SEQÜENCIAMENTO DE DNA: MÉTODOS E PRINCÍPIOS
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SEQÜENCIAMENTO DE DNA: MÉTODOS E PRINCÍPIOS Cristiane Kioko Shimabukuro Dias Pós-doutorado - FAPESP E-mail: [email protected] Laboratório de Biologia e Genética de Peixes - Departamento de Morfologia Instituto de Biociências – UNESP – Botucatu (SP) DEFINIÇ DEFINIÇÃO Determinar a seqüência de nucleotídeos Seqüenciamento de DNA 1 HISTÓ HISTÓRICO 1953 - Watson e Crick Modelo dupla hélice do DNA Seqüenciamento de DNA HISTÓ HISTÓRICO Década de 70 Seqüenciamento de DNA 2 MÉTODOS CLÁ CLÁSSICOS 1977 – Seqüênciamento de DNA • Maxam e Gilbert - método de degradação química Tratamento com substâncias químicas que cortam a molécula de DNA em nucleotídeos específicos • Sanger et al. - método enzimático, dideoxi ou de término da cadeia Síntese enzimática de uma fita complementar, cujo crescimento é interrompido pela adição de um dideoxinucleotídeo Seqüenciamento de DNA MÉTODO DE DEGRADAÇ DEGRADAÇÃO QUÍ QUÍMICA enzima de restrição X X X aquecimento e purificação Seqüenciamento de DNA 3 MÉTODO DE DEGRADAÇ DEGRADAÇÃO QUÍ QUÍMICA Especificidade de bases Químico usado para Químico usado para Químico usado para a alteração de bases remoção de bases clivagem da fita G Dimetilsulfato Piperidina Piperidina A+G Ácido Ácido Piperidina C+T Hidrazina Piperidina Piperidina C Hidrazina + álcali Piperidina Piperidina A>C Álcali Piperidina Piperidina Seqüenciamento de DNA MÉTODO DE DEGRADAÇ DEGRADAÇÃO QUÍ QUÍMICA G A+G C+T C Seqüenciamento de DNA 4 MÉTODO ENZIMÁ ENZIMÁTICO DNA fita simples DNA polimerase primer Animação Seqüenciamento de DNA MÉTODO ENZIMÁ ENZIMÁTICO X MÉTODO DE DEGRADAÇ DEGRADAÇÃO QUÍ QUÍMICA Seqüenciamento de DNA 5 • Métodos de seqüenciamento manual • Método enzimático – mais utilizado, seqüenciamento de genomas, automação • Método de degradação química – substâncias químicas, caracterização de oligonucleotídeos ou no seqüenciamento de estruturas ricas em GC Seqüenciamento de DNA SEQÜ SEQÜENCIAMENTO MANUAL Seqüenciamento de DNA 6 SEQÜ SEQÜENCIAMENTO AUTOMÁ AUTOMÁTICO Seqüenciamento de DNA SEQÜ SEQÜENCIAMENTO AUTOMÁ AUTOMÁTICO • Anos 80 – seqüenciador semi-automático • Substituição das técnicas de detecção por radioatividade pelo uso de marcadores fluorescentes •Radioisótopos – danosos à saúde, dificuldade de automação •Fluorófos – sistema de detecção que permite a leitura automática das seqüências • Preparação do gel e aplicação das amostras • Utilização ddNTPs durante a eletroforese fluorescentes lidos automaticamente • Corantes fluorescentes – reações no mesmo poço no gel Seqüenciamento de DNA 7 SEQÜ SEQÜENCIAMENTO AUTOMÁ AUTOMÁTICO Seqüenciamento em ciclos ou por amplificação linear Seqüenciamento de DNA SEQÜ SEQÜENCIAMENTO AUTOMÁ AUTOMÁTICO animação Seqüenciamento de DNA 8 Seqüenciamento de DNA SEQÜ SEQÜENCIAMENTO AUTOMÁ AUTOMÁTICO Anos 90 - Seqüenciadores de capilares Seqüenciamento de DNA 9 SEQÜ SEQÜENCIAMENTO AUTOMÁ AUTOMÁTICO • Seqüenciadores automáticos – avanço para a genômica, poucas centenas de pb • Seqüenciadores de capilares completamente automatizados duas vezes mais rápidos, • Associação de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecção através de fluorescência confocal excitada por laser Seqüenciamento de DNA SEQÜ SEQÜENCIAMENTO AUTOMÁ AUTOMÁTICO Seqüenciamento de DNA 10 • Eliminação da montagem da placa e preparação do gel • Aplicação das amostras por eletroinjeção • Alta velocidade e resolução na separação das amostras • Eliminação do retraqueamento Seqüenciamento de DNA OUTRAS TÉ TÉCNICAS DE SEQÜ SEQÜENCIAMENTO •Piroseqüenciamento •Seqüenciamento por hibridação •Colônias da polimerase •Seqüenciamento por nanoporos •Espectrometria de massa •Massively Parallel Signature Seuqencing •Determinação de SNP, reseqüenciamento, análise da expressão gênica Seqüenciamento de DNA 11 OUTRAS TÉ TÉCNICAS DE SEQÜ SEQÜENCIAMENTO Piroseqüenciamento – tempo real, seqüenciamento por síntese Método rápido, seqüências menores, genotipagem de SNP, tipagem microbiana, reseqüenciamento de genes para doenças e determinação da seqüência de DNA com estruturas secundárias complexas Seqüenciamento de DNA OUTRAS TÉ TÉCNICAS DE SEQÜ SEQÜENCIAMENTO SBH – complementariedade de pares de bases da molécula de DNA (4n=5) = 1024 Seqüenciamento de DNA, reseqüenciamento de DNA, seqüenciamento de novo e análise da expressão gênica Seqüenciamento de DNA 12 OUTRAS TÉ TÉCNICAS DE SEQÜ SEQÜENCIAMENTO Colônias da polimerase – colônias de DNA de 1 µm de diâmetro que crescem numa lâmina para microscopia •Produção das polônias •Denaturação do DNA imobilizado •Hibridação de um primer universal •Primeira reação de extensão •Microscópio de fluorescência de varredura •Fluorescência removida •Ciclos sucessivos •Seqüência de cada polônia paralelo Estágio inicial, redução de custos; genotipagem e haplotipagem Seqüenciamento de DNA APLICAÇ APLICAÇÕES Análise genômica Haemophilus influenzae (1995) Fago phiX174 (Sanger et al., 1977) Homo sapiens (2003) Seqüenciamento de DNA 13 APLICAÇ APLICAÇÕES Estudo sistemático dos genomas Avanço das técnicas de seqüênciamento Automação Equipamentos sofisticados e precisos Grande quantidade de dados Seqüenciamento de DNA APLICAÇ APLICAÇÕES Genoma completo: 28 archebactérias, 357 bactérias e 22 eucariotos Seqüenciamento de DNA 14 APLICAÇ APLICAÇÕES Ciência forense Análise filogenética Seqüenciamento de DNA APLICAÇ APLICAÇÕES Conservação de espécies Epidemias virais Seqüenciamento de DNA 15 APLICAÇ APLICAÇÕES • DNA barcoding •Genômica comparada •Descoberta de drogas • Screening genético Seqüenciamento de DNA OBRIGADA! Seqüenciamento de DNA 16
