Henrique Passarelli Camilo Análise da expressão das proteínas
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Henrique Passarelli Camilo Análise da expressão das proteínas celulares p53, p16 e ciclina D1 em amostras de tumores penianos São José do Rio Preto 2014 Henrique Passarelli Camilo Análise da expressão das proteínas celulares p53, p16 e ciclina D1 em amostras de tumores penianos Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Microbiologia, junto ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Área de Concentração - Virologia, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Orientador: Prof.ª Dr.ª Paula Rahal Co-orientador: Dr. Mânlio Tasso de Oliveira Mota São José do Rio Preto 2014 Henrique Passarelli Camilo Análise da expressão das proteínas celulares p53, p16 e ciclina D1 em amostras de tumores penianos Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Microbiologia, junto ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Área de Concentração - Virologia, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Comissão Examinadora Dr. Mânlio Tasso de Oliveira Mota UNESP – São José do Rio Preto Co-orientador Dr.ª Carolina Colombelli Pacca FAMERP – São José do Rio Preto Dr.ª Silvana Gisele Pegorin de Campos UNESP – São José do Rio Preto São José do Rio Preto 15 de abril de 2014 “O conhecimento torna a alma jovem e diminui a amargura da velhice. Colhe, pois, a sabedoria. Armazena suavidade para o amanhã”. Leonardo da Vinci Dedico este trabalho aos maiores responsáveis por esta conquista, a eles que mais uma vez confiaram em minha capacidade e me proporcionaram esta vitória, meus pais. Ao meu irmão, e meus queridos avós, que merecem ser lembrados a cada etapa vitoriosa de minha vida. Aos velhos amigos que sempre me apoiaram e aos amigos que conquistei durante esta fase. Obrigado. AGRADECIMENTOS A minha orientadora, Profª Drª Paula Rahal, pela oportunidade que me foi dada, pela confiança, pela amizade, pela compreensão, por ter acreditado na minha capacidade e por todo ensinamento transmitido ao longo desses anos. Ao meu co-orietador, Dr. Mânlio Tasso de Oliveira Mota, por toda atenção a mim dedicada, aos ensinamentos passados, a ajuda nos momentos de dificuldades, as boas conversas que fizeram amadurecer não só meu conhecimento científico, mas também pessoal, tornando-se mais do que um colaborador, um amigo. A Ana Cláudia Silva Braga, quem me apoiou a iniciar esta etapa em minha vida e me apresentou a minha orientadora. Aos amigos do Laboratório de Estudos Genômicos, pela atenção que sempre foi dedicada quando precisei. Cada um de vocês contribuiu de alguma forma durante minha formação. Ao Dr. Carlos Fabián Mendiburu, pela contribuição na realização das análises himunohistoquíicas. A Profa Dra Sonia M. Oliani e seus alunos pela atenção e disponibilização do Laboratório de Morfologia para realização das análises densitométricas. Ao Prof. Domingos Zanchetta Netto e ao Prof. Dr. Geovanni Dantas Cassali pelo auxílio com a histotecnologia e patologia clínica. A Drª. Alessandra Vidotto e Profª. Drª. Fátima Pereira de Souza por terem feito parte da minha banca do Exame Geral de Qualificação e pelas sugestões que me permitiram melhorar meu trabalho. A Drª. Carolina Colombelli Pacca e a Drª. Silvana Gisele Pegorin de Campospor terem aceito fazer parte da minha Banca de Defesa. A FAPESP, pela concessão de auxílio para o laboratório, indispensáveis para a realização deste projeto. A Capes, pela concessão da bolsa de estudos que me acompanhou durante a execução do mestrado. Ao IBILCE pela infra-estrutura e profissionais que possibilitaram a realização do projeto. Muito obrigado!!! SUMÁRIO RESUMO ........................................................................................................................................ 8 Palavras-chave............................................................................................................................... 8 Keywords: ...................................................................................................................................... 9 ABREVIATURAS ............................................................................................................................ 10 1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 11 1.1 Carcinoma de pênis ........................................................................................................... 11 1.2 O vírus do papiloma humano (HPV) e o carcinoma epidermóide (CE) de pênis......... 15 2 OBJETIVOS ........................................................................................................................... 24 3 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................................... 25 3.1 Casuística e considerações éticas...................................................................................... 25 3.2 Detecção e genotipagem de HPV ...................................................................................... 25 3.2.1 Extração de DNA............................................................................................................. 25 3.2.2 PCR para GSTP1 ................................................................................................... 26 3.2.3 Detecção de DNA de HPV por PCR (GP5+/GP6+) ................................................ 26 3.2.4 Detecção de DNA e genotipagem de HPV por INNO-LiPA .................................. 27 3.3 Análises Imunohistoquímicas ............................................................................................ 29 4 RESULTADOS ....................................................................................................................... 32 4.1 PCR para HPV .................................................................................................................... 32 4.2 INNO-LiPA® ........................................................................................................................ 32 4.3 IMUNOHISTOQUÍMICA...................................................................................................... 33 5 DISCUSSÃO .......................................................................................................................... 37 6 CONCLUSÕES ....................................................................................................................... 42 7 REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 43 RESUMO O carcinoma epidermóide de pênis (CEP) é um tumor epitelial invasivo relativamente raro com alta morbidade, decorrente da própria doença ou de seu tratamento. Pacientes sem tratamento geralmente vão a óbito dentro de dois anos após o diagnóstico, devido o descontrole loco-regional ou a metástases distantes. Nos últimos anos, tem sido constatado que a infecção pelo vírus do papiloma humano (HPV), de alto risco, é um dos principais fatores de risco para o desenvolvimento do CEP. Sabe-se que duas proteínas virais, E6 e E7, estão associadas ao desenvolvimento tumoral em outros tipos de carcinomas causados por HPV. Porém, no CEP, os mecanismos moleculares envolvidos na replicação viral e suas interações com a célula hospedeira ainda não estão bem esclarecidos. A proteína viral E6 está associada à degradação de p53 enquanto a proteína E7 está associada à desestabilização da via de fosforilação da proteína Rb, na qual a ciclina D1 e a proteína p16 estão estreitamente relacionadas. O objetivo deste projeto foi correlacionar a presença de HPV de alto risco com os níveis de expressão das proteínas celulares p53, p16 e ciclina D1 em amostras de CEP. Foi realizado estudo comparativo com 61 amostras de pacientes infectados por HPV de alto risco e pacientes sem infecção. Observou-se que em tecidos com HPV de alto risco há diminuição da expressão de p53 e ciclina D1 e aumento de expressão de p16 em relação às amostras negativas (p<0,05). Não existem muitos estudos sobre este tumor. O presente trabalho pode contribuir para uma maior compreensão deste tumor