COMPORTAMENTO E MOTILIDADE DA BACTÉRIA

Fernando Pereira de Almeida
COMPORTAMENTO E MOTILIDADE DA BACTÉRIA
MAGNETOTÁCTICA ‘Candidatus Magnetoglobus
multicellularis’ SOB CAMPO MAGNÉTICO APLICADO
Dissertação de Mestrado
Orientador: Drª. Carolina Neumann Keim
Co-orientador: Dr. Ulysses Garcia Casado Lins
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE MICROBIOLOGIA PROF PAULO DE GÓES
RIO DE JANEIRO
MARÇO DE 2009
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Fernando Pereira de Almeida
COMPORTAMENTO E MOTILIDADE DA BACTÉRIA MAGNETOTÁCTICA
‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ SOB CAMPO MAGNÉTICO
APLICADO
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências (Microbiologia), Instituto de Microbiologia
Prof. Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro,
como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de
Mestre em Ciências Biológicas (Microbiologia)
Orientador: Drª. Carolina Neumann Keim
Co-orientador: Dr. Ulysses Garcia Casado Lins
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE MICROBIOLOGIA PROF PAULO DE GÓES
RIO DE JANEIRO
MARÇO DE 2009
Almeida, Fernando Pereira de
Comportamento e motilidade da bactéria magnetotáctica ‘Candidatus
Magnetoglobus multicellularis’ sob campo magnético aplicado / Fernando
Pereira de Almeida – Rio de Janeiro, 2009.
v, 106p
Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas)
Universidade Federal do Rio de Janeiro/ Instituto de Microbiologia Prof.
Paulo de Góes, 2009.
Orientador: Carolina Neumann Keim
Referências bibliográficas: 130
1. Mobilidade bacteriana 2. Bactérias magnetotácticas 3. ‘Candidatus
Magnetoglobus Multicellularis’
I. Carolina Neumann Keim. II. UFRJ, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo
de Góes, Mestrado em Ciências Biológicas. III. Comportamento e motilidade
da bactéria magnetotáctica ‘Candidatus Magnetoglobus Multicellularis’ sob
campo magnético aplicado.
II
Fernando Pereira de Almeida
COMPORTAMENTO E MOTILIDADE DA BACTÉRIA MAGNETOTÁCTICA
‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ SOB CAMPO MAGNÉTICO
APLICADO
Rio de Janeiro, 31 de Março de 2009.
(Orientadora: Carolina Neumann Keim, doutora, IMPPG).
(Examinador: Henrique Gomes de Paiva Lins de Barros, doutor, IMPPG).
(Examinador: Gilberto Weissmuller, doutor, IBCCF).
(Examinador: Daniel Acosta Avalos, doutor, CBPF)
(Revisor: Nathan Bessa Viana, doutor, IF-UFRJ)
III
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Biologia e
Ultraestrutura de Procariotos, Departamento de Microbiologia Geral,
Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, Centro de Ciências da
Saúde (CCS), Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação
da Profª Carolina Neumann Keim e co-orientação do Prof. Ulysses Garcia
Casado Lins.
IV
V
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus e a todas as pessoas que de alguma forma
ajudaram no desenvolvimento dessa dissertação. Espero conseguir
lembrar todas elas nesse momento tão importante da minha vida.
Agradeço aos meus pais, “Seu Wilson” e “Dona Judite”, as pessoas
mais importantes na minha vida.
Às minhas tias Neuza e Nenzinha, por toda a ajuda e carinho nos
momentos difíceis pelos quais minha mãe passou nesse último ano.
Aproveito para dedicar essa dissertação aos meus tios José e Heitor, que
faleceram recentemente. É grande a saudade.
À minha orientadora, Profª Carolina Keim, por todo apoio,
incentivo e compreensão ao longo desses últimos anos.
Ao Prof. Nathan Viana, por ter sido o revisor e um co-orientador
“não-oficial” dessa dissertação. Sua ajuda foi imprescindível para a
realização desse trabalho.
Ao Prof. Ulysses Lins, por ter me recebido em seu laboratório e
pela sua colaboração ao longo da dissertação.
Ao Prof. Marcos Farina, pelas importantes contribuições ao longo
de todo o mestrado, e por todo o tempo de convivência e aprendizado
que tive em seu laboratório.
À Professora Darci Esquivel, minha primeira orientadora, e aos
professores Henrique Lins de Barros, Eliane Wajnberg e Daniel Avalos,
todos sempre dispostos a ajudar.
À Professora Thaís Souto Padrón, pela grande ajuda no processo
de aprovação da banca examinadora.
À Drª Leida Abraçado, pela ajuda com as bobinas e com a “parte
física” da dissertação.
VI
Aos meus companheiros do LABUP, Drª. Juliana Martins, Karen
Silva, Thais Silveira, Fernanda Abreu, Julia Albuquerque, Herval, Iamé,
Gisele, Bianca, Tamires, Roberta e Daniele. Obrigado pela amizade e
companheirismo. Todos vocês fazem do LABUP um lugar muito
prazeroso de se trabalhar.
Aos meus ex-colegas do Laboratório de Biomineralização, Mair
Oliveira, Leonardo Tavares, Rachel Leal e Leonardo Andrade.
Ao Sr. Carlos Van Der Ley e ao Sr. Osmani Bento da Silva pela
ajuda na confecção das bobinas.
Aos meus colegas de trabalho do CIEP-341 Anne, Patrícia, Priscila,
Graça, Lúcia, Sônia, Juraci, Lucimere, Alex, Laudicéia, Valcira, Cilas,
Paula e Carlos pelo incentivo, amizade e companheirismo. Vocês são o
maior exemplo de como a rede pública de ensino, apesar das péssimas
condições de trabalho, ainda conta com profissionais competentes e
dedicados.
Aos meus amigos Maron, Adriana, Carolina, Luiz, Amanda, e
Rodrigo pelas conversas jocosas às sextas-feiras no quiosque do china.
Aos membros da banca examinadora, por aceitar participar da
minha avaliação e pela compreensão em relação ao pouco tempo entre
a entrega da dissertação e a defesa.
À SEEDUC por pagar o meu salário.
VII
Fernando Pereira de Almeida
COMPORTAMENTO E MOTILIDADE DA BACTÉRIA MAGNETOTÁCTICA
‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ SOB CAMPO MAGNÉTICO
APLICADO
Orientador: Profª. Drª. Carolina Neumann Keim
Co-orientador: Prof. Dr. Ulysses Garcia Casado Lins
Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade
Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do
título de Mestre em Ciências Biológicas.
‘Candidatus
Magnetoglobus
multicellularis’
é
uma
bactéria
magnetotáctica multicelular composta por 18 ± 4 células Gramnegativas. Dentro das células, há estruturas intracelulares compostas
por
cristais
magnéticos
envoltos
por
membranas
biológicas
denominadas magnetossomos. As células são organizadas em um
arranjo radial, que resulta em uma estrutura esférica onde cada célula
encontra-se em íntimo contato com as células vizinhas e apresenta uma
face em contato com um compartimento interno acelular e uma face em
contato com o ambiente apresentando múltiplos flagelos. ‘Candidatus
Magnetoglobus multicellularis’ move-se como uma unidade ao longo de
linhas de campo magnético. O alinhamento do organismo às linhas de
campo se dá de forma passiva, devido ao torque exercido pelo campo
magnético sobre os magnetossomos, enquanto a natação se deve à
rotação ativa dos flagelos. Além do movimento avante, ‘Candidatus
Magnetoglobus multicellularis’ pode ainda realizar rápidas excursões no
sentido inverso, seguido de movimento avante (escape motility). Os
objetivos do presente trabalho foram (i) o desenvolvimento de uma
metodologia para estudar as trajetórias helicoidais de microrganismos,
(ii) a quantificação dos parâmetros que descrevem a natação em
trajetórias helicoidais de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ sob
ação de diferentes campos magnéticos aplicados e (iii) a observação do
efeito de luz ultravioleta sobre a motilidade destes microrganismos. A
metodologia aplicada, baseada em vídeo-microscopia e processamento
de imagem, permitiu a análise de um grande número de trajetórias. As
trajetórias que observamos são bastante alongadas para as bactérias na
presença dos campos magnéticos aplicados neste trabalho. Estas
trajetórias alongadas sugerem uma otimização do movimento avante. A
comparação dos dados obtidos neste trabalho com os dados das
trajetórias de outros procariotos de tamanho similar sugere que a forma
das trajetórias depende do tamanho e/ou disposição dos flagelos na
superfície dos microrganismos. O presente trabalho também analisou o
VIII
efeito da aplicação de pulsos de laser ultravioleta sobre ‘Candidatus
Magnetoglobus multicellularis’. Indivíduos diretamente atingidos pelo
pulso de laser perderam a sua integridade estrutural, passando a
apresentar grupos de células destacadas do arranjo esférico. Um
segundo efeito observado foi uma resposta coletiva de “escape motility”
nos demais microrganismos não diretamente atingidos pelo pulso de
laser. Essa resposta coletiva desapareceu após o terceiro pulso de laser
indicando que houve adaptação ao estímulo, o que levou à hipótese de
que essa resposta seja uma reação de fototactismo negativo.
Palavras-chave: 1. Magnetotaxia 2. Bactérias magnetotácticas 3.
‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ 4. Vídeo-microscopia 5.
Motilidade bacteriana
Rio de Janeiro
Março de 2009
IX
Fernando Pereira de Almeida
COMPORTAMENTO E MOTILIDADE DA BACTÉRIA MAGNETOTÁCTICA
‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ SOB CAMPO MAGNÉTICO
APLICADO
Orientador: Profª. Drª. Carolina Neumann Keim
Co-orientador: Prof. Dr. Ulysses Garcia Casado Lins
Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade
Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do
título de Mestre em Ciências Biológicas.
‘Candidatus
Magnetoglobus
multicellularis’
is
a
multicellular
magnetotactic prokaryote (MMP) composed by 18 ± 4 Gram-negative
cells. In the cells, there are intracellular structures composed of
magnetic crystals enveloped by biological membranes, called
magnetosomes. The cells are organized in a radial arrangement that
results in a spherical shape where each cell has close contact with the
adjacent cells and present a face in contact with an internal non-cellular
compartment and a face in contact with the environment, displaying
multiple flagella. ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ moves as a
unit along magnetic field lines. The alignment of organism to the
magnetic field lines is passive, due to the torque exerted by the
magnetic field on the magnetosomes, while swimming is due to the
active flagella rotation. In addition to the forward movement,
‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ can also perform fast
excursions backwards, followed by a forward movement (escape
motility). The aim of this work were (i) to develop a method to study the
helical trajectories of microorganisms, (ii) to quantify the parameters
that describe the helical swimming of ‘Candidatus Magnetoglobus
multicellularis’ and (iii) to observe the effects of ultraviolet light on the
motility of these microorganisms. The methodology applied in this work,
based on video microscopy and image analyses, enabled the analyses of
a large number of trajectories. The elongated trajectories suggest that
the forward movement is optimized. Comparison of the data obtained in
this work with data of the trajectories of other prokaryotes of similar
size suggests that the shape of the trajectories depends on the size
and/or distribution of flagella on the surface of the microorganisms. The
present work also analyzed the effect of ultraviolet laser pulses on
‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’. Individuals hit directly by the
laser lose their structural integrity, presenting groups of cells detached
from the spherical array. A secondary effect observed was a collective
response similar to the escape motility in the microorganisms not directy
X
hit by the laser. This collective response disappeared after the third
pulse of laser, suggesting that there was adaptation to the stimulus,
which lead to the hypothesis that this is a negative fototactism reaction.
Key-words: 1. Magnetotaxis 2.Magnetotactic bacteria 3.’Candidatus
Magnetoglobus multicellularis’ 4.videomicroscopy 5.Bacterial motility
Rio de Janeiro
March, 2009
XI
LISTA DE ABREVIATURAS
‘Ca. Magnetoglobus Multicellularis – ‘Candidatus Magnetoglobus
multicellularis’
A – Raio das Trajetórias Helicoidais
D – Declinação do campo geomagnético
DIC – Contraste por Interferência Diferencial
E. coli – Escherichia coli
F – Intensidade total do campo geomagnético
H - Intensidade horizontal do campo geomagnético
I – Inclinação do campo geomagnético
IF – Infravermelho
LPS – Lipopolissacarídeo
MMA – Multicellular Magnetotactic Aggregate
MMO – Multicellular Magnetotactic Organism
MMP – Multicellular Magnetotactic Prokaryote
Nd-YAG – Laser de Neodymium-Doped Yttrium Aluminium Garnet
nm – Nanômetro
NS – Bactéria magnética north-seeking
nT – Nanotesla
PVC – Poli-cloreto de vinila
SS – Bactéria magnética south-seeking
t – Tempo
UV – Ultravioleta
V0 – Velocidade inicial
Vt – Velocidade tangencial
X – Componente norte da intensidade horizontal do campo
geomagnético
X0 – Posição inicial no eixo X
Y – Componente leste da intensidade horizontal do campo geomagnético
Y0 – Posição inicial no eixo Y
Z – Intensidade vertical do campo geomagnético
Z0 – Posição inicial no eixo Z
θ- Ângulo entre a velocidade angular e a velocidade instantânea
λ – Comprimento de onda / passo da hélice
µm – Micrômetro
ν – Velocidade de natação
Τ – Período das trajetórias helicoidais
υ – Velocidade Instantânea
Φ – Fase arbitrária
ω – Velocidade Angular
XII
XIII
1. INTRODUÇÃO.......................................................................... 1 1.1. FLAGELO BACTERIANO ........................................................................................................................ 3 1.2. QUIMIOTAXIA ....................................................................................................................................... 6 1.3. FOTOTAXIA ........................................................................................................................................... 8 1.4. BIOFÍSICA DO MOVIMENTO DE MICRORGANISMOS ........................................................................... 9 1.5. MOVIMENTO HELICOIDAL ................................................................................................................. 11 1.6. CAMPO GEOMAGNÉTICO .................................................................................................................... 12 1.7. BACTÉRIAS MAGNETOTÁCTICAS........................................................................................................ 14 1.8. MAGNETOSSOMOS E MAGNETOTAXIA .............................................................................................. 18 1.9. MAGNETO-AEROTAXIA ....................................................................................................................... 19 1.10. PROCARIOTOS MAGNETOTÁCTICOS MULTICELULARES .................................................................. 27 1.11. CARACTERÍSTICAS GERAIS DA BACTÉRIA MAGNETOTÁCTICA MULTICELULAR ‘CANDIDATUS
MAGNETOGLOBUS MULTICELLULARIS’....................................................................................................... 28 2. OBJETIVOS ........................................................................... 33 2.1. OBJETIVO GERAL ......................................................................................................................... 33 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS......................................................................................................... 33 3. MATERIAIS E MÉTODOS........................................................ 34 3.1. COLETA E CONCENTRAÇÃO MAGNÉTICA DE ‘CANDIDATUS MAGNETOGLOBUS MULTICELLULARIS’
..................................................................................................................................................................... 34 3.2. PRODUÇÃO DE CAMPO MAGNÉTICO APLICADO PARA EXPERIMENTOS DE VÍDEO-MICROSCOPIA. . 36 3.3. VÍDEO-MICROSCOPIA DAS TRAJETÓRIAS DE ‘CANDIDATUS MAGNETOGLOBUS MULTICELLULARIS’
SOB CAMPO MAGNÉTICO APLICADO ........................................................................................................... 39 3.4. AVALIAÇÃO DA RESPOSTA DE ‘CANDIDATUS MAGNETOGLOBUS MULTICELLULARIS’ A PULSOS DE
LASER ULTRAVIOLETA E A LUZ ULTRAVIOLETA.......................................................................................... 40 4. RESULTADOS ........................................................................ 43 4.1. TRAJETÓRIAS HELICOIDAIS DE ‘CANDIDATUS MAGNETOGLOBUS MULTICELLULARIS’ SOB CAMPO
MAGNÉTICO APLICADO ................................................................................................................................ 43 4.2. RESPOSTA DE ‘CANDIDATUS MAGNETOGLOBUS MULTICELLULARIS’ A PULSOS DE LASER
ULTRAVIOLETA ............................................................................................................................................. 45 PRANCHA 1 ......................................................................................................................................... 48 PRANCHA 2 ......................................................................................................................................... 51 PRANCHA 3 ......................................................................................................................................... 54 PRANCHA 4 ......................................................................................................................................... 57 PRANCHA 5 ......................................................................................................................................... 60 PRANCHA 6 ......................................................................................................................................... 63 PRANCHA 7 ......................................................................................................................................... 66 PRANCHA 8 ......................................................................................................................................... 69 PRANCHA 9 ......................................................................................................................................... 72 PRANCHA 10 ...................................................................................................................................... 75 PRANCHA 11 ...................................................................................................................................... 78 5. DISCUSSÃO .......................................................................... 81 5.1. VANTAGENS E DESVANTAGENS DA NOVA METODOLOGIA DESENVOLVIDA PARA O ESTUDO DO
MOVIMENTO DE MICRORGANISMOS ........................................................................................................... 81 5.2. QUANTIFICAÇÃO DOS PARÂMETROS DAS TRAJETÓRIAS HELICOIDAIS DE ‘CANDIDATUS
MAGNETOGLOBUS MULTICELLULARIS’ NOS DOIS DIFERENTES CAMPOS MAGNÉTICOS APLICADOS, E
SUAS IMPLICAÇÕES PARA O MOVIMENTO .................................................................................................. 85 XIV
5.3. COMPARAÇÃO DO MOVIMENTO DE ‘CANDIDATUS MAGNETOGLOBUS MULTICELLULARIS’ COM O DE
OUTRAS BACTÉRIAS .................................................................................................................................... 90 5.4. RESPOSTA DE ‘CANDIDATUS MAGNETOGLOBUS MULTICELLULARIS’ A PULSO DE LASER E LUZ
ULTRAVIOLETA. ........................................................................................................................................... 94 6. CONCLUSÕES ........................................................................ 97 7. BIBLIOGRAFIA ................................................................... 100 XV
XVI
1. INTRODUÇÃO
As bactérias podem interagir de diversas formas com o ambiente,
tanto o alterando quanto estando sujeitas às suas condições físicoquímicas. O resultado de quatro bilhões de anos de evolução dos
organismos procariotos gerou uma diversidade de aproximadamente
7000 espécies reconhecidas, pertencentes aos domínios Bacteria e
Archaea,
número
que
pode
chegar
a
centenas
de
milhares
se
considerarmos as espécies ainda não descritas (GARRITY, LIBUM & BELL
2005; MADIGAN & MARTINKO, 2006).
