-se a redução do volume da amostra
através de sua moagem. Este material foi submetido à hidrodestilação em aparelho
do tipo Clevenger por 3 horas. O óleo volátil obtido foi seco com sulfato de sódio
anidro e armazenado a baixa temperatura e ausência de oxigênio.
4.2.2 Extrato Bruto Metanólico
O material seco das folhas e caule, foi moído para redução do tamanho e
macerado separadamente em metanol por 7 dias à temperatura ambiente. O extrato
foi filtrado com papel de filtro e em seguida concentrado usando evaporador rotatório
sob pressão reduzida (COWAN, 1999). Após a concentração ele foi mantido em
frascos de vidro cobertos com filme de PVC, à temperatura ambiente.
4.2.3 Obtenção das Frações do Extrato Bruto Metanólico
O extrato metanólico (18,10g da folha e 18,53g do caule) foi dissolvido em
200 mL de metanol absoluto e 60mL de água. Posteriormente, o extrato foi
submetido a um processo de partição líquido-líquido, com solventes de polaridade
crescente, no caso, hexano, diclometano, acetato de etila e butanol. Em seguida, as
frações foram concentradas utilizando o evaporador rotatório (CHECHINEL FILHO;
YUNES, 1998). Até o momento de sua utilização, os extratos foram acondicionados
em frascos de vidro cobertos com filme de PVC.
4.3 TRIAGEM DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO EXTRATO BRUTO E SUAS
FRAÇÕES.
4.3.1. Microrganismos
Os microrganismos utilizados no presente estudo foram Escherichia coli
CCMB 284, E. coli CCMB 261, sensível à trimetoprima e resistente à sulfonamida,
30
Staphylococcus
aureus
CCMB
262,
resistente
à
estreptomicina
e
dihidroestreptomicina, S. aureus CCMB 263, Bacillus cereus CCMB 282, Salmonella
sp. CCMB 281, Pseudomonas aeruginosa CCMB 268, Candida albicans CCMB 286,
C. parapsilosis CCMB 288. Todas foram cultivadas em Ágar Müeller-Hinton (AMH) a
37 °C por 24 horas (bactérias) e a 28 ºC por 48 horas (leveduras) para obtenção de
biomassa para os testes antimicrobianos. Os microrganismos utilizados no presente
trabalho foram obtidos da Coleção de Culturas de Microrganismos da Bahia
(CCMB/UEFS).
4.3.2 Teste da difusão em disco
A triagem inicial das amostras com atividade antimicrobiana foi realizada pela
metodologia em difusão em ágar, utilizando-se discos de papel de filtro, de 6 mm de
diâmetro, conforme a metodologia do CLSI (2003b), com algumas modificações.
Uma suspensão do microrganismo-teste (0,1 mL de 1,5 x 108 UFC.mL-1 para
bactérias e 0,1 mL de 5 x 105 UFC.mL-1 para leveduras) foi espalhada, com auxílio
da alça de Drigalsk, sobre a superfície de um meio AMH, previamente distribuído em
placas de Petri (90 x 15 mm). A padronização da suspensão bacteriana foi realizada
utilizando-se solução salina 0,45% estéril. Discos estéreis de papel de filtro foram
impregnados com 5 µL do extrato bruto, e suas frações, separadamente, e, após
secos à temperatura ambiente, foram colocados sobre as placas inoculadas com os
microrganismos-teste. Amostras de padrão dos controles nistatina (antifúngico), na
concentração de 10 µg/disco e do cloranfenicol (antibacteriano), na concentração de
30 µg/disco, foram utilizadas para comparação de resultados. As placas foram
incubadas a 28 ºC por 48 h para leveduras e a 37 ºC por 24 h para bactérias. Os
diâmetros dos halos de inibição foram medidos em milímetros, com o auxílio de uma
régua milimetrada e o valor considerado foi a média aritmética das triplicatas.
Também foi feito o controle do solvente, onde no lugar do extrato foi colocado 5 µL
do solvente nas placas inoculadas com os microrganismos-teste.
31
4.3.3. Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
Foi utilizado o ensaio de susceptibilidade por microdiluição em caldo para a
determinação da CIM para bactérias (CLSI, 2003a) e leveduras (CLSI, 2002) com
algumas modificações contra todos os microrganismos-teste. Os testes foram
realizados em caldo Müeller-Hinton (CMH). O extrato e suas frações foram
resuspensos em Dimetilsulfóxido (DMSO) e esterilizados por filtração utilizando
membrana de acetato de celulose (0,22 mm). A utilização do DMSO foi realizada
devido ao tempo de evaporação ser maior em relação ao metanol. Foram
preparadas diluições geométricas por poço onde foram colocados 95 µL dos extratos
e suas frações em placas de microtitulação de 96 poços, sendo que o primeiro
continha uma concentração de 21,05 mg.mL-1 e o último, mais diluído, de 0,01
mg.mL-1. Depois de realizadas as diluições em todos os poços, foram adicionados 5
µL a partir da suspensão de bactérias na concentração aproximada de 9,5 X 106
UFC.mL-1 e 5 X 105 UFC.mL-1 para a suspensão de leveduras, totalizando um
volume de 100 µL em cada poço (95 µL do CMH + extrato e 5 µL microrganismo).
