Universidade Federal Rural da Amazônia Curso de Doutorado em Ciências Agrárias Área de concentração- Agroecossistemas na Amazônia Disciplina: Tópicos Especiais METABOLISMO DA FIXAÇÃO BIOLÓGICA DO N2 Dr. Roberto Cezar Lobo da Costa INTRODUÇÃO O nitrogênio é um dos elementos considerados essenciais para a vida no planeta, está presente em várias partes das células, mais particularmente nas proteínas O nitrogênio é essencial para o crescimento de plantas e grãos e posteriormente incorporado nos organismos dos animais, a incorporação deste gás necessita que o mesmo seja transportado da atmosfera para o solo A principal rota é a fixação do nitrogênio, que é a transformação do nitrogênio atmosférico em compostos, a fixação biológica é feita por certos procariotos, como bactérias, mais especificamente cianobactérias e actinomicetos. Algumas das bactérias responsáveis pela incorporação do nitrogênio em outros compostos podem existir e atuar individualmente, como é o caso da Azotobacter e da Clostridium, porém a mais importante, Rhizobium, forma associações simbióticas com plantas superiores como legumes (feijão, ervilha, alfafa e acácia), cujas raízes são colonizadas por estas bactérias. Exemplos de bactérias fixadoras de azoto De vida livre Aeróbicas Em simbiose com plantas Anaeróbicas Azotobacter Clostridium (algumas) Beijerinckia Desulfovibrio Klebsiella (algumas) Bactérias sulfurosas purpúreas* Cyanobacteria* (algumas) Bactérias não-sulfurosas purpúreas* Bactérias sulfurosas verdes* *bactéria fotossintética Com leguminosas (ex:trevo, feijão) Rhizobium Com outras plantas Frankia Azospirillum FORMAÇÃO DOS NÓDULOS. 1 – CRESCIMENTO DOS PÊLOS RADICULARES. AS RAÍZES EXSUDAM COMPOSTOS ORGÂNICOS, TAIS COMO, AÇÚCARES, AMINOÁCIDOS, ETC. QUE IRÃO ATRAIR AS BACTÉRIAS RHIZÓBIA (QUIMIOTACTISMO), FORMANDO UMA “RHIZOSFERA MICROBIANA”. 2 – OS PÊLOS RADICULARES ELIMINAM EXSUDADOS ESPECÍFICOS (FLAVANÓIDES-ANTOCIANINAS) PARA ATRAIR AS BACTÉRIAS PARA AS RAÍZES E INDUZIR ESPECIFICIDADE ATRAVÉS DO GENE NOD DA BACTÉRIA (NODULAÇÃO). FORMAÇÃO DOS NÓDULOS Crescimento dos pêlos radiculares. Asraízesexsudamcompostosorgânicos,taiscomo,açúcares,aminoácidos,etc.quei rãoatrairasbactériasrhizóbia(Quimiotactismo),formando uma“rhizosferamicrobiana”; Os pêlos radiculares eliminam exsudados específicos(flavanóides antocianinas)paraatrairasbactériasparaasraízeseinduzirespecificidadeatravé sdo gene nod da bactéria(nodulação); A bactéria Rhizóbia atraca na superfície do pêlo radicular(provavelmente pela proteína específica-LECTINA-glicoproteína); A bactéria Rhizóbia digere a parede celular e forma o CORDÃO DE INFECÇÃO(forma de tubo) para dentro do córtex da raiz, onde penetram e se multiplicam intensamente, ocorrendo também intensa divisão celular das células corticais que se exteriorizam, formando o NÓDULO À esquerda observam-se nódulos nas raízes de Medicago sativa (alfalfa) inoculada com S. meliloti 2011. À direita vêem-se plantas leguminosas a crescer em meio pobre em azoto, na presença (plantas à esquerda) e na ausência (à direita) de Rhizobium. A NITROGENASE E A REAÇÃO DE FIXAÇÃO DE NITROGÊNIO N2 NH3(NH4+) Nitrogenase(Nase) A reação de fixação do nitrogênio caracteriza-se pela redução do N2àNH3(NH4+) A enzima nitrogenase é formada por duas unidades protéicas ,a Ferroproteína(Fe-proteína) e a Molibdênio-Ferro-proteína(MoFeproteína),ambas capazes de transportar elétrons. Durante a reação de redução do N2,a nitrogenase é auxiliada por uma terceira molécula transportadora de elétrons, a ferridoxina N2 + 16 ATP + 8 e- + 8H+ ---> 2 NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi. A nitrogenase de molibdênio consiste de uma ferro-proteína (Feproteína) e de uma molibdênio-ferro-proteína (MoFe-proteína). A Fe-proteína funciona como doadora de elétrons para a