Rubella virus IgG ELISA

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Instruções de Utilização
Rubella virus IgG
ELISA
Ensaio imunoenzimático para a determinação quantitativa de anticorpos
IgG contra vírus de rubéola em soro e plasma humanos.
RE58341
96
2-8°C
I B L
I N T E R N A T I O N A L
Flughafenstrasse 52a
D-22335 Hamburg, Germany
Phone: +49 (0)40-53 28 91-0
Fax: +49 (0)40-53 28 91-11
G M B H
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www.IBL-International.com
Rubella virus IgG ELISA (RE58341)
1.
PORTUGUÊS
APLICAÇÕES
Ensaio imunoenzimático para a determinação quantitativa de anticorpos IgG contra vírus de rubéola em
soro e plasma humanos.
2.
SUMÁRIO E EXPLICAÇÃO
A infecção da rubéola pertence às doenças infantis clássicas com uma imunidade vitalícia, e o vírus é
espalhado em todo o mundo endemicamente. Em populações não vacinadas, 80-90% das infecções
ocorrem durante a infância. Apesar da vacinação contra a rubéola, lançada em 1974, na Alemanha,
continuam a aparecer doenças hereditárias.
O agente causador é um vírus RNA geneticamente estável, que pertence ao género Rubivirus da família
dos togaviridae. Os seres humanos são os únicos hospedeiros naturais conhecidos do vírus da rubéola. A
transmissão ocorre através de infecção por gotículas, com um período de incubação de 14-23 dias.
Clinicamente, a doença manifesta-se como uma infecção respiratória ligeira. Os nódulos linfáticos nucal e
retroauricular incham e é observado um aumento moderado do baço. Um pequeno ou médio aumento de
temperatura aparece junto com uma sensação bastante ligeira de doença. A rubéola é facilmente
ultrapassada com sintomas leves e insignificantes, durante a infância. No entanto, é necessária mais
atenção no caso da infecção de mulheres grávidas não-imunizadas, dadas as possíveis malformações do
feto, que podem ser geradas. Como a infecção pode ser transmitida através da placenta, o feto pode sofrer
danos graves, cuja frequência e gravidade depende do momento da infecção durante a gravidez. A
infecção da rubéolo durante o 1º até ao 4º mês pode provocar um aborto precoce ou um nascimento
prematuro. Uma vez que uma terapia causal específica não existe, os sinais secundários tais como febre,
artrite ou artralgias são tratados sintomaticamente.
O diagnóstico diferenciado é problemático, porque exantemas semelhantes e doenças febris aparecem
também no curso de outras doenças infantis, tais como o sarampo, a escarlatina e parvoviroses.
Estão disponíveis os seguintes métodos laboratoriais: teste de inibição da hemaglutinação (HIT), teste de
hemolisina-gel ELISA. A detecção de anticorpos específicos do vírus da IgM é importante para a avaliação
de infecções recentes e o teste de IgG é utilizado para a determinação da imunidade. No caso de infecções
graves hereditárias, o isolamento do vírus da rubéola a partir de esfregaço faríngeo, da urina e de outras
secreções também pode ser realizado.
3.
PRINCÍPIO DO TESTE
Ensaio Imunoenzimático (ELISA - Enzyme-linked Immunosorbent Assay) de fase sólida baseado na técnica
de sandwich. Os poços são revestidos com antigénio. Anticorpos específicos da amostra ligados aos poços
revestidos com antigénio são detectados por um anticorpo secundário conjugado com enzima (E-Ab)
específico para a IgG humana. Após a reacção do substrato, a intensidade da cor desenvolvida é
proporcional à quantidade de anticorpos IgG específicos detectada. Os resultados das amostras podem ser
determinados directamente utilizando uma curva de calibração.
4.
AVISOS E PRECAUÇÕES
1. Apenas para diagnóstico in vitro. Apenas para utilização profissional.
2. Antes de iniciar o teste, leia as instruções completa e cuidadosamente. Utilize a versão válida do folheto
informativo fornecido com o kit. Tenha a certeza de ter entendido tudo.