As placas foram incubadas a 28 ºC por 48 horas (leveduras) e a 37 ºC por 24 horas
(bactérias). Posteriormente, foram adicionados 50 µL da solução do cloreto de 2,3,5trifeniltetrazólio na concentração final de 1,25 mg.poço-1, para análise do
crescimento microbiano nos poços de ensaio e determinação da atividade
antimicrobiana relativa de cada diluição das amostras. Cada teste foi realizado em
triplicata. Diluições do antifúngico nistatina e do antibiótico cloranfenicol, na
concentração estoque de 20 mg.mL-1 e 10 mg.mL-1 respectivamente, foram
utilizadas como controle positivo para fins de comparação de dados entre
experimentos independentes e como indicadores para avaliação relativa do nível de
inibição das amostras testadas. Foram realizados também controles de viabilidade
dos microrganismos testados e da esterililidade do meio de cultura. Neste trabalho
foi considerado como resultados representativos de CIM valores iguais ou inferiores
a 2,63 mg.mL-1 do extrato testado.
A Figura 4 mostra uma ilustração de como foi feito o experimento da
concentração inibitória mínima.
32
CMH + extrato
Extrato 1
Extrato 2
Controles:
CMH
Microrganismo
Extratos 1 e 2
DMSO
Figura 4 – Figura ilustrativa da montagem da placa de 96 poços para o experimento de determinação
da concentração inibitória mínima dos extratos de G. ulei contra microrganismos patogênicos ao
homem. CMH: Caldo Müeller-Hinton.
4.4. BIOAUTOGRAFIA
As amostras de extrato bruto, fração em acetato de etila e a fração butanólica
foram ressuspendidas em metanol; e as frações em hexano e em diclorometano em
diclorometano, todas na concentração de 100 mg.mL-1. Cerca de 1,0 µL de cada
amostra foram aplicados em uma placa de sílica ALUGRAM® SIL G/UV254 e
ALUGRAM® SIL for TLC, em alumínio (Macherey-Nagel), 2,5x10 cm, para que fosse
realizada a cromatografia em camada delgada (CCD), sempre na ordem: folha, na
esquerda, e caule, na direita. As placas foram eluídas em sistemas de solventes
escolhidos de acordo com a fração e previamente testados. No caso das frações em
hexano e em diclorometano o eluente utilizado foi o sistema de solventes hexano:
acetato de etila (80:20 v/v); o extrato bruto foi colocado no sistema acetato de
etila:metanol:água (10:1,3:1 v/v); e as frações em acetato de etila e butanólica no
sistema acetato de etila:metanol:água:ácido acético glacial (10:1,3:1:0,5 v/v). A
corrida foi realizada partindo de 1 cm do início da placa até 1 cm do seu final. As
33
placas ALUGRAM® SIL G/UV254 foram utilizadas para posterior revelação e as sem
indicador de UV para realização da bioautografia. Este experimento foi feito em
triplicata. Após o término da corrida, as cromatoplacas foram colocadas para secar,
e, em seguida, acondicionadas em placas de Petri (150x20 mm) onde foram vertidos
30 mL do AMH, contendo 1,5 mL das suspensões bacterianas, previamente
padronizadas como citado anteriormente, e 3,0 mL do revelador cloreto de 2,3,5trifeniltetrazólio na concentração de 5 mg.mL-1. Essas placas de Petri contendo as
cromatoplacas, o meio de cultura com os microrganismos e corante foram incubadas
a 37° C por 24 horas, no caso de bactérias. As substâncias separadas que
apresentavam atividade antimicrobiana foram reconhecidas por apresentarem halo
de inibição ao redor de suas bandas. O experimento foi realizado em triplicata.
Juntamente com a preparação das placas cromatográficas para bioautografia,
foram feitas placas para que fossem reveladas com reagentes que pudessem
mostrar as classes de metabólitos secundários presentes nas frações. Os reagentes
utilizados foram: (i) Reagente Anisaldeído-Ácido Sulfúrico (AS) – para a revelação de
terpenos, (ii) Reagente Dragendorff com Ácido Clorídrico (DRG) – para a verificação
da presença de alcalóides, (iii) Reagente Liebermann-Burchard (LB) – para
observação da presença de triterpenos e esteróides, (iv) Reagente Hidróxido de
Potássio (KOH) – para revelação de antraquinonas e cumarinas e (v) Reagente
Produtos Naturais - Polietilenoglicol (NP/PEG) – para a observação de flavonóides,
preparados segundo metodologia indicada em Wagner e Bladt (1995) A revelação
foi realizada sob luz UV no espectro de 254 e 365 nm.