MoFe-proteína (que contém o cofator da enzima, FeMoco), num processo dependente de hidrólise de MgATP. AS NITROGENASES ALTERNATIVAS Contrariando as considerações históricas sobre a importância essencial do molibdênio para o funcionamento das nitrogenases17, ainda na década de 80 descobriu-se que várias classes de bactérias são capazes de fixar nitrogênio em condições de deficiência de molibdênio, utilizando sistemas enzimáticos alternativos, como a nitrogenase de vanádio e ferro (nitrogenase VFe)10,18, ou a que contém apenas ferro10 como metal de transição (nitrogenase Fe). Estudo da Arte Um quarto tipo de nitrogenase foi recentemente caracterizado na bactéria termofílica Streptomyces thermoautotrophicus, cuja propriedade mais notável é a dependência de oxigênio e do radical superóxido - ambos nocivos para a maioria das nitrogenases N2 + 8e- + 8H+ + 4-12MgATP → 2NH3 + H2 + 4-12MgADP + 4-12 PO4 3- A reação é acoplada à oxidação de monóxido de carbono realizada por uma enzima do tipo desidrogenase, que contém molibdênio. Esta enzima usa os elétrons da oxidação do CO para reduzir oxigênio até radicais superóxidos que, por sua vez, são reoxidados a O2 por uma enzima superóxido óxidoredutase, que contém manganês. Os elétrons são finalmente transferidos para uma MoFenitrogenase, que reduz nitrogênio até amônia. Quando a enzima nitrogenase está ativa, o interior dos nódulos apresenta uma coloração rósea que indica a presença de moléculas transportadoras de O2, necessário para a respiração dos bacteróides (bactérias com alterações bioquímicas). A LEGHEMOGLOBINA O QUE AS PLANTAS FAZEM? ESTRATÉGIAS Estratégia anatômica O parênquima do nódulo funciona como uma barreira de difusão do O2. Os espaços intercelulares são pequenos e pouco numerosos, podendo ser preenchidos com água Estratégia bioquímica As células vegetais da região central do nódulo produzem a leghemoglobina (hemoglobinadasleguminosas) A molécula é um carregador de O2,que garante que os bacterióides recebam o O2 necessário para sua respiração, evitando que o gás circule livremente no nódulo GENES ENVOLVIDOS NA FIXAÇÃO BIOLÓGICA DO NITROGÊNIO Família Rhizobiaceae Síntese da nitrogenase: Genes nif Codificação da ferridoxina: Genes fix FORMAÇÃO DOS NÓDULOS Genes nod (nodulação) São encontrados na bactéria, sendo responsáveis pela produção da proteína que recebe o sinal químico da planta hospedeira(os flavonóides-antocianinas)e pela produção das enzimas que sintetizam o fator de nodulação. nodulinas As nodulinas (p.ex. a LEGHEMOGLOBINA) desempenham papel importante na formação e manutenção do nódulo radicular. BIOQUÍMICA DA FIXAÇÃO BIOLÓGICA DO NITROGÊGIO FORMAÇÃO DOS UREÍDEOS - São compostos resultantes da fixação do N2 e baseados na estrutura da uréia; - Os principais compostos são: Alantoínas, Ác. Alantóico e a Citrulina, EXEMPLOS TRANSPORTE DE COMPOSTOS NITROGENADOS EM SOJA CULTIVADA COM DIFERENTES FONTES DE NITROGÊNIO HAIKO ENOK SAWAZAKI , LADASLAV SODEK, e JOÃO PAULO FEIJÃO TEIXEIRA 1. Os três processos de assimilação de nitrogênio, fixação de N2, absorção de NH4 e Plantas de soja inoculadas com aminoácidos Rhizobium japonicum foram cultivadas emmais vermiculita absorção de NOi, originaram e ureídeos, sendo a fixação voltada com solução nutritivadesem nitrogênio, casa dede vegetação, no para Centroa Experimental para a formação ureídeos e a em absorção N-mineral, formação de deaminoácidos. Campinas, do Instituto Agronômico. Foi estudado o efeito quanto aos níveis de urefdeos (alantoína e ácido alantóico), aminoácidos (total e qualitativo por analisador encontrados na alantóico seiva do xilema 2.de Foiaminoácidos), encontrada NO3 maiore NH4, proporção de ácido em relação a alantoína, e essa proporção aumentou com a exposição de planta a N-mineral, sugerindo a ocorrência de maior