Transformação (incorporação de DNA por bactérias competentes) 27/9/16 Material: Bactéria competente(50ul/reaction) DNA Gelo 1. Descongele lentamente o seu DNA no gelo. Caso o DNA esteja num papel de filtro veja anexo abaixo. 2. Pegue a bactéria COMPETENTE (não confundir com o estoque de bactérias transformadas) e descongele no gelo. 3. Depois de ressuspender gentilmente a bactéria, divida em tubos novos de acordo com os DNAs que serão recebidos. 4. Adicione 0,5-1ul do DNA com a bactéria competente, e misture gentilmente com a ponta da pipeta sem pipetar para cima e para baixo. 5. Incube no gelo por 20 minutos 6. Dê o choque térmico por 2 minutos a 37°-42°C. 7. Adicione 1.5ml de LB sem antibiótico para que a bactéria transformada possa adquirir resistência ao antibiótico de selação. 8. Agite no agitador de bactérias a 37C por 45 min. Use tubos falcon 15ml como adaptador. 9. Enquanto a bactéria se recompõe, prepare o LB-agar: A) derreta no microondas o LB-agar previamente autoclavado (LB+0,7% agar) B) Separe o volume necessário (25ml/placa) C) Espere esfriar ao toque e adicione o antibiótico de seleção (vai depender do tipo de plasmídio transformado) D) Derrame nas placas de Petri fazendo o mínimo de bolhas. 10. Centrifugue as bactérias na microcentrífuga a Vmax por 5 minutes. Descarte o sobrenadante no descarte de LB. 11. Ressuspenda a bactéria em 100l de LB, flambe o espalhador de metal, espere esfriar e espalhe pela placa de LB-agar 12. Incube as placas com a parte de baixo para cima na incubadora com umidade (e.g. dentro de uma caixa tupperware com um copinho de água). Não se esqueça de marcar no fundo da placa o nome inteiro do plasmídio. No dia seguinte: Para congelamento (estoque de bactéria transformada): 1. Prepare 2ml de LB com antibiótico/placa 2. Toque levemente em uma colônia com um palito estéril 3. Inocule o LB com o palito 4. Cresça no shaker overnight 5. Congele no dia seguinte com 15% de glicerol em criotubos apropriadamente marcados (850l de bactéria+150l de glicerol 100% autoclavado. 6. Guarde no –80C e anote no caderno de bactérias transformadas. Para Miniprep 7. Prepare 2ml de LB com antibiótico/placa 8. Toque levemente em uma colônia com um palito estéril 9. Inocule o LB com o palito 10. Cresça no shaker overnight 11. Proceda com o miniprep Anexo: Como recuperar DNA de papel filtro: 1. 2. 3. 4. Limpe bem uma tesoura com álcool, deixe evaporar o álcool Corte o círculo onde está o DNA no papel Usando luvas, coloque o papel filtro no fundo de um microtubo Adicione pelo menos 20l de água MiliQ autoclavada. Use o suficiente para apenas cobrir o papel filtro. Quanto mais água mais diluído o DNA vai ficar. 5. Deixe 10minutos a 90C 6. Centrifugue por 2 minutos a Vmax 7. Use 5-10l para transformar as bactérias.