Tamanha quantidade de espécies se reflete na grande diversidade
metabólica observada entre os microrganismos, e na imensa variedade
de nichos ecológicos que tais seres podem ocupar. Diferentes espécies
necessitam de diferentes nutrientes e condições ambientais para a sua
sobrevivência, e tais fatores podem variar no espaço de maneira
relevante,
mesmo
em
dimensões
tão
pequenas
quanto
poucos
micrômetros (MADIGAN & MARTINKO, 2006).
A
capacidade
autônoma
de
deslocamento
observada
em
indivíduos dos mais diferentes grupos taxonômicos constitui uma das
características mais fundamentais da vida, tendo crucial importância nos
processos ecológicos e evolutivos (NATHAN, 2008). A capacidade de
deslocamento a favor ou contra um estímulo presente no meio pode
significar a diferença entre a sobrevivência e a morte de um
microrganismo (MADIGAN & MARTINKO, 2006).
As bactérias podem apresentar mecanismos de locomoção que
lhes permitem explorar diferentes regiões do meio onde se encontram,
proporcionando a busca e posicionamento em locais que possuam os
nutrientes e condições ambientais necessárias à sua existência. A
capacidade de movimentação pode, ainda, evitar a predação das
bactérias por outros microrganismos. Nesse sentido, a velocidade de
deslocamento e o padrão de natação “run and reversal” observado em
bactérias marinhas seriam exemplos de parâmetros determinantes na
prevenção da predação (MITCHELL et al., 1995; JÜRGENS & MATZ,
2002).
O tamanho pequeno dos organismos procariotos, que torna difícil
a percepção de gradientes físico-químicos ao longo do seu corpo (no
caso uma ou poucas células), análises teóricas estimam o limite de
tamanho de um microrganismo para percepção espacial em menos de 1
µm. Contudo, a maioria das bactérias se orienta no meio ambiente
comparando o status físico e/ou químico do meio em função do tempo.
Isso significa que, à medida que se desloca, a bactéria compara a
presente condição do meio com aquela percebida em um passado
recente (DUSENBERY, 1998).
A vantagem em possuir capacidade de movimento ativo se torna
explícita quando consideramos a velocidade de difusão de moléculas em
meio aquoso implícito ao movimento Browniano. Uma molécula se
desloca ao longo de uma bactéria de 1 µm em 0,5 ms, mas demora
1000 s para se deslocar 1mm no meio. Isso porque o tempo de
deslocamento aumenta com o quadrado da distância (MITCHELL &
KOGURE, 2006).
Já foram descritos diferentes mecanismos pelos quais as bactérias
se deslocam. Muitas bactérias são capazes de se movimentar sobre
superfícies sólidas por meio de gliding (deslizamento). Outras possuem
mecanismos que permitem regular a sua posição em colunas d’água por
meio de vesículas gasosas. Entretanto, a grande maioria das bactérias
se desloca devido à rotação de flagelos (MADIGAN & MARTINKO, 2006).
2
1.1. Flagelo Bacteriano
O flagelo bacteriano é uma estrutura protéica com formato
helicoidal, constituída por subunidades de flagelina, uma proteína
codificada pelo gene FlgC. A forma do filamento é determinada em parte
pela estrutura e arranjo das moléculas de flagelina e em parte pela
reação à rotação da estrutura. A figura 1 mostra a estrutura típica de
um flagelo de bactéria Gram-negativa.
A base do flagelo difere do filamento flagelar. Trata-se de uma
estrutura mais espessa, denominada gancho, formada pelas flagelinas
associadas ao gancho, codificadas pelos genes FlgK, FlgL e FliD. Tanto o
flagelo quando o gancho são estruturas externas à célula.
O flagelo é conectado através do gancho a um motor protéico
ancorado à parede celular e à membrana plasmática. O motor consiste
em uma haste que atravessa quatro anéis associados a diferentes
estruturas do envoltório celular (BERG, 2003).
As bactérias Gram-negativas apresentam parede celular contendo
pequenas quantidades de peptídeoglicano e uma membrana externa,
constituída de lipopolissacarídeo, lipoproteínas e outras macromoléculas
complexas. Nessas bactérias, o flagelo é conectado ao envoltório celular
de forma que o anel mais externo (anel L) encontra-se associado à
camada de lipopolissacarídeo (LPS). Abaixo, encontra-se o anel P,
ancorado à camada de peptideoglicanas da parede celular. O anel MS
localiza-se na membrana plasmática e o anel C, o mais interno, situa-se
na interface entre a membrana plasmática e o citoplasma (Figura 1).
O motor do flagelo bacteriano é constituído por aproximadamente
20 tipos de proteínas e possui dimensões que não excedem 50 nm. O
motor pode apresentar rotação em frequências da ordem de 100 Hz,
3
cujo torque causa a rotação do flagelo, estrutura responsável pelo
deslocamento da célula (BERG, 2003).
Flanqueando os anéis mais internos do motor (MS e C), existe
uma série de proteínas motoras (Mot), responsáveis pela rotação do
flagelo; e um conjunto de proteínas Fli, cuja função é determinar o
sentido de rotação do motor em resposta a estímulos intracelulares.
Os anéis C, MS e P constituem o corpo basal, atuando como um
rotor. Em volta do corpo basal, as proteínas Mot geram o torque para a
rotação da estrutura. A fonte de energia que move o motor flagelar
provém da passagem de prótons através da membrana plasmática e
através das proteínas Mot associadas aos anéis MS e C. A forma como a
rotação do motor realmente ocorre ainda não é conhecida. Um modelo
proposto para esse fenômeno, “turbina de prótons” (Figura 2), sugere
que a passagem de prótons pelas proteínas Mot exerça forças
eletrostáticas nas cargas das proteínas do rotor dispostas de forma
helicoidal. A atração entre cargas positivas e negativas causaria, então,
a rotação do corpo basal. (BERG, 2003; MADIGAN & MARTINKO, 2006).
4
Figura 1: Estrutura do flagelo de bactérias Gram-negativas. O flagelo é conectado à
superfície da célula por um gancho ligado à haste do motor rotatório. Associado ao LPS
se encontra o anel mais externo (L). O anel P é ancorado à camada de peptídeoglicano
da parede celular. O anel S é associado à membrana plasmática e o anel C encontra-se
na face interna da membrana plasmática, em contato com o citoplasma. Os anéis P,
MS e C constituem o corpo basal, que funciona como um rotor que é impulsionado pelo
fluxo de prótons através das proteínas Mot. Entre os anéis MS e C encontram-se
proteínas Fli, cuja função é alternar o sentido de rotação do motor em resposta a sinais
intracelulares (Adaptado de Madigan & Martinko, 2009).
Figura 2: Modelo de “turbina de prótons” proposto para explicar a rotação do flagelo.
O fluxo de prótons pelas proteínas Mot exerceriam forças nas cargas presentes nos
anéis MS e C, causando a rotação da estrutura (Adaptado de Madigan & Martinko,
2009).
5
1.2. Quimiotaxia
Os estímulos que direcionam as bactérias a favor ou contra um
determinado micro-ambiente podem ser de natureza física ou química.
Os exemplos mais relatados na literatura são as respostas à luz
(fototaxia) e a substâncias químicas (quimiotaxia).
A
quimiotaxia
consiste
no
movimento
ativo
de
células
ou
organismos em resposta a substâncias presentes no meio. Esse
deslocamento pode ocorrer tanto a favor quanto contra o estímulo
químico, onde a natureza da substância e a espécie ou tipo celular em
questão determinam o tipo de resposta (EISENBACH, 2007).
Grande parte dos estudos relacionados à quimiotaxia tem como
modelo a bactéria Escherichia coli. Trata-se de uma bactéria comum do
trato
intestinal
humano
que
tem
forma
de
bastão
e
possui
aproximadamente seis flagelos emergindo de pontos aleatórios da
membrana celular.
Cada flagelo é propelido por um motor protéico rotatório,
ancorado à membrana plasmática e parede celular. Quando os flagelos
giram em sentido anti-horário, tendo como referência o plano da
superfície onde o flagelo se insere, ocorre a formação de um tufo
sincronizado de flagelos, que propele a célula avante, em trajetórias
aproximadamente retilíneas (run) (TUNER, RYU & BERG, 2000). Este
padrão de movimento não constitui uma trajetória perfeitamente
retilínea devido à susceptibilidade da bactéria ao movimento browniano
rotacional e translacional, causados pela colisão da bactéria com
moléculas presentes no fluido circundante. O movimento browniano é
desprezível
quando
comparado
com
o
movimento
de
natação
translacional da célula. Contudo, o movimento browniano é significativo
6
para o movimento rotacional, causando dispersão angular da trajetória
(MITCHELL & KOGURE, 2006).
Quando um ou mais flagelos giram em sentido horário, o tufo de
flagelos se desfaz e a célula passa a se mover em padrão errático,
denominado tumble, que causa a reorientação da célula em nova
direção devido à energia térmica do meio. E. coli realiza quimiotaxia
executando runs e tumbles alternadamente (TUNER, RYU & BERG,
2000).
E. coli possui dimensões muito restritas para detectar diferenças
espaciais na concentração das substâncias dispersas no meio. Contudo,
é capaz de realizar comparações temporais à medida que nada. A
bactéria compara a concentração de substâncias químicas atrativas ou
repelentes com aquelas presenciadas há poucos instantes. Isso permite
à E. coli modular a taxa de runs e tumbles em função da diferença de
concentração da substância presente no meio.
Caso E. coli esteja presente em um gradiente químico atrativo, os
movimentos randômicos existentes em situações de ausência de
estímulos ambientais tornam-se movimentos não aleatórios. À medida
que a bactéria avança para zonas com maior concentração da
substância atrativa, as corridas tornam-se mais longas e os tumbles
menos
frequentes.
Consequentemente,
a
tendência
é
que
o
microrganismo se desloque para regiões de maior concentração da
substância atrativa. Caso o gradiente seja de uma substância repelente,
o
mesmo
mecanismo
é
aplicado.
Entretanto,
é
a
redução
da
concentração da substância que promove o aumento das corridas e a
redução dos tumbles (LOCSEI, 2007).
7
1.3. Fototaxia Diversos microrganismos apresentam alteração no padrão de
natação em resposta à condição de luz do ambiente. Existem três tipos
conhecidos de resposta à luz. A resposta escotofóbica é caracterizada
por uma “fobia ao escuro”: a bactéria entra em tumble, cessa ou reverte
a direção de natação quando percebe uma redução na intensidade de
luz do meio. A fotocinese é caracterizada por uma alteração na taxa de
motilidade do microrganismo devido a diferenças na intensidade de luz
do meio. A fototaxia propriamente dita envolve o movimento orientado
da célula a favor ou contra uma fonte de luz (OBERPICHLER et al.,
2008).
A priori, a vantagem da fototaxia seria permitir aos organismos
fototróficos se posicionar em regiões onde o comprimento de onda e a
intensidade
da
luz
recebida
sejam
os
mais
adequados
para
a
fotossíntese. Isso pode ser observado quando se ilumina com um
espectro de luz uma lâmina de microscópio com bactérias fototróficas.
As bactérias se acumulam na região de máxima absorção de seus
pigmentos fotossintetizantes (MADIGAN & MARTINKO, 2006).
Entretanto, a resposta à luz pode ser observada em espécies
heterotróficas. E. coli responde a pulsos intensos de luz azul realizando
tumbles. A fototaxia em E. coli parece estar relacionada com a síntese
de ferroquelatase, a enzima que catalisa a etapa final de incorporação
de Fe+2 pela protoporfirina IX (YANG, INOKUCHI & ADLER, 1995). A
mutação no gene que codifica a ferroquelatase impede a formação do
grupamento heme (molécula orgânica com estrutura em anel associada
a íons de ferro), causando acúmulo de protoporfirina IX na célula. Cepas
mutantes para o gene hemH que codifica a ferroquelatase respondem à
luz azul (396-450nm) realizando “tumbles”. A retirada da luz azul faz
com que as células passem a apresentar “runs”. As cepas mutantes para
8
hemH são aproximadamente 100 vezes mais sensíveis à luz azul que as
cepas selvagens (YANG et al., 1996).
1.4. Biofísica do movimento de microrganismos
O deslocamento dos microrganismos em meio aquático possui
limitações físicas distintas das observadas na natação de organismos
superiores, como peixes e mamíferos aquáticos. O deslocamento dos
microrganismos na água é regido pela viscosidade do meio. A inércia,
fator relevante na natação de organismos de maior dimensão, torna-se
desprezível para microrganismos como as bactérias.
Para que um microrganismo seja propelido em meio aquoso, é
necessária a atuação ativa e constante de apêndices de superfície, como
cílios e flagelos. A interrupção do batimento ou rotação dessas
estruturas causa a interrupção imediata do movimento avante. Por outro
lado, mesmo que o microrganismo não possua cílios ou flagelos, haverá
movimento. Microrganismos em suspensão em meio aquoso estão
sujeitos à movimentação passiva, de forma randômica, devido ao
movimento térmico das moléculas de água, fenômeno conhecido como
movimento browniano.
Se considerarmos uma população de células se difundindo a partir
de um ponto sobre uma reta, em apenas uma dimensão, observamos
que com o passar do tempo, cada indivíduo da população se afasta cada
vez mais de sua posição inicial, gerando uma curva de distribuição de
posições que é Gaussiana. Com o passar do tempo, a largura da
Gaussiana aumenta. Este tipo de distribuição pode ser caracterizado
pela medida do desvio quadrático médio das partículas, dado quando se
considera apenas uma dimensão por: < r 2 >= 2Dt , onde t é o tempo
decorrido e D é o coeficiente de difusão, que depende do tamanho e da
9
forma da célula, dentre outros fatores, e < > significa uma média
realizada sobre todos os indivíduos da população. Por exemplo, para
uma bactéria com raio de 1µm em meio aquoso à 37ºC, o coeficiente de
5 ×10−9 cm2 / s
difusão é igual a
Quando consideramos duas e três
dimensões, temos < r 2 >= 4Dt e < r 2 >= 6 Dt , respectivamente.