34
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os rendimentos dos extratos brutos e frações da folha e caule da G. ulei
estão descritos na Tabela 1. Os extratos metanólicos brutos da folha e do caule de
G. ulei foram testados contra nove microrganismos entre Gram-positivos, Gramnegativos e leveduras. Foi observada atividade destes extratos utilizando-se a
metodologia de difusão em disco contra B. cereus CCMB 282 (Figura 5A), S. aureus
CCMB 262 (Figura 5B) e S. aureus CCMB 263. Para B. cereus, as frações do extrato
metanólico apresentaram resultados diferenciados, onde foi observada maior
atividade nas frações do extrato da folha (Tabela 2).
Tabela 1 – Massa obtida, em gramas, e rendimento, em %, dos extratos brutos e frações da folha e
do caule da G. ulei
Extrato ou fração
Massa obtida(g)
Rendimento (%)
13,83
9,02
Fração hexano folha
0,9
4,97
Fração diclorometano folha
0,79
4,36
Fração acetato de etila folha
1,03
5,69
Fração butanol folha
3,53
19,50
Extrato bruto caule
17,53
11,94
Fração hexano caule
0,86
4,64
Fração diclorometano caule
0,72
3,88
Fração acetato de etila caule
1,11
5,99
Fração butanol caule
3,13
16,89
Extrato bruto folha
Quando realizada a metodologia para obtenção de óleo essencial, foi
observada a inviabilidade desta fase metodológica. De 400 g da folha da espécie em
estudo e após as 3 horas do procedimento foram obtidos menos de 20 µL de óleo
volátil. Portanto, diante deste baixo rendimento, o objetivo de se avaliar a atividade
antimicrobiana do óleo essencial de G. ulei tornou-se inviável neste trabalho.
35
O teste de difusão em ágar não oferece condições de igualdade para
comparação de substâncias com solubilidade e poder de difusão diferentes. Ser
solúvel em água e o peso molecular das substâncias são fatores que influenciam
nesta difusão (REIS, 2006). Estrela (2000) analisou substâncias com diferentes
capacidades de difusão e dissociação empregando as técnicas de meio líquido e
difusão em ágar, e observou que a primeira seria mais eficaz justamente pela
dificuldade que algumas substâncias têm de difundir em ágar. Assim, no presente
trabalho, pôde-se entender o resultado positivo das frações acetato de etila e
diclorometano pela técnica da difusão em disco do caule contra P. aeruginosa, já
que não se obteve nenhum tipo de atividade contra este microrganismo frente ao
extrato metanólico bruto.
O método de difusão em disco é especialmente bom para determinar o
potencial relativo dos extratos ou de óleos essenciais e para estabelecer seu
espectro antimicrobiano, pois facilita o uso de diferentes linhagens frente ao extrato
(RÍOS; RECIO, 2005).
Segundo Rios e Recio (2005), o método líquido da diluição é a melhor
maneira de se estabelecer a real potência de um composto puro. Por este motivo, no
presente trabalho, foram iniciados os fracionamentos dos extratos brutos
metanólicos das folhas e caules de G. ulei e testados o seu potencial antimicrobiano
através de três metodologias: difusão em disco (Tabela 2), determinação da
concentração inibitória mínima (Tabelas 3 e 4) e bioautografia (Figura 8).
A
B
Figura 5 - Atividades do extrato bruto de G. ulei contra B. cereus CCMB 282 (A), S. aureus CCMB
262 (B).
36
Utilizando-se a mesma metodologia, foi observado que as frações hexano,
diclorometano e acetato de etila, da folha, apresentaram atividade contra S. aureus
CCMB 262 e B. cereus CCMB 282, sendo que a fração diclorometano, além destes,
também apresentou atividade contra S. aureus CCMB 263. A fração hexano do
caule apresentou atividade somente contra S. aureus CCMB 262, enquanto as
frações diclorometano e acetato de etila apresentaram contra S. aureus CCMB 262,
B. cereus CCMB 282 e P. aeruginosa CCMB 268, nas condições aplicadas. A fração
butanol não apresentou atividade contra nenhum dos microrganismos testados
(Tabela
2).
0
6,0±0
4,0±0
0
6,0±0
0
0
0
E. coli
CCMB 284
S. aureus
CCMB 262
S. aureus
CCMB 263
Salmonella sp.