3. Em caso de danos no kit por favor contacte a IBL ou o seu fornecedor por escrito, até uma semana
após ter recebido o kit. Não utilize componentes danificados na execução do teste, mas guarde-os para
reclamação.
4. Obedeça ao número de lote e ao prazo de validade. Não misture reagentes de diferentes lotes. Não
utilize reagentes expirados.
5. Siga as boas práticas de laboratório e as normas de segurança. Vista bata, luvas de látex descartáveis
e óculos protectores sempre que necessário.
6. Reagentes do kit contendo material perigoso podem causar irritação da pele e dos olhos. Veja
MATERIAIS FORNECIDOS e os rótulos para mais detalhes. As Fichas de Segurança do produto para
este kit estão disponíveis na Homepage da IBL ou a pedido directamente à IBL:
7. Químicos e reagentes preparados ou utilizados devem ser tratados como resíduos perigosos de acordo
com as normas nacionais de segurança e resíduos perigosos.
8. Evite o contacto com a solução de Paragem. Pode causar irritação na pele e queimaduras.
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PORTUGUÊS
9. Alguns reagentes contêm azida de sódio (NaN3) como conservante. Em caso de contacto com os olhos
ou pele, enxagúe imediatamente com água. A NaN3 pode reagir com o chumbo e o cobre da
canalização para formar azidas metálicas explosivas. Quando descartar os reagentes, enxagúe com
grande volume de água para evitar a formação dos compostos.
10. Todos os componentes deste kit contendo soro ou plasma humano foram testados e foram
considerados não reactivos para HIV I/II, AgHBs e HCV. No entanto, não é possível excluir em absoluto
a presença destes ou outros agentes infecciosos e portanto os reagentes devem ser tratados com
potencialmente perigosos quer na sua utilização quer na sua eliminação.
5.
ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE
O kit é enviado à temperatura ambiente e deve ser armazenado de 2-8ºC. Mantenha-o longe do calor ou da
luz solar directa. A estabilidade e armazenamento das amostras e reagentes preparados são referidos nas
secções correspondentes.
Os reagentes não abertos permanecem estáveis até a data de validade indicada. O kit é estável até 3
meses após a primeira abertura, quando a Placa de Microtitulação é embalada num saco bem fechado, as
garrafas são fechadas as respectivas com tampas e o kit é armazenado a 2-8 °C.
6.
RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS
Soro, Plasma (EDTA, Citrate)
Devem ser observados os cuidados usuais para a punção venosa. É importante preservar a integridade
química da amostra de sangue desde o momento da colheita até ao momento de ser analisada. Não utilize
amostras muito hemolíticas, ictéricas ou lipémicas. Amostras que apresentem turvação deverão ser
centrifugadas antes do teste e devem ser removidas as partículas de matéria.
Armazenamento:
Estabilidade:
7.
2-8°C
2 dias
-20°C
> 2 dias
Manter afastado do calor ou luz solar directa.
Evitar congelar-descongelar repetidamente.
MATERIAIS FORNECIDOS
Quantidade
Símbolo
1 x 12 x 8
MTP
1 x 15 mL
ENZCONJ IgG
5 x 2 mL
CAL A-E
1 x 60 mL
DILBUF
1 x 60 mL
WASHBUF
CONC
Tampão de Lavagem, Concentrado (10x)
1 x 15 mL
TMB SUBS
Solução de Substrato TMB
1 x 15 mL
TMB STOP
Solução de Paragem TMB
2x
FOIL
Película Aderente
BAG
Saco Plástico
1x
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Componente
Microplaca
Tiras separáveis. Revestida com antigénios específicos.
Conjugado Enzimático IgG
Colorido vermelho. Pronto a usar. Contêm: anti-humano IgG, conjugado com
peroxidase, tampão contendo proteína, estabilizantes.
Padrão A-E
0; 10; 50; 200; 500 IU/mL. Pronto a usar.
Padrão A = Controlo Negativo
Padrão B = Controlo „Cut-off“
Padrão C = Controlo positivo fraco.
Padrão D = Controlo Positivo
Padrão E = Controlo fortemente positivo
Contêm: IgG anticorpos contra Rubéola, Soro humano, PBS, estabilizantes.