Dada a natureza randômica e lenta do deslocamento celular em
meio aquoso devido à energia térmica, a capacidade de natação através
de propulsão proporcionada por estruturas de superfície celular constitui
uma importante vantagem para a sobrevivência dos microrganismos
(BRAY, 1992).
Quando um microrganismo nada propelido por cílios ou flagelos,
ele se depara com duas forças de resistência ao movimento avante: o
arrasto causado pela viscosidade do meio e a resistência inercial do
fluido.
O
Número
de
Reynolds
é
um
parâmetro
adimensional
determinado pela razão entre as forças de inércia e de viscosidade do
meio (NOGUEIRA & LINS DE BARROS, 1995). Números de Reynolds
abaixo de 0,001 indicam que o movimento é influenciado basicamente
pela viscosidade do meio e que as forças inerciais são desprezíveis
(BRAY, 1992).
Para a natação de um dado organismo, o número de Reynolds
depende da dimensão do organismo, da velocidade de natação e da
densidade e viscosidade do meio líquido, sendo dado por:
Re =
f (inércia )
v 2 L2 ρ vLρ
(1)
=
=
η
f (vis cos idade )
vLη
Onde (L) é a dimensão linear do organismo, (v) é a velocidade, (ρ) é a
densidade e (η) a viscosidade do meio. Analisando a equação, temos
que para organismos com dimensões grandes (L grande), o número de
Reynolds também será grande. Nesse caso, o movimento terá grande
influência da inércia. Para o caso de microrganismos, cujas dimensões
são muito reduzidas, tem-se um número de Reynolds extremamente
10
baixo. Para uma bactéria de 1µm de comprimento nadando em meio
aquoso, o número de Reynolds é igual a 10-5, sendo o movimento
dominado pelas forças devido à viscosidade do meio.
Uma das conseqüências do movimento sob o regime de baixo
número de Reynolds é que o formato da célula não constitui nenhuma
vantagem em termos de hidrodinâmica, uma vez que isso só ocorre sob
regime inercial, onde a forma do organismo está relacionada com a
turbulência gerada durante o movimento (BRAY, 1992).
1.5. Movimento Helicoidal
A natação em trajetórias helicoidais é uma característica comum a
diversos microrganismos e células com dimensões entre 5 e 500µm
(JENNINGS 1901, 1904; CRENSHAW, 1993a), sendo observadas em
ciliados, flagelados, células germinativas de animais vertebrados e
invertebrados (CRENSHAW, 1993a). Jennings (1901) realizou a primeira
análise da cinemática do movimento helicoidal em microrganismos,
afirmando que a natação helicoidal envolve dois componentes de
rotação: um paralelo e outro perpendicular ao eixo de movimento. Tais
análises, entretanto, não forneceram uma descrição completa do
movimento helicoidal, nem tampouco discutiram suas consequências.
Organismos com natação em padrão helicoidal respondem a
estímulos do meio através do alinhamento do eixo da trajetória em
direção ao estímulo. A alteração da direção do eixo de natação se dá por
meio de alterações na velocidade rotacional (angular) em resposta ao
estímulo (BROKAW, 1958; CRENSHAW, 1993b).
Em situações onde uma face do organismo sempre aponta para o
eixo da hélice, tanto a velocidade translacional quanto a velocidade
rotacional sempre apontam para a mesma direção em relação ao corpo
11
do microrganismo ou alteram a direção somente em um plano em
relação ao corpo do organismo (CRENSHAW, 1993a).
Organismos que nadam em trajetórias helicoidais podem alterar a
direção de natação em resposta a estímulos do meio simplesmente
variando a velocidade rotacional em função da intensidade do estímulo.
Esse tipo de resposta consiste em uma taxia verdadeira: não há
componentes randômicos nesse mecanismo de orientação (CRENSHAW,
1993b).
Uma peculiaridade da resposta quimiotáctica ou fototáctica de
organismos com natação helicoidal é o fato de que a intensidade do
estímulo percebido sofre variação em função da espiral descrita pelo
microrganismo. Em organismos quimiotácticos com natação helicoidal, a
intensidade resultante do estímulo constitui uma função senoidal em
relação ao tempo. A taxa na qual o microrganismo gira em relação ao
seu eixo anterior-posterior é, por exemplo, proporcional à concentração
de uma substância presente no meio. A orientação pode ser a favor ou
contra
um
gradiente
químico,
dependendo
da
relação
entre
a
intensidade do estímulo e a velocidade rotacional (CRENSHAW, 1993c).
1.6. Campo geomagnético
A terra atua como um grande magneto esférico, sendo envolto por
um campo magnético que varia no tempo e no espaço. Considerando-se
a terra como um grande dipolo magnético, o eixo desse dipolo encontrase desalinhado com o eixo de rotação da terra em aproximadamente
11º. Isso significa que os pólos norte e sul magnético e os pólos norte e
sul geográfico não se sobrepõem.
A qualquer momento ou local, o campo geomagnético pode ser
caracterizado por uma direção e intensidade mensuráveis. Os principais
12
parâmetros que caracterizam o campo magnético são a declinação (D),
a intensidade horizontal (H) e a intensidade vertical (Z). A partir desses
três elementos, todos os demais parâmetros do campo geomagnético
podem ser calculados (Figura 3).
O campo geomagnético varia em diferentes locais da superfície do
planeta. Nos pólos geomagnéticos, a agulha de uma bússola tende a
permanecer na vertical em relação à superfície da terra: a intensidade
horizontal é igual a zero e a bússola não aponta a direção norte-sul (a
declinação é indefinida). No pólo norte magnético, a terminação norte
da bússola aponta para baixo. No pólo sul magnético, a ponta norte da
agulha aponta para cima. No equador magnético, a inclinação da agulha
é zero (a agulha permanece paralela ao eixo norte-sul geomagnético).
A caracterização completa do campo geomagnético se dá através
de
sete
parâmetros:
declinação
(D),
inclinação
(I),
intensidade
horizontal (H), componente norte (X) e componente leste (Y) da
intensidade horizontal, intensidade vertical (Z) e intensidade total (F).
Os parâmetros que descrevem a direção do campo magnético são
a declinação (D) e a inclinação (I), expressos em graus. A intensidade
do campo geomagnético total (F) é descrita pela componente horizontal
(H), pela componente vertical (Z) e pelas componentes norte (X) e leste
(Y) da intensidade horizontal. Essas componentes podem ser expressas
em unidades de Gauss ou, mais comumente, em nano-Tesla (1 Gauss =
105nT). A intensidade do campo geomagnético varia entre 25.000 e
65.000 nT (0,25 e 0,65 Gauss).
A declinação magnética é o ângulo entre o norte magnético e o
norte geográfico. A declinação é considerada positiva quando o ângulo
medido se encontra a leste do norte geográfico e é negativo quando se
encontra a oeste.
A inclinação magnética é o ângulo entre o plano horizontal e o
vetor do campo magnético total, sendo positivo quanto aponta em
13
direção ao chão (latitudes superiores à do equador magnético) e
negativo quando aponta para cima (latitudes inferiores à do equador
magnético) (National Oceanic and Atmospheric Administration - USA,
WWW.noaa.gov.br).
(b)
(a)
Figura 3: (A) Eixo de rotação da terra, o eixo do dipolo geomagnético e orientação
das linhas de campo geomagnético ao redor do globo terrestre. (B) Parâmetros do
campo geomagnético: campo geomagnético total (F), componente horizontal (H),
componente vertical (Z), componente norte (X) e leste (Y) da intensidade horizontal.
1.7. Bactérias magnetotácticas
Há pouco mais de trinta anos, um novo tipo de resposta
microbiana ao ambiente foi descrito por Richard P. Blakemore, então
aluno
de
graduação
em
microbiologia
na
Universidade
de
Massachusetts. Durante uma tentativa de isolar Spirochaeta plicatilis de
sedimentos pantanosos coletados em Woods Hole, no Estado de
Massachusetts
(EUA),
Blakemore
observou
microrganismos
que
nadavam persistentemente para um dos lados da gota de água e
sedimento observada ao microscópio óptico. Blakemore demonstrou
14
experimentalmente que tais bactérias respondiam ao campo magnético:
a
direção
para
a
qual
esses
microrganismos
nadavam
mudava
rapidamente quando um ímã era posicionado próximo à amostra
(BLAKEMORE, 1975).
A microscopia de transmissão desses microrganismos demonstrou
que tais bactérias apresentavam formato aproximadamente esférico,
com diâmetro médio de 1µm. Possuíam dois tufos de flagelos, cada qual
constituído por aproximadamente sete unidades, além de apresentar
duas cadeias citoplasmáticas contendo entre cinco e dez estruturas
eletrondensas de aspecto cristalino, cujo elemento predominante era o
ferro
(fato
demonstrado
através
de
microanálises
de
raios-X).
Blakemore cogitou a magnetita (Fe3O4) como mineral constituinte
dessas estruturas (BLAKEMORE, 1975), o que foi confirmado poucos
anos depois através de espectroscopia de Mössbauer de células
cultivadas (FRANKEL, BLAKEMORE & WOLFE, 1978).
Richard Blakemore usou pela primeira vez os termos “bactéria
magnetotáctica” e “magnetotaxia” em referência a bactérias que
respondem ao campo magnético e ao movimento de bactérias em
resposta ao campo magnético, respectivamente. Segundo Blakemore,
tais inclusões ricas em ferro atuariam como dipolos magnéticos,
conferindo
momento
magnético
às
células
e,
consequentemente,
orientando-as sob campos magnéticos (BLAKEMORE, 1975; FRANKEL,
WILLIAMS & BAZYLINSKI, 2007). Desde então, todos os trabalhos
relacionados a bactérias magnetotácticas se referem, de uma maneira
ou de outra, às idéias propostas por Blakemore para a magnetotaxia
(FRANKEL, WILLIAMS & BAZYLINSKI, 2007).
As bactérias magnetotácticas ocorrem na coluna d’água ou em
sedimentos alagados com estratificação química vertical, ocorrendo
predominantemente na interface de transição óxica-anóxica (zona de
transição entre regiões com e sem oxigênio dissolvido), em regiões
15
anóxicas ou em ambas (BAZYLINSKI et al., 1995; BAZYLINSKI &
MOSKOWITZ 1997; SIMMONS et al., 2004). Apresentam uma grande
diversidade de tipos morfológicos, como espirilos, vibriões, cocos,
bacilos
e
formas
multicelulares.
A
parede
celular
das
bactérias
magnetotácticas possui características similares às de bactérias Gramnegativas. Todas são propelidas por flagelos, cujo arranjo varia de
acordo com a espécie ou cepa, podendo ser monotríqueos polares
(flagelo emergindo em um dos pólos da célula), bipolares (emergindo
em dois pólos da célula) ou estar presente na forma lofotríquea (grupo
de flagelos emergindo de um pólo da célula) (BAZYLINSKI & FRANKEL
2004).
As bactérias magnetotácticas conhecidas até hoje se encontram no
domínio
Bacteria
e
são
associadas
a
diferentes
subgrupos
de
Proteobacteria e com o filo Nitrospira (SPRING & BAZYLINSKI, 2000;
SIMMONS et al., 2004). Todas possuem magnetossomos, estruturas
intracelulares contendo cristais magnéticos compostos pelo óxido de
ferro magnetita (Fe3O4) e / ou pelo sulfeto de ferro greigita (Fe3S4),
envoltos
por
uma
membrana
biológica
(GORBY,
BEVERIDGE
&
BLAKEMORE, 1988; BAZYLINSKI & FRANKEL, 2004; ABREU et al.,
2008). As bactérias produtoras de magnetita são encontradas tanto em
ambientes marinhos quanto em ambientes de água doce. Já as bactérias
magnéticas produtoras de greigita são encontradas somente em
ambientes com alguma influência marinha. Em ambientes marinhos
estratificados onde ambos os tipos de bactérias coexistem, as bactérias
produtoras de magnetita são encontradas no topo da quimioclina,
enquanto as produtoras de greigita ocorrem na base ou abaixo da
quimioclina (BAZYLINSKI et al., 1995; SIMMONS et al., 2004).
Os
cristais
biomineralizados
pelas
bactérias
magnetotácticas
possuem comprimento da ordem de 35 a 220 nm (BAZYLINSKI &
FRANKEL, 2004; McCARTNEY et al., 2001), e se encontram organizados
16
em
cadeias
paralelas
de
comprimentos
diversos,
algumas
vezes
formando feixes (HANZLIK et al., 1996) ou grupos planares (SILVA et
al., 2007).
Quando
observadas
ao
microscópio
óptico,
bactérias
magnetotácticas mortas, por exemplo, por fixação com vapor de
tetróxido de ósmio, não apresentam migração, embora as células não
aderidas à lâmina se alinhem passivamente a campo magnético aplicado
quando a direção deste é alterada. Isso demonstra que a natação da
bactéria de deve à rotação ativa dos flagelos (BLAKEMORE, 1975).
Devido à presença dos magnetossomos, as bactérias magnéticas
são alinhadas passivamente, enquanto se deslocam de maneira ativa
devido à rotação dos seus flagelos (BLAKEMORE, 1975). As velocidades
de natação reportadas na literatura para microrganismos dessa natureza
variam
de
40
a
1000
µm/s
(BLAKEMORE,
1975;
MARATEA
&
BLAKEMORE, 1981; MOENCH, 1988; COX et al., 2002). De maneira
geral, os espirilos magnéticos apresentam as menores velocidades de
natação (<100µm/s) (MARATEA & BLAKEMORE, 1981) e os cocos
magnéticos
apresentam
as
maiores
velocidades
(>100µm/s)
(BLAKEMORE, 1975; MOENCH, 1988; COX et al., 2002).
As bactérias magnetotácticas são de difícil isolamento e cultivo,
existindo atualmente poucas culturas puras desses microrganismos. A
maior
dificuldade
na
obtenção
de
culturas
puras
de
bactérias
magnetotácticas reside no fato destas serem microaerófilas obrigatórias
ou anaeróbias (BAZYLINSKI & FRANKEL 2004). Apesar disso, as
bactérias magnetotácticas são facilmente detectadas em amostras
coletadas do ambiente por meio de isolamento magnético (LINS et al.,
2003).
As espécies reconhecidas atualmente incluem Magnetospirillum
magnetotacticum MS-1 (MARATEA & BLAKEMORE, 1981; BLAKEMORE,
MARATEA & WOLFE, 1979; SCHLEIFER et al., 1991), Magnetospirillum
17
gryphiswaldense
(SCHLEIFER
et
al.,
1991),
Magnetospirillum
magneticum AMB-1 (MATSUNAGA, SAKAGUCHI & TADOKORO, 1991) e
Desulfovibrio magneticus (SAKAGUCHI, ARAKAKI & MATSUNAGA, 2002).
Existem
ainda
espécies
cultivadas,
mas
parcialmente
caracterizadas, como vibriões marinhos MV-1 e MV-2 (BAZYLINSKI,
FRANKEL & JANNASCH, 1988; MELDRUM et al., 1993a), cocos MC-1
(MELDRUM et al., 1993b) e espirilos MMS-1 (anteriormente MV-4)
(BAZYLINSKI & FRANKEL, 2000; MELDRUM et al., 1993b).
1.8. Magnetossomos e Magnetotaxia
As dimensões dos nanocristais magnéticos de magnetita (Fe3O4)
e/ou greigita (Fe3S4) biomineralizados pelas bactérias magnéticas, da
ordem de 35-120nm, caracteriza-os magneticamente como cristais de
domínio
simples.
Isso
significa
que
eles
atuam
como
dipolos
permanentes, alinhando-se a linhas de campos magnéticos de forma
semelhante à agulha de uma bússola.
Os cristais de magnetita ou greigita de domínio simples são
uniformemente magnetizados, possuindo máximo momento de dipolo
magnético por unidade de volume (FRANKEL, WILLIAMS & BAZYLINSKI,
2007). Os magnetossomos encontram-se intimamente associados a
filamentos de citoesqueleto (KOMEILI et al., 2006; SCHEFFEL et. al,
2006).
O torque exercido pela interação entre o dipolo magnético dos
magnetossomos e campos magnéticos externos causa o alinhamento
passivo da célula às linhas de campo, enquanto as células nadam devido
à propulsão gerada pela rotação dos seus flagelos (FRANKEL, WILLIAMS
& BAZYLINSKI, 2007).