CCMB 281
B. cereus
CCMB 282
P. aeruginosa
CCMB 268
C. albicans
CCMB 286
C. parapsilosis
CCMB 288
0
0
0
1,0±0
0
0
1,0±0
0
0
Hexano
Folha
0
0
0
5,0±1
0
4,0±0
4,3±0,08
0
0
Diclorometano
0
0
0
5,0±1
0
0
6,6±1,3
0
0
Acetato
de etila
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Butanol
R= Resistente (não houve desenvolvimento na zona de inibição na concentração testada),
N/A = não se aplica
± = Desvio padrão
0
Ext.
bruto
E. coli
CCMB 261
Microrganismo
0
0
0
0
0
3,3±0,2
7,3±1,3
0
0
Ext.
bruto
0
0
0
0
0
0
1,3±0,3
0
0
Hexano
0
0
1,0±0
1,0±0
0
0
1,0±0
0
0
Diclorometano
Caule
0
0
1,3±1,3
1,6±0,3
0
0
1,0±0
0
0
Acetato
de etila
Diâmetro do halo de inibição (mm) das frações metanólicas
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Butanol
N/A
N/A
2,5±0,9
7±0
7±0
10,6±0,9
11,5±0,9
N/A
N/A
N/A
N/A
N/A
16,6±2,
2
R
N/A
N/A
Nistatina
R
9,8 ±
1,7
Cloranfe
nicol
Controles
Tabela 2 - Média dos diâmetros dos halos de inibição do crescimento microbiano pelo teste de difusão em disco, em mm, dos extratos metanólicos e
de suas frações da folha e do caule de G. ulei (Molluginaceae) contra os microrganismos testes
37
38
Solventes com diferentes polaridades são utilizados visando uma semipurificação de suas substâncias. O intuito é de localizar princípios ativos que
apresentem efeitos biológicos de interesse, onde posteriormente devem ser
submetidos para isolamento e purificação desses compostos (CHECHINEL
FILHO; YUNES, 1998). Tadeg et al. (2005), ao investigar a atividade
antimicrobiana de frações em éter de petróleo, clorofórmio, acetona e metanol
de Lippia adoensis e Olinia rochetiana observou que esta atividade diminuiu
com o aumento da polaridade dos solventes, indicando que os compostos
ativos antibacterianos e antifúngicos dos extratos estão em concentrações mais
elevadas nas frações apolares. No presente trabalho os resultados coincidiram
com os resultados encontrados por Tadeg et al. (2005), pois não foi observada
nenhum tipo de atividade com a fração em butanol, fração mais polar, e os
melhores resultados foram obtidos com o extrato bruto e frações em hexano e
diclorometano da folha e caule, mais apolares.
Sartori, em 2005, obteve resultados com a espécie Acmela brasiliensis
SPRENG (Asteraceae), tanto com extrato bruto como com as frações hexano,
diclorometano, acetato de etila e butanol, que apresentaram atividade contra B.
cereus, S. aureus, Staphylococcus saprophyticus e Streptococcus agalactiae.
Degáspari; Waszczynskyj; Prado (2005), também apresentaram resultados de
sensibilidade antimicrobiana de extratos aquoso e alcoólico dos frutos da
espécie Schinus terebenthifolius Raddi, frente S. aureus e B. cereus. Kummar
et al. (2006), apresentam resultados de 61 espécies vegetais de diferentes
famílias, sendo que,os extratos brutos, extraídos em diclorometano e metanol
(1:1 v/v), de 28 espécies demonstraram atividade contra pelo menos um dos 14
microrganismos testados, dentre eles B. cereus, P. aeruginosa, S. aureus, E.
coli, C. albicans e Micrococcus luteus.
Existem alguns casos relatados onde o extrato bruto da espécie
vegetal tenha apresentado comportamento inativo diante dos microrganismos,
embora quando suas substâncias são analisadas isoladamente apresentam
boa atividade, como é o caso da Cynara scolymus (alcachofra) (SIXEL;
PECINALLI, 2005). Segundo Sixel; Pecinalli (2005) isso acontece porque os
extratos totais contêm saponinas, polifenóis e outros que são considerados
39
sem efeitos e podem influenciar na absorção do verdadeiro princípio ativo.
Pode haver dificuldade em lidar com a abordagem reducionista no estudo
sobre as propriedades curativas das plantas medicinais, como o fato de que
algumas plantas com atividade terapêutica reconhecidamente, não apresentam
a mesma atividade em nenhuma das frações de seus extratos. Isto se deve à
complexa rede de sinergismos e antagonismos entre as diversas substâncias
que compõe a planta e que lhe conferem um determinado poder curativo
(VASCONCELLOS et al., 2002).
