estudo sobre inibidores de serinoproteases extraídos de

1
ESTUDO SOBRE INIBIDORES DE SERINOPROTEASES
EXTRAÍDOS DE ARTRÓPODES
Lais Guedes Ramalho e Sergio Daishi Sasaki
Centro de Ciências Naturais e Humanas– CCNH/UFABC
Santa Adélia, 166 – Bairro Bangu, CEP 09210-170, Santo André – SP
Resumo: O trabalho apresenta uma revisão bibliográfica sobre os inibidores de serinoproteases extraídos de artrópodes. No
desenvolvimento deste trabalho foram realizadas consultas a bancos de dados de informações bibliográficas da área biomédica, via
sites de busca que compilam informações da área. Os artigos selecionados foram lidos para a extração das informações consideradas
mais relevantes para a escrita deste artigo científico de revisão sobre o assunto.
Palavras Chave — Inibidor de serinoprotease, artrópode, kunitz, kazal, Serpin, pacifastin.
I. INTRODUÇÃO
Serinoproteases constituem o tipo catalítico predominante
nas peptidases e são encontradas em quase todos os
organismos vivos [1]. Essas peptidases estão presentes em
importantes processos fisiológicos como a coagulação
sanguínea. Essas enzimas receberam essa denominação por
possuírem um mecanismo catalílico comum, caracterizado
pela existência de um resíduo do aminoácido serina peculiar
no sítio ativo, essencial para atividade enzimática.
Duas formas de controle pós-traducional podem ser
destacadas a ativação de zimogênios e a inibição por
inibidores de serinoproteases específicos. Em insetos
hematófagos, por exemplo, uma das estratégias para a
aquisição de sangue do hospedeiro é a presença de inibidores
de serinoproteases, como por exemplo, inibidores de trombina
ou Fator Xa.
Por muitos anos, o estudo de inibidores de serinoproteases
esteve focado principalmente em animais vertebrados. Nas
últimas décadas, entretanto, tornou-se evidente que as
serinoproteases e seus inibidores estão envolvidos em
processos fisiológicos fundamentais em invertebrados que têm
paralelo com processos existentes em animais vertebrados,
como, por exemplo, a cascata da coagulação da hemolinfa em
Limulus (caranguejo ferradura) [2] e a resposta imune inata
desses animais [3]. Por outro lado, os inibidores estão
envolvidos em outros processos restritos aos artrópodes, por
exemplo, nas mudas de carapaça, na metamorfose de insetos e
na cascata da pro-fenoloxidase [4].
Considerando a importância da atuação destes inibidores de
serinoproteases em diversos processos fisiológicos em
artrópodes, o propósito deste trabalho foi realizar um
levantamento bibliográfico sobre os inibidores Kazal, Kunitz,
Serpin e Pacifastin, onde suas principais características estão
descritas abaixo.
II. CARACTERÍSTICAS
1.
Inibidor Pacifastin
Apresenta um padrão de seis resíduos cisteína estes
resíduos formam três pontes dissulfeto (Cys-1-4, Cys 2-6.
Cys 3 -5), indicando nos membros pacifastin uma notável
estabilidade. Seu domínio inibitório é composto por três
folhas β anti-paralelas e um “loop” canônico exposto (fig.
2A) contendo um sítio reativo ( P1-P1’) (fig.1), que está
envolvido na ligação da proteína alvo e está localizado
próximo ao C-terminal e entre os dois últimos resíduos do
aminoácido cisteína [5,6,9].
Os resíduos do sítio reativo interagem com a protease
competindo por um complexo substrato-enzima. O resíduo
P1(fig.1) é crucial para a especificidade do inibidor.
Estudos em gafanhotos confirmaram que a posição do
resíduo P1 determina a especificidade do inibidor
pacifastin tanto para tripsina quanto para quimotripsina
dependendo do aminoácido do resíduo P1[5,7].
Pouco se sabe sobre a função do inibidor. Estudos
indicam que Pacifastin no camarão de água doce, está
envolvido no processo de regulação da resposta imune e
funciona como um baixo regulador da cascata de prophenoloxidase. Em insetos, o inibidor também pode estar
envolvido na regulação da resposta imune, pela sua
presença no veneno da vespa, Pimpla hipocondríaca, que é
conhecida pela sua influência no sistema imune nos
organismos [5,6].
No gafanhoto pode desempenhar um papel na regulação
de processos neurológicos envolvidos na fase de
transcrição, e regulação de processos fisiológicos
envolvidos na reprodução.