e permitindo melhores tratamentos e prognósticos do paciente, além de contribuir para a definição de novas metodologias para a distinção entre lesões associadas ou não ao HPV de alto risco. Palavras-chave: HPV. Carcinoma de pênis. p16. P53. Ciclina D1. ABSTRACT Squamous cell carcinoma of the penis (SCCP) is a relatively rare invasive epithelial tumor with high morbidity due to the disease itself or its treatment. Untreated patients usually die within two years after diagnosis, due to the uncontrolled locoregional recurrence or distant metastases. In the last years, it has been observed that infection by the high risk human papilloma virus (HPV) is one of the main risk factors for SCCP development. It is known that the E6 and E7 viral proteins are associated with tumor development in other HPV associated carcinomas. However, about SCCP, the molecular mechanisms involved in viral replication and its interactions with the host cell are not well understood. The E6 viral protein is linked to the p53 cellular degradation whereas the E7 is linked with destabilization via phosphorylation of Rb protein, in which cyclin D1 and p16 are closely related. The goal of this project was to correlate the high-risk HPV presence with the expression levels of cellular proteins p53, p16 and cyclin D1 in SCCP samples. Comparative study was conducted with 61 samples from patients infected or not with high-risk HPV. It was observed that in high-risk HPV tissues there is down expression of p53 and cyclin D1 and overexpression of p16 when compared to negative samples (p <0.05). There are not many studies on this tumor. This study may contribute to a greater understanding of this tumor, allowing better treatments and prognoses for patients, and contribute to the development of new methodologies for the distinction between lesions associated or not with high-risk HPV. Keywords: HPV. Penile cancer. p16. p53. Cyclin D1. ABREVIATURAS CEP - Carcinoma epidermóide de pênis. ACS - American Cancer Society, Sociedade Americana do Câncer AJCC - American Joint Committee on Cancer, Comitê da Junta Americana do Câncer HPV - Human Papillmavirus, vírus do papiloma humano HR HPV - Low-risk HPV, HPV de baixo risco LR HPV - High risk HPV, HPV de alto risco HPV NEG - HPV negativo DNA - Deoxyribonucleic acid, ácido desoxirribonucleico ICTV - The International Comittee on Taxonomy of Viruses, Comitê Internacional de Taxonomía de Vírus Pb - Pares de base ORF - Open reading frame, fase de leitura aberta LCR - Long control region, região longa de controle URR - Upstream regulatory region, região reguladora EGFR - Epidermal growth factor receptor, receptor do fator de crescimento epidermal Rb - Família retinoblastoma de proteínas E6AP - E6 associated protein, proteína associada a E6 CDK - Cyclin-Dependent Kinases, quinases dependentes de ciclinas PCR - Polymerase chain reaction, reação em cadeia da polimerase FFPE - Formaldehyde Fixed-Paraffin Embedded, tecidos fixados em formaldeído e incluídos em parafina GSTP1 - Glutationa S-transferase 1 EDTA - Ethylenediamine tetraacetic acid, ácido etilenodiamino tetra-acético BSA - Bovine serum albumin, albumina de soro bovino PBS - Phosphate buffered saline, tampão fosfato-salino PB - Papulose Bowenóide 1 INTRODUÇÃO 1.1 Carcinoma de pênis O carcinoma de pênis, embora relativamente raro em países desenvolvidos, está associado a grandes taxas de morbidade e mortalidade em países em desenvolvimento (PARKIN, 2006; BARNHOLTZ-SLOAN, 2007). A incidência do câncer de pênis varia em diferentes populações. Na Europa Ocidental e nos Estados Unidos, o câncer de pênis representa 0,4% a 0,6% de todas as malignidades, enquanto que nos países da Ásia, África e América do Sul, o carcinoma de pênis pode representar até 10% de todas as malignidades nos homens (BLEEKER et al., 2009). No Brasil, a taxa de incidência de câncer de pênis varia entre 2,9 a 6,8 por 100.000 homens e representa 2,1% de todos os casos de câncer em homens e, embora possa ocorrer em outras idades, a média de idade para este tipo de câncer é de 60 anos (SOLSONA et al., 2004; DALING et al., 2005; FAVORITO et al., 2008). Os diferentes tecidos penianos são formados por tipos celulares variados. Sendo assim, o tipo celular envolvido no carcinoma de pênis pode variar, acarretando em diferentes tipos de carcinoma de pênis. A Sociedade Americana de Câncer (American Cancer Society – ACS) descreve sete diferentes tipos de carcinomas de pênis: carcinoma verrucoso, carcinoma in situ, melanoma, adenocarcinoma, sarcoma, carcinoma de células basais. Sendo o mais comum, com incidência de 95%, o carcinoma epidermóide (CE) se desenvolve a partir de células planas da pele, chamadas de células escamosas (AMERICAN CANCER SOCIETY, 2012). Os sítios anatômicos preferenciais para o surgimento do CE de pênis são a glande (34,5%), seguida pelo prepúcio (13,2%), corpo peniano (5,3%), com sobreposições (4,5%) e outros locais não específicos (42,5%). Estes tumores tendem a crescer lentamente, e, quando se encontram em um estágio inicial, possuem elevada taxa de cura (DEEM et al., 2011; AMERICAN CÂNCER SOCIETY, 2012). As lesões iniciais podem ser ulcerativas ou exofíticas. As lesões ulcerativas estão relacionadas a um pior prognóstico e com a disseminação precoce para nódulos linfáticos, mantendo uma baixa taxa de sobrevida de até 5 anos (HUNGERHUBER et al., 2006). Já as metástases locorregionais linfáticas para os gânglios inguinais superficiais e 12 profundos são os primeiros avanços de propagação do câncer. A disseminação para linfonodos pélvicos está envolvida nos estágios mais avançados da doença, sendo que menos de 3% dos pacientes apresentam metástases à distância (ANTUNES; DALL'OGLIO; SROUGI, 2007). Quando não tratadas, as lesões penianas podem apresentar elevadas taxas de mortalidade, entre 3 a 5 anos (HARDNER et al., 1972). Muitas vezes a inexperiência dos médicos em identificar clinicamente lesões precursoras ou lesões precoces do CE de pênis e a demora dos pacientes em procurar atendimento médico, seja por medo, vergonha ou mesmo desconhecimento, fazem com que o diagnóstico seja tardio na maioria dos casos, resultando no estádio mais avançado da doença (WANICK et al., 2011). O procedimento cirúrgico mais comum para o tratamento do CE de pênis é a penectomia parcial, sendo o principal objetivo deste procedimento manter as habilidades sexuais adequadas do paciente. A penectomia total é realizada em casos mais avançados do tumor, sendo necessária a abertura de um novo canal utilizado para a micção (uretrostomia). Estas técnicas mutilantes de tratamento causam graves repercussões psicológicas e funcionais desfavoráveis, o que dificulta a reabilitação e a reintegração social (GREENBERG, 2010). No entanto, outras terapias alternativas, não multilantes, têm sido utilizadas para o tratamento desta malignidade peniana, tais como crioterapia (SONNEX et al., 1982) terapia a laser (VAN BEZOOIJEN et al., 2001), quimioterapia local (TRABULSI; HOFFMAN-CENSITS, 2010), e a técnica de Mohs (SHINDEL et al., 2007). A determinação do tratamento para o CE de pênis depende do estágio clínico e localização das lesões. O prognóstico mais importante de sobrevivência, específico para esta patologia, baseia-se na presença e na extensão de metástases em linfonodos na região inguinal (PIZZOCARO et al., 2010). Devido à escassez de casos de CE de pênis tratados em centros específicos, permanece uma heterogeneidade significativa no gerenciamento dos tratamentos. Sendo assim, grandes esforços têm resultado em novas diretrizes para seu diagnóstico e tratamento (SPIESS et al., 2013). Em 2010, o AJCC (American Joint Committee on Cancer) atualizou o sistema TNM (Classificação de tumores malignos) de estadiamento do CE de pênis como descritos nos quadros 1 e 2 (SPIESS et al., 2013). O sistema TNM trabalha prioritariamente com a classificação por extensão anatômica da doença, determinada clínica e histopatologicamente. Ele oferece informações relacionadas ao tamanho do tumor (T), dependente da profundidade