No geral, neste trabalho, o resultado de inibição do crescimento
microbiano obtido pela metodologia de CIM corroborou os resultados da
difusão em disco para os microrganismos S. aureus CCMB 262, S. aureus
CCMB 263 e B. cereus CCMB 282, pois foram eles os que tiveram formação do
halo de inibição ao redor do disco e também as menores CIMs (menores ou
iguais a 1,32 mg.mL-1) para os extratos vegetais testados (Tabelas 2, 3 e 4). A
bactéria Gram-negativa P. aeruginosa apresentou-se sensível às frações de
diclorometano e acetato de etila do caule pela metodologia da difusão em
disco. Os microrganismos que sofreram maior inibição foram as bactérias
Gram-positivas S. aureus CCMB 262, S. aureus CCMB 263 e B. cereus CCMB
282 (Tabelas 3 e 4). Segundo Loguercio et al. (2005), as diferenças de
atividade contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas parecem derivar
da constituição da parede celular bacteriana e dos constituintes do extrato
vegetal. Autores como Khan; Kihara; Omoloso (2001) e Srinavasan et al.
(2001), afirmam existir uma relação entre o teor de taninos e a atividade contra
bactérias Gram-positivas, que têm estrutura celular mais rígida, parede celular
quimicamente menos complexa e menor teor lipídico do que as Gramnegativas.
Diferente dos resultados do teste de difusão em disco, os resultados da
concentração inibitória mínima, demonstraram que todas as amostras
apresentaram atividade contra todos os microrganismos (Tabelas 3 e 4) nas
condições testadas. A técnica em meio líquido permite uma maior difusão dos
compostos devido ao aumento da solubilidade (REIS, 2006). Na Figura 6 são
mostradas algumas fotos das CIM realizadas.
40
Foi realizado o controle do solvente (DMSO) que apresentou inibição
do crescimento microbiano na diluição correspondente a 5,26 mg.mL-1 do
extrato. Por este motivo, foram considerados como resultados representativos
de CIM valores iguais ou inferiores a 2,63 mg.mL-1 do extrato testado.
Os resultados mais representativos foram os do extrato metanólico, tanto
da folha como do caule, contra B. cereus CCMB 282, que inibiu o crescimento
deste microrganismo na concentração de 0,08 mg.mL-1; a fração hexano, de
ambas as partes da planta, inibiu o crescimento do S. aureus CCMB 262 na
concentração de 0,33 mg.mL-1; a fração diclorometano, de ambas as partes,
inibiu a crescimento do S. aureus CCMB 263 na concentração 0,66 mg.mL-1; a
fração acetato de etila, de ambas as partes da planta, inibiu o crescimento do
S. aureus CCMB 262 na concentração de 1,32 mg.mL-1. Em geral, os
resultados das CIMs apresentaram-se semelhantes para folha e caule, com
exceção para o extrato metanólico bruto e a fração diclorometano contra S.
aureus CCMB 262, onde as amostras da folha apresentaram melhor resultado.
Para a fração hexano contra E. coli CCMB 261 e P. aeruginosa CCMB 268, a
amostra da folha apresentou melhor resultado para a primeira bactéria e a
amostra do caule para a segunda, enquanto que a fração acetato de etila
contra S. aureus CCMB 263 e C. parapsilosis CCMB 288 foram os
microrganismos sobre o qual as amostras da folha apresentaram melhor
resultado. Segundo Raven; Evert e Curtis (2001), os compostos secundários
não estão uniformemente distribuídos pela planta, sendo freqüentemente
sintetizados em uma parte da planta e armazenados em outra.
Com relação aos resultados do extrato bruto e frações da folha
referentes a um microrganismo pela determinação da CIM, foi possível verificar
que o resultado de maior relevância foi contra S. aureus CCMB 262, onde o
extrato bruto e as frações em hexano, diclorometano e acetato de etila
conseguiram inibi-lo em concentrações significativas (1,32 mg.mL-1; 0,33
mg.mL-1; 1,32 mg.mL-1 e 1,32 mg.mL-1, respectivamente). Também foi
observado um bom resultado contra o microrganismo S. aureus CCMB 263,
pelo extrato bruto (1,32 mg.mL-1), a fração em hexano (0,66 mg.mL-1) e a
fração em diclorometano (0,66 mg.mL-1). Para o B. cereus CCMB 282, o
melhor resultado obtido foi com o extrato bruto, na concentração de 0,08
41
mg.mL-1, porém também foram bem ativas as frações em hexano (0,66 mg.mL1
) e diclorometano (0,66 mg.mL-1). Fora os resultados acima demonstrados, o
extrato bruto apresentou resultados semelhantes contra E. coli CCMB 261, E.