2
extensivamente estudadas.
Um domínio molecular
pertencente a esta família tem baixo peso molecular, menos
que 10 kDa [13], geralmente possui seis resíduos cisteína
com espaços idênticos entre si e formam três pontes dissulfeto
(fig. 2D) . Os membros desta família de inibidores também
foram identificados e isolados a partir de insetos, na hemolinfa
de Bombyx mori e Manduca sexta. Na hemolinfa de Bombyx,
nove inibidores do tipo kunitz-BPTI foram detectados pela sua
atividade sobre quimotripsina.[14].
Figura 1. - Representação esquemática de um inibidor
Pacifastin. As três folhas beta anti-paralelas são retratadas
com setas cinza e as três pontes dissulfeto são mostradas
com linhas verdes). Os dois resíduos do sítio reativo (P1P10) estão coloridos em amarelo, enquanto os resíduos
vizinhos que são importantes para a interação da enzima,
são numerados de P12 a P50 [15].
2.
Inibidor Serpin
Inibidores do tipo Serpin possuem tipicamente 45-50 kDa.
Geralmente possuem seis resíduos cisteína que são
identicamente espaçados uns aos outros e fazem três pontes
dissulfeto. A seletividade inibitória de serpin é determinada
pelo seu sitio ativo exposto na superfície da molécula (fig.
2B).
Serpins também controlam resposta imune em
invertebrados, incluindo coagulação da hemolinfa, ativação da
cascata da pró-fenoloxidase e induz síntese de peptídeos
antimicrobianos, além de apresentarem importantes papéis no
controle da imunidade inata e no desenvolvimento [11].
3.
Inibidor Kazal
Inibidores do tipo Kazal compartilham de uma seqüência
primária conservada (C-X1-7- C-X7-C-X6-Y-X3-C-X2-3-CX9-16-C) e conformação molecular (uma α-hélice central e
três poucas folhas β-antiparalelas), cada domínio consiste em
50-60 aminoácidos com seis cisteínas conservadas, que dão
forma ao intra-domínio de três pontes de dissulfeto (fig. 2C).
A especificidade do inibidor Kazal depende principalmente
do resíduo P1 no sitio reativo. Da mesma forma que o inibidor
pacifastin, estudos sugerem que os aminoácidos da posição P1
com resíduos Arg ou Lys tendem a inibir a enzima tripsina.
[12]
4.
Inibidor Kunitz-BPTI
A família de inibidores do tipo Kunitz-BPTI é uma das mais
Figura 2. A - Representação esquemática da estrutura
característica da família Pacifastin. B - Estrutura terciária
de um inibidor Serpin, esfera amarela - resíduo P1, esfera
verde – resíduo P1´. C - Estrutura terciária de um inibidor
Kazal. D – Estrutura terciária de um inibidor KunitzBPTI.
III. DISCUSSÃO
Em nosso trabalho descrevemos quatro famílias de
inibidores de serinoproteases presentes em artrópodes
(Pacifastin, Kunitz-BPTI, Serpin e Kazal). Estes inibidores
estão presentes em diversos artrópodes como o gafanhoto,
bicho da seda, camarão, besouro e foram encontrados em
diferentes tecidos como células da hemolinfa, saliva,
estômago, apresentando diferentes atividades inibitórias sobre
a quimotripsina, a tripsina, a elastase e trombina. Estes
inibidores podem estar envolvidos com eventos fisiológicos do
próprio artrópode, quando presente na hemolinfa, hemócito e
tecido gorduroso. Como o controle da cascata da pro-
3
fenoloxidase e os eventos de metamorfose e desenvolvimento
embrionário.
Alguns desses inibidores de serinoproteases apresentam
um importante papel na cascata da coagulação sanguínea,
como, por exemplo, o inibidor Kazal responsável pela inibição
da trombina presente no estômago do percevejo hematófago,
Diptelogaster maximus, indicando um possível papel na
alimentação desse inseto.
Em relação à estrutura, os inibidores do tipo Kazal e
Kunitz-BPTI possuem domínios inibitórios de tamanhos
similares apresentando entre 50 a 60 aminoácidos com seis
resíduos cisteína e três pontes dissulfeto. Os Pacifastins são
menores, cada domínio tem em torno de 35 aminoácidos, mas
também possuem três pontes dissulfetos e seis resíduos
cisteína. Os inibidores tipo Serpin diferenciam-se dos demais
por possuírem um tamanho muito maior, cada domínio tem
em torno de 350 a 400 resíduos de aminoácidos e possuem um
massa molecular de aproximadamente 45-50 kDa.