Tampão de Diluição
Cor azul. Pronto a usar. Contêm: PBS Tampão, BSA, < 0.1 % NaN3.
Contêm: PBS Tampão, Tween 20.
Pronto a usar. Contêm: TMB.
Pronto a usar. 0.5 M H2SO4.
Para tapar a Microplaca durante a incubação.
Resselável. Para armazenamento a seco de tiras não usadas.
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5.
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PORTUGUÊS
MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS
Pipetas (Multipette Eppendorf ou aparelhos semelhantes, < 3% CV). Volumes: 5; 50;100; 500 µL
Proveta
Tubos (1 mL) para diluição de amostras
Pipeta de 8 canais com reservatório de reagente
Recipiente de lavagem, sistema de lavagem de microplacas automático ou semi-automático
Leitor de microplacas com capacidade de ler absorvâncias a 450 nm (comprimento de onda de referência
600-650 nm)
7. Água bidestilada ou desionizada
8. Toalhas de papel, pontas para pipetas e cronómetro
9.
NOTAS SOBRE O PROCEDIMENTO
1. O manuseamento incorrecto da amostra ou alterações no procedimento do teste podem influenciar os
resultados. Os volumes de pipetagem indicados bem como os tempos de incubação, a temperatura e os
passos de pré-tratamento devem ser realizados estritamente de acordo com as instruções. Utilize
apenas pipetas e instrumentos calibrados.
2. Uma vez iniciado o teste, todos os passos devem ser executados sem interrupção. Garanta que os
reagentes necessários, os materiais e dispositivos são preparados e prontos a usar no tempo
apropriado. Todos os reagentes e amostras devem estar à temperatura ambiente antes de utilizar
(18-25ºC). Agite cuidadosamente todos os frascos de reagentes líquidos e a amostra antes de utilizar.
Agite os reagentes sem formar espuma.
3. Evite a contaminação dos reagentes, pipetas e poços/tubos. Utilize pontas novas descartáveis para
cada reagente, padrão ou amostra. Não troque as tampas. Feche sempre os frascos não utilizados. Não
reutilize poços/tubos ou reagentes.
1. Recomenda-se a determinação em duplicado das amostras de maneira a identificar potenciais erros de
pipetagem (CV >10%).
2. Utilize um esquema de pipetagem para verificar uma disposição apropriada na placa.
3. O tempo de incubação afecta os resultados. Todos os poços devem ser manuseados pela mesma
ordem e na mesma sequência de tempo. E recomendável utilizar uma Micropipeta de 8 canais para a
pipetagem das soluções nos poços.
4. A lavagem da microplaca é importante. Poços mal lavados originam resultados errados. É
recomendável utilizar uma pipeta multicanal ou um sistema automático de lavagem de microplacas. Não
permitia que os poços sequem entre lavagens. Não arranhe as paredes dos poços durante a lavagem e
aspiração. Encha todos os reagentes com cuidado. Enquanto lava, verifique que todos os poços são
cheios com o Tampão de Lavagem e que não há resíduos nos poços.
5. A humidade afecta os tubos/poços revestidos. Não abra o saco até atingir a temperatura ambiente. Os
tubos/poços não utilizados devem ser automaticamente guardados no saco incluindo o dessecante.
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10.
PORTUGUÊS
INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE
10.1. Preparação de Componentes
Os conteúdos do kit para 96 determinações podem ser divididos em 3 séries separadas.
Os volumes indicados em baixo são para uma experiência com 4 tiras (32 determinações).
Diluir /
dissolver
Componente
20 mL
WASHBUF
Diluente
Relação
Observações
1:10
Aquecer até 37°C para
dissolver cristais.
Misturar energicamente.
180 mL agua bidest.
Armazenamento Estabilidade
2-8°C
4 sem
10.2. Diluição de Amostras
Amostra
Soro / Plasma
diluir
com
Relação
Observações
geralmente
DILBUF
1:101
p.ex. 5 µL + 500 µL DILBUF
Amostras que contenham concentrações superiores à do padrão mais elevado têm que ser novamente
diluídas.
11.