coli CCMB 284 e Salmonella sp. CCMB 281; assim como foram semelhantes
também contra P. aeruginosa CCMB 268 e as leveduras. A fração hexano
apresentou resultados semelhantes contra as duas cepas de E. coli e as
leveduras, diferindo apenas contra Salmonella sp. CCMB 281 e P. aeruginosa
CCMB 268. A fração diclorometano apresentou resultados semelhantes para
as duas cepas de E. coli e contra Salmonella sp. CCMB 281, diferindo apenas
contra P. aeruginosa CCMB 268. A fração acetato de etila apresentou
resultados semelhantes contra as duas cepas de E. coli, S. aureus CCMB 263,
B. cereus CCMB 282 e P. aeruginosa CCMB 268, diferindo contra Salmonella
sp. CCMB 281. A fração butanol apresentou uma atividade moderada, tendo
um resultado melhor frente às bactérias B. cereus CCMB 282 e P. aeruginosa
CCMB 268 (2,63 mg.mL-1 para ambas). Quanto às leveduras não houve
diferenciação entre os resultados do extrato bruto da folha e suas frações, com
exceção da fração butanol contra C. parapsilosis CCMB 288, que foi maior
(5,26 mg.mL-1).
Com relação aos resultados do extrato bruto e frações do caule,
podemos verificar que são bem semelhantes aos resultados com os do extrato
e frações da folha, com algumas exceções nos resultados da fração hexano
contra os microrganismos E. coli CCMB 261, onde foi maior (5,26 mg.mL-1), e
P. aeruginosa CCMB 268, que foi menor (2,63 mg.mL-1); do extrato bruto e da
fração diclorometano contra S. aureus CCMB 262, ambos maiores (2,63
mg.mL-1), e da fração acetato de etila contra S. aureus CCMB 263 e C.
parapsilosis CCMB 288, ambos maiores (5,26 mg.mL-1).
42
A
B
C
D
E
F
G
H
Figura 6: Fotografia das placas de microdiluição contendo os resultados da concentração
inibitória mínima do extrato metanólico bruto de G. ulei contra B. cereus CCMB 282 (A), C.
albicans CCMB 288 (B) e Salmonella sp. CCMB 281 (C); da fração em acetato de etila contra
C. albicans CCMB 286 (D) e Salmonella sp. CCMB 281 (F); da fração em butanol contra
Salmonella sp. CCMB 281 (E); da fração em diclorometano contra B. cereus CCMB 282 (G), S.
aureus CCMB 263 (H).
43
I
J
L
M
N
O
Figura 6 (continuação): Fotografia das placas de microdiluição contendo os resultados da
concentração inibitória mínima da fração em diclorometano contra C. albicans CCMB 288 (I); da
fração em hexano contra S. aureus CCMB 262 (J), S. aureus CCMB 263 (L) e B. cereus CCMB
282 (M); da fração em butanol contra C. albicans CCMB 286 (N), B. cereus CCMB 282 (O).
44
-1
Tabela 3 - Resultados da Concentração Inibitória Mínima (CIM), em mg.mL , do extrato bruto
metanólico da folha de G. ulei (Molluginaceae) e suas frações
CIM do extrato e frações da folha (mg.mL-1)
Microrganismos
E. coli
CCMB 261
E. coli
CCMB 284
S. aureus
CCMB 262
S. aureus
CCMB 263
Salmonella sp.
CCMB 281
B. cereus
CCMB 282
P. aeruginosa
CCMB 268
C. albicans
CCMB 286
C. parapsilosis
CCMB 288
Extrato
Bruto
Hexano
Diclorometano
Acetato
de etila
Butanol
Cloranfenicol
Nistatina
5,26
2,63
5,26
2,63
5,26
10
N/A
5,26
2,63
5,26
2,63
5,26
10
N/A
1,32
0,33
1,32
1,32
5,26
0,078
N/A
1,32
0,66
0,66
2,63
5,26
0,313
N/A
5,26
5,26
5,26
5,26
5,26
0,313
N/A
0,08
0,66
0,66
2,63
2,63
0,313
N/A
2,63
10,53
2,63
2,63
2,63
5
N/A
2,63
2,63
2,63
2,63
2,63
N/A
1,25
2,63
2,63
2,63
2,63
5,26
N/A
2,5
N/A – não se aplica
-1
Tabela 4 - Resultados da Concentração Inibitória Mínima (CIM), em mg.mL , com o extrato
bruto metanólico do caule de G. ulei (Molluginaceae) e suas frações
CIM do extrato e frações do caule (mg.mL-1)
Microrganismos
E. coli
CCMB 261
E. coli
CCMB 284
S. aureus
CCMB 262
S. aureus
CCMB 263
Salmonella sp.