de invasão e não do tamanho, em centímetros, à quantidade e 13 tamanho dos nódulos regionais acometidos (N) e, finalmente, à presença de metástase à distância (M) (CLARK et al., 2013). Quadro 1: Estadiamento TNM de câncer de pênis baseado no AJCC TX T0 Ta Tis T1a T1b T2 T3 T4 Tumor primário (T) Tumor primário não pode ser acessado Sem evidência de tumor primário Carcinoma verrucoso não-invasivoa Carcinoma in situ Tumor invade tecido conectivo subepitelial sem invasão linfovascular e não é pouco diferenciado Tumor invade tecido conectivo subepitelial com invasão linfovascular ou é pouco diferenciado Tumor invade corpo esponjoso ou cavernoso Tumor invade a uretra Tumor invade outras estruturas adjacentes Linfonodos regionais (N) cNX cN0 cN1 cN2 cN3 pNX pN0 pN1 pN2 pN3 M0 M1 Definição no estágio clínicob Linfonodos regionais não podem ser acessados Sem linfonodos inguinais aumentados palpáveis ou visíveis Linfonodo inguinal unilateral móvel palpável Linfonodos inguinais palpáveis múltiplos ou bilaterais Massa nodal inguinal fixa palpável ou linfoadenopatia pélvica unilateral ou bilateral Definição no Estágio patológicoc Linfonodos regionais não podem ser acessados Sem metástases em linfonodos regionais Metástase em um único linfonodo Metástase em linfonodos múltiplos ou bilaterais Extensão extranodal de metastases de linfonodos ou linfonodos pélvicos unilateral ou bilateral Metástases distantes (M) Sem metástases distantes Metástases distantesd a. Penetração broad pushing (invasão) é permitido; invasão destruidora é contra este diagnóstico; b. Baseado em palpação e imagem; c. Definição de estágio patológico baseada em biópsia ou excisão cirúrgica; d. Metástases em linfonodos fora da pelve além de regiões viscerais ou ossos. 14 Quadro 2: Estágios anatômicos/grupos de prognóstico Tis Ta Estágio I T1a T1b Estágio II T2 T3 a Estágio III T1-3 Estágio IIIb T1-3 Estágio 0 N0 N0 N0 N0 N0 N0 N1 N2 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 T4 Qualquer N M0 Estágio IV Qualquer T N3 M0 Qualquer T Qualquer N M1 Devido à baixa incidência de CE de pênis em países desenvolvidos existem poucos estudos realizados. Desta forma, não existem estudos prospectivos, randomizados e com amostragem suficiente que permitam estabelecer a conduta mais adequada nos diversos estádios da enfermidade (DE PAULA et al., 2005). A etiologia do CE de pênis e os fatores moleculares que influenciam no seu desenvolvimento ainda não são totalmente conhecidos. Entretanto, acredita-se que os CE de pênis surjam a partir de duas vias etiologicamente distintas. Uma é dependente da infecção persistente pelo HR HPV (high risk HPV, HPV alto risco) que, provavelmente, está relacionada a contatos sexuais. A segunda envolve uma via não viral e está relacionada a outros fatores de risco como higiene pessoal, fumo e fimose (RUBIN et al., 2001; CALMON et al., 2011; CHAUX; CUBILLA, 2012) O número de parceiros sexuais, a prática de sexo anal, e a preexistência de doenças sexualmente transmissíveis são também apresentados como importantes fatores relacionados à progressão do câncer de forma dependente da infecção por HPV (GIULIANO et al., 2011). Estudos recentes demonstram que a incidência de ácido desoxirribonucléico (DNA) de HPV em tecidos de CE de pênis está entre 15% a 78%, variando de acordo com a população estudada, com o método de coleta do espécime analisado e método utilizado para detecção de HPV (PASCUAL et al., 2007). Os genótipos HPV16 e HPV18 encontra-se presente em aproximadamente 50% dos casos deste tipo de câncer, quando relacionados a infecção por HPV (BACKES et al., 2009; MIRALLES-GURI et al., 2009) 15 1.2 O vírus do papiloma humano (HPV) e o carcinoma epidermóide (CE) de pênis Segundo a caracterização taxonômica e a definição de nomenclaturas estabelecida pelo The International Comittee on Taxonomy of Viruse (ICTV), o HPV pertence à família Papillomaviridae e se agrupa em cinco gêneros (α, β, γ, μ e ν). Cada gênero é subdividido em espécies, que podem ser compostas por um ou mais genótipos (BERNARD et al., 2010). Os papilomavirus podem infectar outros animais, entretanto, são específicos a cada espécie (DE VILLIERS et al., 2004). Até o momento mais de 150 genótipos de HPV foram totalmente caracterizados (BERNARD et al., 2010). A distinção de um genótipo é estabelecida quando a sequência de nucleotídeos da região L1 de um clone viral é diferente de outro, já classificado, em pelo menos 10% (DE VILLIERS et al., 2004; BERNARD et al., 2010). A diferença na nomenclatura dos genótipos é dada pela adição numérica, como exemplo, HPV6, HPV16, HPV18, de acordo com a ordem em que são descobertos (CHEN, Z. et al., 2011). As classificações genômica dos HPVs têm demonstrado correlação entre o tropismo do vírus pelos tecidos epiteliais estratificados, uma vez que, os genótipos do gênero α estão relacionados a infecções em mucosas e pele enquanto os genótipos dos demais gêneros estão relacionados apenas a infecções de pele (CROW, 2012). O ciclo de vida do HPV depende da diferenciação dos queratinócitos. À medida que estas células se dividem, as células basais e parabasais migram em direção à superfície e tornam-se diferenciadas. Ao se dividirem, as células infectadas pelo HPV distribuem igualmente o DNA viral entre as duas células filhas. Uma delas inicia o processo de diferenciação e maturação, enquanto a outra permanece indiferenciada na camada basal, servindo como reservatório do DNA viral. Para que os vírus infectem as células da camada basal é necessário que ocorra perda da integridade do epitélio, como microlesões ou microabrasões. Após a amplificação do genoma, ocorre a síntese das proteínas do capsídeo, montagem e liberação de novas partículas virais (CHOW; BROKER; STEINBERG, 2010). As principais etapas desse processo estão esquematizadas na figura 1. Figura 1. História natural da infecção por HPV no epitélio (WOODMAN; COLLINS; YOUNG, 2007). 16 17 Uma classificação essencialmente clínica, não levando em conta questões moleculares, separam os HPVs em dois grupos distintos, HR HPV e LR HPV (low risk HPV HPV baixo risco). Os genótipos de LR HPV mais comumente encontrados são HPV6, 11, 42, 43 e 44, e os genótipos de HR HPV são 16, 18, 31, 33, 34, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 e 70 (FRANCO; DUARTE-FRANCO; FERENCZY, 2001). O HPV é um vírus pequeno, com aproximadamente 55 nm de diâmetro, não-envelopado. Seu capsídeo, com aproximadamente 2 nm de espessura, é composto por 72 capsômeros, dispostos segundo uma simetria icosaédrica (T = 7). Seu genoma é composto por uma única molécula de DNA circular de dupla fita, com aproximadamente 8000 pares de bases (pb), dependendo do genótipo. O genoma do HPV é dividido em três regiões, de acordo com sua localização e propriedades funcionais: as regiões E (early - primária) e L (late tardia), denominadas ORFs (Open Reading Frames - fases de leitura aberta), e uma terceira região, a LCR (long control region - longa região de controle) ou URR (upstream regulatory region - região reguladora) (ALVARENGA et al, 2000; TAVARES et al., 2000; (HANDISURYA; SCHELLENBACHER; KIRNBAUER, 2009). A região não codificadora, também chamada de região longa de controle – LCR, ou, URR, contém elementos reguladores da origem da replicação e da expressão de genes reguladores da transcrição viral (FERENCZI et al., 2013). A região E é composta por genes que codificam proteínas (E1 a E7) associadas à replicação do DNA viral, transcrição e transformação celular, executando as funções regulatórias vitais para a produção da progênie viral. A região L codifica duas proteínas (L1 e L2), que são unidades estruturais do capsídeo, responsáveis pela produção viral e empacotamento do DNA (BURK; CHEN; VAN DOORSLAER, 2009). Embora ocorram variações no tamanho e na sequência dos genes e das LCRs entre os diferentes papilomavírus, todos têm a mesma organização genômica (figura 2). 