18
Quando
observadas
ao
microscópio
óptico
sob
condições
ambientais de [O2] e sob a influência de campo magnético gerado por
um ímã ou por um par de bobinas eletromagnéticas, as bactérias
magnetotácticas nadam alinhadas ao campo magnético aplicado, em
trajetórias retilíneas ou helicoidais. Quando a direção do campo
magnético aplicado é alterada em 180º, as bactérias se reorientam,
realizando um “U-turn” ou “volta em U” (a bactéria altera a sua direção
de natação em 180°, passando a nadar no sentido oposto ao observado
antes da reversão do campo).
A organização dos magnetossomos em cadeias faz com que a
interação magnetostática entre os cristais resulte em um momento
magnético permanente para a cadeia como um todo (FRANKEL, 1984).
A direção da natação da bactéria seria resultado do torque exercido pela
interação do campo magnético externo com o momento magnético da
célula. Por outro lado, a energia térmica do meio atua como um fator de
perturbação
do
alinhamento
da
bactéria
durante
a
natação.
O
alinhamento médio da bactéria enquanto nada alinhada a um campo
magnético é dado pela razão entre a energia magnética e a energia
térmica do meio (FRANKEL, 1984).
1.9. Magneto-aerotaxia
O modelo originalmente proposto para a magnetotaxia baseava-se
em
dois
pressupostos:
que
todas
as
bactérias
magnetotácticas
possuiriam polaridade fixa em relação à direção de natação, e que todas
seriam microaerófilas (com crescimento apenas em concentrações de
oxigênio reduzidas em comparação às concentrações atmosféricas)
(BLAKEMORE 1975; BLAKEMORE & FRANKEL 1981). No hemisfério
norte, o vetor do campo magnético total é inclinado para baixo: as
19
linhas de campo apontam em direção à superfície da terra. No
hemisfério sul, o campo magnético aponta para o sentido inverso, para
cima. Isso significa que, para nadar para o fundo do sedimento, em
direção a menores [O2], bactérias no hemisfério norte nadam de forma
paralela ao campo magnético. No hemisfério sul, nadar em direção ao
sedimento significa nadar de forma antiparalela ao campo geomagnético
(FRANKEL, WILLIAMS & BAZYLINSKI, 2006).
As bactérias que nadam persistentemente em direção ao norte
magnético são denominadas NS (do inglês “North-seeking” - que nada
para o pólo norte magnético) enquanto as que nadam com orientação
antiparalela são demoninadas SS (“South-seeking” - que nada em
direção ao pólo sul magnético) (FRANKEL, WILLIAMS & BAZYLINSKI,
2006).
Segundo o modelo original proposto para a magnetotaxia, a
inclinação do campo magnético poderia guiar as bactérias verticalmente
no sedimento para regiões com concentrações de oxigênio reduzidas.
Uma vez alcançada tal região, presumia-se que as bactérias cessassem
a migração, aderindo-se ao sedimento até que houvesse alguma
alteração na concentração de oxigênio.
Esta teoria se apóia no fato de haver predominância no hemisfério
norte de bactérias magnetotácticas polares NS, e predominância de
bactérias magnetotácticas polares SS no hemisfério sul observadas sob
condições
aeróbias
(BLAKEMORE
1975;
BLAKEMORE,
FRANKEL
&
KALMIJN, 1980; NOGUEIRA & LINS DE BARROS, 1995). Contudo, a
descoberta de grandes populações de bactérias magnetotácticas na
coluna d’água em regiões de quimioclina de habitats marinhos, a
obtenção de culturas puras de bactérias microaerófilas obrigatórias e a
descoberta de populações de bactérias SS no hemisfério norte não
poderiam
ser
explicadas
pelo
modelo
original
proposto
para
a
magnetotaxia.
20
O modelo original proposto para a magnetotaxia não explicava
como bactérias na zona anóxica da coluna d’água se beneficiavam da
magnetotaxia e não explicava como cocos magnetotácticos polares
como MC-1 formavam bandas microaerófilas horizontais quando em
meio semi-sólido com gradiente de oxigênio, ao invés de se acumular e
crescer
no
fundo
do
tubo
(FRANKEL
et
al.,
1997;
SIMMONS,
BAZYLINSKI & EDWARDS, 2006).
Culturas puras de cocos magnetotácticos marinhos denominados
MC-1 formam bandas microaerófilas em capilar de vidro achatado com
gradiente de oxigênio e campo magnético aplicado. Estas bactérias são
capazes de migrar em ambas as direções do campo magnético, usando
tanto a resposta magnetotáctica quanto a resposta aerotáctica para se
posicionar em regiões onde a concentração de oxigênio é mais adequada
(FRANKEL et al., 1997).
Sob
observada
condições
ao
homogêneas
microscópio
de oxigênio
óptico),
células
(uma
de
gota
MC-1
d’água
nadam
persistentemente na mesma direção de sentido do campo magnético
aplicado, ou seja, apresentam comportamento NS. Quando o campo
magnético é revertido, as células realizam uma volta em U (u-turn) e
continuam a nadar paralelas ao campo aplicado.
Quando inseridas em um capilar de vidro com gradiente de
oxigênio, as células MC-1 formam bandas microaerófilas, nadando tanto
de forma paralela quanto de forma antiparalela ao campo aplicado,
revertendo o sentido de natação quando ultrapassam o limite da banda
(Figura 4c). Se o campo magnético for invertido, as células nadando em
cada direção realizam um u-turn, permanecendo na mesma direção
relativa ao campo antes da reversão, o que tende a desfazer a banda
em dois grupos de células que se afastam em sentidos opostos da
posição da banda original. Quando o campo é novamente revertido para
a orientação original, a banda microaerófila se refaz. Isso demonstra
21
que os cocos MC-1 podem nadar a favor ou contra o sentido do campo
magnético aplicado, mantendo seus dipolos magnéticos alinhados de
forma paralela ao campo em ambos os casos (FRANKEL et al., 1997).
Os mesmos experimentos de resposta ao gradiente de oxigênio e
à inversão do campo magnético foram realizados com Magnetospirillum
magnetotacticum, com resultados diferentes. Quando observados ao
microscópio óptico sob condições homogêneas de oxigênio e campo
magnético aplicado, M. magnetotacticum nada em ambas as direções do
campo aplicado, mesmo após a reversão do campo magnético. Quando
em capilares com gradiente de [O2], M. magnetotacticum formam
bandas microaerófilas, assim como o observado em MC-1. A reversão do
campo aplicado faz com que as células girem 180º. Entretanto, ao
contrário do observado em MC-1, a banda não se desfaz (Figura 4b)
(FRANKEL et al., 1997).
A
formação
de
bandas
microaerófilas
observada
em
M.
magnetotacticum é consistente com o mecanismo temporal-sensorial
(SEGALL et al., 1986; FRANKEL et al., 1997), onde a concentração de
oxigênio determina o sentido de rotação do flagelo. Para essa bactéria, o
campo magnético determina apenas o eixo do movimento, enquanto a
direção de natação é dada em função da resposta aerotáctica. Esse
comportamento foi denominado magneto-aerotaxia axial.
O comportamento observado em MC-1 não pode ser explicado por
uma resposta sensorial-temporal à concentração de oxigênio do meio,
uma vez que a banda se desfaz quando o sentido do campo magnético é
invertido. Assim como MC-1, a maioria das bactérias magnetotácticas
possui magnetotaxia polar (Figura 5). Isso significa que, sob condições
aeróbias, as bactérias NS nadam persistentemente de forma paralela ao
campo magnético, enquanto bactérias SS nadam persistentemente de
forma antiparalela (FRANKEL et al., 1997).
22
O modelo de “dois estados” proposto para as bactérias que
apresentam magneto-aerotaxia polar (Figura 6) sugere que, sob
concentrações de oxigênio acima da ideal, as células NS nadam de
forma paralela ao campo magnético devido à rotação dos flagelos no
sentido anti-horário (“estado oxidado”). Quando a célula presencia
concentrações de oxigênio inferiores à concentração ótima, a célula
reverte a rotação dos flagelos para o sentido horário, passando a nadar
com orientação antiparalela ao campo magnético (“estado reduzido”).
Os sentidos de rotação dos flagelos assumidos para a natação paralela
(anti-horário)
e
antiparalela
(horário)
ao
campo
magnético
são
arbitrários, porém consistentes com o sentido de rotação observado
para outras bactérias em que a rotação dos flagelos no sentido antihorário é observada na direção predominante de natação (FRANKEL et
al., 1997).
23
Figura 4: Distinção entre magneto-aerotaxia polar e axial. (a) Representação
esquemática de um fino capilar onde células crescidas em meio reduzido são inseridas,
resultando em um menisco (M) em ambas as extremidades. Um campo magnético (B)
da ordem de poucos Gauss é aplicado orientado de forma paralela ao capilar. O
oxigênio se difunde a partir das extremidades dos capilares, gerando gradiente de [O2]
que aumenta do centro do capilar em direção às extremidades. (b) A formação de
banda pela bactéria magnetoaerotáctica axial Magnetospirillum magnetotacticum
ocorre em ambas as extremidades. A rotação do campo em 180º após a formação da
banda faz com que as células girem 180º, contudo, sem desfazer as bandas. (C) A
formação de banda pela bactéria magnetoaerotáctica polar MC-1 ocorre somente na
extremidade do capilar onde o campo magnético e a [O2] possuem orientação oposta
entre si. A reversão do campo em 180º faz com que as células girem 180º e
continuem nadando com a mesma orientação observada antes da reversão do campo,
o que desfaz a banda (BAZYLINSKI & FRANKEL, 2004).
24
Figura 5: Representação da polaridade das bactérias magnetotácticas do tipo NS e
SS. Ambas as bactérias possuem dipolo magnético intrínseco orientado de forma
paralela ao campo magnético. Sob condições ambientais de [O2], a rotação do flagelo
no sentido anti-horário faz com que as bactérias NS nadem com orientação paralela ao
campo magnético, enquanto o mesmo sentido de rotação de flagelo nas bactérias SS
produz natação com orientação antiparalela ao campo magnético. Sob condições de
baixa [O2] o flagelo passaria a girar em sentido horário, invertendo o sentido de
natação em ambos os casos (Adaptado de FRANKEL, WILLIAMS & BAZYLINSKI 2006).
25
Figura 6: Esquema demonstrando como a magneto-aerotaxia polar manteria a
bactéria em ambientes microaeróbios, na zona de transição óxica-anóxica em colunas
d’água com estratificação química vertical. Tanto no hemisfério norte quanto no
hemisfério sul, bactérias submetidas a concentrações de oxigênio acima da ideal
apresentam natação avante em consequência da rotação do flagelo no sentido antihorário (“estado oxidado”). Isso faz com que as bactérias NS e SS nadem em direção
ao sedimento até concentrações de oxigênio abaixo da ideal (“estado reduzido”), o que
causa a reversão do sentido de rotação do flagelo para o sentido horário e,
consequentemente, faz com que as bactérias passem a nadar na direção oposta (em
direção à superfície) (Adaptado de FRANKEL, WILLIAMS & BAZYLINSKI 2006).
26
1.10. Procariotos magnetotácticos multicelulares Microrganismos magnetotácticos de natureza multicelular são
reportados na literatura desde a década de 80 (FARINA et al., 1983). Ao
longo dos anos, diferentes denominações foram atribuídas a tais
microrganismos.
“Magnetotactic
Farina
e
Multicellular
colaboradores
Aggregates
atribuíram
(MMAs)”
o
para
termo
designar
microrganismos magnetotácticos compostos por várias células envoltas
por membranas duplas coletados na Lagoa Rodrigo de Freitas, Rio de
Janeiro, Brasil (FARINA et al., 1983; LINS DE BARROS, ESQUIVEL &
FARINA, 1990; KEIM et al., 2007). Em 1990, Rodgers et al. adotaram o
termo “Many-celled Magnetotactic Prokaryotes (MMPs)” para denominar
um microrganismo similar encontrado no Estado da Nova Inglaterra,
Estados Unidos (RODGERS et al., 1990). Uma terceira designação,
“Magnetotactic Multicellular Organisms (MMOs)”, foi adotada por Keim
et al. para um microrganismo multicelular magnetotáctico encontrado
na Lagoa de Araruama, Estado do Rio de Janeiro, Brasil (KEIM et al.,
2004a).
As bactérias magnetotácticas multicelulares são microrganismos
compostos por 10-40 células Gram-negativas organizadas em um
arranjo
esférico
que
se
move
como
uma
unidade sob
campos
magnéticos (FARINA, ESQUIVEL & LINS DE BARROS, 1990; RODGERS et
al., 1990; KEIM et al., 2007; LINS et al., 2007; ABREU et al., 2007;
WENTER et al., in press). Possuem diâmetro variando entre 2,2-12,5µm
(LINS & FARINA, 1999; RODGERS et al., 1990; KEIM et al., 2007;
WENTER et al., in press), velocidade de natação entre 30 e 175µm/s
(FARINA et al., 1983; RODGERS et al., 1990; KEIM et al., 2007) e
cristais magnéticos constituídos por óxido ou sulfeto de ferro (PÓSFAI et
al., 1998b; KEIM et al., 2007; LINS et al., 2007; WENTER et al., in
press). Cada célula apresenta uma face voltada para um compartimento
27
interno acelular e outra face voltada para o ambiente apresentando
múltiplos flagelos (KEIM et al., 2004a, 2007). Sob situação de estresse,
o microrganismo se desagrega em células individuais, que nunca
apresentam motilidade, apesar de se orientarem passivamente a
campos magnéticos aplicados (FARINA, ESQUIVEL & LINS DE BARROS,
1990; LINS & FARINA 1999; KEIM et al., 2004a, 2007; ABREU et al.,
2006). Até o presente momento não existem culturas puras de bactérias
magnetotácticas multicelulares, sendo todos os trabalhos publicados até
então realizados a partir de amostras coletadas do ambiente.
Filogeneticamente, os procariotos multicelulares magnetotácticos
pertencem ao grupo das δ-Proteobacteria, sendo agrupados dentro de
um grupo de bactérias redutoras de sulfato, onde formam um ramo
coeso (DeLONG et al., 1993; ABREU et al., 2007; SIMMONS &
EDWARDS, 2007; WENTER et al., in press). Recentemente, foi descrito
um novo microrganismo dentro deste grupo, denominado ‘Candidatus
Magnetomorum litorale’. Os genes dsrAB e aprA, marcadores de
bactérias redutoras de sulfato, foram detectados em DNA isolados de
amostras de ‘Candidatus Magnetomorum litorale’. Este microrganismo
apresentou resposta quimiotáctica positiva a acetato e propionato,
substâncias comumente utilizadas como fontes de energia e carbono por
bactérias redutoras de sulfato (WENTER et al., in press).
1.11.
Características
gerais
da
bactéria
magnetotáctica
multicelular ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’
A existência de bactérias multicelulares magnetotácticas no
sedimento da Lagoa de Araruama foi relatada por Keim et. al (2004a).
As características de organização celular, ciclo de vida, propriedades
magnéticas, coordenação de movimento e habitat dessa bactéria
multicelular
magnetotáctica,
somada
à
análise
do
rRNA
16S,
28
possibilitaram que a esse organismo fosse dado um nome na categoria
Candidatus (ABREU et al., 2007).
Indivíduos de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ possuem
18 ± 4 células gram-negativas, dispostas em um arranjo esférico (KEIM
et al., 2004a) onde cada célula apresenta uma face exibindo flagelos
(em média 30 por célula) voltados para o meio externo (SILVA et al.,
2007). Possuem faces laterais planas em contato íntimo com as células
adjacentes e uma face voltada para um compartimento interno acelular
(KEIM et al., 2004a).
Sob condições de mudança de pressão osmótica ou quando
expostos à observação prolongada no microscópio óptico, o ‘Ca. M.
multicellularis’ se desagrega em células individuais (Figura 7), que não
apresentam mobilidade (ABREU et al., 2006).
Figura 7 – Microscopia óptica interferencial de Nomarski de ‘Candidatus
Magnetoglobus multicellularis’. (a) Organismo intacto. (b) organismo desagregado.
Barra = 5 µm (retirado de SILVA et al., 2007).
