FARMACOLOGIA BÁSICA E APLICADA (BMF355/313) - ICB

Universidade Federal do Rio de Janeiro
Programa de Graduação de Farmacologia - ICB
FARMACOLOGIA BÁSICA E APLICADA (BMF355/313)
CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - MODALIDADE MÉDICA / BIOFÍSICA
PRÁTICA 4: Manipulação farmacológica da preparação nervo-músculo (simulação).
Descrição: Esta prática é realizada numa preparação simulada em computador de hemidiafragma de rato
montado num banho de órgão isolado com o nervo frênico intacto. O músculo pode ser estimulado a
contrair por estimulação elétrica direta ou indireta, através do nervo. A tensão gerada na contração é
medida por um transdutor isométrico e mostrada na tela do computador na forma como apareceria num
registrador de papel convencional. Agentes farmacológicos que atuam neste sistema podem ser
administrados à preparação em diferentes concentrações, permitindo observar a relação concentraçãoresposta e algumas interações entre os fármacos. Pode-se também lavar a preparação, para verificar a
2+
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reversão dos efeitos, e alterar as concentrações de Ca e Mg no banho.
(O programa The Virtual Twitch foi gentilmente cedido pelo autor, John Dempster da Universidade de
Strathclyde, Escócia)
Procedimento:
1. Localize o grupo do software no menu Iniciar do Windows, selecione o ícone do Twitch e dê um duplo
clique para abrir o programa. Entre seu nome, OK, e observe os elementos da tela. Clique em Help,
Contents, The preparation para ver a montagem experimental. Clique em Start embaixo, à esquerda. O
registro mostra a tensão gerada pelo músculo, em gramas, quando estimulado repetitivamente. Na janela
embaixo à esquerda aparecem o tempo decorrido e a tensão correspondente à posição do cursor, de modo
que o mouse pode ser usado para medir as respostas no registro. Três botões embaixo permitem
selecionar a forma de estímulo - nervo ou músculo. Para aplicar fármacos, selecione um do menu Drugs e
entre a concentração desejada (clicando sobre o valor da concentração aparece uma lista dos valores
possíveis para você selecionar). Os tratamentos aplicados - fármacos, lavagens, etc. - aparecem como
anotações sob o traçado. Para cada tratamento (ou lavagem) aguarde a estabilização do registro e anote a
média aproximada da tensão de pico.
2. Mude o modo de estímulo para o direto (músculo) e verifique se a tensão foi alterada. Volte para
estimulação indireta (nervo) e lave a preparação com solução de Krebs sem cálcio (Wash - Low Ca
Krebs). Anote o que aconteceu e mude para estímulo direto; observe o resultado, volte para estímulo
indireto e lave com solução de Krebs normal.
3. Aplique a tetrodotoxina na concentração de 2×10
depois lave com Krebs normal até reverter o efeito.
−7
M. Verifique o efeito sob estímulo direto e indireto,
−4
4. Aplique a 4-aminopiridina na concentração de 1×10
indireto, depois lave com Krebs normal até reverter o efeito.
M. Verifique o efeito sob estímulo direto e
-4
5. Verifique o efeito da atropina (até 1×10 M) e lave com Krebs normal.
6. Verifique o efeito da neostigmina e a sua reversibilidade.
7. Verifique o efeito do suxametônio (= succinilcolina) e da D-tubocurarina e depois investigue as
interações de cada um com a neostigmina.
8. Planeje com seu grupo uma experiência para obter a curva concentração-resposta (CCR) para a Dtubocurarina (dTC) e determinar sua concentração inibitória média (CI50). Escolham pelo menos seis
-8
-5
concentrações diferentes de dTC entre 5×10 M e 2×10 M. Para cada membro do grupo, deve ser
sorteada uma sequência diferente das concentrações a serem testadas para evitar a tendenciosidade de
possíveis efeitos cumulativos. Cada um testará todas as concentrações, deixando sempre o efeito
estabilizar antes de medir e lavando completamente antes de aplicar novamente a dTC. No final, termine a
simulação saindo do programa (opção Exit) e tabule os resultados para análise. Cada membro do grupo
contribui com uma coluna de valores de tensão (Exp1, Exp2, etc.). Se possível, use um programa de
planilha eletrônica (BrOffice Calc, MS-Excel) para tabular os dados, calcular as estatísticas e lançar em
gráfico, como no exemplo abaixo:
BMF355_Rotprat4_twitch.docx - Prof. Newton G. de Castro - 2014
A
B
C
1
D
E
F
G
H
I
Efeito da d-Tubocurarina na Contração do Diafragma *
2
Tensão de Pico (g)
% do Controle
3
[dTC]μM
Exp1
Exp2
Exp3
Exp1
Exp2
Exp3
Média %
DP %
4
0
y0
y0
y0
100
100
100
100
---
5
x1
y1
y1
y1
100*B5/B4
6
x2
y2
y2
y2
100*B6/B4
7
x3
y3
y3
y3
etc.
8
x4
y4
y4
y4
9
x5
y5
y5
y5
10
x6
y6
y6
y6
100*C5/C4 100*D5/D4 média(E5..G5) desvpad(E5..G5
)
etc.
etc.
etc.
etc.
(*) as funções MÉDIA() e DESVPAD() do BrOffice Calc e do MS-Excel calculam a média e o desvio
padrão amostral.
7. Estime a CI50 da dTC pelo gráfico semilogarítmico de porcentagem da tensão controle vs. concentração.
Use a equação de Hill para calcular a curva teórica usando sua estimativa do CI50 como parâmetro. A
planilha Excel disponibilizada para análise por regressão da CCR já contém o cálculo da expressão:
𝑇(%) = 100 × �1 −
[𝑑𝑇𝐶]
�
[𝑑𝑇𝐶] + 𝐶𝐼50
Verifique graficamente se os valores observados estão próximos dos calculados. Caso contrário, você pode
tentar a equação completa, com o Coeficiente de Hill (n) diferente de 1,0:
𝑇(%) = 100 × �1 −
[𝑑𝑇𝐶]𝑛
�
[𝑑𝑇𝐶]𝑛 + 𝐶𝐼50 𝑛
Resultados:
Tensão de Pico (g)
[dTC]μM
Exp1
Exp2
% do Controle
Exp3
0
BMF354_Rotprat5_twitch.wpd - Prof. Newton G. de Castro - 2012
Exp1
Exp2
Exp3
Média %
DP %
100
100
100
100
---