USO DE FONTES DE CARBONO POR BACTÉRIAS ISOLADAS DE ARROZ (Oryza sativa L.) 2 Lucas L. da Silva*¹ (PG), Larissa B. da Silva¹(PG), Enderson P. B. Ferreira (PQ), Karina F. D. N. Santos¹(PQ), Plínio L. F. Naves¹(PQ), Claudia C. G. Martin-Didonet¹(PQ). ¹Br 153, Nº3105 Fazenda Barreiro do Meio, Câmpus de Ciências Exatas e Tecnológicas – CCET, Anápolis, GO – [email protected] ²Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Arroz e Feijão, Santo Antônio de Goiás, GO. Resumo: O objetivo desse estudo foi caracterizar o crescimento bacteriano quanto à utilização de diferentes fontes de carbono em 20 bactérias associadas à planta de arroz (Oryza sativa L.). A capacidade de metabolizar diferentes fontes de carbono foi determinada por espectrofotometria a 600 nm, sendo os resultados convertidos em dados binários e utilizados para construção de um dendrograma. Mediante as características dos isolados foi observado que 35% dos isolados metabolizaram entre oito a nove das fontes testadas e 87% não foi capaz de crescer em meio enriquecido com ácido maléico. Pelo dendrograma foram identificados nove grupos com índice de similaridade em torno de 80%, sendo quatro isolados 100% similar às estirpes de referência BR322 e BR520. Assim, a análise permitiu a caracterização de isolados de raiz de arroz, os quais apresentaram alta diversidade metabólica frente às fontes de carbono testadas. Palavras-chave: Diversidade metabólica. Caracterização fenotípica. Micro-organismos. Introdução Os micro-organismos podem ser encontrados em diversos habitats como o solo. Este é de grande heterogeneidade física, química e biológica e representa um dos maiores reservatórios de diversidade microbiana, sendo fonte para a exploração biotecnológica. Dentre os micro-organismos presentes no solo, várias espécies de bactérias podem viver livremente ou estarem associadas às plantas, estabelecendo uma importante relação planta-solo-micro-organismos (CARDOSO e NOGUEIRA, 2007; ARAÚJO, 2011; MARON et al., 2011; KUJUR et al., 2012). As bactérias endofíticas podem colonizar o interior dos tecidos de alguns vegetais sem causar danos por sua presença, e têm sido mencionadas em vários estudos como rizobactérias promotoras do crescimento de plantas ou Plant-Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR). Alguns grupos dessas bactérias são capazes de fixar biologicamente o nitrogênio (FBN) atmosférico (N2) em íon amônio (NH4+), sendo denominadas de diazotróficas. O nitrogênio é um elemento fundamental para o desenvolvimento das plantas, sendo que as bactérias diazotróficas endofíticas podem fornecer total ou parcialmente as necessidades deste composto (VARGAS e HUNGRIA, 1997; ESPOSITO-POLESI, 2011). Alguns trabalhos têm demonstrado a diversidade microbiana através de caracterizações fisiológicas tais como a capacidade de metabolizar diferentes fontes de carbono (ALVES, 2005; RODRIGUES et al., 2006; BARBOSA et al., 2006; CASTELLANE e LEMOS 2007; LEONEL et al., 2014) . Nesse contexto, o objetivo desse estudo foi caracterizar o crescimento bacteriano quanto à utilização de diferentes fontes de carbono a partir de 20 bactérias associativas de arroz (Oryza sativa L.). Material e Métodos Material Biológico: As bactérias utilizadas neste estudo foram isoladas de raízes de plantas de arroz e mantidas no Banco de Micro-organismos do Laboratório de Bioquímica-UEG. Os isolados foram testados quanto á sua capacidade em metabolizar diferentes fontes de carbono (C). Meio de cultura e teste de fontes de carbono: As bactérias foram cultivadas em caldo semi-seletivo extrato de levedura-manitol (YM) para bactérias da família Rhizobiaceae, por 24h, sob agitação (140 rpm) a 25 ºC e utilizados 50µL nos testes de fontes de C (ácido maléico, ácido málico, ácido succínico, frutose, glicose, inositol, manitol, manose, sorbitol e trealose) como pré-inóculo (VARGAS e HUNGRIA, 1997). Para o teste foi utilizado o meio mínimo líquido (HUNGRIA et al., 1994) e as fontes de C foram adicionadas por filtração na concentração de 10 mM e distribuídos (1 mL) em micro placas de 96 poços (deep well plate) para crescimento. Estas foram incubadas sob agitação (140 rpm) a 25ºc por 72h. O crescimento celular foi avaliado por espectrofotometria (Epoch®) a 600 nm. Análise dos dados: Através das médias de leitura de cada isolado, os resultados foram convertidos em dados binários e utilizados para construção de uma matriz, adotando os critérios de faixas de leituras. A partir deste processo foi derivada uma matriz de similaridade