18 Figura 2. Estrutura e organização do genoma do HPV16 (adaptada de MUNOZ et al., 2006) Os genes E1 e E2 codificam importantes proteínas regulatórias do HPV. A função destas proteínas é essencial para a replicação do DNA. A proteína E1 é uma proteína de ligação sítio-específica no DNA que se liga com a origem da replicação do genoma viral e promove a abertura da fita dupla de DNA, em preparação para a iniciação da replicação do material genômico, servindo também, como a helicase do DNA durante a replicação (BERGVALL; MELENDY; ARCHAMBAULT, 2013). A proteína E2 é um fator de transcrição de ligação do DNA que pode regular a transcrição viral ligando-se a locais específicos no genoma viral. Além disso, ela também é necessária para a iniciação da replicação do DNA viral e liga-se de forma cooperativa com E1 na origem da replicação do DNA (DELL et al., 2003; MASTERSON et al., 1998). Altos níveis de E2 reprimem a expressão das oncoproteínas virais E6 e E7 (ANDERSSON et al., 2005; CANADAS et al., 2010). A proteína E4 contribui para o sucesso de amplificação do genoma do HPV e síntese do vírus, e seu elevado nível de expressão sugere funções adicionais auxiliando na liberação do vírus e/ou na transmissão (DOORBAR, 2013). E5 é considerada uma oncoproteína, juntamente com E6 e E7 (DIMAIO; PETTI, 2013). Estas proteínas têm demonstrado diversos efeitos sobre o comportamento das células e contribuído para a transformação celular (gênese tumoral) e evolução da fase ciclo de vida do vírus. Supõe-se 19 que as atividades biológicas das proteínas E5 iniciam-se a partir das suas interações com diferentes alvos de proteína celular, como o EGFR (epidermal growth factor receptor, receptor do fator de crescimento epidermal), podendo agir de maneira sinérgica e potencializar a sinalização induzida por esse receptor incluindo a atividade da proteínaquinase ativada por mitógeno (MaPK) (CRUSIUS et al., 1998). Apesar das hipóteses propostas a esta proteína seu papel nos ciclos de vida dos HPVs ainda não está claros. E6 e E7 são consideradas oncoproteínas por sua capacidade de induzir transformações malignas na célula hospedeira (ZUR HAUSEN, 2002). Estas duas proteínas podem se ligar a múltiplos alvos celulares e inativar os mecanismos que controlam o ciclo celular e a apoptose. Entretanto, o papel oncongênico destas proteínas é mais claro em HR HPV, visto que ainda não estão bem definidos tratando-se de LR HPV. As principais características das proteínas E6 e E7 de HR HPV para que sejam consideradas oncoproteínas, é a capacidade de ligar-se e degradar e desestabilizar as proteínas supressoras de tumor p53, e a proteína retinoblastoma (pRb), respectivamente (SCHEFFNER et al., 1990; WERNESS; LEVINE; HOWLEY, 1990; SCHEFFNER et al., 1993; LEHOUX; D'ABRAMO; ARCHAMBAULT, 2009; MOODY; LAIMINS, 2010). Como citado anteriormente, a proteína supressora de tumor, p53, desempenha um papel importante na regulação do ciclo celular e na manutenção da integridade do genoma do hospedeiro, e geralmente, seu gene, TP53, encontra-se mutado em diversos tumores humanos (BROSH; ROTTER, 2009; NEGRINI; GORGOULIS; HALAZONETIS, 2010). Assim, acredita-se que a degradação da p53 mediada por E6 constitua um passo essencial para o desenvolvimento de carcinomas associados ao HR HPV (ZUR HAUSEN, 2002; LEHOUX et al., 2009; MOODY; LAIMINS, 2010). Embora diversos estudos tenham procurado caracterizar a diferença entre a proteína E6 de HR HPV e LR HPV, no envolvimento com a degradação de p53, as bases moleculares para esta diferença ainda continuam desconhecidas (CROOK; TIDY; VOUSDEN, 1991; BRIMER; LYONS; VANDE POL, 2007; MESPLEDE et al., 2012). Alguns trabalhos sugerem que esta diferença seja devido a instabilidade da proteína E6 ao interagir com a p53 ou com a proteína celular E6AP (E6 associated protein - proteína associada a E6). Desta forma, sustentam a ideia de que apenas a proteína E6 de HR HPV pode promover a degradação da p53, enquanto que as proteínas E6 de LR HPV são desprovidas desta capacidade (CROOK et al., 1991; ELBEL et al., 1997; GUCCIONE et al., 2002; BRIMER et al., 2007). As proteínas E6 de HR são capazes de degradar a p53 através da sua interação com a proteína-ubiquitina-ligase E3, E6AP (SCHEFFNER et al., 1990; WERNESS 20 et al., 1990; SCHEFFNER et al., 1993). Quando há a formação do complexo E6-E6AP, a E6AP se liga a p53 marcando-a com uma cadeia de poliubiquitina e causando sua degradação via proteassomal. Na ausência de E6, não há nenhuma influência da E6AP nos níveis de p53 (TALIS; HUIBREGTSE; HOWLEY, 1998; CHAUX; CUBILLA, 2012). A expressão das proteínas virais E6 e E7 é fortemente regulada pela proteína viral E2, que reprime a transcrição dos genes destas proteínas. Uma vez que a ORF da E2 é identificada como o sítio preferencial de abertura para integração do genoma do HPV ao genoma humano, há uma frequente ruptura dos sítios de controle desta proteína, e a transcrição dos genes da E6 e E7 torna-se deficiente, permitindo a superexpressão destas proteínas virais (ANDERSSON et al., 2005; CANADAS et al., 2010). Com isso, o mecanismo de integração do genoma do HPV ao genoma do hospedeiro, e suas consequências, tem sido estudado como um dos fatores para a progressão e desenvolvimento das lesões carcinogênicas. Sendo assim, os principais fatores para que o HR HPV consiga induzir a transformação maligna são: estabelecimento de infecção persistente, integração do genoma viral ao genoma da célula hospedeira e a expressão das oncoproteínas E5, E6 e E7. Durante uma infecção, normalmente os HPVs mantém-se na forma epissomal sendo autolimitantes e desaparecendo em meses. Entretanto, quando ocorre a integração do genoma viral estima-se que 10% dos casos desenvolvem-se em câncer (SCHMITZ et al., 2012). A proteína E7 é capaz de iniciar a síntese de DNA de células epiteliais diferenciandoas principalmente pela ligação e inativação do gene apoptótico e supressor de tumor, retinoblastoma (Rb). A família das proteínas Rb desempenha um papel essencial no controle do ciclo celular através da regulação do ponto de transição entre a fase G1 e S. O Rb hipofosforilado liga-se ao fator transcricional (transcriptional factor – TF) E2F, formando um complexo Rb-E2F, tornando E2F indisponível para a transcrição de genes associados à síntese de DNA. Quando há a fosforilação da pRb, pelos complexos de ciclina-CDK (CyclinDependent Kinases - quinases dependentes de ciclina), E2F é liberado do complexo de repressão transcricional Rb-E2F, induzindo a transcrição dos genes da fase S do ciclo celular (NGUYEN; JAMESON, 1998; VON KNEBEL DOEBERITZ, 2002; DOORBAR, 2005). Quando a proteína E7 do HPV liga-se ao pRb hipofosforilado a ligação entre o complexo pRb/E2 é desfeita, de forma independente de fosforilação e do complexo ciclina-CDK, assim, levando ao descontrole da progressão da fase G1 para a fase S do ciclo celular e promovendo então o desenvolvimento de neoplasias (LOPES et al., 2002; DOORBAR, 2005; FERA et al., 2012) (Figura 3). 