29
O ciclo de vida proposto para o ‘Candidatus Magnetoglobus
multicellularis’ (Figura 8) sugere que o organismo como um todo
inicialmente aumenta o seu volume por meio do aumento do volume de
suas células. Posteriormente, há uma divisão sincronizada das células,
duplicando o número de células do agregado. Em seguida, as células
alteram sua disposição fazendo com que o agregado adquira uma forma
alongada. Uma constrição é formada na região intermediária dessa
estrutura, levando em seguida à divisão do organismo inicial em dois
novos indivíduos (KEIM et al., 2004b).
Figura 8: Seqüência de micrografias de microscopia eletrônica de varredura ilustrando
o ciclo de vida proposto para ‘Candidatus Magnetoglobus Multicellularis’. (a)
microrganismo no início do ciclo, apresentando número reduzido de células. (b)
aumento do volume das células. (c) divisão celular. (d) alongamento do
microrganismo. (e) constrição do microrganismo na região mediana. (f) divisão em
dois microrganismos (retirado de KEIM et al., 2004b).
As
células
que
constituem
o
‘Candidatus
Magnetoglobus
Multicellularis’ apresentam magnetossomos contendo greigita (Fe3S4)
como mineral magnético (KEIM et al., 2004a), envoltos por membranas
do tipo bicamada lipídica no interior do citoplasma (ABREU et al., 2008).
30
‘Candidatus
Magnetoglobus
multicellularis’
possuem
flagelos
peritríqueos quando se considera o agregado com um todo. Porém, cada
célula individualmente apresenta flagelos apenas na face voltada para o
ambiente (KEIM et al., 2004a; SILVA et al., 2007).
Microrganismos com morfologia, ultraestrutura e comportamento
semelhante foram descritos em diversas partes do mundo (FARINA et
al., 1983; FARINA, ESQUIVEL & LINS DE BARROS, 1990; RODGERS et
al., 1990; MANN et al., 1990; PÓSFAI et al., 1998a, 1998b; LINS &
FARINA, 1999; GREENBERG et al., 2005; SIMMONS et al., 2004;
SIMMONS, BAZYLINSKI & EDWARDS, 2006; LINS et al., 2007;
SIMMONS & EDWARDS, 2007; WENTER et al., in press).
Quando
sob
campo
magnético
aplicado,
‘Candidatus
Magnetoglobus multicellularis’ se desloca como uma unidade em
trajetórias retas ou helicoidais (KEIM et al., 2004a), com o eixo de
simetria alinhado à direção do campo magnético (Vídeo 1), com sentido
antiparalelo, exibindo velocidade de (9 ± 2)x10 µm/s (SILVA et al.,
2007). As trajetórias helicoidais apresentam sentido anti-horário,
acompanhada de rotação do microrganismo ao longo do seu próprio
eixo, também no sentido anti-horário (com o microrganismo se
afastando do observador), sendo que, a cada passo da hélice, a célula
gira 2πrad em torno do seu próprio eixo (KEIM et al., 2007). A reversão
do campo magnético durante a natação causa a reorientação do
organismo em 180º (u-turn).
Se
não
há
restrições
para
o
movimento,
‘Candidatus
Magnetoglobus multicellularis’ e os outros procariotos multicelulares
nadam para frente ao longo das linhas do campo magnético local
segundo trajetórias helicoidais ou aproximadamente retilíneas (free
motion). Quando os ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ atingem
o limite de uma gota d’água, passam a exibir rotação ao longo do seu
próprio eixo (rotation) (Vídeo 2) (ABREU et al., 2007; KEIM et al.,
31
2007), com eventuais e curtas excursões paralelas ao campo magnético
acompanhadas de desaceleração até cessar o movimento, voltando
então a nadar com aceleração crescente em sentido antiparalelo ao
campo (Vídeo 3) (GREENBERG et al., 2005; ABREU et al., 2007; KEIM et
al., 2007). Tais excursões, referidas como trajetórias “ping-pong” ou
“escape motility”, são observadas com maior frequência sob campos
magnéticos
elevados
em
relação
ao
campo
magnético
terrestre
(GREENBERG et al., 2005). O movimento de escape (escape motility)
também é observado quando estes microrganismos nadam livremente,
ou seja, sem a existência de uma interface água / ar (GREENBERG et
al., 2005).
Em
campos
magnéticos
menores
(da
ordem
do
campo
geomagnético), estes microrganismos passam a exibir um padrão de
movimento
chamado
“walking”,
que
consiste
em
uma
trajetória
complexa de “looping”, não alinhada ao campo magnético, realizada
próxima à borda da gota (GREENBERG et al., 2005; ABREU et al., 2007;
KEIM et al., 2007).
32
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Estudar o comportamento e motilidade da bactéria magnetotáctica
‘Candidatus
Magnetoglobus
multicellularis’
sob
campo
magnético
aplicado superiores ao campo geomagnético.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Desenvolver uma metodologia que permita quantificar os
parâmetros das trajetórias helicoidais descritas por microrganismos
magnetotácticos (raio, passo da hélice, período, frequência, velocidade
média, velocidade instantânea e velocidade angular) através do uso de
vídeo-microscopia e análise de imagens.
- Quantificar os parâmetros das trajetórias descritas pela bactéria
magnetotáctica ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ sob campo
magnético superior ao campo geomagnético.
- Avaliar a resposta de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’
a pulsos de laser ultravioleta e a luz ultravioleta.
33
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1.
Coleta
e
concentração
magnética
de
‘Candidatus
Magnetoglobus multicellularis’
Amostras de água e sedimento na proporção aproximada de 1:1
foram coletadas na Praia da Baleia, localizada no Município de São Pedro
da Aldeia, Estado do Rio de Janeiro, Brasil (Latitude 22º 52’ 10,82” Sul e
Longitude 42º 06’ 40,42” Oeste). A coleta foi realizada com o uso de
recipientes plásticos de 1000 ml e as amostras foram armazenadas no
laboratório à temperatura ambiente e sob iluminação indireta. Os
experimentos de vídeo-microscopia e de resposta ao laser e à luz
ultravioleta foram realizados até duas semanas após a coleta das
amostras.
Indivíduos
de
‘Ca.
Magnetoglobus
multicellularis’
foram
concentrados magneticamente seguindo o protocolo descrito por Lins et
al. (2003).
frasco
de
Água e sedimento da lagoa foram introduzidos em um
vidro
especialmente
construído
para
concentrar
microrganismos magnetotácticos, que possui uma abertura superior por
onde a água e o sedimento são introduzidos; e um capilar lateral, por
onde o concentrado de ‘Ca. Magnetoglobus multicellularis’ é retirado
(Figura 9a).
O vidro concentrador abastecido de água e sedimento da Lagoa de
Araruama foi inserido em uma bobina confeccionada manualmente com
o uso de cano de poli-cloreto de vinila (PVC) de 150 mm de diâmetro e
fio de cobre esmaltado de 0.33mm de diâmetro (Figura 9b). Esta
bobina, quando conectada a uma fonte de corrente contínua, produz um
campo magnético homogêneo no seu interior, com direção paralela ao
seu eixo longitudinal. O capilar lateral do vidro concentrador foi
34
orientado de forma antiparalela ao campo magnético gerado pela
bobina. Com isso, ‘Ca. Magnetoglobus multicellularis’ presentes na
amostra nadaram em direção ao capilar lateral, permanecendo ali
concentrados. Foi utilizada a fonte de corrente contínua de 0,5 Ampère.
Com o uso de uma micropipeta, 20µL de concentrado de ‘Ca.
Magnetoglobus multicellularis’ foram recolhidos do capilar lateral do
vidro concentrador e depositados sobre lâmina e lamínula espaçados por
um
o-ring
de
500µm
de
espessura
(Figura
9c).
O
tempo
de
concentração magnética foi de cinco minutos. Para os experimentos no
laboratório de pinças ópticas, o mesmo volume foi depositado em uma
placa de petri perfurada, com uma lamínula colada no fundo (Figura 9d).
35
Figura 9: Ilustrações dos materiais utilizados para concentrar e observar os ‘Ca.
Magnetoglobus multicellularis’. (a) Frasco de vidro utilizado para concentrar
microrganismos magnetotácticos preenchido com água e sedimento da lagoa. A
amostra é inserida na abertura superior e após a exposição a um campo magnético
devidamente orientado, ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ concentrados são
recolhidos pelo capilar lateral. (b) Bobina e fonte utilizadas para concentrar
‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’. (c) Amostra concentrada de ‘Candidatus
Magnetoglobus multicellularis’ entre lâmina e lamínula separadas por um o-ring de
500µm de espessura para os experimentos de análise das trajetórias helicoidais sob
campo magnético aplicado. (d) Placa de Petri perfurada com lamínula aderida ao fundo
usada nos experimentos de resposta ao laser UV.
3.2. Produção de campo magnético aplicado para experimentos
de vídeo-microscopia.
Campos magnéticos uniformes e de intensidade controlada para os
experimentos
de
vídeo-microscopia
das
trajetórias
de
‘Ca.
Magnetoglobus multicellularis’, foram obtidos com o uso de pares de
bobinas eletromagnéticas (Figura 10).
36
Figura 10: Representação esquemática das bobinas eletromagnéticas
A estimativa do campo produzido por um par de bobinas
eletromagnéticas leva em conta o número de espiras (N), o raio interno
(Ri), o raio externo (Re), a espessura (L), a corrente (i) e a distância
entre as bobinas (d), conforme ilustrado na figura 10.
Foram montados dois sistemas distintos de bobinas para a
geração de campos magnéticos de 3,9 e 20,0 Gauss. O primeiro, uma
bobina de Helmholtz, foi acoplado a um microscópio Zeiss universal e o
segundo em um microscópio Zeiss Axioplan 2 (Figura 11a).
Cada par de bobinas foi alimentado por uma fonte de corrente
contínua Instrutherm FA-3005, com tensão de saída variável de zero a
trinta Volts e corrente de saída variável de zero a cinco ampères. As
correntes aplicadas para a geração dos campos magnéticos de 3,9
Gauss e 20,0 Gauss foram, respectivamente, 5 e 0,15 ampères. No
sistema acoplado ao microscópio Zeiss foi adaptada uma peça de acrílico
para a movimentação da lâmina a fim de evitar a influência de campo
magnético gerado pela platina do microscópio, que se encontrava
imantado (Figura 11b). Para facilitar os experimentos, uma chave para
reversão de corrente foi conectada entre a fonte e as bobinas,
permitindo assim a rápida reversão do campo magnético (Figura 11c).
O primeiro sistema de bobinas para a aplicação de campo
magnético (20,0 Gauss) utilizado neste trabalho foi construído fora das
37
condições de bobina de Helmholtz. Entretanto, na região correspondente
ao campo de observação das trajetórias (~1000µm2), as linhas de
campo encontram-se distribuídas de forma uniforme, paralelas à
superfície da lamínula.
Para a aplicação de um campo magnético com intensidade de 3,9
Gauss, um segundo par de bobinas foi construído sob condições
próximas às de uma bobina de Helmholtz, ou seja, Re~Ri e d~Re,. Isso
assegurou a uniformidade do campo aplicado sobre as amostras. Uma
descrição detalhada dos sistemas de bobinas pode ser obtida em
http://omnis.if.ufrj.br/~lpo/Bobina.pdf.
Figura 11: Sistema utilizado para produção de campo magnético aplicado de 3,9
Gauss utilizado para vídeo-microscopia das trajetórias percorridas por ‘Ca.
Magnetoglobus multicellularis’. (a) Sistema de vídeo-microscopia com a bobina de
Helmholtz acoplada ao microscópio óptico Zeiss Axioplan 2. (b) Peça de acrílico
adaptada à platina do microscópio (c) Chave para a reversão de corrente da bobina.
38
3.3.
Vídeo-microscopia
das
trajetórias
de
‘Candidatus
Magnetoglobus multicellularis’ sob campo magnético aplicado
As trajetórias do ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ sob
campo magnético aplicado foram filmadas com o uso de uma câmera
CCD JVC TK-1270 conectada a um computador equipado com uma placa
de captura de vídeo Pixel View PlayTV. As amostras concentradas
magneticamente foram colocadas entre lâmina e lamínula separadas por
um espaçador de 500µm de diâmetro e observadas por um tempo não
superior a 20 minutos. As análises das trajetórias para cada um dos
valores de campo magnético aplicado foram realizadas a partir de
amostras de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ provenientes de
coletas distintas.
As trajetórias foram filmadas em campo claro, com objetiva de
40x. Os vídeos foram capturados com o uso do software Pinnacle Studio
8, com uma resolução de 320 x 240 pixels, a 30 fps, no formato AVI.
Os vídeos gerados foram processados e analisados utilizando o
aplicativo ImageJ (NIH).
Os filmes foram submetidos a um filtro de
background e binarizados. Com o uso da ferramenta Mtrack2, foram
obtidas planilhas com as coordenadas XZ de cada uma das trajetórias
(com o eixo Y paralelo ao eixo óptico do microscópio).
As trajetórias senoidais 2D obtidas foram assumidas como
projeções de trajetórias helicoidais cilíndricas em 3D, possuindo eixo de
simetria paralelo ao campo magnético gerado pelas bobinas acopladas
ao microscópio. Os parâmetros usados para a caracterização das
trajetórias foram escolhidos em concordância com equações que
descrevem a posição do centro de massa do “Ca. M. multicellularis” em
função do tempo em trajetórias helicoidais:
39
⎛ 2πt
⎞
X = A cos⎜
+ϕ ⎟
⎝ T
⎠
(2)
Z = Z 0 + V0t
(3)
⎛ 2πt
⎞
+ϕ⎟
Y = A sin⎜
⎝ T
⎠
(4)
onde A = raio da hélice cilíndrica (amplitude), t = tempo; T = período;
ϕ = fase arbitrária; Z
0
= posição inicial arbitrária no plano Z. A
velocidade de natação (V0) foi obtida a partir da regressão linear do
gráfico Z versus t. O raio (A) e o período (T) foram obtidos por meio de
regressão não linear da posição X versus t. A velocidade ao longo do
traço da trajetória, a qual denominamos velocidade tangencial (Vt), é
dada por:
Vt =
(2πA) 2 + λ2
T2
(5)
onde λ = V0 ⋅ T (5) define o passo da hélice. Os dados obtidos permitiram a
projeção tridimensional das trajetórias e a verificação da existência de
correlações entre os parâmetros das trajetórias.
3.4.
Avaliação
da
resposta
de
‘Candidatus
Magnetoglobus
multicellularis’ a pulsos de laser ultravioleta e a luz ultravioleta.
Um sistema de pinças ópticas (Figura 12 a-c) consiste em um
microscópio óptico invertido montado sobre uma mesa pneumática antivibração. Sobre a mesma mesa podem ser montados diferentes tipos de
lasers, lentes, espelhos e diafragmas, de modo a permitir que o feixe
gerado pelos lasers penetre de forma controlada no eixo óptico do
40
microscópio, através da abertura de epi-iluminação do sistema de
fluorescência.
Sobre
um
sistema
de
pinças
ópticas
utilizando
um
laser
infravermelho Nd-YAG de comprimento de onda de 1064nm, foi
acoplado um laser UV (Figura 12c) com comprimento de onda igual a
337,1 nm que gera pulsos de duração inferior a 3.5 ns, com energia de
170µJ por pulso. Este tipo de laser atua como um bisturi óptico. Assim
como o laser infravermelho usado para pinçar objetos, o laser UV foi
posicionado de forma incidir seguindo o eixo óptico do microscópio
através da abertura da epi-iluminação do sistema de fluorescência.
Para os experimentos de resposta ao laser UV, ‘Candidatus
Magnetoglobus multicellularis’ foram concentrados magneticamente por
vinte minutos e depositados sobre uma placa de petri adaptada (Figura
9d).
As
amostras
foram
observadas
em
um
microscópio
óptico
invertido Nikon Eclipse TE300 acoplado ao sistema de pinça óptica, na
modalidade campo claro, com o uso de uma objetiva Plan Fluar 100x
com abertura numérica de 1.4. As imagens foram obtidas por uma
câmera CCD Hamamatsu C2400 e digitalizadas por uma placa de
captura de imagens SCION (Figura 7d).
Com o uso de um ímã, ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’
foram direcionados para a borda da gota, onde pulsos de laser UV foram
aplicados sobre a amostra.