atividade da alantoinase quanto menor o teor de ureídeos. BIOQUÍMICA DA FIXAÇÃO BIOLÓGICA DO NITROGÊGIO FORMAÇÃO DOS UREÍDEOS - São compostos resultantes da fixação do N2 e baseados na estrutura da uréia; - Os principais compostos são: Alantoínas, Ác. Alantóico e a Citrulina, UREÍDEOS X ESTRESSE HÍDRICO UREIDEOS NO XILEMA A controle 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 DIAS DE ESTRESSE 6 mmoles N-ureideo/L seiva mmoles N-ureídico / L seiva UREIDEOS - XILEMA estresse 80 60 40 20 0 1 2 DIAS APÓS A REHIDRATAÇÃO A A importância da fixação biológica de N2 - PRODUTIVIDADE Soja em vasos de 4,5 kg do Argissolo, inoculado ou não, inoculado com Bradyrhizobium japonicum. (90 DAP) Uma linha de soja não inoculada com Bradyrhizobium Aumenta a produtividade do feijão-caupi na região Pré-Amazônia com a inoculação com rizóbios Antonio Carlos Reis de Freitas1, Norma Gouvêa Rumjanek2 e Gustavo Ribeiro Xavier2 O feijão-caupi, também conhecido como feijão macaçar ou feijão-de-corda é cultivado predominantemente nas regiões Norte e Nordeste, principalmente por sua adaptação às condições edafoclimáticas. Nestas regiões o rendimento médio é de 300 a 400 kg ha-1, abaixo do potencial da cultura que pode chegar até 6t/ha (FREIRE FILHO et al., 1998). Essa leguminosa tem a habilidade de se associar com bactérias do solo do grupo rizóbios e desencadear o processo de fixação biológica de nitrogênio, suprindo parte da nutrição nitrogenada pela planta. Entretanto, para alcançar uma fixação efetiva do nitrogênio no sistema rizóbioleguminosa, é necessário selecionar estirpes adaptáveis às áreas de cultivo. Raízes de feijão-caupi inoculado, Município de Zé Doca-MA Plantio Direto de Feijão Caupi Inoculado, Santa Luzia do Paruá-MA O custo do inoculante representa cerca de R$ 8,00, suficiente para uma área de 1ha. Portanto, essa tecnologia representa um instrumento para viabilizar sistemas de produção do feijão-caupi para a região PréAmazônia. Atividade da nitrato redutase de nódulos de plantas colhidas aumentou significativamente no prazo de 24 horas e foi inversamente associado com redução de acetileno. A diferença de nitrato redutase entre nódulos de plantas colhidas e plantas controle tornou-se menos evidente à medida que rebrota filmagem ocorreu e como redução de acetileno aumentou nas plantas colhidas. A atividade de protease aumentou nos nódulos de plantas colhidas, alcançou o máximo em 7 dias após a colheita, e, em seguida, recusou-se a um nível quase igual ao controle por 22 dias após a colheita. Proteína solúvel e leghemoglobina diminuiu nos nódulos de plantas coletadas em uma relação inversa com a atividade da protease. 7D 7B 7C 7A FIG. 7. Nodule deterioration and regrowth after harvest. (A): nodule 4 days after harvest. Note the loss of bacteroids from the disorganized cells at the base of the nodules. (B): nodule 7 days after harvest. The loss of bacteroids has progressed halfway up the nodule. (C): nodule 10 days after harvest. Only a few bacteroid-containing cells remain adjacent to the meristematic region. (D): nodule 26 days after harvest. The disorganized cells have not regenerated, however, the number of bacteroid-containing cells has increased with the renewed growth of the nodule. All nodules are x 50 magnification. B: bacteroidcontaining cells; D: disorganized cells; M: meristem. FIG. 8. Nodules collected from control plants (A): nodule from control alfalfa on the same day as Figure 9B (7 days). Bacteroid-ontaining cells are found throughout the nodule cortex. (B): nodule from control alfalfa on the same day as Figure 9D (26 days). Some cells at the base of the nodule have started to become senescent and disorganized. All nodules are x 50 magnification. B: bacteroid-containing cells; D: disorganized cells; M: meristem. OBRIGADO