PROCEDIMENTO DO ENSAIO
1. Pipetar 100 µL de cada Controlo e amostra diluída para os respectivos poços da Microplaca.
2. Tapar a placa com película adesiva. Incubar 60 min a 18-25°C.
3. Retire a folha. Rejeitar a solução de incubação. Lave a placa 3 x com 300 µL de Solução de
Lavagem. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel.
4. Pipetar 100 µL de Conjugado Enzimático para cada poço.
5. Tapar a placa com nova película adesiva. Incubar 30 min a 18-25°C.
6. Retire a folha. Rejeitar a solução de incubação. Lavar a placa 3 x com 300 µL de Tampão de
Lavagem diluído. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel.
7. Para a adição das Soluções de Substrato e de Paragem usar uma pipeta de 8 canais. A pipetagem
deve ser executada nos mesmos intervalos de tempo para as Soluções de Substrato e de Paragem.
Usar a técnica de “positive displacement” e evitar a formação de bolhas de ar.
8. Pipetar 100 µL de Solução de Substrato TMB para cada poço.
9. Incubar 20 min a 18-25°C, no escuro. (Sem película aderente.)
10. Parar a reacção de substrato adicionando 100 µL de Solução de Paragem TMB a cada poço.
Misturar rapidamente os conteúdos agitando cuidadosamente a placa. A cor muda de azul para
amarelo.
11. Medir a densidade óptica com um fotómetro a 450 nm (Comprimento de onda de referência:
600-650 nm) nos 60 min a seguir à pipetagem da Solução de Paragem.
12.
CONTROLO DE QUALIDADE
Os resultados do teste são válidos apenas se o teste tiver sido executado seguindo as instruções. Além
disso, o operador deve seguir estritamente as regras de GLP (Good Laboratory Practice) ou outros
padrões/leis aplicáveis. Todos os padrões/controlos do kit devem-se encontrar dentro de limites aceitáveis
como indicado no Certificado de Controlo de Qualidade. Caso não se cumpram esses critérios, o teste não
é válido e deve ser repetido. Cada laboratório deve usar amostras conhecidas como controlos adicionais. É
recomendável participar em ensaios de garantia da qualidade apropriados.
No caso de qualquer desvio, os seguintes detalhes técnicos devem ser verificados: datas de validade dos
reagentes (preparados), condições de armazenamento, pipetas, equipamentos, condições de incubação e
métodos de lavagem.
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13.
PORTUGUÊS
CÁLCULO DE RESULTADOS
A avaliação do teste pode ser feita quer qualitativamente quer quantitativamente.
13.1. Avaliação Qualitativa
O valor do Cut-off é dado pela DO do Padrão B (Padrão de Cut-off). O Índice de Cut-off (COI) é calculado a
partir das densidades ópticas médias da amostra e do valor do cut-off. Amostras com DO superiores são
positivas, amostras com DO inferiores são negativas.
Se a densidade óptica da amostra estiver num intervalo de 20% á volta do valor de cut-off (zona cinzenta),
a amostra deve ser considerada como equívoca. Nesse caso, a repetição do teste com o soro ou mesmo
com uma nova amostra de um mesmo paciente, tomada após 2-4 semanas, é recomendada. Ambas as
amostras devem ser medidas em paralelo numa mesma análise.
O índice de Cut-off (COI) das amostras pode ser calculado da
DO amostra
COI
=
seguinte forma:
DO Padrão B
13.2. Avaliação Quantitativa
Constrói-se um gráfico com a DO dos padrões (eixo dos yy, linear) em função da sua concentração (eixo
dos xx, logarítmico), quer em papel gráfico semi-logarítmico quer usando um método computorizado. Uma
boa curva é fornecida optando por interpolação cubic spline, ajustamento 4PL (4 parameter logistics) ou
modelo logit-log.
Para o cálculo da curva de calibração, deve usar cada sinal dos padrões (se um dos duplicados apresentar
um valor claramente diferente do esperado pode ser omitido e o valor mais razoável pode ser usado).
A concentração das amostras pode ser lida directamente a partir da curva de calibração.