Sob as mesmas condições dos experimentos de pulsos de laser
UV, a disponibilidade de uma platina motorizada possibilitou o registro
em
grande
aumento
da
natação
de
‘Candidatus
Magnetoglobus
multicellularis’ alinhada ao campo magnético gerado por um ímã
posicionado próximo à amostra.
Para a avaliação da resposta à iluminação UV, ‘Candidatus
Magnetoglobus
multicellularis’
foram
depositados
sobre
lâmina
e
41
lamínula separados por um o-ring e observados ao microscópio Axioplan
2, na modalidade DIC, sob epi-iluminação com lâmpada de mercúrio
com 50W de potência associada a um filtro para selecionar luz UV.
Figura 12 (a-d): Sistema de pinça óptica do Laboratório de Pinças Ópticas da COPEAUFRJ, situado no Instituto de Ciências Biomédicas / Centro de Ciências da Saúde-UFRJ.
(a) Visão geral do sistema de pinça óptica onde pode ser visualizado o microscópio
óptico Nikon Eclipse TE 300 sobre uma mesa pneumática anti-vibração Newport. (b)
Laser de Neodymium-YAG infravermelho (1064nm). (c) Laser ultravioleta (337,1nm).
(d) Sistema de captura e processamento de imagem.
42
4. RESULTADOS 4.1.
Trajetórias
helicoidais
de
‘Candidatus
Magnetoglobus
multicellularis’ sob campo magnético aplicado
As trajetórias de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ sob
campo magnético aplicado foram filmadas a partir de amostras
concentradas magneticamente com o uso de sistema de vídeomicroscopia equipado com um par de bobinas eletromagnéticas. As
coordenadas xz do centro de massa ao longo das trajetórias de
‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ foram obtidas quadro a
quadro, totalizando duzentas trajetórias sob campo magnético aplicado
de 3,9 Gauss e duzentas trajetórias sob campo magnético aplicado de
20,0 Gauss.
Os parâmetros vx (velocidade no eixo x), vz (velocidade no eixo z),
raio (А) e período (Τ) das trajetórias helicoidais foram obtidos a partir
de regressões lineares e não lineares dos gráficos gerados a partir das
coordenadas X(t) e Z(t). Uma das trajetórias analisadas pode ser
observada na figura 13. Os parâmetros velocidade média (ν), velocidade
angular (ω), comprimento de onda (λ), velocidade instantânea (υ) e
ângulo entre velocidade angular e velocidade instantânea (θ) foram
determinados a partir da trajetória. No total, foram analisadas 180
trajetórias sob campo magnético aplicado de 3,9 Gauss e 184 trajetórias
sob
campo
magnético
aplicado
de
20
Gauss.
As
médias
são
apresentadas na tabela 1.
43
Tabela 1: Valores médios e erros­ padrão dos parâmetros das trajetórias de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ sob campo magnético aplicado (В) Campo magnético (Gauss) (А) Raio (μm) (ν) Velocidade Média (μm/s) (Τ) Período (S) (υ) (ω) (λ) Velocidade Velocidade Passo da Instantânea Angular Hélice (μm/s) (rad/s) (μm) (θ) N Theta (Graus) 3,9 5,0 ± 0,1 (9 ± 1,6)x10 1,1 ± 0,02 (9 ± 1,6)x10 6,0 ± 0,1 (9 ± 3)x10 18,0 ± 0,8 180 20 4,0 ± 0,1 (11 ± 1,9)x10 0,80 ± 0,02 (12 ± 1,8)x10 8,0 ± 0,2 (9 ± 2)x10 16,0 ± 0,5 184 Testes-t (ou probabilidade-t) para dados não-pareados com
variância desigual foram aplicados para verificar a existência de
diferença estatística significativa entre os valores médios obtidos para
cada parâmetro sob os diferentes campos magnéticos aplicados.
Os histogramas do raio das trajetórias sob campos de 3,9 Gauss
(Figura 14a) e 20,0 Gauss (Figura 14b) mostram que no campo
magnético aplicado de maior valor a distribuição do raio se deslocou
para valores menores. O valor obtido no teste-t, 0,00015, (Figura 14c),
indica que as médias são estatisticamente diferentes (o critério usado foi
p<0,05).
Os histogramas para a velocidade média (Figura 15a-b) mostram
que a distribuição foi deslocada para valores maiores quando aplicado o
campo magnético de 20 Gauss. A probabilidade-t para este grupo de
dados (Figura 15c) foi inferior a 0,0001, indicando que a velocidade
média é estatisticamente distinta para cada valor de campo magnético
aplicado.
As figuras 16a e 16b mostram os histogramas de período sob
campo magnético de 3,9 e 20,0 Gauss, respectivamente. As médias são
estatisticamente distintas, com valor de probabilidade-t inferior a
0,0001 (Figura 16c). Os resultados indicam que o período das trajetórias
diminuiu quando foi aplicado o campo magnético de maior intensidade.
44
Assim como a velocidade média (ν), o valor médio obtido para a
velocidade instantânea (υ) foi maior sob campo de 20,0 Gauss. As
distribuições da velocidade instantânea das trajetórias sob 3,9 e 20,0
Gauss são mostradas nas Figuras 17a e 17b. O resultado do teste-t é
apresentado na Figura 17c. O valor de probabilidade-t (<0,0001)
demonstra que as médias são estatisticamente distintas para cada valor
de campo aplicado.
As figuras 18a e 18b apresentam os histogramas da velocidade
angular sob os diferentes campos magnéticos. O resultado do teste-t
(<0,0001) é apresentado na figura 18c. Os resultados indicam que o
valor médio da velocidade angular foi maior sob o campo aplicado de
20,0 Gauss.
O passo da hélice (λ) observado em ambos os campos magnéticos
aplicados
apresentou
valores
médios
próximos.
O
valor
da
probabilidade-t <0,7132 indica que as médias não são estatisticamente
distintas. Os histogramas de comprimento de onda e o resultado do
teste-t são apresentados nas figuras 19a-c.
O ângulo médio entre a velocidade angular (ω) e a velocidade
instantânea (υ) também foi distinto para cada valor de campo
magnético aplicado. Os histogramas de θ para os campos aplicados são
apresentados nas figuras 20a e 20b. O resultado do teste-t é
apresentado na figura 20c. O valor da probabilidade-t (0,0001) indica
que as médias obtidas sob os diferentes campos magnéticos são
estatisticamente distintas.
4.2. Resposta de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ a
pulsos de laser ultravioleta
Os experimentos de resposta a pulsos de laser ultravioleta foram
realizados em um sistema de pinças ópticas conectado a um sistema de
aquisição de imagem.
45
Amostras
de
‘Candidatus
Magnetoglobus
multicellularis’
concentrados magneticamente foram depositadas sobre uma lamínula e
observadas no microscópio em campo claro. Com o uso de um ímã,
‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ foram direcionados para uma
das extremidades da gota d’água, acumulando-se em múltiplas fileiras.
Exatamente no plano focal da interface ar-água, foi observada somente
uma fileira de microrganismos. Poucos micrômetros a partir da interface
ar-água, ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ foram observados
em mais de um plano focal.
Nessas
condições,
‘Candidatus
Magnetoglobus
multicellularis’
apresentaram rotação em torno do seu próprio eixo com diferentes
sentidos
e
observados
velocidades.
Eventos
entre
microrganismos
os
de
escape
motility
acumulados
não
foram
na
região
imediatamente adjacente à interface ar-água, dentro do campo de
aquisição de imagem (Vídeo 4, frames 1-359).
Um pulso de laser ultravioleta com duração inferior a 3,5ns foi
aplicado sobre a amostra. O efeito da interação do pulso de laser com
um dos indivíduos de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ pode
ser visualizado durante 0,16s (Figura 21; Vídeo 4, frames 360-364).
Imediatamente após esse intervalo de tempo foi observada uma
resposta coletiva em que os microrganismos não atingidos diretamente
pelo laser nadaram no sentido oposto, afastando-se da borda da gota.
Após 2,5s, apenas dois indivíduos permaneciam no campo de visão, sem
apresentar motilidade (Figura 22; Vídeo 4, frame 437).
Aproximadamente 10 segundos após a aplicação do pulso de laser
UV, ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ voltaram a se acumular
na interface ar-água e, após 20s, a densidade de microrganismos na
borda da gota encontrava-se comparável com a observada antes do
pulso (Vídeo 4, frame 1137).
46
Os danos causados aos ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’
diretamente alvejados pelo pulso de laser UV podem ser observados na
figura 23 e no Vídeo 4 (frames 700-1235). Um pequeno grupo de
células foi destacado do arranjo esférico, permanecendo aderidas ao
microrganismo,
possivelmente
expondo
o
compartimento
interno
acelular para o meio externo (Figura 23).
Um segundo pulso de laser UV foi aplicado sobre a amostra (vídeo
4, frames 1242-1248). O efeito coletivo novamente foi observado.
Contudo, dois indivíduos atingidos pelo laser permaneceram no campo
de observação apresentando rotação em torno do seu próprio eixo com
velocidade
muito
superior
à
observada
quando
‘Candidatus
Magnetoglobus multicellularis’ se encontram na interface ar-água.
(Vídeo
4,
frames
1297-
1663).
Várias
células
encontravam-se
destacadas do arranjo esférico, porém, ainda conectadas ao agregado.
Após aproximadamente 12 segundos não foi mais observada motilidade
nesses indivíduos.
Um terceiro pulso de laser (Vídeo 4, frame 1940) foi aplicado
sobre a amostra, atingindo um indivíduo já desagregado pelos pulsos de
laser anteriores. A resposta coletiva dos demais indivíduos foi menos
intensa que a observada nos dois primeiros pulsos (Vídeo 4, frames
1940-2691).
‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis expostos a iluminação
com lâmpada HBO demonstraram resposta fóbica à luz UV, porém, de
forma menos intensa à observada na aplicação de pulsos de laser UV
(Vídeo 5). Quando iluminados com lâmpada de tungstênio, apresentam
alteração de motilidade (rotation) quando um filtro verde é posicionado
entre a fonte de luz e a amostra (Vídeo 6). A natação ao longo do
campo magnético aplicado em grande aumento é mostrada nos vídeos 7
e 8.
47
PRANCHA 1
48
Figura 13: Trajetória helicoidal de um indivíduo de ‘Candidatus
Magnetoglobus multlicellularis’ sob campo magnético aplicado de 20,0
Gauss.
(a) Ajuste linear da posição x(t) de uma trajetória helicoidal à
função y = Ax + B , onde B corresponde à velocidade no eixo X.
(b) Ajuste não linear da posição z(t) da mesma trajetória em
função
de
⎞
⎛ 2πx
y = P1 + P2 x + P3 cos⎜⎜
+ P5 ⎟⎟ .
⎠
⎝ P4
Os
parâmetros
P2,
P3
e
P4
correspondem, respectivamente, à velocidade no eixo Z, ao raio e ao
2
2
período da trajetória. A velocidade de natação é dada por v = v x + v z .
49
50
PRANCHA 2
51
Figura 14: Raio das trajetórias (А) de ‘Candidatus Magnetoglobus
multicellularis’ sob campo magnético aplicado.
(a) Histograma do raio das trajetórias helicoidais sob campo
magnético aplicado de 3,9 Gauss.
(b) Histograma do raio das trajetórias helicoidais sob campo
magnético aplicado de 20,0 Gauss.
(c) Resultado do teste-t entre o raio das trajetórias de ‘Candidatus
Magnetoglobus multicellularis’ sob campo magnético aplicado de 3,9
Gauss e 20,0 Gauss.
52
53
PRANCHA 3
54
Figura 15: Velocidade média (ν) das trajetórias helicoidais de
‘Candidatus
Magnetoglobus
multicellularis’
sob
campo
magnético
aplicado.
(a) Histograma da velocidade média sob campo magnético
aplicado de 3,9 Gauss.
(b) Histograma da velocidade média sob campo magnético
aplicado de 20,0 Gauss.
(c) Resultado do teste-t entre a velocidade média das trajetórias
de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ sob campo magnético
aplicado de 3,9 Gauss e 20,0 Gauss.
55
56
PRANCHA 4
57
Figura 16: Período (Τ) das trajetórias helicoidais de ‘Candidatus
Magnetoglobus multicellularis’ sob campo magnético aplicado
(a) Histograma do período das trajetórias helicoidais sob campo
magnético aplicado de 3,9 Gauss.
(b) Histograma do período das trajetórias helicoidais sob campo
magnético aplicado de 20,0 Gauss.
(c) Resultado do teste-t entre o período das trajetórias de
‘Candidatus
Magnetoglobus
multicellularis’
sob
campo
magnético
aplicado de 3,9 Gauss e 20,0 Gauss.
58
59
PRANCHA 5
60
Figura 17: Velocidade instantânea (υ) das trajetórias helicoidais de
‘Candidatus
Magnetoglobus
multicellularis’
sob
campo
magnético
aplicado.
(a)
Histograma
da
velocidade
instantânea
das
trajetórias
das
trajetórias
helicoidais sob campo magnético aplicado de 3,9 Gauss.
(b)
Histograma
da
velocidade
instantânea
helicoidais sob campo magnético aplicado de 20,0 Gauss.
(c) Resultado do teste-t entre a velocidade instantânea das
trajetórias de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ sob campo
magnético aplicado de 3,9 Gauss e 20,0 Gauss.
61
62
PRANCHA 6
63
Figura 18: Velocidade angular (ω) das trajetórias helicoidais de
‘Candidatus
Magnetoglobus
multicellularis’
sob
campo
magnético
aplicado.
(a) Histograma da velocidade angular das trajetórias sob campo
magnético aplicado de 3,9 Gauss.
(b) Histograma da velocidade angular das trajetórias sob campo
magnético aplicado de 20,0 Gauss.
(c) Resultado do teste-t entre a velocidade angular das trajetórias
de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ sob campo magnético
aplicado de 3,9 Gauss e 20,0 Gauss.
64
65
PRANCHA 7
66
Figura 19: Passo da hélice (λ) das trajetórias helicoidais de
‘Candidatus
Magnetoglobus
multicellularis’
sob
campo
magnético
aplicado.
(a) Histograma do passo da hélice das trajetórias helicoidais sob
campo magnético aplicado de 3,9 Gauss.
(b) Histograma do passo da hélice das trajetórias helicoidais sob
campo magnético aplicado de 20,0 Gauss.
(c) Resultado do teste-t entre o passo da hélice das trajetórias de
‘Candidatus
Magnetoglobus
multicellularis’
sob
campo
magnético
aplicado de 3,9 Gauss e 20,0 Gauss.
67
68
PRANCHA 8
69
Figura 20: Ângulo entre a velocidade angular e a velocidade
instantânea (θ) das trajetórias helicoidais de ‘Candidatus Magnetoglobus
multicellularis’ sob campo magnético aplicado.
(a) Histograma do ângulo entre a velocidade angular e a
velocidade instantânea das trajetórias sob campo magnético aplicado de
3,9 Gauss.
(b) Histograma do ângulo entre a velocidade angular e a
velocidade instantânea das trajetórias sob campo magnético aplicado de
20,0 Gauss.
(c) Resultado do teste-t do ângulo entre a velocidade angular e a
velocidade instantânea das trajetórias sob campo magnético aplicado de
3,9 Gauss e 20,0 Gauss.
70
71
PRANCHA 9
72
Figura 21: Série de imagens de vídeo-microscopia demonstrando o
efeito da aplicação do pulso de laser ultravioleta sobre um ‘Candidatus
Magnetoglobus
multicellularis’.
As
setas
indicam
uma
alteração
morfológica na região de incidência do laser sobre o microrganismo.
Barra de escala=6,6µm.
73
74
PRANCHA 10
75
Figura 22: Série de imagens de vídeo-microscopia mostrando os
2,7 segundos subsequentes à aplicação do pulso de laser ultravioleta
sobre a amostra de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’. Observase que apenas dois microrganismos permanecem imóveis na região
observada. Barra de escala=30µm.
76
77
PRANCHA 11
78
Figura 23: ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ diretamente
atingido pelo pulso de laser ultravioleta. Um grupo de células se
encontra destacado do arranjo. Barra de escala=3,3µm.
