calcium chloride transformation of bacteria with

Transformação
(incorporação de DNA por bactérias competentes)
27/9/16
Material: Bactéria competente(50ul/reaction)
DNA
Gelo
1. Descongele lentamente o seu DNA no gelo. Caso o DNA esteja num papel
de filtro veja anexo abaixo.
2. Pegue a bactéria COMPETENTE (não confundir com o estoque de
bactérias transformadas) e descongele no gelo.
3. Depois de ressuspender gentilmente a bactéria, divida em tubos novos de
acordo com os DNAs que serão recebidos.
4. Adicione 0,5-1ul do DNA com a bactéria competente, e misture gentilmente
com a ponta da pipeta sem pipetar para cima e para baixo.
5. Incube no gelo por 20 minutos
6. Dê o choque térmico por 2 minutos a 37°-42°C.
7. Adicione 1.5ml de LB sem antibiótico para que a bactéria transformada
possa adquirir resistência ao antibiótico de selação.
8. Agite no agitador de bactérias a 37C por 45 min. Use tubos falcon 15ml
como adaptador.
9. Enquanto a bactéria se recompõe, prepare o LB-agar:
A) derreta no microondas o LB-agar previamente autoclavado (LB+0,7%
agar)
B) Separe o volume necessário (25ml/placa)
C) Espere esfriar ao toque e adicione o antibiótico de seleção (vai
depender do tipo de plasmídio transformado)
D) Derrame nas placas de Petri fazendo o mínimo de bolhas.
10. Centrifugue as bactérias na microcentrífuga a Vmax por 5 minutes.
Descarte o sobrenadante no descarte de LB.
11. Ressuspenda a bactéria em 100l de LB, flambe o espalhador de metal,
espere esfriar e espalhe pela placa de LB-agar
12. Incube as placas com a parte de baixo para cima na incubadora com
umidade (e.g. dentro de uma caixa tupperware com um copinho de água).
Não se esqueça de marcar no fundo da placa o nome inteiro do plasmídio.
No dia seguinte:
Para congelamento (estoque de bactéria transformada):
1. Prepare 2ml de LB com antibiótico/placa
2. Toque levemente em uma colônia com um palito estéril
3. Inocule o LB com o palito
4. Cresça no shaker overnight
5. Congele no dia seguinte com 15% de glicerol em criotubos
apropriadamente marcados (850l de bactéria+150l de glicerol 100%
autoclavado.
6. Guarde no –80C e anote no caderno de bactérias transformadas.
Para Miniprep
7. Prepare 2ml de LB com antibiótico/placa
8. Toque levemente em uma colônia com um palito estéril
9. Inocule o LB com o palito
10. Cresça no shaker overnight
11. Proceda com o miniprep
Anexo: Como recuperar DNA de papel filtro:
1.
2.
3.
4.
Limpe bem uma tesoura com álcool, deixe evaporar o álcool
Corte o círculo onde está o DNA no papel
Usando luvas, coloque o papel filtro no fundo de um microtubo
Adicione pelo menos 20l de água MiliQ autoclavada. Use o suficiente para
apenas cobrir o papel filtro. Quanto mais água mais diluído o DNA vai ficar.
5. Deixe 10minutos a 90C
6. Centrifugue por 2 minutos a Vmax
7. Use 5-10l para transformar as bactérias.