21 Figura 3. Representação da interação das proteínas E6 e E7 de HR HPV com as proteínas celulares p53 e pRb, respectivamente (adaptada de EL MZIBRI, et al., 2012) Dentre a família das proteínas ciclinas encontram-se as ciclinas mitóticas, A e B, e ciclinas C, D e E (associadas com G1/S de transcrição). Elas agem ligando-se a subunidades catalíticas específicas chamadas CDKs. Umas das ciclinas D, a ciclina D1, forma um complexo com CDk4 e Dk6, induzindo então, a fosforilação da pRb, resultando na transição da fase G1/S do ciclo celular (LANGE; YEE, 2011). No entanto, a expressão da ciclina D1 tem sido estudada em diferentes tipos de carcinomas e uma superexpressão já foi relatada em diferentes tipos de estudos sobre carcinomas epidermóides (HUANG et al., 2012) carcinomas de mama, câncer de cabeça e pescoço (KIM; DIEHL, 2009), câncer cervical (STEWART et al., 2011), entre outros. Estes estudos sugerem que a superexpressão da ciclina D1 encurte o período da fase G1 e acelere o crescimento celular, contribuindo assim para a oncogênese (figura 4). Porém, outros estudos demonstram que em alguns casos, a inativação do complexo pRb/E2F pode levar a uma baixa expressão de ciclina D1, uma vez que a expressão desta proteína é dependente da pRb intacta, não podendo então ser desencadeada por sinais mitogênicos em células sem pRb (HOLZINGER et al., 2013). A proteína p16 também possui um importante papel no controle do ciclo celular ligando-se a CDK4 para formar o complexo p16-CDK4, impedindo a fosforilação do pRb. Como já discutido anteriormente, o pRb hipofosforilado mantém-se como supressor de tumor. Porém, disfunções devido a hipermetilação ou mutação da p16 são comuns em alguns 22 casos de câncer. Quando isto ocorre o complexo p16-CDK4 é desestabilizado liberando a CDK-4 que então pode ligar-se à ciclina D1 e formar o complexo CDK4 - ciclina D1 (SANO et al., 1998; FERREUX et al., 2003). Este complexo promove a fosforilação do pRb e libera o fator transcricional (TF), resultando em um crescimento celular acelerado (CHEN, Q. et al., 1999; WEINBERGER et al., 2006) (figura 4). Por outro lado, a inativação da pRb pela E7 pode causar uma superexpressão da p16 como resultado de um feedback negativo devido a ausência de pRb (NAM et al., 2007). Um aumento na expressão de p16 tem sido observado em amostras de câncer cervical (NAM et al., 2008), cabeça e pescoço (BEGUM et al., 2007), oral (FREGONESI et al., 2003) e região anogenital (LU; EL-MOFTY; WANG, 2003), quando positivas para HR HPV. 23 Apesar das informações descritas, há uma carência em estudos sobre CE de pênis, visto ainda que a relação da patologia com o HPV ainda são bastante complexas, bem como os mecanismos para gênese e desenvolvimento tumoral utilizado pelo por este. O papel do HPV no câncer cervical é bem estabelecido, entretanto a sua presença e as alterações moleculares causadas pelo vírus em CE de pênis são pouco conhecidas. Quando presente, o HPV pode estar relacionado à gênese e ao desenvolvimento deste tumor. A escassez de trabalhos sobre o envolvimento da infecção por HPV na gênese do CE de pênis justifica o presente trabalho. Assim, a detecção do vírus e comparação entre a expressão das proteínas p53, p16 e ciclina D1 nos tecidos tumorais HR HPV e HPV negativos podem ampliar o entendimento de alterações moleculares causadas pela infecção viral que culminam no surgimento e progressão deste tipo de tumor. 24 2 OBJETIVOS Este estudo teve por objetivo geral verificar as alterações na expressão de importantes proteínas regulatórias do ciclo celular, causadas pela infecção por HPV em amostras de CE de pênis. Para isto este trabalho teve como objetivos específicos: 1. Detectar a presença de DNA de HPV em amostras de tecido tumoral peniano de pacientes portadores de CE de pênis; 2. Identificar os genótipos de HPV encontrados nestas amostras; 3. Avaliar e comparar a expressão das proteínas celulares p53, p16 e ciclina D1 entre amostras de tecidos de CE de pênis HR HPV e HPV negativas; 25 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Casuística e considerações éticas Neste trabalho foram utilizadas 61 amostras parafinadas de CE de pênis obtidas de pacientes atendidos no departamento de Urologia do Hospital de Base em São José do Rio Preto. As amostras foram analisadas para a presença de DNA de HPV utilizando o par de oligonucleotídeos iniciadores GP5+/GP6 e, posteriormente, foi confirmada a presença do DNA viral e analisado seus diferentes genótipos a partir do kit INNO-LiPA® (Innogenetics, Gent, Bélgica). O presente estudo foi avaliado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa – CONEP (Nº 3444/2007), da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP). 3.2 Detecção e genotipagem de HPV Para detecção de HPV, as amostras foram submetidas à reação de PCR (Polymerase Chain Reaction), com oligonucleotídeos iniciadores GP5+/GP6+, que detectam grande parte dos genótipos do HPV, verificando assim quais amostras eram positivas para HPV. Buscando confirmar a positividade das amostras para o DNA de HPV e identificar os diferentes genótipos do vírus presente na infecção, todas as 61 amostras foram submetidas ao teste por hibridização reversa em linha, com o kit INNO-LiPA® HPV Genotyping Extra (Innogenetics, Gent, Bélgica). 3.2.1 Extração de DNA O DNA total das amostras parafinadas foi extraído utilizando QIAamp DNA FFPE Tissue kit (Qiagen, Hilden, Alemanha), seguindo as especificações do fabricante. Resumidamente, foi realizada a desparafinização com quatro banhos de xilol. Depois os resíduos de xilol foram retirados com dois banhos de etanol 100%. As amostras foram incubadas em 180μL de tampão ATL e 20μL de proteinase K, a 56ºC, por 1 hora e posteriormente, a 90ºC, por 1 hora. Foram adicionados 200μL de buffer AL e 200μL de etanol 26 100%. A solução foi transferida para a coluna QIAamp MinElute e centrifugada a 8000rpm durante 1 min. A coluna foi lavada com 500μL de tampão AW1 e depois com 500μL de tampão AW2. Após uma centrifugação a 14000rpm, por 3 min., para secar a coluna, o DNA foi eluído com 100μL de tampão ATE e conservado a -20ºC. 3.2.2 PCR para GSTP1 Foi utilizado ensaio de PCR para o gene endógeno glutationa-S-transferase 1 (GSTP1) para determinar a qualidade do DNA nas amostras, verificando assim se a extração do DNA havia sido bem sucedida. As reações ocorreram em um volume final de 25µL, contendo Tampão 1X, dNTP mix (0,02mM), MgCl2 (1,5mM), DMSO (10%), oligonucleotídeos iniciadores (quadro 3) (0,25mM), Taq DNA Polimerase (1U) (BioTools, Madri, Espanha) e DNA purificado. As amostras sofreram uma etapa inicial a 94ºC por 5 min. e então 40 ciclos sob as seguintes condições: 1 min. a 94ºC (desnaturação), 3 min. a 62ºC (anelamento dos oligonucleotídeos), 1,5 min. a 72ºC (extensão da cadeia), com uma fase final de 7 min. a 72ºC para extensão final. Como controle negativo de contaminação, em todos os experimentos, um dos tubos não recebeu DNA. O produto da amplificação foi visualizado em gel de agarose a 2%, corado com brometo de etídeo, juntamente com um marcador de 100pb (Fermentas, Burlington, Canadá), possibilitando verificar a amplificação sob luz ultravioleta. 3.2.3 Detecção de DNA de HPV por PCR (GP5+/GP6+) A presença de HPV nas amostras de CE de pênis foi determinada por amplificação por PCR com oligonucleotídeos iniciadores GP5+ e GP6+ (quadro 3). Estes oligonucleotídeos iniciadores amplificam um pequeno fragmento de 140 a 150 pb da região L1 do genoma viral. As reações de PCR para detecção de HPV foram realizadas num volume total de 50μL. Foram utilizados 5μL de cada amostra, adicionados a uma solução contendo 1x High Fidelity PCR Buffer, 2,5 mM de MgCl2, 0,02mM de dNTP mix, 1μM de oligonucleotídeo iniciador GP5+, 1μM de oligonucleotídeo iniciador GP6+, e 5U da enzima High Fidelity PCR Mix (Fermentas, Burlington, Canadá), por amostra. 27 Os volumes foram submetidos a um ciclo inicial de 94ºC por 5 min., 40ºC por 1 min. e 72ºC por 1,5 min. e, então, 40 ciclos de 45ºC por 1 min. (desnaturação), 40ºC por 2 min. (anelamento), 72ºC por 1,5 min. (extensão), além de um ciclo final a 72ºC por 7 min. Foram utilizados 5μL desta reação para uma segunda reação de PCR nas mesmas condições. Após as reações, os fragmentos foram visualizados em gel de agarose a 3% corados com brometo de etídeo (90 volts por 40 min.), com marcador de peso molecular de 100pb (Fermentas, Burlington, Canadá). Os géis foram visualizados sob luz ultravioleta. Quadro 3 . Sequência dos oligonucleotídeos iniciadores utilizados nos ensaios de PCR Oligonucleotídeos Sequência Alvo iniciadores GSTP1 F ACCCCAGGGCTCTATGGGAA GSTP1 R TGAGGGCACAAGAAGCCCCT GP5+ TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC GP5+ GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC GSTP1 (gene endógeno) HPV 3.2.4 Detecção de DNA e genotipagem de HPV por INNO-LiPA Após confirmação das amostras positivas para HPV utilizando os oligonucleotídeos GP5+/GP6+, todas as amostras de CE de pênis, incluindo as que demonstraram ausência de DNA de HPV no primeiro teste foram analisadas utilizando os kits INNO-LiPA HPV Genotyping Extra Amp e INNO-LiPA HPV Genotyping Extra (Innogenetics, Gent, Bélgica). Estes kits permitem a detecção de 28 