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New approaches for standardization and validation of qRT‐PCR assays for quantitation of yellow fever on clinical samples with high quality parameters. Alice Gomes Fernandes, Bio‐manguinhos Introdução Gênero Flavivírus, família Flaviviridae; RNA fita simples positiva; Genoma completo possui 10.862 nucleotídeos; Três proteínas estruturais e sete não estruturais; Doença infecciosa viral aguda de curta duração; Oligossintomática; Forma fulminante; Sintomas clássicos de icterícia, albuminúria e hemorragias; 20 a 50% dos casos levam a óbito; Uma das vacinas mas efetivas e seguras já produzida; Nos 73 anos decorridos desde seu desenvolvimento, a vacina foi administrada em mais de 540 milhões de pessoas no mundo; Bio‐Manguinhos (Fiocruz) é reconhecido internacionalmente como fabricante da vacina febre amarela; Alice Gomes Fernandes, Bio‐Manguinhos Etapas na produção de uma Vacina Produção dos antígenos Produção dos lotes vacinais Testes clínicos Análise de eventos adversos Objetivos Objetivo Geral Padronizar e validar a técnica de PCR em tempo real para a quantificação do vírus da febre amarela em amostras clínicas e no acompanhamento da cinética viral in vitro; Objetivos Estabelecer uma correlação entre PFU/mL e a quantidade Específicos (cópias) de RNA/mL de vírus de febre amarela em amostras clínicas e em vírus propagado em biorreatores; Acompanhar a cinética de replicação do vírus da febre amarela através da PCR em tempo real e do ensaio de plaque. Padronização e Validação Sensibilidade Precisão Intermediária Repetitividade Linearidade Mesmo operador em dias distintos Reprodutibilidade Limite de quantificação Limite de detecção Operadores distintos no mesmo dia Especificidade e Especificidade Analítica Metodologia Sonda TaqMan® e iniciadores usados na validação, para o alvo correspondente à região NS5 de Febre amarela (YFV) (Mantel e cols, 2008) Tamanho do amplicom 83 pares de bases. Extração de RNA kit “QIAamp Viral RNA Mini” (QIAGEN) Síntese de DNA complementar Kit High‐Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems) Oligo oligo (+) oligo (‐) Sonda Especificidade Febre amarela Febre amarela Febre amarela Sequência 5’‐3’ GCACGGATGTAACAGACTGAAGA CCAGGCCGAACCTGTCAT F‐CGACTGTGTGGTCCGGCCCATC‐T RT‐qPCR TaqMan® Universal PCRMaster Mix (Applied Biosystems) Metodologia Extraída de Invitrogen user manual. TOPO TA Cloning® Kit for Sequencing Version O. 10 April 2006 25‐0276 Limite de Detecção (LD) e Limite de Quantificação (LQ) Precisão intermediária Especificidade e especificidade analítica Amostra Ct Vírus da febre amarela 10⁶ cópias/reação Vírus da febre amarela 10⁵ cópias/reação Vírus da febre amarela 10⁴ cópias/reação Vírus da febre amarela 10³ cópias/reação Vírus da febre amarela 10² cópias/reação Vírus do Dengue 1 Vírus do Dengue 2 Vírus do Dengue 3 Vírus da encefalite Japonesa Controle negativo 19,31 22,76 25,78 29,60 34,54 Indeterminado Indeterminado Indeterminado Indeterminado Indeterminado Resultado da validação o N 1 2 3 4 Parâmetros de Avaliação Repetitividade do método Precisão Intermediária variando dia - Gisela Precisão Intermediária variando dia - Alice Precisão Intermediária variando analista 5 Especificidade Resultado P. sorologico S. Alto 3,35 S. Alto 0,71 S. Alto 2,28 S. Alto 1,72 S. médio 1,72 S. médio 0,45 S. médio 1,31 S. médio 1,13 Critério de Aceitação Amostra clínica S. baixo 2,84 S. baixo 2,17 S. baixo 2,22 S. baixo 2,14 S. Alto 0,62 S. Alto S. Alto 1,07 S. Alto 1,29 S. médio 2,14 S. médio - S. médio 1,57 S. médio 1,59 S. baixo 2,74 S. baixo S. baixo 1,98 S. baixo CV < 20% 10% 2,08 Conforme Positivo para o vírus de febre amarela Negativo para os demais vírus 6 Limite de detecção 7 Limite de quantificação Diluição 12,5 com o CT médio de 36,14 Diluição 100 com o CT médio 34,16 *Dados analisados pelo SEVAN/Biomanguinhos **Os critérios utilizados são os adotados pelo Manual da ANVISA, 2003 A determinar A determinar Controles Internos da reação Amostra Amostra Clínica Baixa Amostra Clínica Média Amostra Clínica Alta Painel Sorológico Alto Painel Sorológico Baixo Vírus Reconstituído em Soro Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4 Amostra 5 Soro Negativo Ct Febre Amarela 36,40 35,84 34,95 20,96 27,49 20,80 35,25 Indeterminado Indeterminado Indeterminado Indeterminado Indeterminado Ct RNAse P 31,30 31,41 31,93 30,43 29,22 29,99 29,99 30,82 31,39 31,78 30,12 30,54 Fator de correlação Log10 Cópias/mL=7,04 Log10 PFU/mL= 0,974±0,049x7,04‐2,807 Log10 PFU/mL= 4,39 Valor experimental em PFU/mL=4,79 slope: 0,974 interceptor: 2,807 R: 0,96 Log10 PFU/mL = 0,974±0,049 Log10 cópias/mL – 2,807 Conclusão A validação da metodologia de RT‐qPCR atendem a todos os parâmetros definidos pelo setor de qualidade de Biomanguinhos. O ideal é a utilização de uma curva padrão plasmidial ao invés de uma estimada por plaque. O teste de RT‐qPCR para o alvo NS5 do vírus da febre amarela se mostrou altamente específico. A RNase P e o EXO‐IPC se comportaram como excelentes controles internos. Confirmamos a existência de uma correlação entre PFU/mL e Cópias/mL. A técnica de PCR em tempo real se mostrou eficiente para determinação da carga viral do vírus da febre amarela, tanto em amostra in vivo quanto in vitro. Colaboradores Instituto Oswaldo Cruz (IOC), FIOCRUZ Laboratório de Biologia Molecular e Doenças Endêmicas Coordenadora: Drª Constança Britto Equipe: Otacílio Moreira Laboratório de Desenvolvimento Tecnológico em Virologia Drª Vanessa Salete de Paula Dr. Marcelo Ribeiro‐Alves Bio‐Manguinhos, FIOCRUZ Dr. Marcos da Silva Freire Laboratório de Tecnologia Virológica Coordenadora: Anna Maya Yoshida Equipe: Sheila Maria de Lima Gisela Freitas Trindade Kelly Araujo Lúcio Renan de Oliveira Vieira Renata Avim Renata Carvalho Pereira Anna Paula Yorio dos Santos Vivane Silva Gomes