utilizando o coeficiente de Jaccard (J) para a construção do dendrograma, por intermédio do algoritmo UPGMA (Unweighted Pair Group with Arithmetic Means), através do software NTSYS-pc® 2.10 (RODRIGUES et al., 2006). Resultados e Discussão Mediante as características dos isolados e das estirpes de referência quanto à capacidade em metabolizar diferentes fontes de C foi observado que 35% dos isolados metabolizaram entre oito a nove das fontes testadas, 87% não foi capaz de crescer em meio enriquecido de ácido maléico, e 9% apresentou crescimento em apenas uma fonte. Dentre as fontes mais utilizadas estão a glicose, inositol, sorbitol e trealose, e as mais discriminadas o ácido maléico, ácido málico e frutose. Resultados semelhantes foram observados por Sampaio (2015) em estudo realizado com bactérias do solo isoladas no estado de Goiás. Pela análise dos resultados foi elaborado um dendrograma sendo definidos nove grupos com índice de similaridade em torno de 80% (Figura 1). Entre os agrupamentos, G1 e G2 foram compostos por dois isolados cada: R18, R139 e R20, R64 respectivamente. Ambos os grupos mostraram crescimento insatisfatório e/ou ausente em meio contendo frutose como fonte de carbono. O maior agrupamento obtido (G4) apresentou 100% de similaridade com as estirpes de referência BR322 e BR520 (Rhizobium tropici), com exceção do isolado R21 (Figura 1). As bactérias inclusas nesse grupo demonstraram ser capaz de assimilar todas as fontes de carbono fornecidas, indicando semelhanças metabólicas entre as mesmas. Já os isolados R136a, R148, R161 (grupo G5) e R23, R59, R141, R50 R68 (grupo G6) mostraram 70% de similaridade com as estirpes de referência. Em relação aos demais isolados, os grupos G7 (R62), G8 (R130) e G9 (R145), foram os que apresentaram resultados mais divergentes não agrupando com nenhum outro grupo. Foi observado que entre as fontes testadas os isolados R62 e R145 apresentaram crescimento favorável em apenas uma fonte de C (inositol e trealose, respectivamente). Alguns estudos têm elucidado o uso de diferentes carboidratos (glicose, sacarose, frutose, arabinose) e sais de ácidos orgânicos como fontes de carbono por bactérias do gênero Rhizobium, sendo esta habilidade relacionada à disputa por nichos na rizosfera (GRAHAM et al., 1991; CAVAGLIERI et al., 2004; CASTELLANE e LEMOS 2007). Os resultados indicam que os isolados de arroz podem estar taxonomicamente relacionados à família Rhizobiaceae pela semelhança metabólica observada, porém outras características são necessárias para determinação taxonômica das amostras. Muitos autores expõem a importância da caracterização fenotípica para seleção de micro-organismos com potencial aplicação biotecnológica e direcionamento taxonômico, sendo comumente empregados parâmetros ecológicos, sorológicos, resistência a antibióticos e tolerância a diversos fatores, tais como: salinidade, variações do pH e temperatura, uso de fontes de carbono dentre outros (PEREIRA, 2002). Coefficient Jaccard Figura 1: Dendrograma de similaridade gerado pelo software NTSYS-pc® 2.10 com base no uso de fontes de carbono (ácido maléico, ácido málico, ácido succínico, frutose, glicose, inositol, manitol, manose, sorbitol e trealose), definido pelo algoritmo UPGMA utilizando o coeficiente de Jaccard. Conclusão A análise permitiu a caracterização de isolados de raiz de arroz, os quais apresentaram alta diversidade metabólica frente às fontes de carbono testadas. O maior grupo formado (G4), apresentou 100% de similaridade com as estirpes de referência (Rhizobium tropici), apresentando também a maior capacidade de assimilação de fontes alternativas de C. Agradecimentos Ao fomento fornecido pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás (FAPEG), pela bolsa em Pesquisa de Pós-graduação nível mestrado Stricto Sensu do Programa de Mestrado em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde. Ao Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (INCTCNPq) em Fixação Biológica de Nitrogênio pelo financiamento do projeto. Referências ALVES, J. B. Seleção de rizóbios para trevo branco. 2005. 68 f. Dissertação (Mestrado em Agronomia). Faculdade de Agronomia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2005. ARAÚJO, J. F. Diversidade bacteriana do solo em diferentes fitofisionomias do Bioma Cerrado e perspectivas biotecnológicas. 2011. 153 f. Tese (Doutorado em Ciências Genômicas e Biotecnologia), Universidade Católica de Brasília, Brasília, 2011. 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