genótipos diferentes de HPV (6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 59, 66, 68, 69, 70, 71, 73, 74 e 82), bem como casos de co-infecções entre diferentes tipos. O ensaio baseia-se no princípio da hibridização reversa, em que parte da região L1 do genoma do HPV é amplificada com iniciadores SPF10 e os produtos amplificados biotinilados são desnaturados e hibridizados com sondas oligonucleotídicas específicas fixas em tiras de membrana de nitrocelulose. Inicialmente uma reação de PCR é realizada. Em um microtubo são adicionados 37,7μL de AMP mix, 2,3μL de ENZ mix e 10μL de DNA da amostra. A reação é 28 incubada a 37ºC por 10 min. e a 94ºC por 9 min. seguidos por 40 ciclos de 94ºC por 30 segundos, 45ºC por 45 segundos e 52ºC por 45 segundos, finalizando com uma fase de extensão a 72ºC por 15 min. Os produtos foram utilizados imediatamente ou conservados a 20ºC. Para o ensaio de hibridização, foram adicionadas as fitas, previamente identificadas, nas calhas de teste, adicionando, em seguida, 10µl da solução de desnaturação e 10µl do produto amplificado, homogeneizando cuidadosamente e incubando por 5 min. a temperatura ambiente (20-25°C). Em seguida, foram adicionados 2 µl da solução de hibridização e incubada a 49ºC, por 60 min., a 80rpm. Após a incubação foram realizadas duas lavagens, adicionando 2 ml da solução de lavagem e em seguida, foram adicionados 2ml da solução de lavagem rigorosa pré-aquecida, em um banho-maria de agitação, a uma temperatura de 49°C, durante 30 min., a 80rpm. Após estas lavagens, 2 ml de solução de conjugado foram adicionados a cada cavidade e incubado em agitação (80rpm) por 30 min., sendo então realizadas duas lavagens, adicionando 2 mL da solução de lavagem (fornecida pelo kit) diluída e uma com 2 mL de tampão substrato. Em seguida, 2 mL de solução de substrato foram adicionados e as fitas incubadas por 30 min., em agitação (80rpm), a temperatura ambiente. Para a revelação de cor, as tiras foram lavadas por duas vezes, com 2 mL de água destilada. Os genótipos de HPV foram obtidos comparando as bandas presentes nas fitas ao painel fornecido pelo fabricante (Figura 5). 29 Figura 5. Localização das sondas e controles na tira de INNO-LiPA. 3.3 Análises Imunohistoquímicas A partir das amostras parafinadas foi possível obter 36, 34 e 40 lâminas referentes às proteínas p53, p16 e ciclina D1, respectivamente, que foram utilizadas para análises imunohistoquímicas. Lâminas contendo cortes de 4µm de tecido de CE de pênis fixado foram submetidas aos procedimentos descritos a seguir. As imunohistoquímicas procederam a partir da desparafinização das lâminas com banhos sequenciais de xilol e reidratação com banhos de álcool em diferentes concentrações. Para os ensaios para verificar a expressão de p53 e ciclina D1, após a reidratação realizou-se a recuperação antigênica por aquecimento em panela de vapor adicionando o Tampão Tris-EDTA (pH 9,0) em uma cuba dentro deste equipamento e aquecendo. Em seguida, as amostras foram colocadas dentro da cuba, incubadas por 20 min. e aquecidas e durante 15 min., à temperatura ambiente. O bloqueio da atividade da peroxidase endógena foi realizado incubando as lâminas em Água Oxigenada (3%), por 10 min., à temperatura ambiente. Os cortes foram embebidos em leite em pó desnatado MOLICO® (5%), posteriormente secos e em seguida, incubados com anticorpo primário (quadro 4), em câmara 30 úmida, por 60 min. à temperatura ambiente. Em seguida, foi utilizado o complexo HiDef Detection™ HRP Polymer System (Cell-Marque Corporation, 954D-30, Rocklin, CA, Estados Unidos), aplicando o HiDef Detection Amplifier e o HiDef Detection HRP Polymer Detector, por 10 min. cada reagente, acompanhado de uma lavagem com água destilada entre as aplicações. As análises da expressão de p16 foram realizadas seguindo os mesmos procedimentos iniciais de desparafinização e reidratação, seguida da recuperação antigênica, que foi realizada com tampão citrato (pH 6,0). O bloqueio da atividade da peroxidase endógena foi realizado com metanol e peróxido de hidrogênio a 30%, durante 10 min., à temperatura ambiente. Os cortes foram embebidos em BSA (Bovine serum albumin, albumina de soro bovino), a 2% em PBS (Phosphate buffered saline, tampão fosfato-salino), incubados por pelo menos 16 horas, à 4ºC, em câmara úmida, com anticorpo primário (quadro 4), diluído em 1% de BSA. Em seguida, foi aplicado o anticorpo secundário biotinilado universal (Dako, Cambridge, Inglaterra), à 30ºC, por 25 min. O complexo estreptavidina-biotinaperoxidase (Dako, Cambridge, Inglaterra) foi aplicado nas mesmas condições. As etapas de revelação procederam-se para os três anticorpos, utilizando diaminobenzidina (DAB TABLETS, Dako, Cambridge, Inglaterra) e contra-coloração com hematoxilina. As lâminas foram desidratadas em álcool e xilol e montadas com bálsamo do Canadá. Quadro 4. Anticorpos primários utilizados para imunohistoquímica Alvo p53 Fabricante Monoclonal (Clone DO-7) Diluição Cell-Marque Corporation (Rocklin, 1:200 Estados Unidos) p16 Monoclonal Abcam (Cambridge, Inglaterra) 1:1000 ciclina D1 Monoclonal (Clone: D1.1) Abcam (Cambridge, Inglaterra) 1:1000 Os resultados da imunohistoquimica para p53, p16 e ciclina D1 foram analisados por densitometria em um microscópio Axioskop II (Zeiss, Oberkochen, Alemanha) utilizando o programa AxiovisionTM (Zeiss,, Oberkochen, Alemanha). Para esta análise, em cada lâmina foram escolhidos aleatoriamente três diferentes campos. Em cada campo, 15 diferentes pontos foram escolhidos de forma aleatória, obtendo-se assim um número, dado em 31 unidades arbitrárias (u.a.), referente à intensidade relativa de imunorreatividade de cada lâmina. A partir dos valores das densitometrias, foram efetuadas análises estatísticas utilizando o software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad, La Jolla, Estados Unidos). O teste U de Mann-Whitney foi aplicado para comparar os valores de expressões das proteínas em amostras tumorais de CE de pênis, na presença de HR HPV e HPV negativos. Um valor de P <0.05 foi considerado estatisticamente significante para todas as análises. 32 4 RESULTADOS 4.1 PCR para HPV Todas as amostras utilizadas foram positivas para GSTP1, demonstrando a qualidade de DNA nas amostras. Das 61 amostras testadas para a presença de HPV através de PCR com oligonucleotídeos iniciadores GP5+/GP6+, um total de 30 (49,2%) foram positivos para HPV. As detecções de DNA de HPV nas amostras de CE de pênis, utilizando PCR para GP5+/GP6+ não excluíram as análises das amostras negativas pelo kit INNO-LiPA®. Como o INNO-LiPA® trata-se de uma metodologia diferente da utilizada na PCR para GP5+/GP6+, buscamos a confirmação da detecção de DNA de HPV também por esse, pesquisando também os diferentes genótipos do vírus. 4.2 INNO-LiPA® As 61 amostras de CE de pênis foram submetidas a genotipagem utilizando o kit INNO-LiPA®. Os resultados mostram que destas 37 (60,7%) foi positiva para HPV, sendo que um total de 22 de 37(59,5%) foram genotipadas como HR HPV e 15 (40,5%) LR HPV. Infecções mistas ocorreram em 14 das 37 (37,8%) amostras e dentre o total de amostras 24 (39,3%) foram negativas para HPV. O número de amostras e seus respectivos status quanto à presença de HPV e seus genótipos estão listados na tabela 1. 33 Tabela 1: Descrição do número de amostras CE de pênis com genótipos HR HPV, LR HPV, mistos e sem a presença de DNA de HPV. Infecções simples HR LR Genótipo 16 6 11 n 13 5 5 Infecções mistas LR HR 6/11 6/16 11/16 6/11/16 16/18 Negativas 5 2 4 2 1 24 Após a genotipagem, em 23 (62,1%) das amostras HPV positivas foi encontrado apenas um tipo de HPV, sendo o HPV16 (56,5%) o mais prevalente seguido pelos tipos HPV6 (21,7%) e HPV11 (21,7%) de igual prevalência. As amostras contendo infecções mistas totalizaram 14 (37,8%), distribuídas em: HPV6 e HPV11 (35,7%); HPV6 e HPV16 (14,3%); HPV11 e HPV16 (28,6%); HPV6, HPV11 e HPV16 (14,3%); HPV16 e HPV18 (7,1%). É importante destacar, que a detecção das amostras com genótipos de HR HPV e sem infecção por HPV foi de grande importância para podermos relacionar a presença ou a ausência destes genótipos do HPV às alterações na expressão das proteínas verificadas por imunohistoquímica. 