79
80
5. DISCUSSÃO Dados das trajetórias de bactérias, tais como comprimento de
onda, diâmetro da hélice, período da trajetória helicoidal e período da
rotação do microrganismo sobre seu próprio eixo, são muito difíceis de
obter em bactérias de tamanho regular (~1 µm), por causa do limite de
resolução do microscópio ótico (~ 0,2 µm). Por outro lado, procariotos
flagelados de tamanho grande (> 5 µm), cujas trajetórias são mais
facilmente observadas ao microscópio ótico, não são cultivados até o
momento. Algumas vezes, estes microrganismos ocorrem em grandes
números na interface entre a água e o sedimento de ambientes
marinhos, de onde podem ser coletados e estudados (ver, por exemplo,
FENCHEL, 1994 e FENCHEL & THAR, 2004). Dadas as dificuldades e o
pequeno número de microrganismos estudados, o estudo do movimento
de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ vem, portanto, contribuir
para o entendimento do movimento dos procariotos flagelados.
Os parâmetros que descrevem a natação em trajetórias helicoidais
(free motion) da bactéria magnetotáctica multicelular ‘Candidatus
Magnetoglobus multicellularis’ sob dois campos magnéticos aplicados
(3,9 e 20 Gauss), ambos superiores ao campo geomagnético local (~0,2
Gauss), foram quantificados. A metodologia aplicada permitiu a análise
eficiente de um grande número de trajetórias através de vídeomicroscopia e processamento de imagem, tendo atingido o objetivo de
gerar dados dos parâmetros das trajetórias.
5.1.
Vantagens
e
desvantagens
da
nova
metodologia
desenvolvida para o estudo do movimento de microrganismos
As técnicas de microscopia desenvolvidas no último século
permitiram a obtenção de uma grande quantidade de informações em
relação ao movimento dos microrganismos. O baixo contraste observado
81
em imagens obtidas por microscopia de campo claro, que limitava a
observação
de
microrganismos
vivos,
foi
suplantado
pelo
desenvolvimento de técnicas como o contraste de fase, campo escuro e
contraste por interferência diferencial (DIC).
Além da óptica dos microscópios em si, os sistemas de registro,
armazenamento e análise de imagens evoluíram muito. A micrografia de
longo tempo de exposição e a cine-fotomicrografia deram lugar a
câmeras de vídeo, detectores CCD, dispositivos digitais de captura,
armazenamento e processamento de imagem.
O grande desenvolvimento tecnológico da vídeo-microscopia se
reflete nos elevados custos dos sistemas oferecidos pelas empresas de
microscopia e de equipamentos científicos. Contudo, a adaptação de
equipamentos não necessariamente desenvolvidos para o uso específico
em
vídeo-microscopia
pode
proporcionar
bons
resultados
para
aplicações que não careçam de sistemas de alto desempenho.
A metodologia aplicada no presente trabalho é um exemplo de
como dispositivos de vídeo desenvolvidos para uso doméstico e
encontrados no mercado a preços acessíveis podem ser empregados na
vídeo-microscopia.
Câmeras
fotográficas
digitais
podem
ser
adaptadas
a
um
microscópio com relativa facilidade. A atual resolução e freqüência de
captura dessas câmeras (em torno de 720x480 pixels e 30 fps)
possibilitam a sua aplicação com finalidades que vão desde um mero
registro qualitativo até a obtenção de dados quantitativos do espécime,
como os obtidos no presente trabalho.
Placas profissionais de captura digital de imagem e computadores
com elementos de hardware e software específicos para a aplicação em
vídeo-microscopia analítica podem também ser substituídos por placas e
programas domiciliares para captura e conversão de vídeos a partir de
dispositivos analógicos, como gravadores de videocassete. Somado a
82
isso, o desenvolvimento e distribuição on line de softwares freeware
como o ImageJ (NIH) proporcionaram uma alternativa de custo zero em
relação aos onerosos aplicativos de análise de imagens disponíveis no
mercado.
A metodologia aplicada para o estudo das trajetórias helicoidais de
‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ constitui uma alternativa
eficiente e de baixo custo aos protocolos comumente utilizados no
estudo do movimento de microrganismos, como micrografia com longo
tempo de exposição e reprodução da natação quadro a quadro
diretamente de um monitor com o uso de filmes plásticos transparentes.
Uma
das
maiores
dificuldades
encontradas
no
estudo
do
movimento de microrganismos reside no fato de que suas dimensões
pequenas requererem o uso de objetivas de grande aumento. Sob tais
condições, a reduzida profundidade de campo faz com que seja difícil
manter um microrganismo em foco enquanto nada. Por outro lado,
reduzir o espaço disponível para a natação no eixo Y (paralelo ao eixo
óptico do sistema) pode influenciar a motilidade devido ao aumento do
arrasto
hidrodinâmico
e,
até
mesmo,
causar
a
adesão
dos
microrganismos à lâmina ou lamínula. Sistemas de vídeo-microscopia
capazes de manter em foco bactérias com dimensões compatíveis às de
E.coli são relatados na literatura (BERG, 1971; THAR, NICHOLAS &
KÜHL,
2000).
Contudo,
tratam-se
de
aparatos
complexos
não
disponíveis comercialmente.
A vídeo-microscopia de bactérias magnetotácticas sob campo
magnético aplicado demonstra-se mais simples devido ao fato do campo
magnético fazer com que as trajetórias fiquem alinhadas de forma
aproximadamente paralela ao plano da superfície da lamínula. Isso faz
com
que
a
possibilitando
posição
o
uso
do
microrganismo
de
objetivas
varie
de
pouco
maior
no
eixo
aumento
Y,
e,
83
conseqüentemente, proporcionando a aquisição de dados com maior
resolução espacial.
O acompanhamento das trajetórias de ‘Candidatus Magnetoglobus
multicellularis’ sob campo magnético aplicado em grande aumento
(objetiva de 100x) pôde ser obtido com o uso de uma platina
motorizada (Vídeos 7 e 8). O resultado preliminar demonstrou-se
promissor para o estudo mais detalhado das peculiaridades da natação
desse microrganismo, como o sentido de rotação do microrganismo em
torno do seu próprio eixo.
Outra ferramenta que pode fornecer informações relevantes em
relação à coordenação da rotação dos flagelos é a microscopia de
fluorescência. TUNER, RYU & BERG (2000) e BERG et al. (2007)
obtiveram importantes resultados em relação à dinâmica da rotação do
flagelo de E. coli. utilizando essa técnica. A provável dificuldade desse
tipo de ensaio em ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ é o
reduzido comprimento e a alta densidade de flagelos em comparação à
E. coli. ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ possui em média 30
flagelos por célula, com comprimento variando entre 0,9 e 3,8µm e
diâmetro entre 12 e 20nm (SILVA et al., 2007). E.coli possui 3±2
filamentos por célula com comprimento de 6±3µm (TUNER, RYU &
BERG,
2000).
Além
disso,
os
filamentos
flagelares
de
‘Ca.
Magnetoglobus multicellularis’ nunca completam um comprimento de
onda, diferentemente dos vários comprimentos de onda observados nos
flagelos de E.coli.
84
5.2. Quantificação dos parâmetros das trajetórias helicoidais de
‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ nos dois diferentes
campos
magnéticos
aplicados,
e
suas
implicações
para
o
movimento
A literatura existente até o momento pertinente ao estudo do
movimento da bactéria magnetotáctica ‘Candidatus Magnetoglobus
Multicellularis’ caracteriza os tipos de movimentos realizados por este
microrganismo em quatro categorias: movimento livre (free motion),
rotação (rotation), motilidade de escape (escape motility) e caminhada
(walking) (KEIM et al. 2006).
Em relação à natação alinhada a linhas de campo magnético
aplicado (free motion), Keim et al. (2004a) relatou que este tipo de
movimento poderia se dar em trajetórias retilíneas ou helicoidais. A
metodologia adotada por Keim et al. (2004a) para o estudo das
trajetórias utilizou microscopia de campo escuro em baixo aumento e
micrografia com longo tempo de exposição.
No presente trabalho não foram observadas trajetórias retilíneas.
Um dos critérios adotados durante a análise das trajetórias helicoidais
foi o registro de pelo menos um passo de hélice no campo de visão do
microscópio, que mede 155x116 µm. Trajetórias com comprimento igual
ou inferior a ¼ de comprimento de onda foram observadas, porém, não
analisadas.
Os valores médios obtidos para o passo da hélice das trajetórias
foram muito superiores aos valores médios de raio; e as médias de
velocidade de natação e velocidade instantânea foram próximas entre si
sob ambos os campos. O elevado valor de passo da hélice em
comparação com o valor do raio das trajetórias poderia fazer com que
trajetórias com raio próximo ao limite inferior da distribuição para este
parâmetro (~1,0µm) fossem registradas como trajetórias retilíneas
85
quando registradas em micrografias obtidas em campo escuro com
longo tempo de exposição. Nesse caso, as trajetórias retilíneas relatadas
por Keim et al. (2004a) poderiam ser trajetórias helicoidais com raio
pequeno e/ou passo da hélice muito grande.
Os valores encontrados para passo da hélice e raio da trajetória
demonstram que as trajetórias helicoidais em ambos os campos são
alongadas. Isso indica grande eficiência na coordenação da rotação dos
flagelos para a natação avante nesses microrganismos. Assim como os
resultados obtidos por Winklhofer et al. (2007), que demonstram um
elevado grau de otimização magnética em ‘Candidatus Magnetoglobus
multicellularis’ (~80%), nossos resultados demonstram um elevado
grau de otimização do movimento avante. Também do mesmo modo
que a otimização magnética (WINKLHOFER et al., 2007), a otimização
do movimento avante implica em um nível elevado de organização entre
as células que compõem os indivíduos de ‘Candidatus Magnetoglobus
multicellularis’.
Sob
o
campo
magnético
de
20,0
Gauss,
as
trajetórias
apresentaram médias superiores tanto para a velocidade média quanto
para a velocidade instantânea. As médias para o raio e para o ângulo θ
sob 20,0 Gauss, inferiores aos obtidos sob 3,9 Gauss, indicam que a
hélice descrita sob esse valor de campo magnético aplicado é mais
estreita quando comparada com as trajetórias descritas sob 3,9 Gauss.
O passo da hélice não variou de forma significativa com o aumento
do campo magnético aplicado. Como o raio sob 20,0 Gauss foi menor, a
distância percorrida durante cada passo de hélice foi inferior sob esta
intensidade de campo aplicado. Tais dados indicam que a natação
avante se torna ainda mais eficiente com o aumento do campo
magnético aplicado, visto que a bactéria nada menos no plano
perpendicular ao eixo de simetria da hélice e percorre uma distância
menor ao longo da trajetória helicoidal, para uma mesma velocidade
86
média. O período necessário para cada passo da hélice sob 20,0 Gauss
também foi menor. A figura 24 apresenta um resumo da variação dos
parâmetros para os diferentes campos magnéticos aplicados.
Figura 24: Comparação da variação dos parâmetros das trajetórias helicoidais de
‘Candidatus Magnetoglobus Multicellularis’ sob 3,9 e 20,0 Gauss.
O ligeiro aumento da eficiência da natação avante sob campo de
20,0 Gauss poderia ser resultado de um maior alinhamento passivo do
microrganismo às linhas de campo magnético ou de alguma influência
sobre a rotação dos flagelos causada pela intensidade do campo
magnético.
Apesar das diferenças entre os valores médios encontrados para
raio da hélice, velocidades média e instantânea, período, velocidade
angular e ângulo θ, a forma dos histogramas de distribuição dos
parâmetros das trajetórias de ‘Candidatus Magnetoglobus Multicellularis’
não sofreram grandes alterações entre os diferentes campos magnéticos
aplicados. Houve apenas um deslocamento das médias para mais ou
para menos dependendo do parâmetro, o que indica que as diferenças
87
encontradas entre os dados obtidos sob dois campos magnéticos
distintos são reais, e não artefatos metodológicos.
Greenberg et al. (2005) demonstraram que o escape motility em
um
procarioto
magnetotáctico
multicelular
é
influenciado
pela
intensidade do campo magnético aplicado. O escape motility raramente
ocorre sob campos magnéticos baixos, sendo que a probabilidade de tal
evento ocorrer aumenta com o módulo do campo magnético aplicado. A
variação na aceleração observada durante esse movimento não pode ser
explicada pelo modelo de torque passivo, o que sugeriu que este
microrganismo apresenta algum tipo de magnetorrecepção.
A alteração dos parâmetros que descrevem a trajetória helicoidal
de ‘Candidatus Magnetoglobus Multicellularis’ não pode ser explicada
apenas por um maior alinhamento passivo do microrganismo em relação
ao campo, pois nesse caso, os valores médios do passo da hélice seriam
diferentes para cada valor de campo magnético aplicado.
Lins de Barros, Farina & Esquivel (1990) demonstraram que a
velocidade de natação de bactérias magnetotácticas aumenta até certo
ponto com o aumento do campo magnético aplicado.
As médias de
velocidade obtidas para cada valor de campo se sobrepõem a uma curva
ajustada a partir da Função de Langevin. Tal modelo parte do
pressuposto de que uma população de bactérias magnéticas pode ser
comparada a uma distribuição de dipolos magnéticos submetidas a
interações
térmicas.
Uma
vez
que
uma
célula
encontra-se
suficientemente distante da outra, o modelo físico será idêntico ao
adotado para descrever materiais paramagnéticos.
Os dados do presente trabalho sugerem que a intensidade do
campo
magnético
aplicado
influencia
a
natação
de
‘Candidatus
Magnetoglobus multicellularis’ de alguma forma além da orientação
passiva,
o
que
é
evidenciado
pelas
diferenças
encontradas
nos
parâmetros das trajetórias.
88
O fato de que as medidas sob os diferentes campos magnéticos
foram obtidas a partir de amostras distintas oriundas de diferentes
coletas não pode ser desconsiderado. As condições ambientais no
momento
das
coletas
microrganismos
e,
podem
ter
influenciado
consequentemente,
a
alterado
motilidade
dos
formato
das
o
trajetórias. Nesse caso, seria esperado que, entre as amostras, um ou
mais
parâmetros
apresentasse
diferença
significativa
na
sua
distribuição. Mesmo entre diferentes amostras de uma mesma coleta
poderia
haver
variações,
pois
o
microambiente
onde
vivem
os
microrganismos pode variar em distâncias da ordem de micrômetros.
Para
a
comprovação
magnetorrecepção
da
sensível
hipótese
ao
de
módulo
um
do
mecanismo
campo
aplicado
de
em
‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’, experimentos realizados a
partir de uma mesma amostra serão necessários. A análise das
trajetórias
sob
um
número
maior
de
campos
magnéticos
com
intensidades distintas pode fornecer informações indicando a partir de
que intensidade de campo magnético os parâmetros na natação são
alterados.
No sedimento de ambientes aquáticos, onde os ‘Candidatus
Magnetoglobus
multicellularis’
e
outros
procariotos
magnéticos
multicelulares são encontrados, existem muitos obstáculos físicos à
natação unidirecional: os grãos de sedimento. Dessa forma, estes
microrganismos devem ter mecanismos para desviar desses obstáculos.
‘Candidatus
comprimento
Magnetoglobus
médio
de
Multicellularis’
2,4±0,5µm. Sob
possui
flagelos
a influência
do
com
campo
magnético terrestre, os flagelos curtos causam desalinhamento da
trajetória, fazendo com que a bactéria altere a sua direção de natação
quando, por exemplo, se choca com um obstáculo no meio (NOGUEIRA
E LINS DE BARROS, 1995; FRANKEL et al., 1997). Isso é evidenciado no
vídeo 8, onde microrganismos que se chocam com obstáculos enquanto
89
nadam alinhados a um campo magnético gerado por um ímã conseguem
facilmente contornar o obstáculo e seguir nadando avante.
As velocidades observadas sob condições aeróbias e sob campo
magnético aplicado superior ao campo geomagnético utilizados neste
trabalho
não
correspondem
necessariamente
às
observadas
no
ambiente. O campo geomagnético no local da coleta é muito inferior aos
campos utilizados no presente estudo. O fato dos experimentos terem
sido realizados sob condições aeróbias também pode ter influenciado os
valores obtidos para os parâmetros de natação helicoidal.