CCMB 281
B. cereus
CCMB 282
P. aeruginosa
CCMB 268
C. albicans
CCMB 286
C. parapsilosis
CCMB 288
N/A – não se aplica
Extrato
bruto
Hexano
Diclorometano
Acetato
de etila
Butanol
Cloranfenicol
Nistatina
5,26
5,26
5,26
2,63
5,26
10
N/A
5,26
2,63
5,26
2,63
5,26
10
N/A
2,63
0,33
2,63
1,32
5,26
0,078
N/A
1,32
0,66
0,66
5,26
10,53
0,313
N/A
5,26
5,26
5,26
5,26
5,26
0,313
N/A
0,08
0,66
0,66
2,63
2,63
0,313
N/A
2,63
2,63
2,63
2,63
2,63
5
N/A
2,63
2,63
2,63
2,63
2,63
N/A
1,25
2,63
2,63
2,63
5,26
5,26
N/A
2,5
45
No presente trabalho, como o controle do DMSO na CIM apresentou
atividade antimicrobiana, é possível que a inibição do crescimento microbiano
possa ter sofrido interferência deste solvente. Não podemos descartar a
possibilidade do DMSO ter causado efeito potencializador da atividade
antimicrobiana do(s) composto(s) do extrato (RIBEIRO; CARVALHO FILHO;
LISTONI, 2001; HERSCHLER 1970). Na literatura encontram-se trabalhos que
descrevem a ação permeante do DMSO em membranas biológicas (JACOB,
1982 apud RIBEIRO; CARVALHO FILHO; LISTONI, 2001), bem como sua
utilização como potencializador de drogas antibacterianas, antifúngicas,
antivirais e antiparasitárias (POOTZ et al., 1967; BRAYTON, 1986 apud
RIBEIRO; CARVALHO FILHO; LISTONI, 2001). Por isso, no presente estudo,
foram considerados como resultados representativos de CIM valores iguais ou
inferiores a 2,63 mg.mL-1 do extrato testado, ou seja,concentrações menores
ou iguais ao observadas para o DMSO, equivalente a 5,26 mg.mL-1 na
determinação da CIM.
Também foram realizados testes de bioautografia dos extratos brutos e
frações das folhas e caules, e os constituintes nas placas cromatográficas
foram visualizados sob UV e com reveladores químicos, sendo os resultados
analisados segundo Wagner e Bladt (1995). As placas cromatográficas
reveladas para a verificação da presença de alcalóides com o reagente
Dragendorff com Ácido Clorídrico (DRG) e para verificação de antraquinonas e
cumarinas com hidróxido de potássio (KOH) apresentaram-se negativas para
todos os extratos testados. As placas reveladas com o reagente AnisaldeídoÁcido Sulfúrico (AS) indicaram a presença de terpenos e esteróides em todas
as frações, pela presença de manchas violeta, rosa e amarelas, conforme
exemplificado na figura 7A para a fração em hexano. A visualização das placas
com o reagente de Liebermann-Burchard (LB) entretanto indica a presença de
triterpenos em todas as frações, com manchas entre rosa e vermelha, e de
esteróides apenas nas frações do caule e folha em hexano e butanol, com
manchas verdes a azuis. Para a observação de flavonóides foi utilizado o
revelador de Produtos Naturais-Polietilenoglicol (NP/PEG) com resultados
positivos para as frações em diclorometano, acetato de etila e butanol, com
manchas amarelas ou amarelas esverdeadas fluorescentes sob a luz com
46
comprimento de onda de 365 nm. A presença de ácidos fenólicos é sugerida
nas frações em hexano e acetato de etila do caule e folhas pela presença de
manchas com coloração azul fluorescente (Figura 7B e C).
A
B
1
2
C
Figura 7: Fotografia das placas cromatográficas com as frações em hexano (A e B), acetato de
etila (C) da folha (1) e do caule (2), visualizadas com revelador AS (A), seguido por
aquecimento a 100°C e com revelador NP/PEG sob luz UV no espectro de 365 nm (B) e (C).
47
A
B
C
D
Figura 8 - Bioautografia referente às frações diclorometano (A, B, C) e hexano (D) frente aos
microrganismos B. cereus (A), S. aureus CCMB 262 (B e D) e S. aureus CCMB 263 (C).
Nos ensaios bioautográficos realizados com o extrato bruto e as frações
da G. ulei (Figura 8) observou-se inibição de três das bactérias avaliadas, B.
cereus, S. aureus CCMB 262 e S. aureus CCMB 263, com formação das
manchas (halos) de inibição, apenas para as frações em hexano e
diclorometano.
As
frações
que não foram
ativas
pela
bioautografia,
apresentaram maiores valores de CIM. Isso pode acontecer devido à diferença
de sensibilidade entre os métodos microbiológicos, como foi mostrado no
trabalho de Valgas et al. (2007). A presença de atividade nas frações e não no
extrato bruto pode ser explicada devido a quantidade dos compostos ativos que
estão mais concentrados nas frações.