4.3 IMUNOHISTOQUÍMICA A partir das amostras disponíveis foi possível a realização de imunohistoquímica em 36, 34 e 40 lâminas contendo tecidos de portadores de CE de pênis para p53, p16 e ciclina D1, respectivamente. As lâminas foram separadas em três grupos: um contendo lâminas de tecidos tumorais de CE de pênis negativos para HPV, outros dois contendo lâminas de tecidos tumorais de CE de pênis positivo para HR HPV e LR HPV. As quantidades de lâminas variaram entre as diferentes proteínas analisadas, devido à dificuldade na obtenção das amostras para confecção das lâminas. Uma vez que a quantidade de lâminas LR HPV foi pequena, estas foram excluídas das análises. A quantidade de lâminas utilizada em cada grupo para a análise da expressão de p53, p16 e ciclina D1 está descrita na tabela 2. 34 Tabela 2: Total de amostras utilizadas em imunohistoquímica (após retirada das amostras com infecção por LR HPV) p53 p16 Ciclina D1 HR HPV 15 14 17 HPV Neg 15 16 16 Total 30 30 33 Os valores densitométricos da expressão da proteína p53 foram analisados e comparados entre as 15 lâminas de tecidos tumorais negativo para HPV e as 15 positivas para HR HPV. Desta forma, foi possível observar que a expressão da proteína p53 foi significativamente maior em amostras negativas para HPV (p=0,0002). Na figura 6 as fotomicrografias demonstram as marcações nucleares desta proteína. Como pode ser observado, nas amostras HR HPV estas foram fracas ou nula, contrária a isto as amostras HPV negativas apresentaram fortes marcações. Quando analisados os dados densitométricos da expressão de p16, obtidos por meio da análise das 16 lâminas de tecidos tumorais negativo para HPV e as 14 lâminas positivas para HR HPV, pode-se observar que a expressão da proteína p16, diferente do que foi observado em p53, demonstrou-se significativamente maior em amostras HR HPV (p< 0.0001), as marcações celulares observadas na figura 6, demonstram estes dados. Já nas análises da expressão de ciclina D1, entre 17 lâminas de tecidos tumorais negativos para HPV e 16 de HR HPV, foi possível observar uma expressão significativamente maior nas amostras negativas para HPV (p=0,0030). Uma representação desta marcação também pode ser observada nos núcleos das células apresentadas pelas fotomicrografias na figura 6. 35 400X 400X 400X 400X 400X 400X Figura 6: Fotomicrografias representativas de imunohistoquímica para as proteínas, p53, p16 e ciclina D1. Imunomarcação em: A) Significativa expressão de p53 em tecido de CE negativo para HPV; B) Ausência de expressão de p53 em tecido de CE HR HPV; C) Fraca expressão de p16 em tecido de CE negativo para HPV; D) Forte expressão de p16 em tecido de CE HR HPV. E) Forte expressão de ciclina D1 em tecido CE negativo para HPV; F) Fraca expressão de ciclina D1 em tecido de CE HR HPV. Aumento: 400x. 36 A figura 7 apresenta os valores densitométricos da imunohistoquímica das proteínas p53, p16 e ciclina D1, obtidos a partir da análise estatística, utilizando o teste Mann-WhitneyWilcoxon (WU et al., 2014). Figura 7: Gráficos dos valores densitométricos da expressão das proteínas p53, p16 e ciclina D1, respectivamente. (u. a. – unidades arbitrárias; A) ***p=0,0002; B) ***p<0,0001; C**p=0,0030). 37 5 DISCUSSÃO A quantidade de estudos envolvendo o CE de pênis é pequena, quando comparada a estudos com cânceres semelhantes, como o cervical. Como resultado desta escassez, os mecanismos moleculares envolvidos bem como o papel da infecção por HPV na evolução tumoral ainda não estão bem estabelecidos. Neste trabalho, verificou-se a prevalência de HPV e seus genótipos em tecidos de CE de pênis. A partir dos dados obtidos, foi possível analisar as alterações na expressão de três importantes proteínas envolvidas no ciclo celular, na presença e na ausência de infecção por HR HPV. Amostras de CE de pênis foram submetidas a ensaios de PCR, utilizando os oligonucleotídeos iniciadores GP5+/GP6+, que permitem a detecção de uma ampla quantidade de genótipos do HPV, possibilitando então a verificação de quais amostras possuíam DNA de HPV. Uma vez determinada a presença de HPV, os genótipos do vírus foram identificados pelo INNO-LiPA HPV Genotyping Extra (Innogenetics). Este kit, comercialmente disponível, além de identificar os genótipos, também proporciona um amplo reconhecimento da presença de diferentes tipos de HPV nas amostras, utilizando uma metodologia diferente da que foi utilizada primeiramente. Assim, decidiu-se repetir as análises de identificação de DNA de HPV nas amostras de CE de pênis que apresentaram resultado negativo quando analisado pela PCR para GP5+/GP6+. A prevalência de HPV em amostras de CE de pênis varia entre 15% a 78% em estudos que relaciona o HPV e este tipo de tumor (PASCUAL et al., 2007). Esta variação pode estar relacionada ao método de detecção utilizado para verificar a presença de DNA do HPV, à utilização de subtipos histológicos diferentes para a análise, além da conservação do material (fresco ou fixado em parafina) (ANIC; GIULIANO, 2011). Quando analisada a presença de DNA do HPV nas amostras de CE de pênis utilizando a PCR para os oligonucleotídeos GP5+/GP6+, foi encontrada positividade em 30 das 61 amostras (49,2%). Porém, ao serem analisadas as 61 amostras utilizando o INNO-LiPA HPV Genotyping Extra (Innogenetics), um total de 37 (60,7%) das amostras apresentaram positividade para HPV. A diferença na quantidade de amostras positivas para HPV encontrada entre as duas técnicas pode ser devido a integridade do DNA, uma vez que as amostras são provenientes de tecido fixado em parafina, o que pode promover uma grande degradação do DNA. Ao utilizarmos os oligonucleotídeos iniciadores GP5+/GP6+ na detecção do DNA de 38 HPV, a região alvo de amplificação é de 150pb, porém a reação de amplificação do material genômico que é realizada pelo INNO-LiPA kit, a partir dos oligonucleotídeos iniciadores SPF10, tem como alvo uma região de 65pb. Sendo esta, menor do que a região alvo do primeiro par de oligonucleotídeos, pode ser amplificada com mais facilidade, o que pode justificar esta diferença. As taxas prevalência de HPV em casos de tumores penianos variam entre 56% a 65% (IWASAWA; KUMAMOTO; FUJINAGA, 1993; GIULIANO et al., 2007; NIELSON et al., 2007; STANKIEWICZ et al., 2012). Em estudos anteriores, as taxas de detecção do HPV16 foram variáveis, porém, em todos, é o genótipo mais prevalente (VARMA et al., 1991; MADEN et al., 1993; LONT et al., 2006; PASCUAL et al., 2007; TORNESELLO et al., 2008), assim demonstrando que nossos resultados são corroborados pela literatura. Além do conhecimento sobre a prevalência do HPV, os dados apresentados anteriormente possibilitaram a diferenciação das amostras em HR HPV, LR HPV e HPV negativas, o que permitiu a comparação da expressão das proteínas p53, p16 e ciclina D1 entre amostras HR HPV e HPV negativas. Estas proteínas estão intimamente relacionadas ao controle do ciclo celular, e têm sido estudadas em outros tipos de cânceres relacionados a infecções por HPV (BEGUM et al., 2007; BROSH; ROTTER, 2009; KIM; DIEHL, 2009; MESPLEDE et al., 2012). O aumento da expressão das oncoproteínas E6 e E7, de HR HPV resultam na degradação e desestabilização de duas proteínas, a p53 e a pRb, respectivamente (GIANNOUDIS; HERRINGTON, 2001). Sendo elas responsáveis por alguns mecanismos de controle da proliferação celular, o conhecimento da alteração destas proteínas, bem como de proteínas envolvidas nas mesmas vias de controles do ciclo celular podem esclarecer alguns mecanismos da gênese tumoral no CE de pênis (LI et al., 2012; SACHDEVA; O'BRIEN, 2012). Além disso, alguns estudos sugerem que o conhecimento do padrão de expressão destas pode ser útil como marcador para atividade patológica de HPV (NAM et al., 2007; ERNOUX-NEUFCOEUR et al., 2011; NASSER et al., 2011). A proteína p53 é uma importante proteína