Os Padrões deste ensaio foram ajustados ao Padrão OMS RUBI-1-94 (1st Intl. Standard).
Ao ler os resultados a partir do gráfico tem que se considerar a diluição inicial. Os resultados das amostras
com pré-diluição superior têm que ser multiplicados pelo factor de diluição.
Amostras que apresentem concentrações acima do padrão mais elevado, têm que ser diluídas como
descrito em INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE e testadas novamente.
(OD)
2.500
Curva de Calibração Típica
(Exemplo. Não usar para cálculos!)
Padrão
A
B
C
D
E
14.
IU/mL
0
10
50
200
500
2.000
DOMédia
0.022
0.471
1.252
2.086
2.446
1.500
1.000
0.500
0.000
1
10
100
1000
(IU/mL)
INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS
Método
Quantitativa
(Curva Padrão)
Qualitativa
(Índice de Cut-off, COI)
15.
Rubella virus IgG
Intervalo
< 8 IU/mL
8 – 12 IU/mL
> 12 IU/mL
< 0.8
0.8 – 1.2
> 1.2
Interpretação
negativo
indeterminado
positivo
negativo
indeterminado
positivo
Os resultados por si só não devem ser a
única razão para qualquer acção
terapêutica
e
deverão
ser
correlacionados com outras observações
clínicas e testes de diagnóstico.
VALORES ESPERADOS
Num estudo interno, indivíduos aparentemente saudáveis evidenciaram os seguintes resultados:
Interpretação
Rubéola
n
positivo
indeterminado
negativo
IgG
172
95.4 %
0%
4.7 %
IgM
175
1.9 %
8.6 %
89.7 %
Recomenda-se que cada laboratório estabeleça o seu próprio intervalo de normalidade.
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LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
A recolha de amostras tem um efeito significativo nos resultados dos testes. Ver RECOLHA E
ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS para detalhes.
Para reacções cruzadas, ver DESEMPENHO.
Azidas e timerosal em concentrações > 0.1 % interferem nos ensaios e podem levar a resultados falsos.
Os seguintes componentes sanguíneos não têm um efeito Hemoglobina
8.0 mg/mL
significativo (+/- 20% do esperado nos resultados do teste até Bilirrubina
0.3 mg/mL
às concentrações descritas em baixo:
Triglicéridos
5.0 mg/mL
17.
DESEMPENHO
Especificidade Analítica Não foram detectadas
reacções cruzadas com:
(Reacção Cruzada)
Precisão
Intra-Ensaio
Inter-Ensaio
Inter-Lotes
Sensibilidade Analítica
Linearidade
Recuperação
Especificidade Clínica
Sensibilidade Clínica
18.
Herpes 1, Citomegalovírus, Toxoplasma, dsDNA,
Sarampo, Papeira, Varicalla e EBV-VCA. Interferências de
amostras positivas da parainfluenza (vírus paragripal) o do
parvovírus não podem ser excluídas.
CV (%)
4.3 – 7.2
2.6 – 17.0
5.3 – 23.2
Média (IU/mL)
8.6 - 161
8.2 - 174
9.8 - 413
0.29 IU/mL
Intervalo (IU/mL)
Diluição em Série até
58 - 227
1/4
Recuperação media após adição de reforço
100%
(n = 7)
100%
(n = 163)
Intervalo (%)
75 - 110
102 – 118 %
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antibody in serum. Clin. Chem. 30: 889 (1984).
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immunosorbent assay and an automated microparticle enzyme immunoassay (IMx). J. Clin. Microbiol.
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13. WHO Europe: Strategic plan for measles and congenital rubella infection in the European region of the
WHO. 2004.
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Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα
REF
Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθµός-Κατ.:
LOT
Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή:
Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: /
Χρησιµοποιείται από:
No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: /
Αριθµός εξετάσεων:
CONC
LYO
IVD
Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα
Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο
In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In
Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In
Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.
Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos
para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.
Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. /
Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni
prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.
Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. /
Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la
luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να
φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου.
Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση
στους:
Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός:
Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!
Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.
Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben.
Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.
Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS.
Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.
Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.
Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ.
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IBL International GmbH
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cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer’s liability is not to exceed the value of the test kit.
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