Prática 7: Agentes Antimicrobianos Nas aulas práticas anteriores

Prática 7: Agentes Antimicrobianos
Nas aulas práticas anteriores tivemos a oportunidade de estudar alguns dos
agentes bacterianos associados ao homem e outros animais, nomeadamente as
espécies Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Ambas as bactérias fazem
parte da flora microbiana do homem, localizando-se a E. coli a nível intestinal
enquanto que o Staphylococcus aureus está associado às vias respiratórias
(nariz, nasofaringe) e à pele, entre outros. Todavia várias espécies bacterianas
são agentes de doenças, sendo necessário controlar o desenvolvimento destas
espécies com o emprego de substâncias desinfectantes e antibióticos, assim
como através da chamada esterilização (Singleton, 1997; Prescott et al. 2002).
A esterilização é um processo que objectiva a morte dos microrganismos. Esta
técnica pode efectuar-se pelo calor de uma chama, no caso das ansas e pinças
que se utilizam diariamente no laboratório, utilizando as lamparinas ou o bico
de Bunsen, através do uso de uma estufa de secagem, ou através da autoclave.
Este aparelho é muito utilizado na esterilização dos meios de cultura. A
esterilização pode também fazer-se por filtração e pela acção de agentes
químicos. A esterilização tem assim o objectivo de eliminar todos os
microrganismos. Distintamente, a desinfecção destrói ou inactiva
microrganismos potencialmente nocivos, sem afectar os outros
microrganismos. Por exemplo espécies de Pseudomonas podem desenvolver-se
em soluções diluídas de fenol (Singleton, 1997). Os desinfectantes que
exterminam as bactérias, são chamados de “bactericidas”. Aqueles que param
o seu crescimento, sem inviabilizar a bactéria chamam-se bacteriostáticos.
Alguns dos desinfectantes utilizados no controle de microrganismos incluem
o fenol, e os hipocloritos (Prescott et al. 2002).
Os antibióticos são produtos de origem microbiana (inicialmente), com acção
inibitória ou letal sobre outros microrganismos. Actualmente comercializamse muitos antibióticos produzidos sintéticamente, em laboratórios
farmacêuticos. Não se conhece um único antibiótico que seja efectivo contra
todas as bactérias (Singleton, 1997). Alguns deles são efectivos contra diversos
microrganismos e por isso designados de largo espectro, outros actuam sobre
um número restrito de microrganismos.
O nível de actuação do antibiótico é variável. Alguns afectam a parede celular,
interferindo na síntese do peptidoglicano, outros actuam na membrana
citoplasmática ou a nível da síntese proteica nos ribossomas.
Os principais antibióticos foram descobertos antes de 1955. Desde então têm
sido feitas pesquisas, tentando modificar e adaptar esses antibióticos. A
penicilina é um exemplo de um antibiótico com efeito na síntese do
peptidoglicano, produzido pelo fungo do género Penicillium (ver Prescott et
al. 2002, ou Black, 2002).
As cefalosporinas, como exemplo, são antibióticos efectivos contra gram (+)s e
gram (-)s. Os antibióticos com efeito sobre a membrana citoplasmática das
bactérias incluem a polimixina B, antibiótico produzido pelo género Bacillus.
Esta droga é efectiva contra as infecções provocadas por Pseudomonas. As
sulfonamidas e trimetoprim actuam na síntese de ácido tetrahidrofólico, um
co-factor necessário para a síntese das bases timina, guanina, uracil e adenina.
Para muitos microrganismos, nomeadamente, Pseudomonas, Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Proteus, Serratia etc., não se sabe com exactidão qual o
antibiótico efectivo no seu controle. Isto acontece devido ao desenvolvimento
de estirpes resistentes.
A nível laboratorial pode-se testar a sensibilidade ou susceptibilidade dos
agentes bacterianos a diversos antibióticos. Um dos métodos mais utilizados é
o método de difusão de Kirby-Bauer.
Material e Métodos
- Culturas bacterianas em meio de agar sólido:
Escherichia coli, (gram negativa) Staphylococcus aureus,(gram positiva)
Enterococcus sp. (gram positiva), Proteus sp. (gram negativa).
- Caixas de petri com meio agar Mueller-Hinton.
- Tubos de ensaio com caldo nutriente ou caldo TSB
- Cotonetes esterilizadas, ansas, pinças, lamparinas
- Prepare antecipadamente as amostras das bactérias cuja susceptibilidade aos
antibióticos se deseja testar, inoculando essas bactérias em meio líquido
estéril, por exemplo em caldo nutriente ou TSA, em tubos de ensaio. Coloqueos em banho-maria ou na incubadora no dia anterior, ou por algumas horas,
de modo a obter uma boa turvação.
- Inocule meio de agar Mueller-Hinton com a solução bacteriana a testar, uma
caixa para cada espécie, de modo a cobrir toda a superfície do agar, utilizando
a cotonete previamente mergulhada na solução bacteriana, executando os
movimentos indicados na figura:
.
- Deixe secar o meio por cerca de 5 minutos.
- Coloque em cima, assépticamente, com auxílio de pinça esterilizada, os
discos de antibióticos espaçados disponibilizados pelo seu orientador (da
OXOID).
- Incube os meios a 35- 37oC por 24h.
Resultados e Discussão
No próximo período laboratorial, será necessário medir o diâmetro das zonas
de inibição, que entretanto se formaram com auxílio de uma régua (em mm).
Consoante as dimensões destas zonas de inibição, classifique a
susceptibilidade das bactérias aos antibióticos em “susceptível”,
“moderadamente susceptível” ou “resistente”. Recorra às fotocópias e
literatura indicada pelo seu orientador. Poderá então concluir qual ou quais
os antibióticos mais efectivos sobre as suas bactérias, e com auxilio da
literatura recomendada saber a que nível esse antibiótico actua.
Bibliografia recomendada:
- Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. (2002). Chapter 35: Antimicrobial
chemotherapy.
- Singleton, P. (1997). Chapter 15: Man against bacteria