Os compostos fenólicos de fontes vegetais podem se divididos em dois
grupos: os flavonóides e os não flavonóides, sendo que ambos são metabólitos
secundários presentes em frutas e vegetais. Muitos destes compostos
apresentam uma grande gama de efeitos biológicos, incluindo ações
48
antioxidantes, antimicrobiana, antiinflamatória e vasodilatadora, apresentando
também diversas funções de defesa para as plantas, não somente contra
agentes do meio ambiente (luz, temperatura e umidade), mas para fatores
internos incluindo diferenças genéticas, nutrientes, hormônios, contribuindo
para a sua síntese (DEGÁSPARI; WASZCZYNSKYJ; PRADO, 2005; SOUZA e
SILVA, 2008).
Os terpenos e esteróis são elaborados a partir dos mesmos precursores,
constituindo um amplo conjunto de metabólitos secundários. Grande parte dos
terpenos ocorre nas plantas, porém não são exclusivos deste grupo. Não existe
diferença fundamental entre os triterpenos e os esteróis, considerando-se estes
últimos como triterpenos tetracíclicos que perderam, no mínimo, três metilas. A
importância biológica dos esteróides é reconhecida, e apenas algumas células
como bactérias podem desenvolver-se em sua ausência. Seu interesse
terapêutico se dá pela importância dos glicosídeos cardiotônicos que fazem
parte
desse
grupo;
espirostânicas,
que
interesse
servem
por
de
sitosterol,
estigmasterol,
matéria-prima
para
saponinas
anticonceptivos,
anabolizantes, antiinflamatórios, entre outras (FRACARO, 2004).
Com os resultados obtidos no presente trabalho, verificou-se que a
espécie
vegetal
estudada,
G.
ulei,
possui
potencial
antimicrobiano
considerável, uma vez que seu potencial inibitório foi bastante representativo
para alguns dos microrganismos testados principalmente S. aureus e B.
cereus. Estes resultados contribuirão para um maior conhecimento científico
sobre a planta e poderão também servir de base informativa para a elaboração
de um novo medicamento fitoterápico. Para isso, são necessários maiores
estudos no intuito de isolar e purificar, o(s) princípio(s) ativo(s) responsável (is)
por essa atividade, bem a verificação de sua toxicidade.
Os resultados do presente trabalho demonstraram a importância dos
extratos das plantas na busca de novos agentes antimicrobianos. Vale ressaltar
que os resultados se reportam à atividade de um extrato composto por uma
mistura de várias substâncias. Diferenças na composição dos extratos brutos
podem ser vistas como um aspecto determinante da ação antimicrobiana.
Outro ponto importante é que foram utilizadas metodologias diferentes, sendo
possível fazer uma comparação entre os métodos, sendo assim verificado qual
49
deles melhor demonstra a atividade antimicrobiana do extrato estudado
(ORLANDO, 2005).
Este é o primeiro trabalho na literatura sobre a atividade antimicrobiana
in vitro e do estudo fitoquímico de G. ulei, espécie vegetal endêmica da região
de Dunas do Rio São Francisco, região de Pilão Arcado, BA.
50
6 CONCLUSÕES
Através dos resultados obtidos foi possível chegar às seguintes
conclusões:
O extrato metanólico bruto e suas frações apresentaram atividade
antimicrobiana contra as duas linhagens de S. aureus (CCMB 262 e
CCMB 263), B. cereus CCMB 282 e P. aeruginosa CCMB 268
testadas neste trabalho pelo método de difusão em disco;
O extrato e suas frações apresentaram atividade contra todos os
microrganismos utilizando-se o método da Concentração Inibitória
Mínima, demonstrando maior sensibilidade desta técnica; sendo que
os resultados obtidos pela CIM (organismos mais sensíveis)
corroboraram com os achados da metodologia da difusão em disco;
Pela técnica do CIM o extrato bruto e suas frações demonstraram
atividade, com concentrações variando de 0,08 a 10,53 mg.mL-1,
sendo mais eficientes contra B. cereus CCMB 282 e contra as duas
linhagens de S. aureus estudadas.
O estudo bioautográfico sugere a presença de terpenos e flavonóides
com atividade antimicrobiana.
Os
resultados
obtidos
neste
trabalho
apontam
o
potencial
antimicrobiano de G. ulei, planta endêmica da região de Dunas de
São Francisco (Pilão Arcado, BA), porém outros trabalhos deverão
ser realizados para a complementação destes estudos e aplicações,
com isolamento dos possíveis agentes antimicrobianos.
51
7 REFERÊNCIAS
ACOSTA, G. O. Flora del bajío y de regiones adyacentes. Instituto de
Ecología, A.C. Centro Regional del Bajío Pátzcuaro, Michoacán. Fascículo 101,
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