Apesar da diferença estrutural existente entre as famílias de
inibidores de serinproteases estudadas, com exceção dos
inibidores Serpin, as demais famílias apresentam mecanismo
inibitório semelhante com a presença de um sítio reativo, onde
o resíduo chamado de P1 exerce papel fundamental na
especificidade inibitória da molécula.
O estudo dos inibidores de serinoproteases de artrópodes
possibilita uma melhor compreensão de eventos fisiológicos
desses animais e a interação que ocorre com outros
organismos, como por exemplo na relação parasita-hospedeiro
existente nos artrópodes hematófagos e vertebrados.
V. BIBLIOGRAFIA
[1] Simonet G, Claeys I, Franssens V, De Loof A, Broeck
JV.Genomics, evolution and biological functions of the
pacifastin peptide family: a conserved serine protease inhibitor
family in arthropods. Peptides. 2003; 24(10):1633-44.
[2] Agarwala KL, Kawabata S, Miura Y, Kuroki Y, Iwanaga
S. Limulus intracellular coagulation inhibitor type 3.
Purification, characterization, cDNA cloning, and tissue
localization J Biol Chem. 1996; 271(39):23768-74
[3] Imler JL, Hoffmann JA. Toll and Toll-like proteins: an
ancient family of receptors signaling infection. Rev
Immunogenet 2000; 2(3):294-304. Review.
[4] Jiang H, Kanost MR. The clip-domain family of serine
proteinases in arthropods. Insect Biochem Mol Biol. 2000;
30(2):95-105. Review.
[5] Breugelmans B, Simonet G, van Hoef V, Van Soest S,
Vanden Broeck J. Pacifastin-related peptides: Structural and
functional characteristics of a family of serine peptidase
inhibitors. Peptides. 2009; 30(3):622-32.
[6] Simonet G, Claeys I, Van Soest S, Breugelmans B,
Franssens V, De Loof A, Vanden Broeck J. Molecular
identification of SGPP-5,a novel pacifastin-like peptide
precursor in the desert locust. Peptides. 2004; 25(6):941-50.
[7] Liang Z, Sottrup-Jensen L, Aspán A, Hall M, Söderhäll K.
Pacifastin, a novel 155-kDa heterodimeric proteinase inhibitor
containing a unique transferrin chain. Proc Natl Acad Sci U S
A. 1997; 94(13):6682-7.
[8] Simonet G, Claeys I, Franssens V, De Loof A, Broeck
JV.Genomics, evolution and biological functions of the
pacifastin peptide family: a conserved serine protease inhibitor
family in arthropods. Peptides. 2003; 24(10):1633-44.
[9] Gáspári Z, Ortutay C, Perczel A. A simple fold with
variations: the pacifastin inhibitor family Bioinformatics.
2004; 20(4):448-51.
[10] Liang Z, Sottrup-Jensen L, Aspán A, Hall M, Söderhäll
K. Pacifastin, a novel 155-kDa heterodimeric proteinase
inhibitor containing a unique transferrin chain. Proc Natl Acad
Sci U S A. 1997; 94(13):6682-7.
[11] Simonet G, Claeys I, Broeck JV. Structural and
functional properties of a novel serine protease inhibiting
peptide family in arthropods. Comp Biochem Physiol B
Biochem Mol Biol. 2002; 132(1):247-55.
[12]Zheng QL, Chen J, Nie ZM, Lv ZB, Wang D, Zhang YZ.
Expression, purification and characterization of a threedomain Kazal-type inhibitor from silkworm pupae (Bombyx
mori). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 2007;
146(2):234-40.
[13] Kress H.;Jarrin A.;Thüroff E.;Saunders R.; Weise
C.;Schmidt am Bush M.; Knapp EW.; Wedde M. &
Vilcinskas A. Insect Biochem Mol Biol. 34, p. 855-69 (2004).
[14] He N, Yakiyama M, Fujii H, Banno Y, Yamamoto K.
Genomic structure and expression analysis of the gene
encoding a silkworm basic Kunitz-type chymotrypsin
inhibitor. Biochim Biophys Acta. 2003; 1628(1):71-7.
[15] Breugelmans B, Simonet G, van Hoef V, Van Soest S,
Vanden Broeck J. Pacifastin-related peptides: Structural and
functional characteristics of a family of serine peptidase
inhibitors. Peptides. 2009; 30(3):622-32.
4