5.3. Comparação do movimento de ‘Candidatus Magnetoglobus
multicellularis’ com o de outras bactérias
A maioria das bactérias encontradas em ambientes marinhos com
gradiente vertical de oxigênio apresenta elevada velocidade de natação,
o que pode ser considerado uma adaptação comum a este tipo de
ambiente (FENCHEL & THAR, 2004). São exemplos Ovobacter propellens
e Thiovulum majus, ambas as bactérias flageladas e de tamanho grande
relativamente à maioria dos procariotos (FENCHEL, 1994; FENCHEL &
THAR, 2004). ‘Candidatus Magnetoglobus Multicellularis’ também se
encontra em ambiente com estratificação vertical de oxigênio e
apresenta alta velocidade de natação. O tamanho relativamente grande
do indivíduo multicelular permitiu o estudo das trajetórias deste
microrganismo utilizando microscopia ótica de campo claro, mesmo
sendo as células individuais de tamanho normal (~1µm de diâmetro).
A natação em trajetórias helicoidais é um fenômeno comumente
observado em microrganismos com dimensões entre 5 e 500µm
(CRENSHAW,
1999a).
Purcell
(1977)
sugere
que
microrganismos
propelidos por estruturas cilíndricas como cílios e flagelos sob regime de
90
baixo número de Reynolds tendem a nadar em trajetórias helicoidais,
pois qualquer falta de uniformidade no corpo do microrganismo pode
gerar uma componente rotacional no movimento.
A razão pela qual as bactérias com dimensões da ordem de 1µm
não nadam em trajetórias helicoidais se dá pelo fato de que a
componente rotacional é mais afetada pelo movimento browniano
(BERG, 1983; FENCHEL, 1994; FENCHEL & THAR, 2004). Como tal
efeito é inversamente proporcional ao cubo do diâmetro celular,
microrganismos apresentando diâmetros maiores são menos afetadas
pela
energia
térmica
do
meio
(FENCHEL,
1994).
‘Candidatus
Magnetoglobus Multicellularis’, Ovobacter propellens e Thiovulum majus
possuem dimensões grandes o suficiente para que a componente
rotacional de suas trajetórias seja pouco afetada pelo movimento
browniano.
A bactéria Ovobacter propellens possui diâmetro entre 4 e 5µm,
formato ovóide, parede celular Gram-negativa, e um proeminente tufo
de flagelos. Essas bactérias comumente nadam com velocidades entre
0,6 e 0,7mm/s, sendo observados indivíduos que nadam a 1mm/s. A
trajetória da natação consiste em uma hélice com sentido anti-horário
(com o microrganismo se afastando do observador). O momento
angular dos motores dos flagelos faz com que a célula gire no sentido
horário. As trajetórias possuem raio entre 2 e 3µm, com passo da hélice
entre 5 e 10µm e período entre 0,1 e 0,2s. As células podem alterar a
direção de natação de forma abrupta, mas sem realizar tumble. Isso
ocorre através da alteração da razão entre a velocidade de natação e a
velocidade instantânea. Tipicamente, as células realizam curvas de
180°, mas são observadas alterações da direção de natação com
ângulos entre 110° e 270° (FENCHEL, 1994; FENCHEL & THAR, 2004).
A bactéria Thiovulum majus possui diâmetro entre 5 e 25µm,
apresenta
flagelos
peritríqueos
e,
assim
como
‘Candidatus
91
Magnetoglobus
multicellularis’
e
Ovobacter
propellens,
nada
em
trajetórias helicoidais. Tanto a trajetória quanto a célula giram no
sentido anti-horário (com a bactéria de afastando do observador). O raio
das trajetórias varia entre 5 e 40µm, com passo da hélice entre 40 e
250µm. O período varia entre 0,2 e 1s. A velocidade tangencial varia
entre 150 e 600µm/s, com velocidades máximas obtidas sob condições
de O2 que excedem a concentração ótima.
Em experimentos sob
condições de gradiente de oxigênio, as células que nadam para fora da
banda realizam um u-turn de 150-200µm, o que faz com que retornem
para a banda (FENCHEL, 1994). A tabela 2 apresenta os valores de
alguns dos parâmetros das trajetórias helicoidais de ‘Candidatus
Magnetoglobus multicellularis’, Ovobacter propellens e Thiovulum majus
e os dados disponíveis para E. coli, para comparação.
Tabela 2: Parâmetros da natação helicoidal de bactérias de ambiente marinho com estratificação vertical de oxigênio. Dados de E. coli estão na tabela para comparação. Bactéria Ovobacter propellens Thiovulum majus Raio da Passo da Diâmetro Velocidade Rotação da Rotação do (μm) (μm/s) Trajetória microrganismo 4‐5 600‐700 Anti‐horária Horária 2‐3 5‐10 0,1‐0,2 5‐25 150‐600 Anti‐horária Anti‐horária 5‐40 40‐250 0,1‐1,0 Trajetória (μm/s) Hélice (μm) Período (s) Refs. FENCHEL & THAR, 2004 FENCHEL, 1994 *KEIM et al., 2004b; ‘Candidatus Magnetoglobus 6‐9,5* 30‐170** Anti‐horária*
Anti‐horária* 1‐10** 20‐200** 0,8‐1,0** Multicellularis’ *KEIM et al., 2006 **ESTE TRABALHO Escherichia coli 2,5 x 0,9 29 ± 6 Horária DARNTON et al., 2007 92
Os valores médios obtidos para os raios das trajetórias de
‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ (5 e 4µm sob os campos
magnéticos de 3,9 e 20,0 Gauss, respectivamente) são também muito
próximos aos valores médios do raio dos microrganismos, entre 3 e 5
µm (KEIM et al., 2004b). De modo similar, os valores de raio do
microrganismo e da trajetória são relativamente próximos em Ovobacter
propellens e Thiovulum majus. Se a semelhança entre estes valores é
mera coincidência ou resultado do mecanismo de propulsão destes
microrganismos, permanece uma questão a ser respondida.
‘Candidatus Magnetoglobus Multicellularis’ apresenta a rotação da
trajetória helicoidal e do corpo no mesmo sentido. Essa característica,
também observada em Thiovulum majus, pode ser consequência do tipo
de flagelação. Thiovulum majus apresenta flagelos curtos (comprimento
total menor que o comprimento de onda), com distribuição peritríquea
(DE BOER, RIVIÈRE & HOUWINK; 1961; SILVA et al., 2007). Se
considerarmos
o
microrganismo
como
um
todo,
‘Candidatus
Magnetoglobus Multicellularis’ apresenta esse mesmo tipo de flagelação
(SILVA et al., 2007). Ovobacter propellens apresenta rotação da
trajetória e da célula em sentidos opostos. Apesar de possuir dimensões
próximas às do ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ e Thiovulum
majus, Ovobacter propellens apresenta um tipo de flagelação distinta,
caracterizada por um proeminente tufo de flagelos emergindo de um dos
lados da célula. Para organismos propelidos por flagelos lofotríqueos
(tufo de flagelos emergindo de um ponto da célula), como Ovobacter
propellens, a frequência de rotação do corpo é proporcional à frequência
de rotação do flagelo. Contudo, não se pode afirmar o mesmo para
microrganismos com flagelação peritríquea (com flagelos emergindo de
diferentes pontos da superfície celular).
A comparação entre os parâmetros das trajetórias helicoidais
entre ‘Candidatus Magnetoglobus Multicellularis’, Thiovulum majus e
93
Ovobacter propellens sugere que o padrão de distribuição dos flagelos
pode ter implicação no passo da hélice das trajetórias. Candidatus e
Thiovulum, que possuem flagelos peritríqueos, apresentam valores de
passo da hélice bem maiores e bem mais próximos entre si quando
comparados com Ovobacter (Tabela 2). A rotação da célula e da
trajetória no mesmo sentido parece ser também consequência desse
tipo de distribuição de flagelos.
Apesar
de
Thiovulum
majus
e
‘Candidatus
Magnetoglobus
Multicellularis’ possuírem o mesmo padrão de movimento, distribuição e
tamanho de flagelos (DE BOER, RIVIÈRE & HOUWINK; 1961; SILVA et
al., 2007), Thiovulum majus apresenta velocidade de natação bastante
superior à observada em ‘Candidatus Magnetoglobus Multicellularis’
(150-600µm/s).
Isso
pode
ser
consequência
da
fisiologia
do
microrganismo, ou ainda de uma maior eficiência na coordenação dos
flagelos em Thiovulum majus, dada a sua natureza unicelular.
Por
outro
lado,
a
natação
em
‘Candidatus
Magnetoglobus
Multicellularis’ pressupõe um mecanismo mais complexo de controle da
rotação dos flagelos, dada a sua natureza multicelular. A coordenação
da rotação dos flagelos entre as diferentes células que constituem o
‘Candidatus Magnetoglobus Multicellularis’ seria, nesse caso, menos
eficiente que a observada em Thiovulum majus.
5.4. Resposta de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ a
pulso de laser e luz ultravioleta.
OBERPICHLER et al. (2008) classifica a resposta de bactérias à luz
em três tipos: escotofóbica, fotocinética e fototáctica (HÄDER, 1987;
RAGATZ et al., 1994; 1995; GEST, 1995). A resposta escotofóbica é
caracterizada por uma ‘fobia ao escuro’: bactérias que nadam para
94
regiões onde a intensidade da luz é reduzida realizam tumble, cessam o
movimento ou revertem a direção de natação. A fotocinese é descrita
como uma alteração na taxa de motilidade, ou seja, na velocidade do
movimento causada por diferenças na intensidade da luz. A resposta
fototáctica, por sua vez, consiste na orientação do movimento da
bactéria em resposta a uma fonte de luz.
‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’, quando concentrados
magneticamente na borda de uma gota d’água, apresentam resposta
claramente fotocinética quando realiza movimento do tipo Rotation: as
células passam a girar mais lentamente em torno do seu próprio eixo
quando um filtro verde é posicionado entre a fonte de luz e a amostra
(Vídeo
6).
Contudo,
as
respostas
observadas
em
‘Candidatus
Magnetoglobus multicellularis’ quando expostos a pulsos de laser e à luz
ultravioleta
não
se
enquadram
perfeitamente
em
nenhuma
das
respostas de microrganismos à luz descritas acima.
No caso do laser ultravioleta, houve a morte do indivíduo atingido
diretamente (como esperado) e um efeito coletivo dos microrganismos
próximos, que nadaram na direção oposta, retornando após vários
segundos. Como houve a morte do indivíduo diretamente atingido pelo
laser, há a possibilidade de que alguma substância liberada pela lise
celular tenha induzido a resposta fóbica. Contudo, mesmo atingindo
novamente o mesmo microrganismo já morto, a resposta ocorre, mas
após algumas repetições o efeito diminui. O fato de que uma resposta
similar foi observada com luz UV, que não induziu a morte de nenhum
indivíduo durante a observação, sugere que um mecanismo de
adaptação, similar ao utilizado em quimiotaxia, está presente.
A adaptação em quimiotaxia ocorre quando a sensibilidade do
receptor diminui, fazendo com que uma concentração maior do ligante
seja necessária para produzir a mesma resposta. A adaptação permite
às bactérias quimiotácticas seguir um gradiente de concentração
95
utilizando
um
mesmo
receptor,
desde
a
menor
até
a
maior
concentração, pois o receptor vai se “adaptando” às concentrações
crescentes do ligante (perdendo sensibilidade) pelo caminho (MADIGAN
& MARTINKO, 2006).
‘Candidatus
Magnetoglobus
multicellularis’
é
encontrado
predominantemente no sedimento, onde a incidência de luz é pequena
ou inexistente. Quando observado ao microscópio óptico, a exposição à
luz parece ter um efeito deletério: amostras observadas durante longo
tempo perdem progressivamente a motilidade. É provável que a luz,
sobretudo
a
UV,
constitua
um
fator
de
estresse
para
estes
microrganismos. As diferenças observadas entre a resposta da aplicação
da luz e do laser UV provavelmente se dão em função da densidade de
energia luminosa aplicada sobre a amostra.
Alterações na motilidade de bactérias em função da exposição à
luz UV são relatadas na literatura. Cianobactérias, por exemplo, são
extremamente sensíveis à luz ultravioleta, mesmo sob níveis ambientais
de UV-B. Sob condições de luz solar, tanto a motilidade quanto a fotoorientação são afetadas. Halobacterium ssp., uma bactéria heterotrófica
de ambientes hipersalinos, reverte a direção de movimento quando sai
de regiões iluminadas com luz verde ou quando penetra em regiões
iluminadas com luz ultravioleta ou azul. Similarmente ao observado em
nossos resultados, a iluminação UV causa a dispersão dos indivíduos do
campo de observação (HÄDER, 1987).
A
similaridade
da
resposta
de
‘Candidatus
Magnetoglobus
multicellularis’ ao laser e à luz ultravioleta com o “escape motility” é
muito grande: ambas envolvem movimento no sentido oposto, seguido
de “free motion”. Apesar do nome, até o momento não há qualquer
evidência de que o “escape motility” seja uma resposta a estímulos
negativos ou prejudiciais. A resposta ao ultravioleta seria a primeira
evidência neste sentido.
96
6. CONCLUSÕES
• Os parâmetros que descrevem a natação em trajetórias
helicoidais (free motion) da bactéria magnetotáctica multicelular
‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ sob dois campos magnéticos
aplicados (3,9 e 20 Gauss) foram quantificados.
• Foi desenvolvida uma metodologia que permite a análise eficiente
de um grande número de trajetórias de bactérias magnetotácticas
através de vídeo-microscopia e processamento de imagem.
• Os valores de passo da hélice e raio das trajetórias obtidos no
presente trabalho sugerem que as trajetórias retilíneas de ‘Candidatus
Magnetoglobus Multicellularis’ previamente relatadas na literatura
podem ser trajetórias helicoidais com raio pequeno e/ou passo da hélice
muito grande.
• As trajetórias helicoidais em ambos os campos magnéticos
aplicados são alongadas, indicando grande eficiência na coordenação da
rotação dos flagelos para a natação avante nesses microrganismos.
• Assim como o elevado grau de otimização magnética em
‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’, a otimização do movimento
avante implica em um nível elevado de organização entre as células que
compõem os indivíduos.
• A natação avante de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’
aparentemente se torna mais eficiente com o aumento do campo
magnético aplicado.
97
• A intensidade do campo magnético aplicado influencia a natação
de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ de alguma forma além da
orientação passiva. Experimentos realizados a partir de uma mesma
amostra
e
sob
um
número
maior
de
campos
magnéticos
com
intensidades distintas serão necessários para a comprovação da
hipótese da existência de mecanismo de magnetorrecepção sensível ao
campo magnético aplicado.
• As
velocidades
de
natação
observadas
em
‘Candidatus
Magnetoglobus multicellularis’ corroboram a hipótese de que elevadas
velocidades de natação constituem uma adaptação comum a bactérias
encontradas em ambientes marinhos com gradiente vertical de oxigênio.
• A comparação entre os parâmetros das trajetórias helicoidais de
‘Candidatus Magnetoglobus Multicellularis’ com os de outras bactérias
sugere que o padrão de distribuição dos flagelos pode ter implicação no
passo da hélice das trajetórias. A rotação da célula e da trajetória no
mesmo sentido parece ser também consequência do tipo de distribuição
de flagelos.
• A menor velocidade de natação de ‘Candidatus Magnetoglobus
Multicellularis’ quando comparada com a observada em Thiovulum
majus pode ser consequência da fisiologia do microrganismo, ou ainda
de uma maior eficiência na coordenação dos flagelos na bactéria
unicelular.
• ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ apresenta resposta
fotocinética quando realiza movimento do tipo Rotation: as células
passam a girar mais lentamente em torno do seu próprio eixo quando
um filtro verde é posicionado entre a fonte de luz e a amostra.
98
• As
respostas
observadas
em
‘Candidatus
Magnetoglobus
multicellularis’ quando expostos a pulsos de laser e à luz ultravioleta não
se
enquadram
perfeitamente
em
nenhuma
das
respostas
de
microrganismos à luz descritas até o momento na literatura.
• A redução da resposta coletiva observada após sucessivos pulsos
de laser UV e o fato de que uma resposta similar ter sido observada com
luz UV sugere que um mecanismo de adaptação, similar ao utilizado em
quimiotaxia,
está
presente
em
‘Candidatus
Magnetoglobus
multicellularis’.
• A
similaridade
da
resposta
de
‘Candidatus
Magnetoglobus
multicellularis’ ao laser e à luz ultravioleta com o “escape motility”
constitui a primeira evidência de que este padrão de movimento seja
uma resposta a estímulos negativos ou prejudiciais.
99
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