Os mosquitos também têm malária
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Henrique Silveira Os mosquitos também têm malária! Malária arrepios calor suores Malária Malária - ciclo esporogónico Malária - ciclo esporogónico Resposta imunológica do mosquito Epitélio Corpo gordo Hemolinfa zigoto oocineto gametas Mecanismos efectores péptidos anti-microbianos ~~ oocisto melanização M.P. Intestino médio coagulação esporozoitos Glândulas salivares Número de parasitas Interrupção do ciclo de vida 104 103 102 101 gâmetas esporozoitos (intestino médio) oocineto X (glândulas salivares) oocisto 012345 10 Dias após a infecção 25 X Resposta imunológica do mosquito Áreas de investigação Modulação da resposta oocisto Intestino Médio - Cloroquina - Moléculas imunoestimuladoras Imunoestimulação Imunoestimulação Sequências nucleotidicas imunoestimuladoras DNA PRM Perspectivas terapêuticas dos Oligo-CpG - estimular respostas imunológicos protectoras - modular a resposta imunológico a alergenos - adjuvante de vacinas Resposta imunológica Imunoestimulação Hipótese de trabalho Os oligos-CpG interferem com a resposta imunológica do mosquito Alterar a susceptibilidade à infecção pelo parasita Imunoestimulação Desenho experimental Oligo-CpG 0604 Anopheles gambiae TCCATGACGTTCCTGATGCT 18h p.t 10d p.i. 1404 TCCATGAGCTTCCTGATGCT Controlo 69nl of a 0.1mM oligo P. berghei 10-20%EP + exflagelação amostra - intestino médio - corpo gordo Dissecção - taxa de infecção - intensidade de infecção qRT-PCR microarrays GeneChip® Imunoestimulação Resultados Taxa de infecção 50 % 40 30 20 265 255 226 10 0 control 1404-ODN 0604-ODN treatment no. of oocyst per mosquito Intensidade de infecção 60 1000 100 10 1 control (117) 1404-ODN (127) treatment 0604-ODN (59) De 44% para 26% De 9 para 4 oocistos por intestino médio Imunoestimulação microarrays 24% 2% 2% 22% Cytoskeleton 2% 16% 18% 16% Recognition CLIP serine proteases Other serine proteases Serine proteases inhibitors Coagulation/wounding Coagulação/cicatrização PPO Transcription factor Immunity 29% Unknown Gene 8% Unknown Function 15% Egg production/ Hormone 5% Metabolism/ Cell function 24% Oxidative Stress 11% Transport 6% Imunoestimulação Mecanismo de acção gene ID gene name Recognition/Receptor AGAP001212 PGRP-LB AGAP003878 LRR AGAP005335 CTL4 AGAP007562 Ig, Involucrin repeat, proline-rich region AGAP008364 TEP15 AGAP008647 CD9/CD37/CD63 antigen AGAP009916 Q5XLG8_ANOGA AGAP000999 Toll CLIP domain serine proteases AGAP011791 CLIPA1 AGAP011790 CLIPA2 AGAP011780 CLIPA4 AGAP011787 CLIPA5 AGAP003252 CLIPB6 AGAP002270 CLIPB7 AGAP010833 CLIPB14 AGAP003058 CLIPB9 AGAP003689 CLIPC7 *Other serine proteases AGAP000182 AGAP003248 AGAP003627 AGAP003691 AGAP007043 AGAP008295; 96 TRY2_ANOGA; TRY1_ANOGA AGAP010730 AGAP012614 Serine proteases inhibitors AGAP006909 SRPN1 AGAP006911 SRPN2 AGAP006910 SRPN3 AGAP001377 SRPN11 AGAP001376 SRPN17 AGAP003354 Q8WR37_ANOGA AGAP002925 Placental 11 precursor EC_3.4.21 AGAP003580 PEBP AGAP004333 Proteinase inhibitor I15, antistasin; I2, Kunitz metazoa AGAP008585 Proteinase inhibitor I4, serpin; kinase AGAP009527 Kazal AGAP011319 proteinase inhibitor I19, pacifastin PPO AGAP012616 PPO5 Coagulation/Wounding AGAP002579 von Willebrand factor; Fibronectin AGAP002593 Lipocalin; Apolipoprotein D AGAP005526 CUB; EGF-like, laminin AGAP009097 Transglutaminase AGAP009184 Fibrinogen AGAP003308 Chitin binding Peritrophin-A AGAP004690 CPF3 AGAP009758 CPLC13 AGAP009871 CPR75 AGAP011615 Chitin binding Peritrophin-A AGAP002588 Proline-rich region Transcription factor AGAP006747 REL2 fold change 2,61 1,31 1,28 1,92 1,57 -1,72 2,09 1,29 1,30 1,52 1,39 2,17 1,33 1,38 -1,72 1,43 1,98 PRM 1,39 1,61 1,41 1,69 1,32 -1,63 1,46 1,42 Cascata de proteases serinicas 1,72 1,36 1,38 1,31 1,63 1,60 1,61 1,39 1,50 1,56 1,55 1,33 coagulação -1,50 1,53 -1,33 -1,85 1,65 1,47 1,65 2,20 1,62 1,41 2,32 -1,37 1,44 Oligo--CpG Oligo transglutaminase Imunoestimulação Inibição da coagulação Transglutaminase crosslink fibrinogénio Polímero de fibrina coagulação Se a modulação da resposta imunológica pelo oligo-CpG ao Plasmodium é mediada pela aglutinação X Transglutaminase Aumento da susceptibilidade à infecção? Imunoestimulação Desenho experimental 69nl of a 150uM Inibidor TGM 18h D003 - inibidor Control p.t 10d p.i. P. berghei 10-20%EP + exflagelação Dissecção - taxa de infecção - intensidade de infecção Imunoestimulação Inibição da coagulação Taxa de infecção Intensidade de infecção 100 250 200 Exp 1 80 Exp 2 Exp 3 70 Total 60 nº of oocysts/midgut % infected mosquitoes 90 Exp 1 150 Exp 2 Exp 3 100 Total 50 50 Control D003 N=130 N=152 0 Control (82/130) De 63% para 82% D003 (125/152) De 79 para 152 oocistos por intestino médio Imunoestimulação Conclusões 1- O tratamento de mosquitos com oligos-CpG estimula o sistema imunológico do mosquito sobretudo genes associados com mecanismos de coagulação 2- A Imunoestimulação com oligos-CpG resulta na diminuição da TAXA de INFECÇÂO e INTENSIDADE de INFECÇÂO 3- A inibição da transglutaminase resulta no AUMENTO da infecção por Plasmodium Impacto do nosso trabalho Podemos manipular o sistema imunológico do mosquito a nosso favor usando moléculas imunoestimuladoras como oligo-CpG E agora? Melhorar os níveis de estimulação Compreender os mecanismos moleculares Procurar outras moléculas mais eficazes Encontrar novos métodos de controlo inovadores e eficazes Equipa • Patrícia Abrantes • Luís Filipe Lopes • Susana Ramos • Ana Gabriel • Rute Felix • Cristina Mendes • Catarina Alves • V. E. do Rosário Parceiros & Financiadores University of Minnesota, St Paul, Minnesota, USA • M. S. Abrahamsen Universidade de Gotemburgo, Suécia • V. Collins Johns Hopkins University, Baltimore, USA • G. Dimopoulos INETI-Departamento de Biotecnologia, Portugal • A. Domingos IBMC, Estrasburgo, França • J.-M. Reichhart IHMT - UNL • P. Almeida • A. Santos-Grácio Obrigado Obrigado