supressora de tumor, ela é capaz de, durante o ciclo de divisão celular, verificar se há alguma mutação na sequência de nucleotídeos do DNA, o que leva à produção de tumores. Quando há uma alteração, a p53 induz uma correção ou a morte celular por apoptose (NEGRINI et al., 2010). A inativação da p53 nos casos de cânceres relacionados ao HPV é, provavelmente, devida à degradação 39 mediada pela oncoproteína E6 (PORTARI et al., 2013). Como descrito por Talis et al. (TALIS et al., 1998), a interação da oncoproteína E6 de HR HPV com uma proteínaubiquitina-ligase, forma o complexo E6AP que é capaz de se ligar a p53, causando sua degradação via proteassomal. Estudos realizados com amostras de câncer cervical demonstraram relação entre a degradação desta proteína e a presença de HR HPV, o que reforça esta ideia (LU et al., 2003; HORN et al., 2006). Por outro lado, ainda são poucos os trabalhos semelhantes utilizando amostras de CE de pênis, o que dificulta o conhecimento dos mecanismos moleculares envolvidos na evolução desta patologia. O aumento da expressão da oncoproteína E6 de HR HPV pode ser considerado como responsável pela disfunção da p53. Os dados da expressão de p53 encontrados neste trabalho corroboram com outro estudo recente que obteve resultados semelhantes em carcinomas de células escamosas da orofaringe (HOLZINGER et al., 2013), no qual o autor considera a p53 um bom marcador para distinguir lesões associadas e não associadas ao HR HPV. Um trabalho com amostras de CE de pênis também observou a fraca expressão desta proteína na patologia, porém não houve comparação com o status de infecção por HPV, já que foram analisados tecidos tumorais e tecidos normais (GUNIA et al., 2012). A expressão de p53 tem variado entre 40 a 89% em estudos de câncer de pênis invasivo (MUNEER et al., 2009). Contudo, entre os estudos que avaliaram a expressão da p53 em CE de pênis relacionando com status de infecção por HPV (STANKIEWICZ et al., 2011; MANNWEILER et al., 2013) não é possível estabelecer um perfil conclusivos sobre a expressão desta proteína, o que deixa claro a necessidade de outras avaliações. A proteína p16 está envolvida no ciclo celular e, em condições fisiológicas normais, é expressa para controlar a evolução da fase G1 para a fase S, na mitose (SHERR, 1996). Seu mecanismo de controle baseia-se na formação de um complexo com as CDKs4, inibindo a fosforilação da proteína Rb (pRb) que, em condições de hipofosforilação mantém desativado o fator de transcrição E2F, promovendo o controle da proliferação celular (SHERR, 1996; NGUYEN; JAMESON, 1998). Porém, quando a oncoproteína viral E7 se liga a pRb, promove a desestabilização e a sua degradação, resultando na liberação e ativação do fator de transcrição E2F e então, no aumento da proliferação celular. Desta forma, o processo de retroalimentação negativa da p16 fica comprometido e esta se mantém em níveis elevados de expressão (KAMB et al., 1994; SHERR, 1996; NAM et al., 2007). Esta alteração nos níveis de expressão da p16 já foi relatada em CE de pênis associado à HR HPV, sendo 40 considerado como um possível marcador substituto para o diagnóstico de HR HPV induzido por CE de pênis (DO et al., 2013). Diferenças nas expressão da proteína p16 está associada com o HR HPV em lesões cervicais e genitais (FERREUX et al., 2003; MANNWEILER et al., 2013). A diferença na expressão de p16 encontrada neste trabalho corrobora estes estudos anteriores, podendo assim, inferir uma relação entre a infecção pelo HR HPV e o aumento na expressão desta proteína. Entretanto, um estudo da expressão de p16, também em CE de pênis, não observou diferenças significativas entre amostras HR HPV positivas e negativas (SENBA et al., 2009). Com isso, não fica estabelecido um consenso em relação à expressão desta proteína em tecidos de CE de pênis infectados por HR HPV. A ciclina D1 está intimamente relacionada ao ciclo celular e a via de fosforilação da pRb, assim como a p16. Como descrito por (LANGE; YEE, 2011), a ciclina D1 se liga a subunidades catalíticas específicas, chamadas CDKs, formando um complexo com CDk4 e induzindo esta fosforilação da pRb o que, como discutido anteriormente, resultará na transição da fase G1 para a S no ciclo celular. Diversos trabalhos têm analisado a expressão de ciclina D1 em outros tipos de cânceres relacionados ou não ao HPV (JARES; COLOMER; CAMPO, 2007; HONG et al., 2011; MOHAMMADIZADEH et al., 2013) e em um trabalho analisando amostras de CE de pênis o autor verificou uma significativa alteração na expressão desta proteína (PAPADOPOULOS et al., 2007). Nestes, foram relatados a superexpressão ciclina D1, quando comparados a tecidos normais. Sendo assim, estes trabalhos consideram que sua superexpressão possui um papel importante na gênese tumoral (KIM; DIEHL, 2009; HONG et al., 2011; HUANG et al., 2012). Porém, nestes trabalhos não foram levados em consideração a presença ou ausência de HPV nas amostras, o que demonstra um objetivo diferente da nossa pesquisa. Outros trabalhos verificaram a expressão desta proteína em tumores que possuem o HR HPV como um de seus fatores de risco. Nestes foi expressiva a diminuição nos níveis da ciclina D1 em amostras HR HPV, quando comparadas a amostras HPV negativas, o que sugere que esta proteína tem um questionável papel no desenvolvimento tumoral na presença de HR HPV (SOUTHERN; HERRINGTON, 1998; HOLZINGER et al., 2013). PORTARI et al. (2013) sugere que a ausência ou fraca expressão desta proteína em tecidos tumorais infectados por HR HPV seja devido ao fato de que quando há uma desregulação da pRb pela oncoproteína viral E7, as ciclinas do tipo D1 podem não ser necessárias para a transição da fase G1 para a fase S do ciclo celular, ignorando a exigência 41 da formação do complexo entre ciclina D1 e CDKs na progressão do ciclo. Como resultado há uma perda do feedback positivo e, por sua vez, uma baixa regulação da ciclina D1, apesar do aumento da proliferação celular. Além disso, sinais mitogênicos em células sem a pRb não são desencadeados, resultando em uma queda da expressão da ciclina D1 (BATES et al., 1994). Desta forma, nossos resultados possibilitaram confirmar uma influência do HR HPV na diminuição da expressão da ciclina D1, porém um maior conhecimento sobre as taxas de expressão da oncoproteína E7 e a proteína pRb, seria essencial para reforçar as hipóteses apresentadas que resultam nesta alteração de expressão. Os dados deste trabalho exibem alterações na expressão das proteínas envolvidas no ciclo celular, em tecidos de CE de pênis HR HPV e HPV negativo, o que nos permite pensar na possível utilização destas proteínas na distinção de lesões associadas ao HR HPV e não associadas. Todas as diferenças entre as taxas de expressão encontradas foram estatisticamente significantes entre os grupos de amostras HR HPV e HPV negativos, porém acredita-se ser necessárias análises com um maior número de amostras para que se possa considerá-las como marcadores usuais. Além disso, estes dados trazem contribuições importantes no entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na gênese e desenvolvimento do CE de pênis e sustenta a relação do HPV como um fator de risco. Uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares desta doença é necessária para auxiliar no tratamento e prognósticos mais precisos, resultando em abordagens clínicas e terapêuticas mais adequadas. 42 6 CONCLUSÕES Os dados obtidos permitem concluir que: O HPV tem importante papel na gênese e desenvolvimento do CE de pênis; Há alta prevalência de HPV em pacientes com CE de pênis; O HPV16 é o tipo de HPV mais prevalente entre os casos de CE de pênis; Há diferenças significativas entre a expressão das proteínas p53, p16 e ciclina D1 quando comparadas entre amostras HR HPV e HPV negativas. 43 7 REFERÊNCIAS ALVARENGA, G. C.; et al. Papilomavírus Humano e carcinogênese no colo do útero. DST Jornal Brasileiro de Doenças Sexualmente Transmissíveis, v. 12, n. 1, p. 28-38, 2000. 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